專利名稱：：羅漢果保肝制劑及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以中草藥制備保肝制劑的方法，特別是羅漢果提取物制備保肝制劑的方法。
背景技術(shù)：
：肝炎是一種危害性很大的疾病。我國是肝炎的高發(fā)區(qū)，據(jù)有關(guān)資科，目前國內(nèi)約有l(wèi).2億人攜帶乙型肝炎病毒(HBV)，其中約有3000萬乙型肝炎顯癥患者。急性肝炎年發(fā)病約140萬200萬人，居傳染病第三位，其中20%的急性乙型肝炎和50%60%的急性丙型肝炎可能發(fā)展為慢性肝炎，慢性肝炎治療周期長、治愈難、預后差，相當一部分慢性肝炎患者由于治療不及時或治療不當，會進一步發(fā)展為肝硬化、肝癌甚至危及生命，因此世界各國對肝炎治療藥物的研究均給予了高度重視。目前，臨床常用的肝炎治療藥物有干擾素拉米呋定及苦參素等抗病毒藥，胸腺素、豬苓多糖等免疫制劑，甘草酸等保肝藥，但這些藥物的療效和安全性等方面均存在一定的局限性，尚不能完全滿足臨床用藥的需求，因此開發(fā)治療肝炎的新藥仍是當前該領(lǐng)域研究的一個熱點。羅漢果，(Momordicagrosvenoriswingle),(以下簡稱Mog)屬葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物的果實，是我國南方的特有植物，主要產(chǎn)于廣西桂北地區(qū)。過去民間長期把羅漢果作為清熱解毒的中藥，特別是用羅漢果作為止渴生律、消熱解暑、止咳化痰、涼血潤肺的藥物，原因是羅漢果含有羅漢果苷(止咳化痰)的成分，后來人們采用了很多方法從羅漢果提取羅漢果苷，例如溶劑萃取法、樹脂吸附法、微波提取法、微孔濾膜法等從羅漢果中提取到強甜昧物質(zhì)羅漢果甜苷，并研究了其藥理作用。我們從公開文獻檢索到了較多有關(guān)羅漢果及其提取物主要是羅漢果皂苷(甙)的作用，現(xiàn)摘錄如下題名羅漢果皂甙提取物的分離、純化及對體外自由基的清除作用作者張俐勤[1]戚向陽[2]機構(gòu)[l]嘉興職業(yè)技術(shù)學院生物工程系，[2]華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，刊名食品研究與開發(fā).2006，27(3),16-18文摘研究了羅漢果皂甙提取物的分離、純化工藝及對體外自由基的清除作用.結(jié)果表明①選用大孔樹脂H可較好地分離純化羅漢果皂甙，所制備的羅漢果皂甙提取物皂甙含量比分離前提高了32.90%.②羅漢果皂甙V的高效液相制備條件為制備柱Shim-PackPREP-ODS(0.25mX20.0V)柱,流動相20.5%乙腈，流速8.OmL/min.③羅漢果皂甙提取物具有清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的作用，其中羅漢果皂甙V具有很強的清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的活性,表明羅漢果中主要的皂甙成分-羅漢果皂甙V是其主要的抗氧化活性成分。題名羅漢果皂甙提取物對l型糖尿病小鼠細胞免疫功能的影響作者陳維軍[l]宋方方[2]劉烈剛[2]戚向陽[l]謝筆鈞[l]宋云飛[3]機構(gòu)[l]華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，[2]華中科技大學同濟醫(yī)學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，[3]桂林萊茵生物制品有限公司刊名營養(yǎng)學報.2006,28(3).-221-22文摘目的探討羅漢果皂甙提取物(mogrosideextract,MG)對l型糖尿病(type1diabetesmellitus，TIDM)小鼠脾臟淋巴細胞亞群及細胞因子表達的影響。方法給予Balb/c小鼠腹腔注射200mg/kgbw四氧嘧啶造模(TIDM)。成模后按血糖隨機分為，糖尿病對照組，低、高劑量MG治療組(150、300mg/kgbw);正常小鼠也按血糖隨機分為正常對照組以及低、高劑量MG組。連續(xù)灌胃30d，實驗結(jié)束時測小鼠血糖水平，流式細胞儀檢測脾臟淋巴細胞CD4、CD8亞群以及細胞因子IFN-Y，TNF—a和IL-4的表達，并觀察胰腺組織學變化。結(jié)果與正常對照組相比，TI函小鼠血糖顯著升高，脾臟CD8—+淋巴細胞數(shù)目顯著增加，CD4/CD8比值降低；IFN—Y、TNF—a的表達水平升高。MG尤其是低劑量組能降低血糖，改善胰腺的病變程度以及下調(diào)IFN—Y、TNF—ci的表達水平，增加TIDM小鼠脾臟CD4"+淋巴細胞數(shù)目，使CD4/CD8比值恢復正常，此外，還可顯著增加正常小鼠和TIDM小鼠脾臟淋巴細胞IL-4的表達水平，但對正常小鼠其它各項指標無明顯影響。結(jié)論MG能通過免疫調(diào)節(jié)機制對TIDM小鼠脾臟淋巴細胞的抗原表達進行調(diào)控，拮抗TIDM時出現(xiàn)的細胞免疫功能失衡，進而對TIDM起到一定的治療作用。題名羅漢果皂甙清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化作用的研究作者戚向陽[l]陳維軍[l]張俐勤[1，2]單夏鋒[3]宋云飛[4]機構(gòu)[l]華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，[2]浙江嘉興職業(yè)技術(shù)學院生物工程系，[3]中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，[4]桂林萊茵生物制品有限公司，刊名中國農(nóng)業(yè)科學.2006,39(2),382-388文摘目的研究羅漢果皂甙提取物及羅漢果皂甙V的體外抗氧化活性。方法采用D-脫氧核糖法、抗超氧陰離子試劑盒法及比色法分析羅漢果皂甙清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化的效果。結(jié)果(1)羅漢果皂甙提取物(MC)均能有效地清除自由基，可抑制大鼠肝組織的脂質(zhì)過氧化，對Fe2+和HA誘導的肝組織過氧化損傷具有保護作用，能減少紅細胞溶血的發(fā)生。(2)羅漢果皂甙V清除羥基自由基的效果與MC相當，但對02—的清除作用優(yōu)于MC。結(jié)論羅漢果皂甙提取物具有抗氧化活性，羅漢果皂甙V是提取物中主要的抗氧化活性成分。題名羅漢果皂苷提取物對糖尿病小鼠血糖、血脂及抗氧化作用的影響作者張俐勤[1，2]戚向陽[l]陳維軍[3]宋云飛[4]機構(gòu)[l]華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，[2]嘉興職業(yè)技術(shù)學院生物工程系，[3]中化寧波進出口公司，[4]桂林萊茵生物制品有限公司，刊名中國藥理學通報.2006，22(2),237-240文摘目的探討羅漢果皂苷提取物對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的調(diào)節(jié)作用及其作用機制。方法分別以50，100，300，500mgkg—-lbw劑量的羅漢果皂苷提取物連續(xù)30d灌胃四氧嘧啶糖尿病小鼠，末次給藥后眼眶取血測定血糖、血脂指標；分離肝組織測定抗氧化指標。結(jié)果①100，300和500mgkg'-lbw劑量組可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖(P〈0.01〉，且以中劑量100mg'kg'-lbw的降糖作用最佳。②羅漢果皂苷提取物可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的TC、TG含量，提高HDL-C含量，有利于糖尿病小鼠血脂水平的恢復(P〈O.Ol或P〈0.05〉。③羅漢果皂苷提取物可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠肝臟的MDA含量，提高SOD、GSH-Px含量.表明羅漢果皂苷提取物可改善糖尿病小鼠的氧化應激水平(P〈O.Ol或P〈0.05〉。④在其最佳劑量(100mgkg—-lbw)，羅漢果皂苷提取物的降血糖，降血脂及其抗氧化效果同消渴丸相當(P)0.01)。結(jié)論羅漢果皂苷提取物對糖尿病小鼠有明顯的治療作用，其降糖機制可能與提高糖尿病小鼠抗氧化能力及改善血脂水平有關(guān)。題名羅漢果甜苷的止咳祛痰作用研究作者陳瑤[l]范小兵[l]王永祥[2]杭曉敏[l]機構(gòu)[l]上海交大昂立股份有限公司，[2]上海交通大學藥學院，刊名中國食品添加劑.2006(1),41-43,59文摘目的羅漢果甜苷的安全和功能性研究。方法采用急性毒性實驗，鏈脲佐菌素導致小鼠糖尿病模型、氨水致咳實驗以及酚紅刺激氣管分泌實驗，觀察羅漢果甜苷的毒性，以及對小鼠血糖、咳嗽和氣管分泌物的影響。結(jié)果羅漢果甜苷的口服劑量大于15g/kg;對正常小鼠和糖尿病小鼠的血糖沒有顯著性影響；羅漢果甜苷可以顯著降低小鼠的咳嗽次數(shù)，增加氣管分泌物的量。結(jié)論羅漢果甜苷屬于無毒級物質(zhì)，服用安全，具有止咳祛痰的作用。題名羅漢果提取液對自由基的清除作用作者郝桂霞機構(gòu)韓山師范學院化學系，刊名江西化工.2005(4).-89-90文摘以鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超氧自由基(02'-)，F(xiàn)enton反應產(chǎn)生羥自由基('0H)，用分光光度法測定羅漢果提取物對02—-和'OH的清除作用。結(jié)果表明，羅漢果提取物對02'-和"'0H均有顯著清除作用。題名羅漢果保肝活性部位的研究作者王勤李愛媛等機構(gòu)廣西中醫(yī)學院中草藥研究室，刊名中藥藥理與臨床.1998,14(6),31-關(guān)鍵詞羅漢果保肝作用免疫功能活性部位文摘羅漢果水提醇沉物及其經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后的水液部份對CCl4所致小鼠急性肝損傷有顯著保護作用。8題名清肺羅漢果糖漿藥效學實驗研究作者韋奇志周智劉廷快陳邦樹游伯翔機構(gòu)廣西壯族自治區(qū)藥品檢驗所，刊名中國實驗方劑學雜志.2004，10(2).-51-5文摘目的觀察清肺羅漢果糖漿的止咳、化痰、抗炎作用及對免疫功能的影響。方法采用各種動物模型及免疫實驗，觀察清肺羅漢果糖漿的藥效。結(jié)果清肺羅漢果糖漿原藥材浸膏灌胃給藥對小鼠氨水引咳及二氧化硫引咳均有一定的止咳作用.有提高小鼠氣管分泌功能及加快家鴿氣管纖毛運動的作用，對小鼠醋酸所致腹膜炎性滲出有一定的抑制作用，對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能有一定的增強作用。結(jié)論清肺羅漢果糖漿具有一定的止咳、化痰、抗炎及提高免疫功能的作用。9題名羅漢果甜苷的生物活性研究作者王霆[l]黃志江[2]機構(gòu)[l]中國藥科大學藥理教研室[2]廣西師范大學生物系刊名中草藥.1999，30(12).-914-91文摘報道了羅漢果Siraitiagrosvenorii(Swingle)C.jefferyexLuetZ.Y.Zhang提取物羅漢果甜苷(mogi"osides，Mog)的祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘等藥理作用。結(jié)果表明Mog能增加小鼠氣管酚紅的分泌量，抑制氨水誘發(fā)的小鼠咳嗽，促進青蛙食道粘液移動，但并不影響枸櫞酸誘發(fā)的豚鼠哮喘。提示Mog有化炎鎮(zhèn)咳作用，是羅漢果的有效活性成分。10題名羅漢果的藥理作用研究作者王勤李愛媛機構(gòu)廣西中醫(yī)學院中草藥研究室刊名中國中藥雜志.1999,24(7).-425-428文摘目的探討羅漢果水提取物(MG)的藥理作用。方法每項藥理作用用12種文獻介紹的方法進行實驗研究。結(jié)果MG對濃氨水或二氧化硫誘發(fā)的小鼠咳嗽均有明顯抑制作用，可增加小鼠氣管酚紅排泌量和大鼠氣管排痰量，使正常小鼠或便秘小鼠的排便粒數(shù)明顯增加，降低四氯化碳或硫代乙酰胺肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，增強氫化可的松損傷小鼠的單核細胞吞噬功能。結(jié)論提示MG有止咳祛痰、涫下、保肝和增強免疫功能等藥理作用。從上述公開文獻了解到，羅漢果及其提取物羅漢果甜苷不僅具有止渴生律、消熱解暑、止咳化痰、涼血潤肺的作用，還能夠降血糖、保肝、增強免疫功能、抑制變鏈菌致齲、抗氧化、改善血脂等，還可以起到抑癌作用。所以預料不久的將來，羅漢果及其提取物可以制備成止咳、降糖、保肝、抗癌的藥物，更好地為我們?nèi)祟惙?。但是我們所見公開文獻除了將羅漢果制成止咳糖漿以外，還沒有制成其它制劑，用于治療高血糖、高血脂或保肝等癥狀的內(nèi)容。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供以羅漢果提取物進行精制后，采用最有效的化合物制備成具有保肝作用的制劑，為羅漢果的應用開辟一條新路。本發(fā)明羅漢果提取物的提取精制方法目前已經(jīng)有大量文獻記載，一般采用水提取、吸附樹脂分離、洗脫、減壓濃縮、脫色、干燥后得到純度較高的羅漢果甜苷，甜苷的主要成分是葫蘆烷形四環(huán)三萜類化合物。本發(fā)明的羅漢果提取物可以采用上述方法制得；也可以采用桂林萊茵生物制品有限公司申請的"一種從羅漢果中提取羅漢果甜甙的方法"，申請?zhí)?3117430.2該方法是以鮮羅漢果為原料，以水為提取溶媒，采用微濾、超濾、納濾為主要提取工藝。本發(fā)明的要點是將羅漢果提取物制成具有保肝作用的制劑，并進行藥理學試驗。本發(fā)明所述的羅漢果保肝制劑可以制成顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液、滴丸劑、糖漿劑，其中片劑可以制成普通片劑、薄膜包衣片；其中膠囊劑可以制成硬膠囊、軟膠囊、長效膠囊等劑型。以下分別敘述各種劑型的生產(chǎn)方法1、顆粒劑，取重量份100份的羅漢果提取的精制物，加入成型劑100500重量份，混合均勻，濕法制?；蚋煞ㄖ屏?。所述的成型劑，為聚乳糖和糊精中的至少一種，總量為100500重量份。2、片劑，取重量份100份的羅漢果提取的精制物，加入輔料100500重量份，混合，在壓片機上壓片，然后用包衣粉包衣，得到羅漢果保肝片劑。所述的輔料為乳糖或預膠化淀粉、硫酸鈣或碳酸鈣和微晶纖維素，其中乳糖或預膠化淀粉占輔料總重量的20-30%，硫酸鈣或碳酸鈣占輔料總重量的60-70%，微晶纖維素占輔料總重量的10%。這些輔料的作用如下乳糖改善了其可壓性、流動性，不改變其崩解性，制成的片劑硬度、崩解性都較好，釋藥速度快，有利于提高生物利用度。微晶纖維素具有良好的可壓性，且兼具粘合、助流、崩解等作用，對主藥有較大的容納性，同時有強烈的吸水膨脹作用，能使水分快速進入片劑內(nèi)部、使片劑內(nèi)部和外部都迅速崩解，是較為優(yōu)良的稀釋劑。硫酸鈣或碳酸鈣作填充劑時，不僅使顆粒成型性改觀，也利于中藥片的崩解。3、硬膠囊，取重量份100份的羅漢果提取的精制物，加入輔料100500重量份，混合，填充于硬膠囊中，得到羅漢果保肝硬膠囊。所述的輔料為稀釋劑、助流劑和崩解劑，其中稀釋劑選用淀粉、乳糖；助流劑選用微粉硅膠、滑石粉；崩解劑選用干淀粉、微晶纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯垸酮，羥乙基纖維素和羥丙基纖維素等。其中稀釋劑、助流劑、崩解劑各分別占全部輔料重量的70%、25%、5%左右?？梢愿鶕?jù)需要調(diào)整。4.滴丸劑取重量份1份的羅漢果提取的精制物，加入成型劑2-20重量份，混合均勻，加熱使融熔，置于滴丸機貯液槽，滴入冷凝液中，滴丸。所述的成型劑為PEG4000和PEG6000中的任一種，或兩者的混合物；冷凝液為液體石蠟、二甲基硅油中的一種或兩者的混合物。5.口服液取重量份1份的羅漢果提取的精制物，加入0.02-0.2重量份防腐劑，加入4-50重量份的輔料，溶于20-200重量份的溶劑中，混合均勾，灌裝于10ml的容器中，封蓋。所述防腐劑為苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、對羥基苯甲酸乙脂/對羥基苯甲酸丁脂中的一種或混合物；所述的輔料為蔗糖；所述溶劑為蒸熘水或純凈水。6.糖漿劑取重量份1份的羅漢果提取的精制物，加入O.02-0.2重量份防腐劑，加入12-120重量份的輔料，溶于20-200重量份的溶劑中，混合均勻，灌裝。所述防腐劑為苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、對羥基苯甲酸乙脂/對羥基苯甲酸丁脂中的一種或混合物；所述的輔料為蔗糖；所述溶劑為蒸餾水或純凈水。7.緩釋膠囊，取重量份100份的羅漢果提取的精制物，加入輔料100500重量份，混合，加入總重量0.5—5%的鯨蠟或其它阻滯劑包衣，分別制成2、4、6、8小時緩釋小丸，每種小丸用不同色澤區(qū)分，混合均勻后裝入空膠囊中，包裝成盒或熱壓成鋁塑板得到成品緩釋膠囊。所用的輔料與上述硬膠囊的相同。8.軟膠囊，取重量份100份的羅漢果提取的精制物，加入輔料植物油、蜂蠟按1:1:0.02制成混懸物，以明膠甘油水為1:(0.40.6):0.9的比例制備膠皮，然后將混懸物灌裝壓制成軟膠囊，25'C以下定型，用乙醇洗去軟膠囊外表油層，于25'C以下干燥，取出即得軟膠囊產(chǎn)品。本發(fā)明的羅漢果提取物制備保肝制劑的機理雖然上述
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提到了一些，但是還不全面，這里詳細論述肝臟是人體最大的腺體，從胃腸道吸收的物質(zhì)幾乎均要進入肝臟，在肝臟內(nèi)進行合成，分解，轉(zhuǎn)化，貯存。各種有害因子和物質(zhì)(如病毒，藥物，乙醇，缺氧，免疫因素)等，都可損傷肝臟，造成細胞壞死和凋亡，炎癥，纖維化等病理變化，最終導致各種肝臟疾病。肝細胞損傷是各種類型肝病的共同病理基礎(chǔ)，治療和糾正肝細胞損傷是各型肝病治療的主要措施之一。肝損傷動物試驗模型的復制是進行防治肝損傷藥物研究的前提，目前肝損傷動物試驗模型的復制主要有生物性，免疫性，化學性等方法。生物學方法要求試驗條件高且費用昂貴，故限制了其應用，僅用于病原體及其致病機理的高層次研究，近年來有用鴨乙肝病毒感染麻鴨，北京鴨而復制鴨乙肝動物模型的大量報告，但在病毒性肝損傷病理改變不甚典型，主要應用其病毒血癥進行抗病毒研究。免疫方法是造成免疫性肝損傷，主要用于通過免疫機制而抗肝損傷的藥物研究。肝炎后肝纖維化、肝硬化及癌變的機制雖然復雜，但最主要的原因是嗜肝病毒的持續(xù)感染，故抗病毒治療是最主要的手段。HBV健康攜帶者的概念已不存在，新近的大量病理學證實HBV對肝臟的損害是隱匿、持續(xù)的，且是100%的。有相當一部分患者從來就肝功正常和無癥狀，但就診時已經(jīng)肝硬化甚至晚期了。同樣從循證醫(yī)學角度看，目前慢肝抗病毒治療的病例的篩選條件仍不盡合理。對非活動性肝炎和靜止期肝硬化因ALT/AS]"的持續(xù)正常而失與治療，導致惡化率上升。這是因為抗病毒治療的概念和篩選條件據(jù)有關(guān)統(tǒng)計資料顯示約有40%以上的慢性肝炎可發(fā)展為肝硬化、肝癌；肝硬化失代償期的5年生存率僅70%左右；肝癌已是當今發(fā)病率最高的致死性癌癥之一，且好發(fā)年齡在30—50歲之間。從現(xiàn)代循證醫(yī)學的觀點看，以往的思路與方法是失敗的。如何阻止慢性肝炎的病情惡化是臨床首先應該考慮的問題。中醫(yī)辨證更能體現(xiàn)個體化的原則，實踐已證明中醫(yī)的扶正祛邪具有增強免疫功能、抗病毒等作用；活血化瘀具有抗炎、抗肝纖維化等顯著療效。沒有理由拒絕或輕視中草藥的應用，只是需要加快步伐，需要更專業(yè)化更現(xiàn)代化的研究和應用?？梢灶A言解決我國的肝炎問題，還要靠我國的醫(yī)學科研成果和中醫(yī)藥的優(yōu)勢?；瘜W方法則是應用化學性肝毒物質(zhì)，如CCl4硫代乙酰胺，黃曲霉素等致肝損傷。CCl4是長期以來公認的復制肝損傷動物模型的化學物質(zhì)，許多研究均認為CC14復制的肝損傷可模擬病毒性肝損傷，其表現(xiàn)出來的癥狀，肝功能檢測指標，肝臟病理改變與病毒性肝炎具有相似性。雖然病因不同，但病理解剖，病理生理諸方面改變與病毒性肝炎接近。在我國衛(wèi)生部頒布的《中藥藥理試驗指導原則》中明確指定應用CClJf損傷動物模型進行保肝降酶新藥的藥理試驗。應用CCl4復制肝損傷動物模型條件要求低，技術(shù)易于掌握，可靠性強，重復性好，都是其他任何肝損傷動物模型無法比擬的。CCl4造成的肝損傷是典型的自由基損傷，CCl4進入體內(nèi)后，經(jīng)肝臟PA代謝裂解成三氯甲基(CCl3，)，通過氫吸附而攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的磷脂分子，引起膜脂質(zhì)過氧化，CC1^進而與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子進行公價結(jié)合，引起膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞,CCl3，還可抑制細胞膜上鈣泵的活性，使Ca2+內(nèi)流增加引起細胞中毒壞死。此外，CCl4所啟動的過氧化鏈中尚可啟動毒性更強的超氧離子(02—，)和羥自由基(-0H)，這些自由基和細胞結(jié)構(gòu)共價結(jié)合引起脂質(zhì)過氧化反應損傷肝細胞，其造成肝損傷的機理與以下因素有關(guān)(1)通過抑制肝細胞的RNA和漿膜蛋白的合成造成肝細胞破壞(2)肝細胞壞死與細胞外的鈣離子大量進入細胞內(nèi)有關(guān)。肝臟是含酶豐富的臟器，在肝內(nèi)的ALT主要分布于細胞漿內(nèi)，AST則主要分布于細胞漿和線粒體內(nèi)。在肝臟出現(xiàn)臟器組織損傷或破壞，壞死時，酶從細胞內(nèi)溢出進入血液，血中ALT,AST活性增高。肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶量約為血中含量的100倍，只要有％1的肝細胞壞死，便足以使血清中酶活力增加一倍。因此血清轉(zhuǎn)氨酶ALT，AST是測定肝細胞損害的敏感指標，血清轉(zhuǎn)氨酶升高在一定程度上反映了肝細胞的損害程度。本試驗結(jié)果顯示，Mog能顯著降低CC14肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平，這一結(jié)果與病理結(jié)果吻合，說明Mog對CC14肝損傷有保護作用。Mog對小鼠BCG+LPS免疫性肝損傷的保護作用由CCl4化學藥品引起的經(jīng)典肝損傷動物模型屬中毒性肝壞死范疇，與臨床上多數(shù)肝炎的免疫病理有很大區(qū)別，也不適用于有護肝作用的免疫調(diào)節(jié)劑或影響免疫系統(tǒng)的護肝藥的藥效評價。一般認為，肝內(nèi)免疫反映是引起病毒性肝損傷的重要機制之一，例如乙型肝炎的發(fā)病過程中，引起肝細胞損傷和破壞的直接因素是T細胞介導的細胞免疫反映。因此，以免疫學機制誘發(fā)的肝損傷模型的建立，為肝損傷的研究開辟了新的途徑，對研究病毒性肝炎的防治具有重要意義。這種模型的特點在于其病理機制主要由免疫導介，這與人類肝炎的免疫功能紊亂類似，早期文獻報道，小鼠注射丙酸桿菌或卡介苗若干天后，注射微量脂多糖，可導致嚴重的肝損傷。國內(nèi)學者在此基礎(chǔ)上創(chuàng)立了BCG加LPS誘導的小鼠免疫性肝損傷模型以模擬人類肝炎發(fā)病中部分免疫機制，并提出以下假說單核細胞，枯否細胞在致炎因子的作用下，向肝臟積聚并被致敏，這些致敏的枯否細胞在接觸LPS后，會釋放一些細胞毒性介質(zhì)，包括氧自由基，N0，TNF—A，IL-l等，從而造成肝細胞損傷，這種動物模型的特點是免疫損傷起主導作用。病理檢査顯示在注射LPS后肝臟呈充血，炎性細胞浸潤，點狀壞死，片狀壞死，帶狀壞死等病變。在正常情況下，體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，自由基參與機體的殺菌，抗炎作用及免疫反映過程。而在一些病理情況下，體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除不足，過度激活的自由基可通過與細胞內(nèi)成分以共價鍵結(jié)合或?qū)Σ伙柡椭舅岬闹|(zhì)過氧化，進攻多種生物大分子物質(zhì)，改變細胞生理代謝活動，使其結(jié)構(gòu)和功能受損，加重肝細胞的損傷。S0D是體內(nèi)清除自由基，抑制自由基反映的酶系之一，它能抑制黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化成黃嘌呤氧化酶，減少自由基的產(chǎn)生，減輕肝細胞損傷，SOD的活性降低則自由基清除不足。據(jù)報道，各類肝病患者SOD的活性明顯降低，且與肝臟病理損傷的嚴重程度呈正相關(guān)。在脂質(zhì)過氧化反應中，MDA是其分解的終產(chǎn)物之一，MDA被作為自由基產(chǎn)生的間接指標，能對膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴重損傷。在細胞膜中多富含不飽和脂肪酸，極易受自由基攻擊，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，反應的終產(chǎn)物MDA能進入膜磷脂的水相，和膜蛋白，膜磷脂上的NH2交聯(lián)形成Schiff堿，使細胞膜變硬，膜流動性降低，通透性增加，從而導致膜的功能損傷或喪失。因此SOD及MDA可反映出肝細胞損傷的程度和藥物對肝細胞的保護作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)BCG加LPS免疫性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶升高。說明有肝細胞病變；病理檢査亦證實模型組肝細胞出現(xiàn)胞漿嗜酸性變，胞核消失，呈點狀壞死和灶狀壞死，細胞間有大量炎性細胞浸潤，試驗還發(fā)現(xiàn)BCG加LPS免疫性肝損傷小鼠肝勻漿的脂質(zhì)過氧化物MAD水平明顯升高，SOD活性下降說明免疫性肝損傷與制止過氧化有關(guān)。Mog聯(lián)苯雙酯滴丸明顯降低BCG加LPS免疫性肝損傷小鼠血清ALT,AST水平；降低BCG加LPS免疫性肝損傷小鼠肝勻漿MDA水平，升高S0D水平，改善肝損傷小鼠病理學的改變，說明Mog對BCG加LPS免疫性肝損傷有保護作用，其機理可能與抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。Mog對CCl4大鼠慢性肝損傷的保護作用CCl4不僅可誘導急性肝損傷，使肝細胞變形壞死，炎細胞浸潤，而且通過慢性炎癥使纖維組織增生，出現(xiàn)肝纖維化。用少量CCh長時間誘導，導致慢性肝損傷，肝細胞反復出現(xiàn)變性壞死，炎細胞浸潤，肝組織細胞的過度或異常的纖維性結(jié)締組織增生，便可使肝小葉的結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，肝細胞的總數(shù)減少。出現(xiàn)明顯的脂肪變性，質(zhì)地變硬，表面顆粒狀或小結(jié)狀，CCl4致大鼠慢性肝損傷及肝纖維化是經(jīng)典的慢性肝損傷模型，具有簡便易行，造模成功率高，病變典型的優(yōu)點。被廣泛用于對肝損傷的研究。我們實驗研究采用2ml/kg(首次5ml/kg)體重背部皮下注射40XCCl4花生油溶液，每周兩次，連續(xù)八周，復制大鼠慢性肝損傷模型，實驗結(jié)果顯示該造模方法可行,CCl4模型組血清ALT,AST,TyP，HA，PIIINP水平明顯升高，ALB，TP含量降低。肝組織勻槳MDA含量升高，SOD,GSH-px含量下降，肉眼可見CC14模型組大鼠的肝臟表面粗糙，顏色為土黃色，病理檢査結(jié)果顯示模型組大鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞，并有較明顯的纖維隔形成，肝索排列混亂，肝細胞明顯腫脹變性，其中多為脂肪變，中央經(jīng)脈周圍有少量壞死的肝細胞，并伴有中性粒細胞，單核細胞等炎癥細胞浸潤。匯管區(qū)由于結(jié)締組織增生而變寬。說明我們用40XCCl4花生油溶液，每周兩次，連續(xù)八周，復制大鼠慢性肝損傷模型是成功的。正常機體及肝組織中存在秸抗清除氧自由基系統(tǒng)其一為SOD，過氧化氫酶，過氧化物酶，GSH-px，non-GSH-px等酶類；其二為VitE，GSH，VitC，硒等低分子物質(zhì)。當大量氧自由基合成時，上述物質(zhì)顯著下降。補充上述物質(zhì)及應用其他抗氧化損傷藥物是治療肝纖維化必要的，有效地手段之一。脂質(zhì)過氧化反應可以擴大自由基的連鎖放應，脂質(zhì)過氧化反應主要是由體內(nèi)各種自由基抽提不飽和脂肪酸中氫而起動；在不飽和脂肪酸過氧化時又產(chǎn)生R-，ROO-,ROOH。也就是說，可以使自由基數(shù)目以4n的幾何級數(shù)的速度增長，從而增強自由基的毒性脂質(zhì)過氧化反應能產(chǎn)生許多初級和次級代謝產(chǎn)物，MDA是其主要產(chǎn)物之一，MAD含量的測定可以反應機體內(nèi)氧化反應的程度；SOD可清除超氧陰離子自由基，降低MDA等的產(chǎn)生，保護細胞免受氧化損害；GSH-px在拮抗氧化性毒物中發(fā)揮重要作用，可通過氧化反應而降低毒物過氧化能力，從而抗氧化損傷。本試驗研究表明大鼠皮下注射CC14后，模型對照組的肝組織的GSH-px含量，SOD活性與正常組相比有顯著性降低，MDA含量與正常組相比有顯著性升高。說明GSH-px,SOD，MDA參與介導了CC14復合因素所導致的大鼠慢性肝損傷。Mog高，中，低計量組均能降低CC14復合因素所導致慢性肝損傷大鼠肝組織MDA含量和S0D活性白蛋白僅由肝細胞制造，白蛋白一旦在肝細胞合成后，便由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移向光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，再分泌至肝竇。體內(nèi)40%在血液中，其余分布在各器官組織和組織液中。肝損害時，白蛋白合成，細胞內(nèi)運輸和釋放發(fā)生障礙，引起血清白蛋白減少。但由于白蛋白的半衰期較長(20天)，白蛋白的降低常于一周后才能顯示出來,故不是反因應急性肝病患者白蛋白代謝的良好指標，急性肝炎患者正?；蜉p度減少，但在病程較長的重癥肝炎時可明顯降低，且減少程度與嚴重程度成正比，故血清蛋白的濃度可作為肝炎嚴重程度的判斷依據(jù)，測定血清蛋白的濃度可作為肝病患者愈后的良好指標，因此我們把白蛋白納入檢測指標。纖維增生是慢性肝損傷階段的重要病理特點，尋找特意敏感的血清學肝纖維化檢測指標，阻斷或延緩肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，并逆轉(zhuǎn)肝纖維化是目前臨床急待解決的問題，進來有報道有關(guān)血清學指標與肝組織病理和肝纖維化分期之間的關(guān)系，認為肝纖維化，肝硬化的主要發(fā)生機理是肝細胞外基質(zhì)(ExtracelluarMatrix,ECM)的過渡增多和異常沉積，ECM主要由膠原蛋白，糖蛋白，蛋白多糖和彈性纖維組成。目前對于肝纖維化常用的指標仍以病理組織學檢查和反應膠原代謝的指標為主，血清III型前膠原氨基端肽(PIIINP)含量與肝纖維化病變程度呈密切相關(guān)，反應肝纖維合成狀，III型前膠原氨基端肽(PIIINP)是III前膠原分泌至肝細胞外沉積前，經(jīng)氨基端肽酶裂解所產(chǎn)生的氨基端多肽，在此過程中PIIINP與III型前膠原呈等分子濃度，并進入血液循環(huán)，因此，血清PIIINP水平可以作為檢測III型前膠原合成情況的指標。PIIINP經(jīng)層析分為四部分50KD的氨基端前肽，lOKD的Coll(為前者的降解部分)，另兩部分為高分子量的前肽二聚體。隨著纖維化的發(fā)展，主要是50KD的PIIINP水平增高，且與肝纖維化呈定量的顯著關(guān)。國外(日本，德國，法國等)80年代以來一直采用PIIINP水平作為判定肝纖維化的主要指標。透明質(zhì)酸(HA)由間質(zhì)細胞合成，參與形成蛋白聚糖多聚體是結(jié)締組織基制的重要成分，其升高幅度與肝組織纖維化改變呈正相關(guān)，被認為是反映肝活動性肝纖維化的定量標準，肝硬變患者血清及肝組織HA含量明顯升高。孫自勤等發(fā)現(xiàn)CC14誘導的實驗性大鼠肝纖維化血清及肝組織HA含量顯著高于正常對照組。阻止和延緩HA增高，對肝纖維化有一定的逆轉(zhuǎn)作用。羥脯氨酸(HyP)是原膠蛋白的主要成分，其他蛋白幾乎不含HyP，在纖維化過程中，肝HyP含量隨著膠原的消漲而相應變化，故肝HyP含量可作為評估肝膠原含量和肝纖維化程度的可靠指標。研究發(fā)現(xiàn)，對纖維化大鼠肝HyP含量的影響在肝纖維化尚未形成的早期階段即開始應用，具有良好的抗肝膠原增生的效果，此時即使損害肝細胞和造成肝纖維化的因素依然存在，早期應用仍可望延緩肝纖維化膠原的產(chǎn)生和發(fā)展進程。我們的實驗顯示采用2ml/kg(首次5ml/kg)體重背部皮下注射40%0:14花生油溶液，每周兩次，連續(xù)八周，復制大鼠慢性肝損傷模型。到實驗結(jié)束大鼠已經(jīng)有輕度的肝纖維化，模型組血清TyP，HA，PIIIP較正常組明顯升高，陽性對照組，Mog各計量組血清較模型組有不同程度降低，說明Mog有一定的抗慢性肝損傷和抗肝纖維化作用。TGFel由于具有影響肝纖維化進程的突出作用而納入我們的試驗研究。已經(jīng)明確TGF在正常情況下與其他細胞因子一起處于一種網(wǎng)絡平衡狀態(tài)，共同維持肝臟內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。當肝臟受到損傷時，肝內(nèi)間質(zhì)細胞就能產(chǎn)生活性TGFei后者在炎癥環(huán)境中的各種酶和細胞因子激活形成活性TGFP1,從而加速肝纖維化產(chǎn)生?？罐譚GFP1對治療肝纖維化有著顯著意義。TGFPl誘導肝纖維化的機制包括以下幾點誘導肝細胞凋亡，抑制肝細胞再生，并影響其功能TGFP1的重要生物活性之一就是抑制肝細胞再生。TGFP1通過抑制肝細胞的DNA的合成而誘導肝細胞凋亡，并能抑制間質(zhì)細胞分泌肝細胞生長因子，(h印atocytegrowthfactor,HF)及抑制HGF對細胞有絲分裂的促進作用，從而抑制肝細胞的分裂和增值。此外，還有證據(jù)表明受損的肝細胞能產(chǎn)生TGFP1，從而使肝細胞損傷不斷加重，啟動了肝纖維化的第一步。(2)活化貯脂細胞在肝纖維化的過程中，貯脂細胞是細胞外基質(zhì)(extracelluarmatrix,ECM)產(chǎn)生的主要細胞。TGFP1是貯脂細胞和纖維母細胞的生長因子，在TGF的作用下，貯脂細胞被激活或轉(zhuǎn)化為纖維母細胞。TGFP1能剌激這些細胞向損傷部位遷移，增值和產(chǎn)生膠原，并自分泌TGFei，使它們成為肝纖維化后期TGFP1的主要來源，導致ECM循環(huán)到不斷產(chǎn)生，形成肝纖維化的基礎(chǔ)條件。增加ECM合成TGF通過調(diào)控ECM生成細胞的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平，促進各種ECM成分表達，包括粘蛋白膠原蛋白，蛋白多糖等。在貯脂細胞和纖維母細胞中，以增加I，III型膠原mRNA轉(zhuǎn)錄為主，同時亦明顯刺激了蛋白多糖基因表達。在肝內(nèi)皮細胞中則以增加纖維連接蛋白尤為明顯。且TGF01本身有促進毛細血管生成的作用，使肝竇出現(xiàn)毛細血管變化，形成纖維化最早期的組織病理學改變。TGFP1引起細胞自分泌TGF—P1的正反饋機制使得它在加強細胞合成膠原的作用更加明顯。ECM的大量產(chǎn)生使肝纖維化程度不斷加重。抑制ECM降解ECM的代謝是通過多種水解酶實現(xiàn)的，其中主要包括金屬蛋白酶，膠原酶，名膠酶等。TGF通過調(diào)節(jié)這些酶的產(chǎn)生活性來參與ECM的代謝。TGF01能在轉(zhuǎn)錄水平上促進a2巨球蛋白表達，后者與金屬蛋白酶結(jié)合即可抑制金屬蛋白酶的功能;TGFP1還能增加蛋白酶抑制劑等，從而拮抗ECM水解酶的作用，引起ECM分解減少沉積增加，刺激結(jié)締組織形成。此外，TGFei還可增加明膠酶，減少膠原酶，明膠酶促進DISSE間隙IV型膠原分解，I型膠原可因膠原酶減少而增多，并取代IV型膠原，使肝竇毛細血管變化，加速膠原纖維的發(fā)展。調(diào)節(jié)ECM受體的表達TGFei能調(diào)節(jié)ECM受體在肝臟的表達，增加了細胞與基質(zhì)的黏附，有利于ECM在肝內(nèi)沉積，促進肝纖維化乃至肝硬化形成。由此可見，TGFP1的高表達，使ECM合成增多，降解減少，造成ECM合成與降解失衡，從而促進肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，在肝纖維化中發(fā)揮重要作用。我們的試驗發(fā)現(xiàn)Mog對CC14慢性肝損傷大鼠肝組織TGFei的高表達有抑制作用，說明Mog抗肝纖維化與抑制肝組織TGFPl的表達有關(guān)。所以本發(fā)明人認為-Mog能降低CC14所致急性肝損傷小鼠和BCG+LPS所致免疫性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶，提示Mog對CCl4所致急性肝損傷小鼠和BCG+LPS所致免疫性肝損傷小鼠具有顯著保護作用；Mog能降低BCG+LPS所致免疫性肝損傷小鼠肝勻槳升高的MDA，提高S0D的活性，說明其保肝作用與抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。Mog對CCl,所致大鼠慢性肝損傷有保護作用，并一定的抗肝纖維化作用，其機制可能是-促蛋白合成，有助于肝細胞的再生與修復；抗脂質(zhì)過氧化，能升高肝臟GSH-px和S0D含量，降低MDA含量保護肝細胞免受損害調(diào)節(jié)細胞因子(TGFP1)表達，減輕細胞因子對肝臟的損害，阻斷肝纖維化進程。肝炎是一種常見病及多發(fā)病，從植物中尋找抗肝炎藥物日益受到國內(nèi)外學者的重視，Mog屬于葫蘆垸形四環(huán)三萜化合物，現(xiàn)有的研究認為葫蘆烷形四環(huán)三萜化合物多具有保肝和抗癌活性。我們的實驗也證明了Mog對急性，免疫性，慢性肝損傷有保護作用，對羅漢果的化學研究發(fā)現(xiàn)羅漢果根和葉等部位都含有與羅葫蘆垸形四環(huán)三萜，因此本發(fā)明對提高羅漢果的綜合利用有重要作用，今后應該在細胞，分子水平上對Mog保肝作用的機制進行深入研究，進一步闡明其保肝機制，深入研究Mog對肝臟的保護作用渴望將其開發(fā)為新的治療肝損傷的藥物。本發(fā)明重要的一點還在于，將羅漢果提取的羅葫蘆烷形四環(huán)三萜類化合物做成保肝制劑，首先依賴該制劑的進一步實驗論證，還要確定羅漢果制成保肝制劑的準確含量以及輔料的選擇，因為無論是保健品或者中藥制劑，制劑的準確含量以及輔料的選擇對制劑的成型合保存都是比較重要的，需要發(fā)明人付出創(chuàng)造性的勞動。具體實施方式實施例l先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取物用D101型大孔樹脂柱或者其它樹脂分離，用去離子水和乙醇分別洗脫至無色，收集其乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解過濾，濾液用D280型大孔樹脂柱脫色，減壓濃縮，干燥后即可分別得到純度在80%以上的羅漢果甜苷，取重量份100份的羅漢果提取的精制物(羅漢果甜苷)，加入成型劑聚乳糖或糊精100500重量份，混合均勻，濕法制?；蚋煞ㄖ屏＃频昧_漢果保肝顆粒劑。實施例2先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取物用D101型大孔樹脂柱或者其它樹脂分離，用去離子水和乙醇分別洗脫至無色，收集其乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解過濾，濾液用D280型大孔樹脂柱脫色，減壓濃縮，干燥后即可分別得到純度在80%以上的羅漢果甜苷，取重量份100公斤的羅漢果提取的精制物(羅漢果甜苷)，加入乳糖或預膠化淀粉50公斤，硫酸鈣或碳酸鈣150公斤，和微晶纖維素20公斤，混合，在壓片機上壓片，然后用包衣粉包衣，得到羅漢果保肝片劑。實施例3先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取物用D101型大孔樹脂柱或者其它樹脂分離，用去離子水和乙醇分別洗脫至無色，收集其乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解過濾，濾液用D280型大孔樹脂柱脫色，減壓濃縮，干燥后即可分別得到純度在80%以上的羅漢果甜苷，取重量份100公斤的羅漢果提取的精制物(羅漢果甜苷)，加入輔料100500公斤，混合，填充于硬膠囊中，得到羅漢果保肝硬膠囊。所述的輔料為稀釋劑、助流劑和崩解劑，其中稀釋劑選用淀粉、乳糖；助流劑選用微粉硅膠、滑石粉或微晶纖維素；崩解劑選用干淀粉、微晶纖維素、預膠化淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯垸酮和羥丙基纖維素等。其中稀釋劑、助流劑和崩解劑占全部輔料重量的70%、25%和5%左右。可以根據(jù)具體情況調(diào)整。實施例4先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取物用D101型大孔樹脂柱或者其它樹脂分離，用去離子水和乙醇分別洗脫至無色，收集其乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解過濾，濾液用D280型大孔樹脂柱脫色，減壓濃縮，干燥后即可分別得到純度在80%以上的羅漢果甜苷，取重量份1份的羅漢果提取的精制物(羅漢果甜苷)，加入成型劑2-20重量份，混合均勻，加熱使融熔，置于滴丸機貯液槽，滴入冷凝液中，得到羅漢果保肝滴丸。所述的成型劑為PEG4000和PEG6000中的任一種，或兩者的混合物；冷凝液為液體石蠟、二甲基硅油中的一種或兩者的混合物。實施例5先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取物用D101型大孔樹脂柱或者其它樹脂分離，用去離子水和乙醇分別洗脫至無色，收集其乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解過濾，濾液用D280型大孔樹脂柱脫色，減壓濃縮，干燥后即可分別得到純度在80%以上的羅漢果甜苷，取重量份1份的羅漢果提取的精制物(羅漢果甜苷)，加入O.02-0.2重量份防腐劑，加入4-50重量份的輔料，溶于20-200重量份的溶劑中，混合均勻，灌裝于10ml的容器中，封蓋，得到羅漢果保肝口服液。所述防腐劑為苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、對羥基苯甲酸乙脂/對羥基苯甲酸丁脂中的一種或混合物；所述的輔料為蔗糖；所述溶劑為蒸餾水或純凈水。實施例6先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取物用D101型大孔樹脂柱或者其它樹脂分離，用去離子水和乙醇分別洗脫至無色，收集其乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解過濾，濾液用D280型大孔樹脂柱脫色，減壓濃縮，干燥后即可分別得到純度在80%以上的羅漢果甜苷，取重量份1份的羅漢果提取的精制物(羅漢果甜苷)，加入O.02-0.2重量份防腐劑，加入12-120重量份的輔料，溶于20-200重量份的溶劑中，混合均勻，灌裝，得到羅漢果保肝糖漿劑。所述防腐劑為苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、對羥基苯甲酸乙脂/對羥基苯甲酸丁脂中的一種或混合物；所述的輔料為蔗糖；所述溶劑為蒸餾水或純凈水。實施例7先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取物用D101型大孔樹脂柱或者其它樹脂分離，用去離子水和乙醇分別洗脫至無色，收集其乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解過濾，濾液用D280型大孔樹脂柱脫色，減壓濃縮，干燥后即可分別得到純度在80%以上的羅漢果甜苷，取重量份100公斤的羅漢果提取的精制物(羅漢果甜苷)，加入稀釋劑、助流劑、崩解劑和表面活性劑，其中稀釋劑選用淀粉、乳糖；助流劑選用微粉硅膠、滑石粉；崩解劑選用干淀粉、微晶纖維素、預膠化淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮和羥乙基纖維素，羥丙基纖維素等。其中稀釋劑、助流劑和崩解劑占全部輔料重量的25%左右。取稀釋劑、助流劑、崩解劑混合羅漢果提取的精制物，加入總重量0.5—5%的鯨蠟或其它阻滯劑包衣，分別制成2、4、6、8小時緩釋小丸，每種小丸用不同色澤區(qū)分，混合均勻后裝入空膠囊中，包裝成盒或熱壓成鋁塑板，得到羅漢果保肝緩釋膠囊。實施例8先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取物用D101型大孔樹脂柱或者其它樹脂分離，用去離子水和乙醇分別洗脫至無色，收集其乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解過濾，濾液用D280型大孔樹脂柱脫色，減壓濃縮，干燥后即可分別得到純度在80%以上的羅漢果甜苷，取重量份100公斤的羅漢果提取的精制物(羅漢果甜苷)，加入輔料植物油、蜂蠟按1:1:0.02制成混懸物，以明膠甘油水為1:0.40.6:0.9的比例制備膠皮，然后將混懸物灌裝壓制成軟膠囊，25'C以下定型，用乙醇洗去軟膠囊外表油層，于25'C以下干燥，取出即得到羅漢果保肝軟膠囊產(chǎn)品。本發(fā)明的藥效學試驗(未公開過的試驗)將本發(fā)明實施例得到的產(chǎn)品進行動物保肝試驗，結(jié)果如下刖目慢性肝炎是我國的常見病和多發(fā)病，又是導致肝硬化的基礎(chǔ)疾病，目前尚無有效而理想的治療藥物，探索其治療新方法有重要意義。Mog是羅漢果中的主要甜味成分，屬于葫蘆烷四環(huán)三蔽類化合物。文獻報道[l，2，3，4，5]該類化合物有多種生物活性，有保肝、抗炎、提高機體免疫能力、抗化學致癌和抗腫瘤作用，以及抗肝纖維化，抗細胞凋亡的作用。本實驗旨在觀察其對CC14造成的大鼠慢性肝損傷的保護作用，并初步探討其作用機理。1材料1.1藥品及試劑Mog:桂林興達制藥廠，批號041022;聯(lián)苯雙酯滴丸北京協(xié)和制藥廠，批號04060109。CC14(分析純)上海長江化工廠生產(chǎn)，批號8807107;ALT、AST測定試劑盒南京建成生物工程研究所，批號20050406;TP、ALB測定試劑盒南京建成生物工程研究所，批號20050410;S0D、MDA測定試劑盒南京建成生物工程研究所，批號20050708;GSH-px測定試劑盒南京建成生物工程研究所，批號.*20040510。1.2動物清潔級Wistar大鼠，雌雄兼用，體重200土20g，廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號桂(動)許字2000第001號。2方法2.1動物分組及處理.-大鼠隨機分為6組正常對照組、模型對照組、陽性對照組、Mog高、中、低劑量組。實驗期間除正常對照組外，各組大鼠按3ml/kg(首次5ml/kg)體重背部皮下注射4(mCCl4花生油溶液，每周兩次，連續(xù)8周，造成大鼠慢性肝損傷。每周稱重兩次，并依次調(diào)整藥物和CCl4的劑量。正常對照組、模型對照組灌胃去離子水；Mog高、中、低劑量組分別灌胃Mog0.8g/kg、0.4g/kg、0.2g/kg，陽性對照組灌胃O.lg/kg聯(lián)苯雙酯滴丸，給藥兩為10ml/kg。2.2標本留取末次給藥24h后，蛙板固定大鼠，股動脈放血處死，取血前12h禁食不禁水。分離血清，低溫保存；取同一部位肝組織制成10%的勻漿；取肝大葉10%甲醛固定。2.3指標檢測所有檢測均用美國Agilent8543紫外可見分光光度計檢測；檢測均按試劑盒說明進行。2.4肝組織病理學檢察石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。按以下標準進行評分(-)l分:肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞整齊，無異常。(+)2分:肝細胞局限性變性，輕微纖維化，肝細胞灶狀壞死，有少量炎細胞浸潤。(++)3分:肝細胞彌漫性變性、壞死、纖維化，肝小葉結(jié)構(gòu)改變，肝細胞局限性壞死，有較多炎細胞浸潤。(+++)4分肝細胞彌漫性變性、壞死，纖維化較重，肝小葉結(jié)構(gòu)嚴重破壞，大量炎細胞浸潤。2.5統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以^is表示，兩組間均數(shù)差異用t檢驗。3結(jié)果3.1Mog對大鼠CC14慢性肝損傷血清中ALT、AST的影響CCh慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST水平明顯升高。模型對照組大鼠血清血清ALT、AST水平較正常對照組明顯升高，P〈0.01。與模型組比較，陽性對照組、Mog高、中、低劑量組四個用藥組均能顯著降低CCl4慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST水平，P〈0.01或P〈0.05。結(jié)果見表l表lMog對大鼠CCV漫性肝損傷血清中ALT、AST的影響(7±,,n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*與模型對照組比較P<0.05;林與模型對照組比較P<0.013.2Mog對大鼠CCl4慢性肝損傷血清中ALB、TP、A/G的影響與正常對照組比較，模型對照組血清ALB、TP含量顯著降低，A/G值也顯著降低，P〈0.01。陽性對照組血清ALB、TP含量、A/G值有顯著升高作用，P〈0.01。與模型對照組比較Mog各劑量組對ALB、TP含量有明顯的升高作用P<0.01或P<0.05。結(jié)果見表2表2Mog對大鼠CCV侵性肝損傷血清中ALB、TP、A/G的影響(f±^，n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*與模型對照組比較P<0.05;林與模型對照組比較P<0.013.3Mog對大鼠CCl4慢性肝損傷肝組織勻漿中S0D、MDA、GSH-px的影響與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝勻漿中SOD、GSH-px水平顯著降低；MDA水平升高，P〈0.01;與模型對照組比較陽性對照組大鼠肝勻漿中SOD、GSH-px水平顯著升高，MDA水平顯著降低P〈0.01;與模型對照組比較Mog各劑量組能顯著升高SOD、GSH-px水平，降低MDA水平，P<0.01或P<0.05。結(jié)果見表3表3Mog對大鼠CCl4慢性肝損傷肝組織勻漿中S0D、MDA、GSH-px的影響(f±s,n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>氺與模型對照組比較P〈0.05;林與模型對照組比較P<0.013.4Mog對大鼠CCl4慢性肝損傷肝組織病理學的影響模型組大鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞，膠原纖維含量增加，并有較明顯的纖維隔形成，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞。與模型組比較陽性對照組、Mog各劑量組病理組織有明顯改善，見表4。表9Mog對CCl4慢性肝損傷大鼠肝組織病理學的影響(3f±S，n=10)組別劑量動物數(shù)評分<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>Mog中劑量組0.4102.6±0.52*Mog低劑量組_^_^_2.6±0.70*_*與模型組比較？<0.05;林與模型組比較P〈0.014.討論目前羅漢果藥用都是用于呼吸系統(tǒng)疾病，而在傳統(tǒng)的藥用方法中，羅漢果不僅僅限于治療呼吸系統(tǒng)疾病，對消化系統(tǒng)疾病和抗菌也有較好的藥效。我們前期實驗證明Mog對小鼠CCl4肝損傷、卡介苗加脂多糖聯(lián)合所致免疫性肝損傷有保護作用(另文發(fā)表)。因此我們開展Mog對大鼠cch慢性肝損傷保護作用的實驗研究，實驗結(jié)果證實Mog對大鼠cc:u慢性肝損傷有保護作用。Mog可降低血清中ALT、AST活性；升高TP、ALB;升高肝組織SOD、GSH-px活性，降低肝組織MDA含量；改善肝組織病理變化。其機制可能與其抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)，具體機制有待進一步研究。權(quán)利要求1.一種羅漢果保肝制劑，其特征在于先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，然后加入輔料制成具有保肝作用的顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液、滴丸劑或糖漿劑。2.—種如權(quán)利要求1所述的羅漢果保肝制劑，其特征在于顆粒劑的制備方法是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，取該精制物重量份100份，加入成型劑100500重量份，混合均勻，濕法制?；蚋煞ㄖ屏＃龅某尚蛣┦蔷廴樘呛秃械闹辽僖环N。3.—種如權(quán)利要求l所述的羅漢果保肝制劑，其特征在于片劑的制備方法是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，取該精制物重量份100份，加入輔料100500重量份，混合，在壓片機上壓片，然后用包衣粉包衣，得到羅漢果保肝片劑；所述的輔料為乳糖或膠化淀粉、硫酸鈣或碳酸鈣和微晶纖維素，其中乳糖或膠化淀粉占輔料總重量的20-30%，硫酸鈣或碳酸鈣占輔料總重量的60-70%，微晶纖維素占輔料總重量的腦。4.一種如權(quán)利要求1所述的羅漢果保肝制劑，其特征在于硬膠囊的制備方法是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，取該精制物重量份100份，加入輔料100500重量份，混合，填充于硬膠囊中，得到羅漢果保肝硬膠囊；所述的輔料為稀釋劑、助流劑和崩解劑，其中稀釋劑選用淀粉、乳糖；助流劑選用微粉硅膠、滑石粉或微晶纖維素；崩解劑選用干淀粉、微晶纖維素、預膠化淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯垸酮和羥丙基纖維素；其中稀釋劑、助流劑和崩解劑分別各占全部輔料重量的70%、25%和5%。5.—種如權(quán)利要求1所述的羅漢果保肝制劑，其特征在于滴丸的制備方法是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，取該精制物重量份1份的羅漢果提取的精制物，加入成型劑2-20重量份，混合均勻，加熱使融熔，置于滴丸機貯液槽，滴入冷凝液中，滴丸；所述的成型劑為PEG4000和PEG6000中的任一種，或兩者的混合物；冷凝液為液體石蠟、二甲基硅油中的一種或兩者的混合物。6.—種如權(quán)利要求1所述的羅漢果保肝制劑，其特征在于口服液的制備方法是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，取該精制物重量份1份的羅漢果提取的精制物，加入O.02-0.2重量份|^腐劑，加入4-50重量份的輔料，溶于20-200重量份的溶劑中，混合均勻，灌裝于10ml的容器中，封蓋；所述防腐劑為苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、對羥基苯甲酸乙脂/對羥基苯甲酸丁脂中的一種或混合物；所述的輔料為蔗糖；所述溶劑為蒸餾水或純凈水。7.—種如權(quán)利要求1所述的羅漢果保肝制劑，其特征在于糖漿劑的制備方法是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，取該精制物重量份1份的羅漢果提取的精制物，加入O.02-0.2重量份防腐劑，加入12-120重量份的輔料，溶于20-200重量份的溶劑中，混合均勻，灌裝；所述防腐劑為苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、對羥基苯甲酸乙脂/對羥基苯甲酸丁脂中的一種或混合物；所述的輔料為蔗糖；所述溶劑為蒸餾水或純凈水。8.—種如權(quán)利要求1所述的羅漢果保肝制劑，其特征在于緩釋膠囊的制備方法是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，取該精制物重量份100份，加入輔料100500重量份，混合，所述的輔料為稀釋劑、助流劑和崩解劑，其中稀釋劑選用淀粉、乳糖；助流劑選用微粉硅膠、滑石粉或微晶纖維素；崩解劑選用干淀粉、微晶纖維素、預膠化淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮和羥丙基纖維素；其中稀釋劑、助流劑和崩解劑分別占全部輔料重量的70%、25%和5%，加入總重量0.5—5%的鯨蠟或其它阻滯劑包衣，分別制成2、4、6、8小時緩釋小丸，每種小丸用不同色澤區(qū)分，混合均勻后裝入空膠囊中，包裝成盒或熱壓成鋁塑板得到成品緩釋膠囊。9.一種如權(quán)利要求1所述的羅漢果保肝制劑，其特征在于軟膠囊的制備方法是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的的精制物，取該精制物重量份100份，加入輔料植物油、蜂蠟按l:1:0.02制成混懸物，以明膠甘油水為1:0.40.6:0.9的比例制備膠皮，然后將混懸物灌裝壓制成軟膠囊，25'C以下定型，用乙醇洗去軟膠囊外表油層，于25"C以下干燥，取出即得軟膠囊產(chǎn)品o全文摘要本發(fā)明涉及以葫蘆科的羅漢果提取物制備保肝制劑的方法，其特點是先將羅漢果粉碎，用水加熱提取，再將提取液用大孔樹脂柱分離，濃縮，干燥，得到羅漢果提取的精制物，將其制成顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液、滴丸劑或糖漿劑，這些制劑對大鼠CCl₄慢性肝損傷有保護作用，可降低血清中ALT、AST活性；升高TP、ALB；升高肝組織SOD、GSH-px活性，降低肝組織MDA含量，改善肝組織病理變化。文檔編號A61K36/185GK101167782SQ20071005045公開日2008年4月30日申請日期2007年11月3日優(yōu)先權(quán)日2007年11月3日發(fā)明者李愛媛,勤王,王志萍,剛肖申請人:廣西中醫(yī)學院