專利名稱：：脂氧素在治療腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療腫瘤的藥物，特別涉及生物分子在治療腫瘤中的應(yīng)用，即抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤的播散轉(zhuǎn)移。技術(shù)背景腫瘤是危害人體健康最嚴(yán)重的疾病之一，由于其發(fā)病原因復(fù)雜,不能有效預(yù)防。目前治療腫瘤的主要方法有化療、放療和手術(shù)治療三種。然而許多癌癥患者在接受手術(shù)、化療或放療后，癌細(xì)胞反而加速擴(kuò)散甚至"越治越擴(kuò)散"[參見HomsMY,KuipersEJ，SiersemaPD.Palliativetherapy.JSurgOncol.2005,92(3):246-56.]。加之目前多數(shù)抗腫瘤藥物不具有明顯的選擇性，對l下常細(xì)胞也存在明顯的毒副作用。因而，研發(fā)低毒性、高選擇性特別是抗腫瘤擴(kuò)散的藥物正是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界亟待解決的課題。脂氧素(Lipoxins，LXs)是哈佛大學(xué)Serhan教授于1984年發(fā)現(xiàn)的二十烷家族中--類花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，在脂加氧酶作用下經(jīng)跨細(xì)胞途徑(transcellularpathway)合成[參見2ClarksonMR,McGintyA,GodsonC,etal,Leukotrienesandlipoxins:lipoxygenase-derivedmodulatorsofleukocyterecruitmentandvasculartoneinglomerulonephritis.NephrolDialTransplant,1998，13:3043-3051.]。隨著對LXs研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)炎癥的發(fā)生與消散過程中LXs與白三烯(leukotrienes,LTs)相互拮抗，前者有很強(qiáng)的抗炎癥效應(yīng)，被稱之為炎癥反應(yīng)的"剎車信號(brakingsignals)"或"停止信號(stopsignals)"[參見O'mearaYM，BradyHR.Lipoxins,leukocyterecruitmentandtheresolutionphaseofacuteglomerulonephritis.KidneyIntSupp).]997，58:S56-61,]。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的任務(wù)是提供一種治療腫瘤的藥物，使其具有能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤的播散轉(zhuǎn)移等作用。本發(fā)明提供的這種治療腫瘤的藥物是脂氧素(Lipoxins,LXs)。實(shí)驗(yàn)資料一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動物BALB/c—nu/nu裸小鼠32只，鼠齡46周，體重152Qg，雌性，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物研究所，飼養(yǎng)條件按無特定病原體(SPF)要求。2.試劑與儀器1640培養(yǎng)基(Hyclony公司)，胎牛血清(Gibco公司)，脂氧素(Cayman公司)，D'H]-TdR為中科院上海原子能研究所產(chǎn)品，瓊脂糖，Trizol,胰蛋白酶、DMSO及(Sigma公司)，線粒體膜電位檢測試劑盒和DNALadder抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。C02培養(yǎng)箱(ThermoForma公司)，PCR儀(MjRsearch公司)，流式細(xì)胞儀(Becton公司)，紫外分光光度計(jì)、激光共聚焦顯微鏡(01ympus公司)。3.細(xì)胞來源人白血病細(xì)胞株K562和HL60、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株L-174-T(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)。培養(yǎng)于含10X胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中并置于37'C、5%(:02細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，定期換液，細(xì)胞70-80%融合時進(jìn)行傳代。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將培養(yǎng)細(xì)胞分組。二、實(shí)驗(yàn)方法1RT-PCR檢測lipoxinA4rec印tor表達(dá)各組細(xì)胞處理24小時后，采用Trizol提取各樣品總RNA，紫外分光光度計(jì)測定純度定量后取4ug進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后取l"1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。lipoxinA4rec印tor上游引物為5'-CACCAGGTGCTGCTGGCAAG-3'，下游引物為5'-AATATCCCTGACCCCATCCTCA-3'。脂氧素受體(ALXR)的退火溫度為64°C,循環(huán)次數(shù)為30次。產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳后照相并行圖像分析。2細(xì)胞增殖檢測2.13H-TdR法細(xì)胞接種于24孔板，處理24小時后，加入'H-TdR74kBq/well'繼續(xù)培養(yǎng)6h后，收集細(xì)胞，液閃儀測放射性活度。2.2流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖周期各組細(xì)胞處理48h后，離心收集細(xì)胞，以75^乙醇一20。C固定過夜；離心棄上清，PBS洗2次后，加入染色液(PI50ug/ml，RNaseA50ug/ml，Na2EDTA0.lmmol/L，Triton-X1000.1%),4。C染色lh后，上流式細(xì)胞儀(Becton)檢測。2.3腫瘤細(xì)胞接種裸鼠8只裸鼠不作任何處理，按無特定病原體(SPF)要求飼養(yǎng)。取對數(shù)生長期人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株LS-174-T細(xì)胞，常規(guī)方法消化后計(jì)數(shù)，臺盼藍(lán)測定細(xì)胞活力在95%以上。懸浮于無血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，制成lX107ml的細(xì)胞懸液。余下每組8只，每只裸鼠接種O.2ml細(xì)胞懸液，內(nèi)含2X106腫瘤細(xì)胞接種于左脅腹部皮下。裸鼠通過尾靜脈給藥，連續(xù)7天，每次注射0.lml脂氧素溶液(按表l所述分組，每組8只小劑量20nM，中劑量100nM，大劑量500nM)，另取8只裸鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水作為對照組。5周后處死裸鼠，摘取接種腫瘤細(xì)胞的裸鼠的接種瘤，置于10%甲醛中固定，石蠟包埋、組織連續(xù)切片(每隔lmm)HE染色。顯微鏡下觀察并拍照，觀察、記錄腫瘤大小和生長情況。3細(xì)胞凋亡檢測3.1流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡比例各組細(xì)胞處理48小時后，離心收集細(xì)胞，以75%乙醇一20"固定過夜；離心棄上清，PBS洗2次后，加入染色液(PI50yg/ml，RNaseA50ng/ml，N&EDTA0.1畫1/L，Triton-X1000.1%)，4。C染色l小時后，上流式細(xì)胞儀(Becton)檢測。3.2DNALadder法檢測凋亡1000-2000g離心1-2分鐘，棄上清，收集細(xì)胞。每1毫升樣品裂解液中加入5微升蛋白酶K，混勻。對于上述處理好的樣品，每5毫克組織或者106個細(xì)胞中加入500微升添加了蛋白酶K的樣品裂解液，Vortex混勻，充分裂解組織或細(xì)胞。50'C水浴消化過夜。加入500微升Tris平衡苯酚抽提樣品。加入Tris平衡苯酚后劇烈顛倒或晃動10-30秒，以使酚相和水相充分相互作用。然后4。C,約12000g離心5分鐘。吸出酚相及中間相(可以吸除少量靠近中間相的水相液體)，剩余的水相用等體積Tris平衡酚再抽提一次。吸出酚相及中間相(可以吸除少量靠近中間相的水相液體)，剩余的水相用等體積氯仿再抽提一次。吸出約300微升上清液，加入60微升10M醋酸鈸和600微升無水乙醇，顛倒數(shù)次混勻，此時可見DNA沉淀產(chǎn)生。-2(TC凍存1小時，以充分沉淀小片斷DNA。12，00()g離心10分鐘，棄上清。加入7CB乙醇洗滌DNA沉淀一次。取部分抽提得到的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳分析。3.3激光共聚焦測測細(xì)胞線粒體膜電位取10-60力'細(xì)胞，重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中。加入0.5mlJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37'C孵育20分鐘。在孵育期間，按照每lmlJOl染色緩沖液(5X)加入4ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1X),并放置于冰浴。37'C孵育結(jié)束后，600g4'C離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次加入lnilJC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600g4'C離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入lmlJC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600g4。C離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。3.4流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞線粒體膜電位取10-60萬細(xì)胞，重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中。加入0.5mlJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37。C孵育20分鐘。在孵育期間，按照每lmlJC-1染色緩沖液(5X)加入4ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1X)，并放置于冰浴。37'C孵育結(jié)束后，600g4"離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次加入lmlJC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600g4。C離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入lmlJC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600g4。C離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸后，用流式細(xì)胞儀觀察。4細(xì)胞遷移的檢測4.1Transwell小室法檢法檢測腫瘤細(xì)胞遷移transwell在24孔板中浸泡1小時；消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液，每孔加入100Ul細(xì)胞懸液；加藥刺激；下腔室中加入條件培養(yǎng)基或其他刺激因子；37。C培養(yǎng)箱中，孵育20-24h;取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4°C;PBS洗2遍，加入結(jié)晶紫(0.1%)染色，室溫0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)IO照相，記錄。4.2裸鼠內(nèi)臟腫瘤轉(zhuǎn)移的檢測按2.3方法處理后取出各組裸鼠肺置于10%甲醛中固定，石蠟包埋、組織連續(xù)切片(每隔lmm)HE染色。顯微鏡下觀察并拍照，觀察、記錄轉(zhuǎn)移瘤大小和生長情況。5報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶檢測24孔板細(xì)胞張至80%密度時，轉(zhuǎn)染NF-KB報(bào)告質(zhì)粒或空載體，并同時轉(zhuǎn)染e-半乳糖酐酶報(bào)告質(zhì)粒作為內(nèi)參照，轉(zhuǎn)染后6h，更換培養(yǎng)液并加入LXAi孵育24小時。棄培養(yǎng)液，加入裂解緩沖液，將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)入離心管中，渦旋振蕩15s，4'C下12000g離心2min，取上清，一部分上清加入熒光素酶檢測試劑檢測熒光素酶活性，另取部分與e-半乳糖酐酶檢測試劑混合，37。C孵育3小時后420nm測e-半乳糖酐酶活性。6ELISA檢測培養(yǎng)上清中TGF-e含量各組細(xì)胞處理預(yù)設(shè)的時間后，收集培養(yǎng)上清，按試劑盒說明書方法依次加入樣本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體、酶結(jié)合物工作液、顯色液、顯色終止液，最后酶標(biāo)儀450nm測U直。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)均以x士S表示，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析及均數(shù)間多重比較。P<0.05為差異有顯著意義。四、結(jié)果1.K562，HL60和LS-174-T細(xì)胞表達(dá)脂氧素受體RT-PCR結(jié)果顯示，K562和HL60細(xì)胞均能表達(dá)脂氧素受體，見圖1K562,HL60和LS-174-T細(xì)胞表達(dá)脂氧素受體。2.脂氧素抑制腫瘤細(xì)胞增殖(1)見圖2脂氧素抑制K562和HL60細(xì)胞增殖(";X0.01vscontrolgroup),細(xì)胞處理24小時后:'H-TdR法分析發(fā)現(xiàn)脂氧素A4抑制K562和HL60細(xì)胞增殖，對HL60細(xì)胞的作用更為明顯。(2)脂氧素對白血病細(xì)胞周期的影響見圖3脂氧素對K562和HL60細(xì)胞增殖周期的影響(AP〈0.05vs空白組)，脂氧素作用于腫瘤細(xì)胞48小時后，細(xì)胞周期的G。/G,期細(xì)胞比例增高，而S期和G,/M期細(xì)胞比例則降低。本結(jié)果提示脂氧素具有明顯的G。/d期阻滯作用。(3)脂氧素對裸鼠接種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株LS-174-T后接種瘤生長的影響接種后動物未見明顯異常反應(yīng)，局部均未出現(xiàn)明顯的紅腫等情況。第1、2周未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的結(jié)節(jié)。第3周開始，生理鹽水對照組裸鼠接種腫瘤細(xì)胞部位可觀察到類圓形結(jié)節(jié)狀物，局部無紅腫。以后腫塊逐漸增大，呈不規(guī)則形或分葉狀。脂氧素治療組結(jié)節(jié)狀物比生理鹽水對照組小。5周后處死裸鼠，分別摘取接種瘤和肺，置于10%甲醛中固定，石蠟包埋、組織連續(xù)切片(每隔1mm)，HE染色。顯微鏡下觀察并拍照，對照組接種瘤表面可見清晰的血管網(wǎng)形成。部分裸鼠出現(xiàn)惡液質(zhì)現(xiàn)象，表現(xiàn)為明顯消瘦，體重減輕，活動減少，呈弓背狀。見表1。__表l接種瘤生長情況__組別出現(xiàn)腫瘤的例數(shù)接種部位腫瘤大小(mm3)腫瘤重量(g)空白對照組^55生理鹽水對照組83254±3655.88±0.93**小劑量脂氧素組82865±3164.25±0.67*袖中劑量脂氧素組61974±3212.74±0.55**1大劑量脂氧素組._^_336±143_0.79±0.35*抑*P<0.05，**P<0.01vs空白對照組；存PO.05,弁弁PO.01vs生理鹽水對照組3.脂氧素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡(1)流式檢測結(jié)果見圖1脂氧素對K562和HL60細(xì)胞凋亡的影響。(2)DNAladder結(jié)果見圖5脂氧素對K562和HL60細(xì)胞凋亡的影響，(1，DNALadderMarker;2,空白HL60細(xì)胞;3,K562細(xì)胞;4,Lipoxin+HL60;5,Lipoxin+K562)。(3)激光共聚焦檢測細(xì)胞線粒體膜電位結(jié)果見圖6脂氧素對K562和HL60細(xì)胞膜電位的影響。(4)流式檢測細(xì)胞線粒體膜電位結(jié)果見圖7脂氧素對K562和HL60細(xì)胞膜電位的影響，由圖7可見，K562和HL60細(xì)胞接受Lipoxin刺激后，經(jīng)流式分析，UR部分比例明顯下降，提示線粒體膜電位下降的細(xì)胞含量增加。結(jié)果表明，Lipoxin促進(jìn)K562和HL60細(xì)胞的凋亡是部分通過線粒體途徑的。4.脂氧素抑制腫瘤細(xì)胞遷移(1)如圖8脂氧素LXA4抑制K562和HL60細(xì)胞遷移("/X0.01vscontrolgroup),transwell小室分析發(fā)現(xiàn)脂氧素A4抑制K562和HL60細(xì)胞遷移。(2)脂氧素對裸鼠接種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株LS-174-T后腫瘤肺轉(zhuǎn)移的影響肉眼可見裸鼠肺臟較同期空白對照組肺臟明顯增大，個別裸鼠肺臟表面見結(jié)節(jié)狀物，呈半透明灰白色不規(guī)則形。鏡下可見巨大轉(zhuǎn)移灶并可見血管周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，肺組織有明顯的癌細(xì)胞浸潤。脂氧素小劑量治療組肺組織表面可見灰白色斑點(diǎn)，呈花斑狀外觀，鏡下觀察轉(zhuǎn)移灶數(shù)量較多，體積較大，細(xì)胞呈高度異型性，呈多邊形，核大、濃染，核漿比例失調(diào)，核分裂象多見，癌細(xì)胞呈團(tuán)狀排列，偶見腺管樣結(jié)構(gòu)，間質(zhì)較少。脂氧素中劑量治療組肺組織表面可見散在灰白色斑點(diǎn)，直徑約0.8-1.3誦，鏡下可見少量微小轉(zhuǎn)移灶，細(xì)胞呈巢狀排列，胞核明顯濃染脂氧素大劑量治療組肺組織外觀無明顯異常改變，鏡下未發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶。見表2。表2棵鼠肺組織重量及轉(zhuǎn)移灶統(tǒng)計(jì)情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*P<0.05,**P<0.01vs空白對照組；#P<0.05,##P<0.01vs生理鹽水對照組5.脂氧素抑制腫瘤細(xì)胞NF-icB轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)染帶有NF-KB結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，脂氧素A4抑制K562和HL60細(xì)胞NF-kB轉(zhuǎn)錄活性，而對空載體的基礎(chǔ)熒光素酶活性無明顯影響(見圖9LXA4抑制K562和HL60細(xì)胞NF-kB轉(zhuǎn)錄活性，Ap〈0.05vscontrolgroup)。6.脂氧素抑制腫瘤細(xì)胞分泌TGF-e見圖10LXA4抑制K562和HL60細(xì)胞分泌TGF-P，脂氧素A4抑制K562和HL60細(xì)胞分泌TGF-0(AA/X0.01vscontrolgroup)。本研究結(jié)果表明，脂氧素可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，并可有效抑制腫瘤血管床的形成，從而抑制轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生和癌細(xì)胞擴(kuò)散。脂氧素可以有效抑制K562和HL60白血病細(xì)胞TGF-e的分泌，即從源頭上阻斷TGF-t5信號通路，從而抑制腫瘤的擴(kuò)散。脂氧素通過抑制NF-icB活性從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制增殖及轉(zhuǎn)移。圖1K562,UL60和LS-174-T細(xì)胞表達(dá)脂氧素受體；圖2脂氧素抑制K562和HL60細(xì)胞增殖，細(xì)胞處理24h后3H-TdR法分析發(fā)現(xiàn)脂氧素A4抑制K562和HL60細(xì)胞增殖，對HL60細(xì)胞的作用更為明顯。圖3脂氧素對K562和HL60細(xì)胞增殖周期的影響，脂氧素作用于腫瘤細(xì)胞48h后，細(xì)胞周期的G。期細(xì)胞比例增高，而S期和G2/M期細(xì)胞比例則降低。本結(jié)果提示脂氧素具有明顯的G。/Gl期阻滯作用。圖4脂氧素對K562和HL60細(xì)胞凋亡的影響；圖5脂氧素對K562和HL60細(xì)胞凋亡的影響，圖中1為DNALadderMarker;2為空白HL60細(xì)胞；3為K562細(xì)胞；4為Lipoxin+HL60;5為Lipoxin+K562。圖6脂氧素對K562和HL60細(xì)胞膜電位的影響；圖7脂氧素對K562和HL60細(xì)胞膜電位的影響，K562和HL60細(xì)胞接受Lipoxin刺激后，經(jīng)流式分析，UR部分比例明顯下降，提示線粒體膜電位下降的細(xì)胞含量增加。結(jié)果表明，Lipoxin促進(jìn)K562和HL60細(xì)胞的凋亡是部分通過線粒體途徑的。由圖7可見，K562和HL60細(xì)胞接受Lipoxin刺激后，經(jīng)流式分析，UR部分比例明顯下降，提示線粒體膜電位下降的細(xì)胞含量增加。結(jié)果表明，Lipoxin促進(jìn)K562和HL60細(xì)胞的凋亡是部分通過線粒體途徑的。圖8脂氧素LXA4抑制K562和HL60細(xì)胞遷移；圖9LXA4抑制K562和HL60細(xì)胞NF-kB轉(zhuǎn)錄活性；圖10LXA4抑制K562和HL60細(xì)胞分泌TGF-e，脂氧素A4抑制K562和HL60細(xì)胞分泌TGF-P。具體實(shí)施方式實(shí)施例脂氧素用于治療腫瘤的用法(1)商品購買脂氧素溶于乙醇稀釋。(2)用于實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈給藥，連續(xù)7天，每次注射O.1ml脂氧素溶液，每次O.5-1.0mg。(3)用于人靜脈給藥，連續(xù)14天，一天1次,每次1-2.5mg。權(quán)利要求1.脂氧素在制備用于治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。2.—種治療腫瘤的藥物制劑，其特征在于，它含有有效量的脂氧素和制藥學(xué)上可接受的載體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療腫瘤的藥物制劑，其特征在于，所說的制藥學(xué)上可接受的載體為乙醇。全文摘要本發(fā)明提供了一種治療腫瘤的藥物，這種治療腫瘤的藥物是脂氧素Lipoxins，LXs，將脂氧素用于腫瘤的治療，具有能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤的播散轉(zhuǎn)移等作用。文檔編號A61K31/185GK101327205SQ20071005251公開日2008年12月24日申請日期2007年6月21日優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日發(fā)明者葉篤筠,萍吳,周小燕,力張,李詠生,陳建國申請人:華中科技大學(xué)