專(zhuān)利名稱(chēng)：：布魯氏菌分子標(biāo)記和毒力缺失弱毒疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種布魯氏菌弱毒疫苗及生產(chǎn)工藝，尤其是提供一種可區(qū)分自然感染或野毒感染的布魯氏菌弱毒疫苗，用于能區(qū)分人與動(dòng)物是疫苗接種還是自然感染；本發(fā)明還公開(kāi)了上述疫苗的生產(chǎn)方法，屬于免疫疫苗生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：布魯氏菌病(Brucellosis)是由小球桿狀布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病，在世界各地都有廣泛流行。每年因此造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元，而且此病還會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅。從上個(gè)世紀(jì)90年代起，人與動(dòng)物發(fā)病率又有上升的趨勢(shì)。當(dāng)前的布魯氏菌疫苗種類(lèi)較多。重組蛋白疫苗與DNA疫苗保護(hù)性能有限，滅活疫苗保護(hù)期短。目前人和動(dòng)物多用弱毒疫苗，弱毒疫苗較前幾種疫苗保護(hù)作用及效果好，但它同樣存在著缺陷，致使人們不敢、不愿也不能對(duì)其廣泛應(yīng)用。主要原因是其一，接種后人們無(wú)法區(qū)別自然感染和人工接種免疫。如果廣泛應(yīng)用這樣的疫苗就給該病流行病學(xué)調(diào)査，探查疫源產(chǎn)生很大的障礙。許多國(guó)家與地區(qū)限制用血清學(xué)方法檢測(cè)布魯氏菌病呈陽(yáng)性地區(qū)的肉制品、奶制品進(jìn)口，對(duì)國(guó)際貿(mào)易產(chǎn)生嚴(yán)重的影響；其二，毒性大，返祖現(xiàn)象嚴(yán)重，會(huì)對(duì)人與動(dòng)物機(jī)體造成傷害，甚至發(fā)病。所以研制一種能區(qū)分是自然感染還是人工主動(dòng)免疫，保護(hù)性能好，毒力弱、安全性能好的布魯氏菌病弱毒疫苗具有重要的實(shí)踐意義。所以構(gòu)建一株能區(qū)分是自然感染還是人工接種免疫，保護(hù)性能好，毒力弱的布魯氏菌弱毒疫苗是本發(fā)明的任務(wù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種可區(qū)分自然感染或野毒感染的布魯氏菌弱毒疫苗△S19-1和AS19-2，解決了常規(guī)的布魯氏菌疫苗不能區(qū)分人與動(dòng)物是人工免疫接種還是野生菌感染、病毒強(qiáng)，容易至使接種的人與動(dòng)物不良反應(yīng)、甚至發(fā)病的問(wèn)題。本發(fā)明還公開(kāi)了該布魯氏菌弱毒疫苗的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。一種布魯氏菌弱毒疫苗AS19-l,特征在于:布魯氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成AS19-1。一種布魯氏菌弱毒疫苗AS19-2，特征在于AS19-1毒力基因Bmpl8缺失而成弱毒疫苗株AS19-2。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下為了本發(fā)明的目的，首先以布魯氏菌的弱毒疫苗株S19為起始材料，以PCR的方法從S19的染色體中擴(kuò)增出要改造的目的基因Bp26的引導(dǎo)序列，并把它克隆到T載體上，進(jìn)行基因改造。而后把這個(gè)經(jīng)改造的引導(dǎo)序列克隆到pBK-CMV上而成重組質(zhì)粒pBK-BP26-Luc，并在pBK-Bp26-Luc合適的位置上，克隆上sacB基因，最終成為同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)pBLs。用同樣的方法得到布魯氏菌毒力基因B卿8的引導(dǎo)序列，克隆到T載體上，進(jìn)行基因改造，并把它連接到pBluescriptSK+重組質(zhì)粒，最終成為同源重組載體pBBs,用電轉(zhuǎn)化法把自殺性質(zhì)粒pBLs轉(zhuǎn)化到布魯氏菌S19中，由于同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)不能在布魯氏菌中自主復(fù)制，因此轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞內(nèi)的超螺旋的自殺質(zhì)粒便會(huì)被線性化。因自殺質(zhì)粒上含有受體菌基因的同源序列，它便會(huì)插入受菌體S19的染色體中，接著線性化的質(zhì)粒與Bp26基因發(fā)生置換，也就是通常所說(shuō)的單交換同源重組事件的發(fā)生。只有置換到S19染色體上被線性化的自殺質(zhì)粒才能隨著染色體的復(fù)制而存在。把受體菌涂布在含有篩選標(biāo)記的肝湯瓊脂平板上，因自殺質(zhì)粒上帶有篩選藥品抗性基因，所以很容易的篩選出單交換子。由于單交換是整個(gè)載體序列(含篩選藥物抗性基因和sacB基因)都置換到染色體上，因此，我們必須篩選僅有經(jīng)改造的目的基因整合到染色體上的雙交換子。將獲得的同源重組單交換子液體培養(yǎng)物涂布于添加5%蔗糖的肝湯培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落即為陽(yáng)性同源重組雙交換子。因?yàn)槿绻剪斒暇p交換子染色體上存在sacB基因等載體序列，在蔗糖存在的情況下將會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌死亡，只有在5%蔗糖肝湯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落才是發(fā)生2次重組的雙交換子(丟失sacB基因和抗性等載體序列)，即得到本發(fā)明的厶S19-1。用同樣的方法把自殺性質(zhì)粒pBBs轉(zhuǎn)化到AS19-1中去得到本發(fā)明的AS19-2。用這樣的方法首先得到布魯氏菌弱毒疫苗株S19的Bp26基因突變?nèi)笔е辍鱏19-l，而后得到AS19-1毒力基因Bmpl8缺失株AS192。本發(fā)明的具體制備方法主要包括以下步驟(1)以布魯氏菌弱毒疫苗基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法，擴(kuò)增出分子標(biāo)記目標(biāo)基因的同源重組引導(dǎo)序列，而后克隆到T載體上對(duì)目標(biāo)基因改造；(2)用(1)得到的基因片段與復(fù)制啟動(dòng)子為pUCoir的載體相連，而后將sacB基因連接到這個(gè)載體的適當(dāng)位置，構(gòu)建成同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)；(3)使步驟(2)得到的重組載體轉(zhuǎn)化到布魯氏菌中去；利用同源重組載體自帶的篩選標(biāo)記篩出同源重組單交換子，利用sacB基因篩選出同源重組的雙交換子，得到本發(fā)明的分子標(biāo)記疫苗株AS19-1;(4)重新設(shè)計(jì)引物，從布魯氏菌基因組中，擴(kuò)增出目標(biāo)毒力基因的同源重組引導(dǎo)序列，使用(1)(3)的方法使AS19-1的毒力缺失，得到本發(fā)明的分子標(biāo)記、毒力缺失弱毒疫苗株AS19-2。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案:所說(shuō)的弱毒疫苗株為S19。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案:所說(shuō)的分子標(biāo)記目標(biāo)基因?yàn)锽p26。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案所說(shuō)的分子標(biāo)記目標(biāo)基因是指用限制性內(nèi)切酶切除其中500bp，而后在這個(gè)位置上連接上LucNF+報(bào)告基因。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案所說(shuō)目標(biāo)蛋白是BP26蛋白。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案所說(shuō)的目標(biāo)毒力基因是Bmpl8基因。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案所說(shuō)目標(biāo)毒力基因改造是指用限制性內(nèi)切酶切除其中的200bp，而后使之相聯(lián)。其中所說(shuō)分子標(biāo)記突變株在本發(fā)明中被命名為AS19-1，分子標(biāo)記、毒力缺失弱毒疫苗突變株被命名為AS19-2用AS19-2接種動(dòng)物，根據(jù)動(dòng)物所表現(xiàn)的臨床癥狀分析，AS19-2毒力明顯比接種其親本菌株S19。用PCR的方法從布魯氏菌S19中擴(kuò)增出Bp26基因，把它克隆到pET28a+上面成重組質(zhì)粒pETBp26。把它轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)并純化出融合蛋白His-BP26。以His-BP26為包被抗原，用ELISA的方法檢測(cè)動(dòng)物的血清，就容易區(qū)分開(kāi)動(dòng)物是其它布魯氏菌感染還是AS19-2接種的?；虼虬惺腔贒NA同源重組技術(shù)發(fā)展起來(lái)的在分子水平上改造、剔除或取代某個(gè)特定基因，能達(dá)研究基因改造后個(gè)體的表型進(jìn)而研究目標(biāo)基因的功能。一般來(lái)說(shuō)，由于外源DNA與宿主細(xì)胞DNA自然發(fā)生同源重組的機(jī)率非常低，因此對(duì)成功地進(jìn)行了基因打靶是一件非常困難的工作。本發(fā)明中構(gòu)建的自殺性質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)為pUCori，可以在￡coh'存活并復(fù)制，但不能在布魯氏菌中存活與復(fù)制，所以該載體在布魯氏菌中為自殺質(zhì)粒。因此，在載體構(gòu)建過(guò)程中涉及到此復(fù)制子需在￡中操作，它帶有篩選標(biāo)記便于同源重組單交換子的篩選。為了獲得不帶抗性標(biāo)記的工程菌株，必須篩選雙交換子。如果用抗性基因作為負(fù)篩選標(biāo)記，必須逐個(gè)驗(yàn)證是否丟失抗性，工作煩瑣而容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。用sacB基因作為正篩選標(biāo)記。該基因編碼的果糖蔗糖酶，能將蔗糖水解為果糖并生成大分子量的果聚糖，在G—細(xì)菌周質(zhì)空間(極少數(shù)0+細(xì)菌的假周質(zhì)空間結(jié)構(gòu))累積，導(dǎo)致細(xì)胞停止生長(zhǎng)或死亡，因此，含有該基因的G—宿主菌對(duì)蔗糖高度敏感，可以用來(lái)作為同源重組雙交換的正篩選標(biāo)記，只細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，它就是丟失抗性基因的雙交換子，工作簡(jiǎn)便可靠將LucNF+報(bào)告基因代替了Bp26基因部分片段。LucNF+基因是經(jīng)基因工程改進(jìn)的螢火蟲(chóng)螢光素酶基因，使其在構(gòu)建螢光素酶N端融合蛋白時(shí)具有最大的靈活性。蛋白不需要翻譯后加工，立即產(chǎn)生報(bào)告活性。本發(fā)明用PCR的方法擴(kuò)增出Bp26基因，經(jīng)過(guò)克隆、亞克隆，最后連接到到pET-28a上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果37。C誘導(dǎo)4個(gè)小時(shí)，用SDS-PAGE分析，高效表達(dá)出帶有His-tag標(biāo)簽的融合蛋白BP26蛋白，經(jīng)Western-blot免疫鑒定，它具有免疫活性。為了評(píng)價(jià)本發(fā)明的基因工程構(gòu)建的布魯氏工程弱毒疫苗AS19-2的正確性，分別在分子標(biāo)記目標(biāo)基因與毒力基因的引導(dǎo)序列上設(shè)計(jì)引物，以親本菌株S19為對(duì)照，比較擴(kuò)增基因片段的大小，驗(yàn)證基因改造情況，經(jīng)凝膠電泳分析，結(jié)果與理論值相符，見(jiàn)圖廣圖2。為了檢定本發(fā)明的基因工程構(gòu)建的布魯氏工程菌AS19-2的毒力，本發(fā)明以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用AS19-2接種動(dòng)物，以S19注射為對(duì)照組，檢測(cè)接種小鼠脾臟不同時(shí)候的AS19-2與S19含菌量，用不同高濃度的AS19-2與S19接種小鼠，觀察小鼠的臨床癥狀及最小致死數(shù)量，比較分析了它們的毒力強(qiáng)弱。其結(jié)果表明△S19-2比其親本S19弱很多。詳細(xì)的方法與步驟及數(shù)據(jù)見(jiàn)實(shí)施例4。用本發(fā)明制取的His-Bp26融合蛋白做包被抗原，用ELISA方法成功區(qū)分了是S19接種的小鼠還是AS19-2接種的小鼠。詳細(xì)的方法與步驟及數(shù)據(jù)見(jiàn)實(shí)施例5。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)所構(gòu)建的布魯氏弱毒疫苗AS19-2具有分子標(biāo)記，毒力相對(duì)缺失的特點(diǎn)。本發(fā)明構(gòu)建了這兩個(gè)基因缺失株，實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)，本發(fā)明的基因工程菌株接種動(dòng)物后能與其它菌株感染動(dòng)物用ELISA方法區(qū)分開(kāi)來(lái)。通過(guò)接種小鼠進(jìn)行毒力測(cè)試，其毒力明顯比S19株弱。本發(fā)明的積極效果在于提供布魯氏菌分子標(biāo)記、毒力缺失弱毒活疫苗AS19-2株，及提供基于所說(shuō)的突變株疫苗的方法，特別是進(jìn)一步提供了能區(qū)分人與動(dòng)物是疫苗接種還是野生菌感染的方法。這對(duì)布魯氏菌病監(jiān)測(cè)、診斷、凈化和控制具有重要意義，具有廣泛的應(yīng)用實(shí)踐價(jià)值。圖1、同源載體pBLs插入S19染色體上與AS19-2雙交換PCR檢測(cè)；M.lkbpDNALadderMarker;1.S19;2.同源載體插入后的S19;3.AS19-2。圖2、改造后的Bmpl8基因在AS19-2雙交換子正確性的PCR檢測(cè)；M.lkbpDNALadderMarker;1.AS19-2;2.S19。圖4、自殺性質(zhì)粒pBBs的構(gòu)建過(guò)程。圖5、PCR擴(kuò)增凝膠回收后驗(yàn)證。圖6、重組質(zhì)粒酶切電泳；l.pBb26/XhoI;2.pBmpl8/XbaI;3.pSacB/(BamHI+SalI);4.pB即18/(XbaI+SacII);5.pBK-Bp26-Luc/EcoRI;M.lkbpDNALadderMarker。圖7、同源載體pBLs插入S19染色體上與AS19-2雙交換PCR檢測(cè)；M.lkbpDNALadderMarker;1.S19;2.同源載體插入后的S19;3.AS19-2。圖8、改造后的Bmpl8基因在AS19-2雙交換子正確性的PCR檢測(cè)；M,lkbpDNALadderMarker;1.AS19-2;2.S19。圖9、目的基因的擴(kuò)增；1:Bp26(694bp);2:DNAmarkerDL2000圖10、重組質(zhì)粒pMDBp26;1:pMDBp26;2:1Kbmarker。圖ll、重組質(zhì)粒pETBp26酶切鑒定圖；Fig.3-3RestrictionmapofrecombinantplasmidpETBp26。圖12、融合蛋白SDS-PAGE檢測(cè)；1:LowMRproteinmarker;l-3:pETBp26肌21inducedfor2,3,4hrespectively;4:pET28a/BL21inducedfor4h。圖13、表達(dá)產(chǎn)物的薄層掃描結(jié)果。圖14、純化蛋白質(zhì)SDS-PAGE檢測(cè)。圖15、融合蛋白Bp26Westernblot檢測(cè)。1:RabbitserumagainstrecombinedBp26:2:LowMRproteinmarker;3:pET28a/BL21inducedfor4h。具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。實(shí)施例1同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)的構(gòu)建1材料與方法1.1菌株、質(zhì)粒、載體布魯氏菌S19株、DH5a、pBluescriptSK+本研究室保存；pBK-CMV購(gòu)自Stratagene公司;pSP-LucNF+購(gòu)自P簡(jiǎn)ega公司;pIB279南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔣建東博士惠贈(zèng)；pMD18-Tsimplevector購(gòu)自TakaRa公司。1.2試劑限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶I(Klenow大片段)，大腸桿菌DNA聚合酶I，LA-TaqDNApolymerase、lkbpDNALadderMarker、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司。1.3PCR擴(kuò)增1.3.1含有Bp26基因同源重組指導(dǎo)序列的擴(kuò)增根據(jù)Bp26基因的序列以及pMD18-Tsimplevector和pBK-CMV噬菌粒載體特點(diǎn)分別設(shè)計(jì)5'端含有限制性內(nèi)切酶XhoI的上游引物與含有XbaI酶切位點(diǎn)的下游引物。上游引物GAATTCTTTAGTCCATCCGACCCAAGTTTACG;下游引物CTCGAGTGAACACTGACCATACGCTG了GAAGAAG。反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5min;94。C變性2min，60。C退火2min，72。C延伸5min，30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。從布魯氏菌S19的基因組中擴(kuò)增。1.3.2含有Bmpl8基因同源重組指導(dǎo)序列的擴(kuò)增設(shè)計(jì)在5'端加有XbaI酶切位點(diǎn)上游引物CTAGACCAGCACCACACCGCGCGAG;加有SacII酶切位點(diǎn)引下游物CCGCGGTCATTGGCGAGGACAAGGTCCACTT。反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5min;94。C變性2min，64。C退火2min，72。C延伸5min，30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。從布魯氏菌S19的基因組中擴(kuò)增。1.3.3LucNF+基因的擴(kuò)增設(shè)計(jì)一對(duì)上下游都含有BssHII酶切位點(diǎn)的引物GCGCGCATGGTCACCGACGCCAAAAAC與GCGCGCTTACACGGCGATCTTTCCGC，以95。C預(yù)變性5min;94。C變性80s，63。C退火80s，72。C延伸100s;最后72。C延伸10min，從質(zhì)粒pSP-lucNF+擴(kuò)增出LucNF+基因片段。1.3.4sacB基因的擴(kuò)增分別設(shè)計(jì)5'端含有限制性內(nèi)切酶BamHI的上游引物與含有SalI酶切位點(diǎn)的下游引物。上游引物GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAGACAT;下游引物GGATCCTGGGATTCACCTTTATGTTGATAAG，以95。C預(yù)變性5min，94。C變性75s，60。C退火75s，72。C延伸90s反應(yīng)條件，最后72。C延伸10min，以質(zhì)粒pIP279為模板，擴(kuò)增sacB基因。1.4自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建1.4.1含有Bp26基因同源序列自殺質(zhì)粒pBLs的構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBLs構(gòu)建的過(guò)程見(jiàn)圖3。把1.4.1中的擴(kuò)增出的長(zhǎng)度4300bp的基因片段(其中包含Bp26基因)，與pMD18-T相連得到重組質(zhì)粒pBb26。把1.4.3擴(kuò)增出的LucNF+與pMD18-T相連而成重組質(zhì)粒pLUC。把1.4.4擴(kuò)增出sacB基因片段與pMD18-T相連而成重組質(zhì)粒pSacB。用限制性內(nèi)切酶BssHII分別消化重組質(zhì)粒pBb26與pLUC，并把回收的LucNF+與pBb26相連而成重組質(zhì)粒pBb26-Luc。再用限制性內(nèi)切酶XbaI與XhoI分別消化質(zhì)粒pBK-CMV與pBb26-Luc，并把Bp26-LucNF+基因片段與線性化的pBK-CMV相連而成重組質(zhì)粒pBK-Bp26-Luc。再用限制性內(nèi)切酶BamHI與SalI分別消化重組質(zhì)粒pBK-Bp26-Luc與pSacB，并把sacB基因片段與連接到線性化的pBK-Bp26-Luc而成自殺質(zhì)粒pBLs。1.4.2含有Bmpl8基因同源序列自殺性質(zhì)粒pBBs的構(gòu)建自殺性質(zhì)粒pBBs構(gòu)建的過(guò)程見(jiàn)圖4。把1.4.2中的擴(kuò)增出的長(zhǎng)度2700bp的基因片段(其中包含Bmpl8基因)，與pMD18-T相連得到重組質(zhì)粒pB即18。用限制性內(nèi)切酶NruI與SacI消化重組質(zhì)粒pBmpl8，并把消化過(guò)的pB卿18用DNAPolymeraseI處理后再用T4DNALigase使之連接，再用XbaI與SacII消化它，凝膠回收目標(biāo)片段，使之與用XbaI與SacII消化過(guò)的pBluescriptSKII(+)相連而成重組質(zhì)粒pBb即18。再用限制性內(nèi)切酶BamHI與SalI分別消化重組質(zhì)粒pBbmpl8與pSacB，并把sacB基因片段與線性化的pBb卿18相連而成自殺質(zhì)粒pBBs。2結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果從布魯氏菌S19株基因組擴(kuò)增出含有Bp26基因在內(nèi)的4300bp大小的基因片段，凝膠純化后待用；從布魯氏菌基因組擴(kuò)增出含有Bmpl8在內(nèi)的2700bp大小的基因片段，凝膠純化后待用；從質(zhì)粒pSP-LucNF+擴(kuò)增出1700bp大小的LucNF+基因片段，凝膠純化后待用；從質(zhì)粒pIP279擴(kuò)增出1400bp大小sacB的基因片段，凝膠純化后待用。它們經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證，均可觀察到與理論值大小相符條帶，見(jiàn)圖3。2.2幾個(gè)主要的重組質(zhì)粒酶切電泳鑒定pBb26經(jīng)XhoI單酶切，在7100bp左右有一電泳帶，與預(yù)期值相符；pBmpl8經(jīng)XbaI單酶切，在5400bp左右有一電泳帶，與預(yù)期值相符；pSacB經(jīng)BamHI與SalI雙酶切，可以在1400bp和2700bpd左右有兩條帶，與預(yù)期值相符；剔除部分200bp基因后的pBmpl8經(jīng)XbaI與SacII雙酶切，在2400bp與2700bp左右出現(xiàn)兩條帶與理論值相符；pBK-Bp26-Luc經(jīng)EcoRI單酶切，在12000bp左右有一條帶，與預(yù)期值相符，見(jiàn)圖4。實(shí)施例2布魯氏菌分子標(biāo)記、毒力缺失疫苗株AS19-2的構(gòu)建1.1試劑螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司，其它試劑同實(shí)施例一。1.2肝湯培養(yǎng)基取新鮮的牛肝去脂肪、筋膜后絞碎，秤取500g，加自來(lái)水1000mL與之混合，置鍋中煮沸l(wèi)h，過(guò)濾，加水補(bǔ)足原量，加入NaC15g，蛋白胨10g。肝湯瓊脂配制取上述肝湯培養(yǎng)基1000mL，加入瓊脂20g，高壓滅菌備用1.3電轉(zhuǎn)化1.3.1感受態(tài)的制備取240mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前中期(6^。。=0.15)布魯氏菌液體培養(yǎng)物放入預(yù)冷的250mL離心管中，迅速將培養(yǎng)物置于冰水混和物中15~30min,不時(shí)的緩慢搖勻保證內(nèi)容物充分冷卻。然后4'C1000Xg離心15rain，回收細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，用冰冷10%的丙三醇重懸沉淀，以1000Xg離心15min洗滌細(xì)胞3次。最后用3mL10%的丙三醇重懸沉淀制成感受態(tài)。1.3.2電轉(zhuǎn)化操作步驟取0.5yg自殺質(zhì)粒加入100uL上述制作的布魯氏菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)中混勻，加入電擊杯中，以E=12.5kv/cm電擊，然后立即加入37。C預(yù)熱的1mL的肝湯培養(yǎng)基中。放入搖床以37°C180r/min振蕩培養(yǎng)24h。取出200mL涂布于含有篩選標(biāo)記的肝湯瓊脂平板上，3d后篩選出重組子，挑選出單菌落，進(jìn)一步培養(yǎng)鑒定。1.4同源重組子的篩選1.4.l單交換子的篩選把電轉(zhuǎn)化受體菌涂布在含有篩選標(biāo)記(Amp100mg/L,Kan50mg/L)的肝湯瓊脂平板上，因同源重組載體上帶有篩選標(biāo)記基因，所以很容易的篩選出單交換子。1.4.2雙交換子的篩選將獲得的同源重組單交換子液體培養(yǎng)3d，適當(dāng)稀釋?zhuān)坎加谔砑?%蔗糖的肝湯培養(yǎng)基平板上，37'C培養(yǎng)4d。因自殺質(zhì)粒上含有sacB基因，該基因編碼的果糖蔗糖酶，能將蔗糖水解為果糖并生成大相對(duì)分子量質(zhì)的果聚糖，在G-細(xì)菌周質(zhì)空間(極少數(shù)G+細(xì)菌的假周質(zhì)空間結(jié)構(gòu))累積，導(dǎo)致細(xì)胞停止生長(zhǎng)或死亡，挑取單菌落即為陽(yáng)性同源重組雙交換子(丟失sacB基因和抗性等載體序列)。1.5雙交換子的驗(yàn)證1.5.1PCR方法的驗(yàn)證在自殺質(zhì)粒LucNF+基因外側(cè)，Bp26基因的同源臂上設(shè)計(jì)上游引物GAATTCCAGAGAAGCAGAACAGGCAC與下游引物CTCGAGAAATCGTTCGTCGTTACCGC，在雙交換重組子基因組中擴(kuò)增LucNF+基因片段；在Bmpl8剔除片段的兩側(cè)的同源臂上設(shè)計(jì)上游引物GAATTCACCTCACCGTGGACATAAAG與下游引物CTCGAGTGCCGTCGCAATTGATGAT同時(shí)在S19與雙交換子AS19-2基因組中擴(kuò)增B卿18基因片段，比較其大小。1.5.2應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)取90uL布魯氏菌AS19-2培養(yǎng)物，加入10pLlmol/LK2HP04(pH7.8)，20mmol/LEDTA，用干冰快速冷凍混合物，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到室溫并置于室溫水浴中。加入300uL新鮮配制的裂解混合物，混均后于室溫孵育10min。用20^L細(xì)胞裂解液加入裝有螢光素酶檢測(cè)試劑的螢光光度計(jì)試管中，吹打混合。將螢光光度計(jì)的程序設(shè)置為2s延遲及10s螢光素酶活性測(cè)量讀數(shù)。2結(jié)果2.1PCR法法驗(yàn)證同源載體pBLs插入S19染色體上與AS19-2雙交換子正確性用PCR方法分別從S19、同源載體插入后的S19、AS19-2的基因組中分別擴(kuò)增出不同片段，見(jiàn)圖12。l是從S19中擴(kuò)增出包含Bp26在內(nèi)的長(zhǎng)為1740bp的基因片段；2是從同源載體插入后的S19不僅擴(kuò)增出包含Bp26在內(nèi)的長(zhǎng)為1740bp基因片段，同時(shí)擴(kuò)增出了與Bb26-Luc長(zhǎng)度相符的2980bp的基因片段，與理論相符；3是從AS19-2只擴(kuò)增出的Bb26-Luc，證明了AS19-2雙交換子只含有Bb26-Luc基因。見(jiàn)圖5。2.2PCR方法驗(yàn)證改造后的Bmpl8基因在AS19-2雙交換子的正確性用PCR方法分別從S19基因組中擴(kuò)贈(zèng)出包含Bmpl8在內(nèi)的長(zhǎng)為2730bp基因片段；2是從AS19-2擴(kuò)增出的包含改造的Bmpl8長(zhǎng)為2470bp基因，1與2相比較少了260bp，這與我們剔除的基因長(zhǎng)度相符，見(jiàn)圖6。2.3螢光素酶報(bào)告基因在布魯氏菌中表達(dá)結(jié)果在螢光光度計(jì)中連續(xù)三次的讀數(shù)分別為5.570、5.438和5.304。2.4AS19-2遺傳穩(wěn)定性分析將AS19-2傳至20代，用PCR驗(yàn)證，結(jié)果同上述(2.4PCR方法驗(yàn)證)，用螢光素酶表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果也同上述(2.5螢光素酶驗(yàn)證)相符。證明AS19-2具有遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例3:△S19-2毒力的鑒定在本發(fā)明實(shí)施例2中，我們?nèi)笔Я薙19的主要的毒力基因之一Bmp18，構(gòu)建了AS19-2突變株。理論上講，AS19-2的毒力比S19弱。本發(fā)明以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，檢測(cè)接種小鼠脾臟不同時(shí)候的AS19-2與S19含菌量，用不同高濃度的AS19-2與S19接種小鼠，觀察小鼠的臨床癥狀及最小致死數(shù)量，比較分析了它們的毒力強(qiáng)弱。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株見(jiàn)實(shí)施例21.2方法1.2.1細(xì)菌計(jì)數(shù)法(1)48小時(shí)的布魯氏菌培養(yǎng)物，用無(wú)菌生理鹽水洗下，用標(biāo)準(zhǔn)比濁制成10億/mL菌懸液。(2)然后作10倍連續(xù)稀釋每mL為1億、1千萬(wàn)、1百萬(wàn)、10萬(wàn)、1千、1百、IO個(gè)菌。(3)每個(gè)稀釋度取0.3mL，接種3塊平皿，每個(gè)平皿0.lmL，涂勻。每個(gè)稀釋度換一支吸管。(4)然后將平皿置37r溫箱中培養(yǎng)，35d觀察菌落數(shù)。(5)取菌落數(shù)介于30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)稀釋度3個(gè)平皿的平均菌落數(shù)。推算出實(shí)際菌數(shù)。1.2.2細(xì)菌的處理用無(wú)菌生鹽水洗三次，再分別稀釋到每mL5億、l千萬(wàn)、l百萬(wàn)個(gè)菌。1.2.3接種小鼠脾臟細(xì)菌的計(jì)數(shù)取16只小鼠隨機(jī)分成兩組，每組8只，分別用AS19-2與S19每只小鼠接種1千萬(wàn)個(gè)菌，14d后，麻醉小鼠無(wú)菌取脾臟，用無(wú)菌研磨器研磨，用無(wú)菌生理鹽水稀釋后，涂布于肝湯瓊脂培養(yǎng)基上，37'C溫箱中培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。1.2.4接種小鼠的癥狀觀察取2億、l億、1千萬(wàn)菌體接種的AS19-2與S19，分別觀察接種后2d、5d、8d小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，以此分析AS19-2與S19毒力的強(qiáng)弱。2結(jié)果2.1接種10萬(wàn)AS19-2和S19菌體，比較7d后小鼠脾臟分離的菌體數(shù)，從AS19-2接種小鼠分離菌體數(shù)，明顯少于的S19接種的，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表5-1。_表5-1從接種小鼠脾臟里分離的細(xì)菌數(shù)_小鼠編號(hào)(以發(fā)現(xiàn)在接種AS19-2小鼠接種S19小鼠的菌數(shù)量為先后)的脾臟發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌數(shù)脾臟發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌數(shù)14172413331243123116297278272.2接種不同細(xì)菌量、不同時(shí)期的小鼠臨床癥狀表現(xiàn)2.21用l百萬(wàn)菌體接種的小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀，見(jiàn)下表5-2。表5-2接種1百萬(wàn)菌體的小鼠臨床癥狀表現(xiàn)小鼠隨機(jī)編號(hào)用S19接種小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀用AS19-2接種小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀2d5d8d2d5d8d1ABCCCC2ABCcCC3AACcCC4AACcCC5AACccC6ADCccC7ADcccC8ADcccC注A.精神不振、B.所好轉(zhuǎn)、C.恢復(fù)正常D.無(wú)明顯表化2.2.2用1億菌體接種的小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀見(jiàn)表5-3表5-3接l億菌體的小鼠臨床癥狀表現(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注A.伏地、聚群、畏寒;B.有所好轉(zhuǎn);C.無(wú)明顯變化2.2.3用2億菌體接種的小鼠表現(xiàn)的性狀5-4表5-4接種2億菌體的小鼠臨床癥狀表現(xiàn)小鼠隨接種S19小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀接種AS19-2小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀機(jī)編號(hào)2d5d8d2d5d8d1AABCDE2AABCDEAAFcDE4AFcDEAFcDE6AFcDE7FcDE8FcDE:A.伏地、聚群、畏寒、行走困難;B.伏地、畏寒；C.精神不振、聚群、寒；D.精神不振;E.明顯好轉(zhuǎn);F.死亡3小結(jié)布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型十分重要，通常要選擇能造成類(lèi)似于人和大動(dòng)物的病理?yè)p害的動(dòng)物模型較難。理想的動(dòng)物模型應(yīng)具備四個(gè)條件，即能經(jīng)相同的自然途徑感染，敏感性一致，類(lèi)似的臨床體征和病理學(xué)改變。本實(shí)驗(yàn)初步對(duì)AS19-2的毒力進(jìn)了研究。與S19相比AS19-2毒力明顯減弱。即使用AS19-2高濃度接種小鼠，所引發(fā)的癥狀與未接種小鼠相比不太明顯。實(shí)施例4:布魯氏菌BP26蛋白基因的克隆、表達(dá)及純化布魯氏菌BP26蛋白是一種具有強(qiáng)免疫原性的外周漿蛋白。它由細(xì)胞內(nèi)向外釋放，具有可溶性，相對(duì)于固定的外膜蛋白易于檢測(cè)。有報(bào)道顯示在感染布魯氏菌的牛、羊、山羊和人類(lèi)中都可以檢測(cè)到BP26蛋白抗體的存在。使用BP26蛋白作為檢測(cè)抗原，應(yīng)該有較高的準(zhǔn)確性。本發(fā)明克隆了布魯氏菌的BP26蛋白基因，并進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)親和層析進(jìn)行了純化。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株與、質(zhì)粒、載體布魯氏菌S19、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21和pET28a+本研究室保存；pMD18-Tsimplevector購(gòu)自TakaRa公司。1.1.2儀器分光光度計(jì)Lambda3B(UV/V/S)，Perkin-ELMER;脫色搖床TY-80B,南京大學(xué)；其它儀器同前二章。1.1.3限制性內(nèi)切酶及其它試劑限制性內(nèi)切酶Ndel、EcoRI、Sacl、HindIII、SalI和T4DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司。DNA回收試劑盒同第一章；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體購(gòu)自鼎國(guó)生物公司；RNase購(gòu)于華美生物工程公司；IPTG及TMB購(gòu)自Sigma公司；PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品；丙烯酸胺、雙甲基丙烯酞胺、低分子量蛋白Marker購(gòu)自TaKaRa公司；布魯氏菌陽(yáng)性牛血清本室研制，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG購(gòu)自鼎國(guó)生物公司；金屬鰲合層析介質(zhì)S印harose-4-B購(gòu)自Pharmacia公司。1.1.4主要試劑的配制1.1.4.1SDS-PAGE試劑30%(w/v)Acrylamidel00mL:稱(chēng)取29gAcrylamidelgBIS置于100mL燒杯中，加入約80mL的去離子水后，加熱使之溶解，加去離子水將溶液定容至100mL，用0.45um過(guò)濾膜過(guò)濾除雜質(zhì)，于棕色瓶中4。C保存。1.5mol/L(pH8.0)Tris-HC1緩沖液18.17gTris加入90mol/LdH20使之溶解，用濃HC1調(diào)pH值至8.0，最后加dH20定容至IOOmL;1.0mol/L(pH6.8)Tris-HCl緩沖液2.llgTris加入90mL朋20使之溶解，濃HC1調(diào)pH值至6.8，最后加dH20定容至100mL;10%SDS:稱(chēng)取電泳級(jí)SDS10g，加入90mLdH20使之溶解，調(diào)pH值至7.2，最后加dH20定容至IOOmL;10鬼(w/v)過(guò)硫酸胺lmL:稱(chēng)取100g過(guò)硫酸胺，加入lraL的去離子水后，充分?jǐn)嚢枞芙?，?'C保存，不宜久放；IOX電極緩沖液3gTris、14.4g甘氨酸、lgSDS，dH20定容至1000mL;2XSDS上樣緩沖液2.0mL甘油、lmL2-巰基乙醇、0.6gSDS、1.OmL1%溴酚藍(lán)、2.5mL1.Omol/LpH6.8Tris-HCl，dH20定容至10mL;考馬斯亮藍(lán)R-250染色液稱(chēng)取lg考馬斯亮藍(lán)R-250，置于IOOOraL燒杯中，加入250mL的異丙醇，100mL冰醋酸，650mL去離子水后，充分?jǐn)嚢枞芙?，過(guò)濾除去顆粒物質(zhì)后，室溫保存；脫色液量取50mL的乙醇、100mL冰醋酸、850mL去離子水，置于IOOOmL燒杯中，充分混合后待用。1.1.4.2Westernblot檢測(cè)試劑轉(zhuǎn)移緩沖液甘氨酸2.9g、Trisbase5.8g、SDS0.37g、甲醇200mL,調(diào)pH8.3加水至1000mL;封閉液含3%BSA的TBS;洗滌液TBST(O.05%Tween-20):稱(chēng)取8.8gNaCl，加入于800mL去離子水，充分溶解后，加入20mLpH8.01.0mol/LTris-HC1、0.5mLTween20，定容至1000mL。1.1.5培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基在950mldH20中加入細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨10g，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，NaCl10g,完全溶解后用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，12rC高壓下蒸汽滅菌20min，4'C保存。LB固體培養(yǎng)基在1LLB液體培養(yǎng)基中加入30g的瓊脂粉，高壓滅菌。1.2方法1.2.1目的基因的擴(kuò)增與克隆根據(jù)Bp26基因的序列以及pMD18-Tsimplevector和pET28a+表達(dá)載體的特點(diǎn)分別設(shè)計(jì)兩端含有限制性內(nèi)切酶NdeI、SalI酶切位點(diǎn)的引物上游5'-CATATGCAGGAGAATCAGATGACGACG-3'下游5'-GTCGACTTACTTGATTTCAAAAACGACATT-3'用PCR的方法從S19基因組中擴(kuò)增出Bp26基因片段。PCR條件為95'C預(yù)變性5min;94。C變性2min，55。C退火lmin，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-Tsimplevector相連構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDBp26，重組質(zhì)粒pMDBp26送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。1.2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pETBp26的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NdeI與SalI同時(shí)消化pMDBp26與pET28a+，分別凝膠回收純化Bp26與pET28a+基因片段。取目的片段l叱、載體3ul混合后，加10XLigationbuffer2ul，T4DNA連接酶lul，加無(wú)菌去離子水到20叱。混勻后置4。C連接過(guò)夜。在無(wú)菌條件取連接產(chǎn)物10u1，加入到200mLfco"'.DH5a感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化(涂板時(shí)加IPTG、X-gal)。1.2.3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌將質(zhì)粒快速轉(zhuǎn)化受體菌將1叱質(zhì)粒加入到冰浴的己融化的BL21感受態(tài)細(xì)菌中，輕輕混勻。繼續(xù)冰浴30min，42。C熱休克90s后，立即冰浴3min。將處理過(guò)的全部感受態(tài)菌鋪到預(yù)先在37。C預(yù)熱的含50ug/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均勻涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。37-C孵箱過(guò)夜培養(yǎng)。1.2.4融合蛋白BP26-His的表達(dá)。取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種到3ml含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培養(yǎng)液中。于搖床中37'C，轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)4h至0De。。值達(dá)0.38。取出lmL未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)移到另一管中，12000轉(zhuǎn)離心lmin，棄上清，保留菌體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照。剩余培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度lmmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，37。C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)。4h后，收集菌體。1.2.5SDS-PAGE電泳(1)洗凈玻璃板，固定在電泳槽上。按分子克隆的配方配制12y。的分離膠20mL，迅速注入兩玻璃板之間，膠頂覆蓋lmL雙蒸水。待分離膠凝固后傾出覆蓋層液體，用去離子水沖洗凝膠頂部數(shù)次，倒置空干液體，加入5mL5%的積層膠溶液，插上梳子，垂直放置電泳槽使其凝固。(2)小心移去梳子，在電泳裝置上、下槽間加入Tris-甘氨酸緩沖液，將電源負(fù)極與上槽相連。(3)將細(xì)菌沉淀重懸于100ul1XSDS凝膠加樣緩沖液中，煮沸15min。取20叱上樣，用55V電壓電泳至浪酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，把電壓提高到110V，繼續(xù)電泳至澳酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。(4)染色取下凝膠用蒸餾水沖洗，用5倍凝膠體積的考馬斯亮藍(lán)染色液(45mL甲醇、45mL水、10mL冰醋酸中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán))浸泡凝膠，放在脫色搖床上室溫染色3h。(5)脫色用含30%甲醇、10%冰乙酸的混合液，在脫色搖床上脫色過(guò)夜，其間更換脫色液34次，待藍(lán)色背景完全脫凈后，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。1.2.6Western-blot免疫鑒定1.2.6.1制膜當(dāng)SDS-PAGE行將結(jié)束時(shí)，切8張濾紙和1張PVDF膜，其大小略小于凝膠。用剪刀在濾膜一角作好標(biāo)記。把硝酸纖維素濾膜漂浮于一盤(pán)去離子水中，借毛細(xì)作用使之從下往上濕潤(rùn)后，將之浸沒(méi)于水中，浸泡5rain以上以驅(qū)除留于濾膜上的氣泡。在一淺托盤(pán)中加入250ml轉(zhuǎn)移緩沖液，把濾紙浸泡于其中。戴上手套按如下方法安裝轉(zhuǎn)移裝置平放底部電極(為陽(yáng)極)，石墨電極朝上。在這一電極上放置3張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過(guò)的濾紙，逐張疊放，精確對(duì)齊，然后用一玻璃移液管作滾筒以擠出氣泡。把PVDF膜放在濾紙上，要保證精確對(duì)齊，而且在3mra濾紙與硝酸纖維素濾膜之間并不留有氣泡。從電泳槽上撤出放置SDS聚丙烯酰胺凝膠的玻璃，把凝膠轉(zhuǎn)移到一盤(pán)去離子水中略微漂洗一下，然后準(zhǔn)確平放于PVDF膜上。把凝膠左下角置于PVDF膜的標(biāo)記角上，排除所有氣泡。把最后3張3S1濾紙放在凝膠上方，同樣須確保各層精確對(duì)齊并不留氣泡。1.2.6.2轉(zhuǎn)膜將陰極放于濾紙上，石墨一邊朝下。接電源(將陽(yáng)極導(dǎo)線接于底部石墨電極)，根據(jù)凝膠面積按0.65mA/cm接通電流，4'C轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，拆卸轉(zhuǎn)移裝置。1.2.6.3封閉把PVDF膜放入覆蓋有塑料膜的小托盤(pán)中，根據(jù)濾膜面積以O(shè).lmL/cm2的量加入封閉液，平放在平緩搖動(dòng)的搖床上，于室溫?fù)u動(dòng)1.5h。1.2.6.4與第一抗體的結(jié)合按0.1mL/cm2的量加入第一抗體。將濾膜平放在平緩搖動(dòng)的搖床上，于4'C溫育2h。1.2.6.5與第二抗體的結(jié)合用50mlTBST洗滌3次，每次10min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(l:5000稀釋)，于室溫平緩搖動(dòng)2h。1.2.6.6顯色用50mlTBST洗滌4次，每次10min。加入O.4mlTMB顯色至目的條帶清晰，加蒸餾水終止反應(yīng)。1.2.7親和層析純化重組蛋白1.2.7.1菌體的裂解每克菌(濕重)加入3ml裂解緩沖液(pH7.920mmol/LTris-HC1，5mmol/Limidazole,0.5mmol/LNaCl)，重懸細(xì)菌沉淀。按每毫升裂解緩沖液加入10u1MgS04(lmol/L)，10ii1Dnase(2mg/mL)，2iUPMSF(50mmol/L)的比例，加入上述三種試劑，冰上孵育30min5000轉(zhuǎn)離心15min收集沉淀，按每克菌濕重加入5ml結(jié)合緩沖液的比例，將沉淀用結(jié)合緩沖液重懸，-7(TC放置過(guò)夜。將-7(TC放置的菌液冰上融化后，超聲破碎菌體。5000rpm，4。C離心15min，收集上清。-7(TC保存或立即用于純化。1.2.7.2親和層析柱的準(zhǔn)備準(zhǔn)備好層析柱，用記號(hào)筆做好標(biāo)記。用磷酸鹽緩沖液充滿35cm柱高，封閉出口。懸浮親和層析介質(zhì)，把它裝入柱內(nèi)。讓柱開(kāi)始流動(dòng)并加入更多的介質(zhì)，一直到介質(zhì)水平達(dá)到合適的柱高。打開(kāi)出口，加磷酸鹽緩沖液，增加流速使介質(zhì)下沉，持續(xù)沖洗直到柱床高度恒定為止。將2個(gè)柱體積的20mmol/LNiS(^金屬離子溶液勻速通過(guò)層析柱。用5個(gè)柱床體積的蒸餾水洗柱。用5個(gè)柱床體積的結(jié)合緩沖液沖洗柱。1.2.7.3重組蛋白的親和層析樣品的吸附與洗滌將待純化的樣品加到金屬鰲合的柱中，并以最佳流速讓其流過(guò)柱床。用洗滌緩沖液洗柱，一直到流出樣品的紫外監(jiān)測(cè)值為基線水平。目的蛋白的洗脫加入洗脫緩沖液，待紫外監(jiān)測(cè)儀數(shù)值上升時(shí)開(kāi)始接樣，隨數(shù)值上升可分段接樣。直到數(shù)值回落后一段時(shí)間停止接樣。清洗和再生層析結(jié)束后，用50mmol/LEDTA，l國(guó)ol/LNaCl，pH78清洗柱使金屬離子解離下來(lái)。然后用新鮮的金屬離子再生后開(kāi)始下一輪的純化。2結(jié)果2.1Bp26基因的擴(kuò)增與克隆2.1.l用PCR方法從布魯氏菌基因組中擴(kuò)增出630bp條帶，與Bp26理論大小值相符，如圖9;2.1.2把目標(biāo)基因克隆到T載體上，提取質(zhì)粒，與環(huán)形pMDBp26理論大小值相符，見(jiàn)圖IO。2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pETBp26的鑒定重組質(zhì)粒pETBp26用NdeI+SalI酶切消化后可見(jiàn)與pET28a及Bp26基因大小相符的條帶，如圖ll。1:DNAmarkerDL2000;2:recombinantplasmidpETBp26digestedwithNdeI+SalI(694bp)3:1Kbmarker2.3Bp26蛋白在大腸桿菌BL21中表達(dá)2.3.1SDS-PAGE分析把重組質(zhì)粒pETBp26轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，挑選陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)到0K38時(shí)，加入IPTG到最終濃度lmmol/L，分別誘導(dǎo)2、3、4小時(shí)，觀察Bp26蛋白在大腸桿菌BL21中表達(dá)情況，分析認(rèn)為誘導(dǎo)4個(gè)小時(shí)的表達(dá)量最高。SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖12。2.3.2Bp26蛋白在大腸桿菌體總蛋白含量的測(cè)定將待檢菌體蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，脫色完全后用CS-9000雙薄層掃描儀分別對(duì)電泳條帶進(jìn)行掃描(圖13)，結(jié)果，表達(dá)的重組蛋白Bp26占上清總蛋白量的23.25%。2.4融合蛋白親合層析純化SDS-PAGE分析純化的BP26蛋白可見(jiàn)只有一條帶，如圖14所示，凝膠薄層掃描分析純度為89%。2.5免疫印跡在29kDa左右出現(xiàn)了特異性帶，如圖15所示。實(shí)施例5布魯氏菌S19與AS19-2鑒別診斷方法的建立用純化的BP26蛋白可以區(qū)別開(kāi)野毒株感染與AS19-2接種動(dòng)物。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一理論，用S19與AS19-2接種小鼠實(shí)驗(yàn)，初步建立了這一診斷方法。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株布魯氏菌S19本研究室保存；AS19-2見(jiàn)第二章。1.1.2ELISA試劑配制(1)包被液碳酸鹽緩沖液Na2C03(無(wú)水碳酸鈉)1.6g，NaHC03(碳酸氫鈉)2.9g，加去離子水至lOOOmL。(2)洗滌液PH9.2磷酸鹽緩沖液(Tween-20)Na2HP0412H202.9g，KC10.2g，KH2P040.2g，NaCl18g，吐溫-200.5mL加去離子水至lOOOmL(3)甲液0.lmol/L檸檬酸4.2g/200mL，乙液0.2mol/LNa臭12H2014.3g/200mL，取甲液24.3mL與乙液25.7mL混合，臨用前加20mg鄰苯胺(OPD)，加過(guò)氧化氫(HA)0.02mL。(4〉終止液2mol/LH2S04溶液取分析純濃硫酸110mL，加去離子水至100mL。1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明鼠購(gòu)自長(zhǎng)春市生物制品所1.2方法1.2.1布魯氏菌接種小鼠前的處理用PBS洗兩次，然后用生理鹽水稀釋到1億/mL。1.2.2實(shí)驗(yàn)小鼠的接種把布魯菌S19與AS19-2培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用生理鹽水洗滌三次；用生理鹽水稀釋到目的濃度；對(duì)小鼠采用腹腔注射。1.2.3被檢動(dòng)物血清的制備對(duì)用S19與AS19-2免疫14天的小鼠斷尾采血，血樣在4'C冰箱放置3個(gè)小時(shí)后，5000rpm離心5min，取上清即為制備血清。1.2.4檢測(cè)方法(1)ELISA檢測(cè)按常規(guī)方法進(jìn)行，將純化的目的蛋白IO倍稀釋后包被酶標(biāo)板，用被檢動(dòng)物血清l:IOO稀釋作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgGl:200稀釋作為二抗。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)陰性和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作對(duì)照。(2)操作過(guò)程用微量移液器向每個(gè)孔內(nèi)加IOO化包被液稀釋的蛋白樣品，置濕盒內(nèi)于37°0直溫培養(yǎng)箱中l(wèi)h，然后于4'C冰箱中包被過(guò)夜。次日，用洗滌液洗滌二次，甩去洗滌液，倒置在紗布上輕輕拍扣使孔內(nèi)的液體充分流出，每次間隔3min。向孔內(nèi)分別加入用稀釋液稀釋好的1:100陽(yáng)性血清、陰性血清0.lmL,置濕盒內(nèi)于37'C恒溫箱中反應(yīng)lh后，甩去血清，用上面的方法洗滌3次，再加入稀釋好的1:200酶標(biāo)記兔抗牛IgG0.lmL，置于濕盒內(nèi)于37"C恒溫箱靜置，甩去殘留的酶標(biāo)記物溶液，以同法洗滌三次。加入底物溶液10014VmL，置濕盒內(nèi)于37。C恒溫箱中靜置30min，取出后立即向孔內(nèi)加入0.02mL終止液，終止反應(yīng)。(3)結(jié)果判定將培養(yǎng)板放入分光光度計(jì)讀取450吸收波的OD值。2結(jié)果2.1用BP26蛋白區(qū)分接種10萬(wàn)S19與AS19-2菌體，7d后的小鼠將純化的BP26蛋白作抗原，用ELISA法檢測(cè)S19與AS19-2接種7d的小鼠血清中是否含有BP26蛋白的抗體，很易容區(qū)分S19和AS19-2接種的小鼠。具體ELISA讀數(shù)如表4-l。表4-1S19與AS19-2接種小鼠7d后ELISA檢測(cè)血清結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>32000.9450.8700.8410.4790.0640.0560.0610.0620.05564000.5200.5950.6230.2360.0420.0430.0500.0460.056128000.2420.4150.2900,1690.0380.0280.0360.0250,050256000.1660.2000.1530.0960.0600.0170.0230.0100.0452.3結(jié)果判讀從2.1、2.2中的可以明顯分辨出S19與AS19-2接種的差異。權(quán)利要求1.一種可區(qū)分自然感染或野毒感染的布魯氏菌弱毒疫苗ΔS19-1，特征在于布魯氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成ΔS19-1。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的布魯氏菌弱毒疫苗AS19-2，特征在于:△S19-1毒力基因Bmpl8缺失而成弱毒疫苗株AS19-2。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2限定的疫苗制備方法，其特征在于根據(jù)布魯氏菌基因組序列，設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增出分子目標(biāo)基因Bp26同源重組的引導(dǎo)序列，在T載體上對(duì)其進(jìn)行改造，在它的中間用限制性內(nèi)切酶去除其中的500bp，在這個(gè)位置上連接上LucNF+基因，破壞了Bp26的原有序列，然后把改造好的基因片段連入自殺性的質(zhì)粒上pBLs。4、根據(jù)權(quán)利要求3限定的疫苗制備方法，其特征在于主要包括以下步驟(1)以布魯氏菌弱毒疫苗基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法，擴(kuò)增出分子標(biāo)記目標(biāo)基因的同源重組引導(dǎo)序列，而后克隆到T載體上對(duì)目標(biāo)基因改造；(2)用(1)得到的基因片段與復(fù)制啟動(dòng)子為pUCoir的載體相連，而后將sacB基因連接到這個(gè)載體的適當(dāng)位置，構(gòu)建成同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)；(3)使步驟(2)得到的重組載體轉(zhuǎn)化到布魯氏菌中去；利用同源重組載體自帶的篩選標(biāo)記篩出同源重組單交換子，利用sacB基因篩選出同源重組的雙交換子，得到本發(fā)明的分子標(biāo)記疫苗株AS19-1;(4)重新設(shè)計(jì)引物，從布魯氏菌基因組中，擴(kuò)增出目標(biāo)毒力基因的同源重組引導(dǎo)序列，使用(1)(3)的方法使AS19-1的毒力缺失，得到本發(fā)明的分子標(biāo)記、毒力缺失弱毒疫苗株AS19-2。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的弱毒疫苗株為S19。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的分子標(biāo)記目標(biāo)基因?yàn)锽p26。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的分子標(biāo)記目標(biāo)基因是指用限制性內(nèi)切酶切除其中500bp，而后在這個(gè)位置上連接上LucNF+報(bào)告基因。8、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)目標(biāo)蛋白是BP26蛋白。9、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的目標(biāo)毒力基因是Bmpl8基因。10、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)目標(biāo)毒力基因改造是指用限制性內(nèi)切酶切除其中的200bp，而后使之相聯(lián)。全文摘要本發(fā)明涉及布魯氏菌疫苗，特別是涉及了布魯氏菌疫苗株的分子標(biāo)記與毒力基因缺失。本研究通過(guò)構(gòu)建自殺質(zhì)粒，采用定向同源重組的方法(基因打靶)，將螢光素酶改造基因(LucNF+)代替了布魯氏菌弱毒疫苗S19株Bp26基因部分片段，破壞了其免疫原性蛋白BP26的表達(dá)，構(gòu)建了布魯氏菌Bp26基因缺失突變株ΔS19-1。BMP18蛋白是布魯氏菌主要的毒力因子之一。采用相同的方法剔除了ΔS19-1的Bmp18基因，使其不表達(dá)Bmp18蛋白，構(gòu)建成了布魯氏菌毒力基因缺失突變株ΔS19-2。本發(fā)明解決了常規(guī)的布魯氏菌疫苗不能區(qū)分人與動(dòng)物是人工免疫接種還是野生菌感染、病毒強(qiáng)，容易使接種的人與動(dòng)物發(fā)病的問(wèn)題。對(duì)布魯氏菌的監(jiān)測(cè)、診斷、凈化各控制具有重要意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A61K39/10GK101185756SQ20071005600公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2007年8月29日優(yōu)先權(quán)日2007年8月29日發(fā)明者王興龍,閆廣謀申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所