專利名稱：干擾人甲胎蛋白基因的siRNA及重組腺病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，特別是涉及一種干擾人甲胎蛋白基因的siRNA及一種表達針對 人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒。
背景技術：
原發(fā)性肝癌(或稱肝細胞癌，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國的惡性腫瘤 中死亡率居第二位。因此，對原發(fā)性肝癌的病因和治療學等方面的研究始終是腫瘤學研究 中的熱點問題。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)作為肝癌特異性最強的腫瘤標記物， 是診斷肝癌的主要指標。
AFP其合成部位主要是在胚胎的肝臟，但也可在卵黃囊及胃腸道等。在正常情況下，AFP 的功能可能主要在于維持正常妊娠，并保持胚胎不受母體排斥。AFP在成人血清的重新出現 提示病理情況的出現，特別是肝癌和惡性畸胎瘤。因而過去AFP—直被認為是診斷原發(fā)性肝 癌的特異性腫瘤標志物，具有早期診斷、鑒別'診斷及確立診斷的作用。動態(tài)測定血清甲胎 蛋白對肝癌手術、化療、中西醫(yī)結合治療、放療等療效及預后判斷有其重要的臨床價值。
AFP在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的診斷價值是勿庸置疑的，但是AFP調節(jié)腫瘤細胞生長的生物 學作用卻未得到重視。近十幾年，研究者們發(fā)現甲胎蛋白是一種與腫瘤細胞生長密切相關 的內源性蛋白，而不僅僅是單純作為一種伴隨出現的腫瘤特異性蛋白而存在。目前，人們 已經認識到AFP的臨床潛在作用(①Mizejewski GJ, Biological role of ti丄pha-fetoprotein in cancer: prospects for anticancer therapy. Expert Rev Anticancer Ther. 2002 Dec; 2 (6) : 709-35. ②Mizejewski GJ, Muehle腿nn M, Da叩hinee M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 2006;52(2) :83-90. ③Muehlemarm M， Miller KD， Dauphinee M， Mizejewski GJ. Review of Growth Inhibitory Peptide as a biotherapeutic agent for tumor growth, adhesion, and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 2005 S印;24(3) :441-67.)，其研究主要集中于以下幾個方面(1) AFP可作為抗腫 瘤藥物的結合物。研究顯示AFP通過受體介導的細胞內吞途徑容易結合并選擇性進入腫瘤 細胞。(2) AFP在細胞生長過程中的生長調節(jié)作用。有研究表明AFP在多種腫瘤細胞與正 常細胞中表現有生長調節(jié)活性。AFP在高濃度的情況下以誘導細胞發(fā)生凋亡的形式體外抑 制多種腫瘤細胞的生長。AFP還可以通過胞漿信號傳導過程中蛋白與蛋白間的相互作用調 矜:細胞生長。并且，AFP及其來源的肽段可以介導G蛋白偶聯(lián)的信號轉導從而調節(jié)細胞的
生長。(3) AFP作為重要的蛋白因子可影響腫瘤免疫。(4) AFP來源的生長抑制肽 (growth-inhibitory p印tide， GIP)可作為抗腫瘤的生物治療劑。GIP可以有效地抑制 腫瘤的生長和轉移，但對正常的成人細胞無影響。
近年來，有研究報道一些AFP型別可作為雙向調節(jié)因子促進和抑制細胞的生長。在多種 細胞類型中，如肝、胎盤、卵巢、子宮、淋巴、表皮、內皮、乳房和特定類型的腫瘤中， AFP上調和下調生長與分化的能力是與劑量密切相關的。外源性高劑量(〉100ixg/ml)的AFP 在體外實驗中表現為生長抑制，可誘導腫瘤細胞的死亡，這種現象出現于多種腫瘤細胞， 包括肝癌細胞H印G2，鼠的原始纖維細胞瘤細胞L-929和乳腺癌細胞MCF-7等。而低劑量的AFP (<100ug/ml)則不但不能抑制細胞的生長，反而顯示出輕微的刺激生長的效應。這些體 外實驗的數據表明AFP促進或抑制生長的作用與AFP的濃度密切相關。推測AFP調控細胞生長 的可能機制包括凋亡調節(jié)、胞漿信號調節(jié)和受體脫敏等作用。最近幾年，研究者發(fā)現AFP 通過與細胞表面的受體結合，激活cAMP-PKA信號轉導途徑，改變K-rasp21基因的表達，進 而影響細胞增殖。但是肝癌細胞本身表達的AFP對肝癌細胞的生長影響尚不清楚。因而本發(fā) 明以確定內源性的AFP對肝癌細胞生長的影響為目標，采用了最為有效的抑制內源性基因表 達的技術(即RNA干擾技術)。
核糖核酸干擾技術(RNAi)被評為2002年十大科技熱點之一的是近年來發(fā)現的生物系 統(tǒng)的一種比反義核酸更為有效的細胞內基因干擾系統(tǒng)[①Fire A, et al. Potent and specific genetic interference by double-strand RNA in Caenorhabditis elegans ， Nature《自然雜志》1998,391:806-871. ②Tuschl T, et al. Target mRNA dergradation by double-strand腿in vitro. Gene & Development 《基因與進化雜志》 1999,13:3191-3197]，或基因免疫系統(tǒng)即細胞內雙鏈核糖核酸(dsRNA)介導對其相應單鏈 靶序列特異性降解，達到阻止目標基因的表達，這種雙鏈RNA作用效果好，比反義RNA(基 因是單鏈)對RNA降解酶的抵抗力要強。在植物中可對外源性感染的病毒在基因(RNA)水 平上進行有效的降解，從而達到抵抗病毒感染的作用[Voinnet 0. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics《遺傳學趨勢雜志》 2001， 17(8) :449-459]。但是這種雙鏈核苷酸與一般化學藥物相比的缺點是其分子量比較 大，制備合成時的技術要求相對復雜。
人們進一步發(fā)現雙鏈RNA在降解過程中是通過裂解成21-25堿基的雙鏈RNA (稱為小 干擾性RNA， siRNA)而發(fā)揮直接作用的[Elbashir SM, et al. Duplexes of 21-nucleotides RNAs mediated RNA interference in cultured mammalian cells. Nature《自然雜志》 2001,411:494-498]。根據這些原理，Gitlin等利用合成的小干擾性RNA特異阻止了脊髓 灰質炎(Polio)病毒在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的繁殖[Gitlin L， et al. Short interfering RNA confers intrcellular activiral immunity in human cells . Nature《自然雜志》 2002,418:430-434]，對丙型肝炎病毒的基因表達在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的抑制可達90%以上 [Willson JA， et al. RNA interference block gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cell.Proc . Natl, Acad. Sci. 《美
國國家科學院院刊》2003, 100(5) : 2783-2788],和在小鼠體內對丙型肝炎病毒的抑制作 用[McCaffrey AP， et al. RNA interference in adult mice. Nature 《自然雜志》 2002,418:38-39]等。這些研究結果已表明RNA干擾技術原理已作為一種有效的新藥開發(fā) 途徑。因而，本發(fā)明選用了使用比反義核酸技術更為有效的核糖核酸干擾技術(RNAi)作 為抑制肝癌細胞內源性AFP功能的一種手段，并研發(fā)抑制甲胎蛋白(AFP)性的抗腫瘤藥物 或處理方法。 _
到目前為止合成siRNA的方法主要有三大類化學合成dsRNAs;體外生物轉錄雙鏈/ 發(fā)夾結構RNAs (small hairpin RNA， shRNA);利用質?；虿《倔w內轉錄雙鏈/發(fā)夾結構 RNAs。但由于化學方法合成，其價格非常昂貴而且它誘導的基因沉默具有一過性的特點， 因而在此之后又產生了基因工程技術途徑合成的方法。siRNAs合成體外直dsRNA體外生物 轉錄雙鏈/發(fā)夾結構RNAs (small hairpin RNA， shRNA)再導入有機體內；利用適當的質 ?；蛘卟《据d體嵌入目的基因片段(一種人工設計shRNA的RNA分子)轉入有機體后進行表 達發(fā)夾結構RNAs，在體內加工為成熟的siRNA，從而引發(fā)基因沉默的作用。
我們在本發(fā)明中選擇了腺病毒載體。因為目前，將遺傳性物質導入人源性細胞最普遍 使用的載體即為腺病毒。腺病毒有幾大特點使其更適用于基因治療。首先，腺病毒非常普 遍?，F已從大量不同物種中分離出腺病毒，并且已有報道的血清型有100多種，其中人類 有43種。用于基因治療的腺病毒多數成年人已經有過接觸史(血清型2和5)。其次，腺 病毒載體可以快速感染多種人類細胞，并且和其他現有載體相比，腺病毒載體趨向于產生 高水平的轉移基因產物。第三，腺病毒載體在人體中具有較低的致病性它可以導致較輕 癥狀的普通感冒。第四，.腺病毒載體可以容納相對較大的DNA片段(大于7.5kb)并可在 非增殖細胞中轉導這些基因。第五，病毒基因組的重排幾率較低，插入的外源性基因在連 續(xù)的病毒復制過程中通常不會發(fā)生改變。最后，腺病毒載體通過應用DNA重組技術比較容 易操作。亞臨床研究顯示腺病毒載體DNA通常表達于肝，骨骼肌，心臟，肺，胰和腫瘤組 織(Stephan A. Vorburger， Kelly K. Hunt. Adenoviral Gene Therapy. Oncologist, 2002;7(1) :46-59)。當腺病毒載體通過靜脈給入時，多數病毒集中于肝臟。因此，這將有 利于肝癌的基因治療
發(fā)明內容
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本發(fā)明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種干擾人甲胎蛋白基因的siRNA。 本發(fā)明的第二個目的是衝共一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒。 本發(fā)明的第三個目的是衝共一種采用siRNA干擾技術開發(fā)針對人甲胎蛋白基因mRNA(cDNA)
全長2032個堿基序列為基礎的臨床應用產品。 本發(fā)明的技術方案概述如下
一種干擾人甲胎蛋白基因的siRNA，具有序列表SEQ ID No l所述的寡核苷酸序列，和 序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列。
一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒(Adv-AFPsiRNA)，是用下述方法構建的
(1) 以人甲胎蛋白基因mRNA全長2032個堿基序列，應用軟件進行小干擾RNA預測設計， 篩選出最佳的RNA干擾靶位點區(qū)域，并針對此區(qū)域設計出干擾人甲胎蛋白基因的siRNA， 發(fā)卡狀siRNA及其發(fā)卡狀siRNA互補的cDNA雙鏈，所述干擾人甲胎蛋白基因的si認A為序 列表SEQ ID No l所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列，所 述cDNA雙鏈為序列表SEQ ID No 3所述的寡核苷酸序列，序列表SEQ ID No 4所述的寡核 苷酸序列；
(2) 合成SEQ ID No 3所述的寡核苷酸序列，SEQ ID No 4所述的寡核苷酸序列，退火， 分別插入到pENTR/U6載體，構建成pENTR/U6/AFPsiRNA,轉插入pAD/BLOCK-ITTM-DEST載體， 構建成了重組表達干擾AFPsiRNA的pAD/BLOCK-IT -DEST/AFPsiRNA載體；
(3) 轉染293A細胞，篩選出一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒。 采用siRNA干擾技術開發(fā)針對人甲胎蛋白基因mRNA (cDNA)全長2032個堿基序列為基礎
的臨床應用產 品。
本發(fā)明的特點是 -
1. 特異性強，針對肝癌特異性表達的甲胎蛋白的基因，對正常肝細胞及其它組織細胞不具 有明顯作用。
2. 效果明顯，體外及體內動物實驗均已表明一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組 腺病毒對肝癌細胞及已形成的肝腫瘤的生長都具有明顯的抑制作用。
3. 重組治療肝癌的腺病毒是一增殖缺陷的病毒，因而病毒本身在體內不能擴增，具有安全 性特點。
4. 易于制備和純化。.
圖l為治療肝癌的重組腺病毒(Adv-AFPsiRNA)對肝癌細胞(H印G2細胞)中AFP的表達 的有效而特異的抑制作用。
A圖中的C與B圖中的control代表空白對照H印G2細胞組。
Control:代表空白對照H印G2細胞組；Adv-LacZsiRNA:表達無關siRNA的重組腺病毒 組；Adv-AFPsiRNA:治療肝癌的重組腺病毒組。
A. Western blot結果顯示與對照相比，AFP的表達受到明顯抑制。
B. 柱形圖顯示與空白及陰性對照相比，AFPsiRNA對于耙蛋白表達的抑制率達75X。 圖2為治療肝癌的重組腺病毒(Adv-AFPsiRNA)對肝癌細胞(H印G2細胞)生長的抑制作用。
Adv-LacZsiRNA:表達無關siRNA的重組腺病毒組；Adv-AFPsiRNA:治療肝癌的重組腺 病毒組。
圖3為治療肝癌的重組腺病毒(Adv-AFPsiRNA)對(H印G2)肝癌腫瘤在裸鼠體內生長的 抑制作用。 Untreated: PBS緩沖液對照組；Adv-LacZsiRNA:表達無關siRNA的重組腺病毒組； Adv-AFPsiRNA:治療肝癌的重組腺病毒組
A. 顯示Adv-AFPsiRNA處理腫瘤組，Adv-LacZsiRNA處理腫瘤組與未處理腫瘤組之 間腫瘤體積的顯著性差異。在治療結束時從動物體內取出腫瘤，每組6只動物。
B. 顯示Adv-AFPsiRNA處理腫瘤組，Adv-LacZsiRNA處理腫瘤組與未處理腫瘤組之 間腫瘤體積的顯著性差異。Adv-AFPsiRNA處理腫瘤組與其他兩組的差異具有統(tǒng)計 學意義(p〈0.01)。而另兩組腫瘤體積并無統(tǒng)計學上的差異。
治療肝癌的重組腺病毒(含Adv-AFPsiRNA的有義鏈)可轉錄出發(fā)卡狀siRNA，形成SEQ ID No l和SEQ ID No 2，可以抑制甲胎蛋白基因轉錄的mRNA翻譯甲胎蛋白的過程，進而對肝癌 腫瘤的生長產生了抑制作用。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明作進一步的說明。
(1)以人甲胎蛋白基因mRNA (cDNA)全長2032個堿基序列，應用德國網上軟件進行 小干擾RNA (siRNA)預測設計，篩選出最佳的RNA干擾靶位點區(qū)域。并針對此區(qū)域設計出 了干擾人AFP的siRNA和發(fā)卡狀siRNA及其發(fā)卡狀siRNA互補的cDNA序列。
將發(fā)卡狀siRNA互補的cDNA的雙鏈(即有義鏈與反義鏈)由美國IDT公司(Iowa， USA) 合成。合成的序列為
發(fā)卡狀AFPsiRNA-有義鏈(SEQ ID No 3)
發(fā)卡狀AFPsiRNA-反義鏈(SEQ ID No 4)
SEQ ID No 3中從5'端的第6 —第26個堿基與SEQ ID No 2堿基序列互補，而第 33 _第53個堿基與SEQ ID No 1堿基序列互補，由SEQ ID No 3可轉錄出發(fā)卡狀 AFPsiRNA，從而形成SEQ ID No 1和SEQ ID No 2。
SEQ ID No 1: 5'UACAAGGAAGUAAGCAAAAUG3， SEQ ID No 2: 3'AUGUUCCUUCAUUCGUUUUAC 5， (5'CAUUUUCJCUUACUUCCUUGUA3，) 發(fā)卡狀無關siRNA-有義鏈
5，CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3'
發(fā)卡狀無關siRNA-反義鏈
5 ，隱AAAACTAC AC AAATC AGCGATTTTTCGA AATCGCTGATTTGTGTAGC-3 ，.
(2)將合成的發(fā)卡狀AFPsiRNA-有義鏈，發(fā)卡狀AFPsiRNA-反義鏈進行退火，同時合成的 發(fā)卡狀無關siRNA的有義鏈與發(fā)卡狀無關siRNA-反義鏈進行退火,分別插入到pENTR/U6載 體(Invitrogen， USA),構建成pENTR/U6/AFPsiRNA與pENTR/U6/LacZsiRNA載體，然后轉 插入pAD/BLOCK-IT -DEST載體(Invitrogen， USA)，從而構建成了重組表達干擾AFPs,iRNA
pAD/BLOCK-IT -DEST/AFPsiRNA和無關對照siRNA(LacZsiRNA)pAD/BLOCK-IT _DEST/ LacZsiRNA的載體，將此載體轉染293A細胞，篩選出重組表達干擾AFP siRNA的腺病毒， 大量制備，并滴定其病毒量。
將重組的腺病毒在體外培養(yǎng)的人肝癌細胞進行特異性AFP表達抑制實驗及其生長抑制 實驗。
在裸鼠體內肝癌移植模型中進行重組治療肝癌腺病毒實驗性研究。 本發(fā)明流程 1.質粒的構建
1.1 pENTR/U6/AFPsiRNA與pENTR/U6/LacZsiRNA的構建 設計有義鏈與反義DNA鏈。
AFP的首鏈DNA長寡聚物(SEQ ID No 3):
5' CACCGTACAAGGAAGTAAGCAAAATGTTCAAGAGACATTTTGCTT ACTTCC TTGTA—3' AFP的底鏈DNA長寡聚物(SEQ ID No 4):
5 ， -AAAATACAAGGAAGTAAGCAAAATGTCTCTTGAACATTTTGCTTAC TTCCTTGTAC-3' LacZ的首鏈DNA長寡聚物
5' -CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 ， LacZ的底鏈DNA長寡聚物 5 ， -AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3' (2)產生雙鏈DNA核苷酸(ds oligo)。
無菌離心管中，室溫下將首鏈DNA長寡聚物、底鏈DNA長寡聚物、退火緩沖液、 無DNase/RNase水混合，經變性、室溫下冷卻后，瞬時離心5秒，混合均勻，一20 'C保存。
(3) 退火混合物中取出l W按l: 20稀釋。
(4) 檢測DNA雙鏈退火效果。
應用5W1: 20稀釋度的溶液進行檢測，并與相應濃度的起始DNA單鏈進行比較。 3%瓊脂糖膠電泳，80V， 30分鐘。
(5) 連接反應
室溫下將連接緩沖液、pENTR /U6、產生的雙鏈DNA核苷酸(ds oligo)、無 DNase/RNase水和T4 DNA連接酶混合，反復吹打均勻，室溫下孵育兩小時，這樣 就將DNA雙鏈克隆入pENTRTM/U6載體。
(6) 用連接反應物轉化TOPIO感受態(tài)E. coli。
A. 連接反應物與TOPIO感受態(tài)E. coli混合，冰上放置，經熱休克，再冰浴加入250 W S0C培養(yǎng)基，37'C水平振蕩1小時，取出適量的轉化液體，鋪于預熱好的含有50 Pg/ml 卡那霉素的LB瓊脂板上，37'C孵育過夜，挑取10個克隆進行檢測
(7) 分析轉化株
A. 挑取IO個卡那霉素抗性的克隆，在含有50化/ml卡那霉素的LB或SOB培養(yǎng)液中
培養(yǎng)過夜。
B. 堿裂解法小量提取質粒DNA。
C. 選定正確克隆，QIAGEN 100柱提取純化pENTR/U6/AFPsiRNA與 pENTR/U6/LacZsiRNA質粒。
1. 2 pAD/BLOCK-IT -DEST/AFPsiRNA和pAD/BLOCK-IT -DEST/LacZsiRNA的構建
(1) 建立LR重組反應體系
pENTR/U6/AFPsiRNA (或LacZsiRNA) (150ng/反應) 5Ml pAD/BLOCK-ITTM-DEST (150ng>l) IW TE緩沖液，pH8. 0
LR克隆酶 扭l 混合均勻。
(2) 25。C18小時。
(3) 加入2W蛋白酶K溶液。37'C10分鐘。
(4) 取出2Pl轉化T0P10，篩選正確克隆并純化。
2治療肝癌的重組腺病毒(一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒)的制備與 滴定
2. 1病毒的制備
(1)尸sc I內切酶處理質粒pAD/BLOCK-IT -DEST/AFPsiRNA (LacZsiRNA):
pAd/BLOCK-iTTM-DEST表達克隆轉染293A細胞前，必須暴露左右兩側的病毒ITRs 以進行正確的病毒復制和包裝。過程如下 ，
A. 應用尸ac I酶切5 Pg純化的pAD/BLOCK-ITTM-DEST/AFPsiRNA或pAD/BLOCK-IT -DEST/ LacZsi腿。
B. 酚/氯仿抽提純化酶切的質粒DNA，應用乙醇沉淀。
C. 用10W TE緩沖液，pH 8.0，重懸洗提純化的質粒。 (2)轉染293A細胞(生含有10XFBS的MEM-a培養(yǎng)液)
A. 制備DNA-LipofectAmine 2000復合體
稀釋l Pg尸ac I酶切的pAD/BLOCK-IT -DEST/AFPsiRNA (LacZsiRNA) 至250 Pl Opt i-MEM I無血清培養(yǎng)基中，混合均勻。
LipofectAmine 2000用前輕輕混勻，取3 W稀釋至250 W Opti-MEM I無血清培養(yǎng) 基中，混合均勻，室溫下孵育5分鐘。
將稀釋的DNA與LipofectAmine 2000混合均勻。
室溫下孵育20分鐘，使得DNALipofectAraineT" 2000復合體形成。
B. 在培養(yǎng)293A細胞的6孔板中，先更換不含抗生素10XFBS的MEM-a培養(yǎng)液。再將 DNA-LipofectAmine 2000復合體滴加入每孔中，混合均勻，37°C、 COJ瞎箱中孵
育過夜。次日，更換MEM-a完全培養(yǎng)基。
C. 每2 —3天更換5XFBS MEM-a培養(yǎng)基一次，直至可見細胞病變(CPE) G.更換培養(yǎng) 液，使得病變繼續(xù)進展，直至80^CPE產生
D. 將含有病毒的細胞由培養(yǎng)板上吹打下來，將細胞和培養(yǎng)液共同轉移至無菌的1.5ml 離心管中。
(3)制備病毒裂解粗提物
A. 將含有細胞和培養(yǎng)液的離心管在-8(TC放置30分鐘，再取出于室溫下融解。重復 兩次。
B. 臺式離心機離心細胞裂解物，室溫下3000轉/分鐘(936g)離心15分鐘以沉降細胞 碎片。
C. 將含有病毒顆粒的上清轉移分裝至1.5ml離心管中，每管lml，保存于-8(TC。 2. 2病毒的濃縮與純化
(1 ) 293A細胞傳至15cm玻璃平皿內，待生長至80—90%時，更換2%FBS的MEM-a ， 加入5X106 pfu重組腺病毒。37°C， 5%C02孵箱內孵育。
(2) 48小時，細胞病變達80%左右，小心吸取上清，保存于一8(TC。每平皿于細胞單 層上添加8mlPBS，于一8(TC反復凍融三次后與上清混合。
(3) 4°C, 7000轉/分鐘(5000g) 離心15分鐘，小心取上清。
(4) 加入3MNaCl 8ml，終濃度為0. 5M，充分混勻。
(5) 加入無菌的50%聚乙二醇(PEG8000) 9ml，至終濃度8%，充分混勻，4。C攪拌 過夜。
(6) 4'C， 10000g 30分鐘，棄上清。
(7) 400W PBS重懸沉淀，分裝至1.5ml離心管中，100W/管，保存于一80。C。 2.3滴定制備病毒
(1) 轉染前一天(第一天)，消化并計數293A細胞，以80-90%的密度傳入培養(yǎng)板中， 37'C過夜。
(2) 轉染當天(第二天)，融解病毒并準備10倍系列稀釋的液體，由10—4至10—9。對于 每個稀釋度，將病毒原液用2。/。FBS的MEM-a培養(yǎng)基稀釋至300W，注意不要渦旋。
(3) 棄去細胞培養(yǎng)液，將稀釋好的病毒液加入各孔中(總體積300ri)。
(4) 輕輕將培養(yǎng)基搖勻，37°C孵育5個小時。
(5) 棄去含有病毒的培養(yǎng)液并在每孔中加入lml瓊脂糖溶液覆蓋。制備瓊脂糖溶液方法 如下
A. 對于一塊24孔板，輕輕混合24ml 37。C預熱的培養(yǎng)液和2.4ml， 65匸預熱的4%瓊脂 糖，注意不要產生氣泡。
B. 將混合液小心延孔壁加入孔(每孔加入lml)中。 C.室溫下將24孔板水平放置直至瓊脂糖凝固。將24孔板放回37°C 、 0)2孵箱。
(6) 加入瓊脂糖膠3-4天后(第6 — 7天)，每孔再額外加入0.5ml瓊脂糖膠，制備過程 同上。待膠凝固后放回37'C 、 C0J瞎箱。
(7) 觀察平板直至可見空斑(通常感染后8 —12天)。計數空斑數即可得到病毒的滴度。
3.治療肝癌的重組腺病毒(一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒)體外對 H印G2細胞AFP表達及其生長抑制作用
3.1治療肝癌的重組腺病毒(一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒)體外對 H印G2細胞AFP表達，結果見圖l。
(1) 感染前一天，消化并計數H印G2細胞，以80-90%的密度傳入24孔培養(yǎng)板中，37'C過 夜。
(2) 感染當天，融解病毒并用2。/。FBS的MEM-a培養(yǎng)基稀釋病毒至300W， MOI = 20，充分 混勻。
(3) 棄去細胞培養(yǎng)液(24孔板)，將稀釋好的病毒液加入各孔中(總體積300ri)。
(4) 輕輕將培養(yǎng)基搖勻，37'C孵育5個小時。
(5) 棄去含有病毒的培養(yǎng)液并在每孔中加入10XFBS的MEM-a完全培養(yǎng)基，將24孔板放 回37 。C 、 C02孵箱。
(6) 48小時后獲取細胞進行分析。細胞用PBS清洗一次。
(7) 24孔板培養(yǎng)細胞，每孔加入100y 1RIPA; 6cm平皿培養(yǎng)細胞，每平皿加入400u 1RIPA。
置于4'C，裂解25分鐘。
(8) 收集裂解液，反復吹打20次，4°C 16000g，離心10分鐘，收集上清。
(9) 考馬司亮藍G-250法測定蛋白含量，各樣品均取出50ug進行10%聚丙烯酰胺凝 膠電泳。
(10) 目的蛋白電泳至膠體中部，取出聚丙烯酰胺凝膠進行硝酸纖維素膜電轉移。4'C， lOOmA，轉移過夜。
(11) 出硝酸纖維素膜，置于Blotto封閉液中，室溫下封閉3個小時。
(12) 加入一抗，室溫下孵育兩個小p。
(13) TBST清洗4次，每次5分鐘。
(14) 加入二抗，室溫下孵育一個小時。
(15) TBST清洗4次，每次5分鐘。
(16) 按照使用說明加入增強化學發(fā)光試劑，作用3分鐘，曝光，觀察結果。
3.2治療肝癌的重組腺病毒(一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒)體外對 H印G2細胞生長的抑制作用
采用克隆形成實驗，為檢測AFP靜默的H印G2細胞的增殖能力(克隆形成能力)，我們進 行了三次獨立的實驗，應用Adv-AFPsiRNA和Adv-LacZsiRNA分別感染H印G2細胞，以檢測
其克隆形成能力的差異。三種pSilencer2. l-U6neo/AFPsiRNA轉染H印G2細胞穩(wěn)定篩選克隆 和對照未處理H印G2細胞的克隆形成檢測運用相同方法進行。結果見圖2。
(1) Adv-AFPsiRNA和Adv-LacZsiRNA感染H印G2細胞48小時后，消化，計數，保 證以相同的密度接種至六孔板中。
(2) 每種細胞各2乂103個重懸于2.4ml軟瓊脂培養(yǎng)基(0.3%瓊脂糖，10%FBS的 MEM-a培養(yǎng)基)，接種到含有基底層(0.5%瓊脂糖，10XFBS的MEM-a培養(yǎng)基) 的六孔板中。
(3) 室溫下靜置，待軟瓊脂凝固后，每孔加入2ml MEM-a完全培養(yǎng)基。每三天更換 一次。
觀察細胞三周，肉眼觀察克隆形成情況并進行計數。
Adv-AFPsiRNA的有義鏈可轉錄出發(fā)卡狀siRNA,形成序列SEQ ID No 1和SEQ ID No 2，可以抑制甲胎蛋白基因轉錄的mRNA翻譯甲胎蛋白的過程，進而對H印G2 細胞的生長產生了抑制作用。
4.治療肝癌的重組腺病毒(一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒)對肝癌
生長的抑制作用
采用肝癌細胞(H印G2)裸鼠成瘤移植模型中進行實驗，結果見圖3。
(1) 選擇4-6周齡BALB/c無胸腺裸鼠。于裸鼠右腋下注射lXl(TH印G2細胞/200u 1。
(2) 待腫瘤生長至直徑5腿時，隨機分配至Adv-AFPsiRNA注射組(n = 6); Adv-LacZsiRNA注射組(n二6);無處理組(n=6)。
(3) 重組Adv-AFPsiRNA注射組與Adv-LacZsiRNA注射組分別共注射4次。前兩次為每 兩天一次，后兩次為每三天一次。每次注射的重組腺病毒用PBS稀釋至3X108 pfu/100yl 。注射時，分三個方向進針進行注射。
(4) 裸鼠成瘤第16天處死，用電子標尺衡量腫瘤長度與寬度。腫瘤體積用公式(長 X寬2) /2計算，并表示為平均值士SD腿3。腫瘤保存于-80°C。
(5) 應用SPSSll.O中的one-way AN0VA (Scheffe test)方法分析各組間腫瘤體積的 差異。
(6) 腫瘤固定于10%甲醛溶液，石蠟包被，制備腫瘤組織切片并進行HE染色。 局部通過瘤內注射本發(fā)明的一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒，其治
療顯示腫瘤的生長明顯受到抑制，這與Adv-AFPsiRNA對于H印G2細胞生長影響的體外實驗 結果是一致的。研究表明，瘤內注射重組腺病毒可能導致皮下腫瘤轉基因的非均一性表達。 這種局限可導致最終腫瘤的再生。考慮到這一點，我們首先將瘤內注射分為三個不同的角 度，盡量使重組腺病毒在瘤體內均一分布。同時，我們在注射重組腺病毒后第十六天停止 觀察，收集腫瘤樣本。結果顯示Adv-AFPsiRNA導致明顯的腫瘤生長抑制。
權利要求
1.一種干擾人甲胎蛋白基因的siRNA，其特征是具有序列表SEQ ID No 1所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列。
2. —種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒，其特征是用下述方法構建的:(1) 以人甲胎蛋白基因mRNA全長2032個堿基序列，應用軟件進行小干擾RNA預測設計， 篩選出最佳的RNA干擾靶位點區(qū)域，并針對此區(qū)域設計出干擾人甲胎蛋白基因的si認A， 發(fā)卡狀siRNA及其發(fā)卡狀siRNA互補的cDNA雙鏈，所述干擾人甲胎蛋白基因的siRNA為序 列表SEQ ID No l所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列，所 述cDNA雙鏈為序列表SEQ ID No 3所述的寡核苷酸序列，序列表SEQ ID No 4所述的寡核 苷酸序列；(2) 合成SEQ ID No 3所述的寡核苷酸序列，SEQ ID No 4所述的寡核苷酸序列，退火， 分別插入到pENTR/U6載體，構建成pENTR/U6/AFPsiRNA,轉插入pAD/BLOCK-IT -DEST載體， 構建成了重組表達干擾AFPsiRNA的pAD/BLOCK-IT -DEST/AFPsiRNA載體；(3) 轉染293A細胞，篩選出一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒。
3. 采用siRNA干擾技術開發(fā)針對人甲胎蛋白基因mRNA (cDNA)全長2032個堿基序列為基 礎的臨床應用產品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種干擾人甲胎蛋白基因的siRNA及重組腺病毒，一種干擾人甲胎蛋白基因的siRNA，具有序列表SEQ ID No 1所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列，一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒效果明顯，體外及體內動物實驗均已表明它對肝癌細胞及已形成的肝腫瘤的生長都具有明顯的抑制作用，一種表達針對人甲胎蛋白基因的siRNA的重組腺病毒是一增殖缺陷的病毒，因而病毒本身在體內不能擴增，具有安全性特點，易于制備和純化。
文檔編號A61K48/00GK101096670SQ20071005747
公開日2008年1月2日 申請日期2007年5月29日 優(yōu)先權日2007年5月29日
發(fā)明者冉 強, 華 湯 申請人:天津賽爾生物技術有限公司