專利名稱：銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動相關(guān)基因pa1550及應(yīng)用的制作方法
銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動相關(guān)基因PA15 5 0及應(yīng)用S^領(lǐng)域本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動相關(guān)基因 M7息背景fe^銅綠假單胞菌(i^"cfowonayam/gz力aya)是一種重要的^ff^病菌，常在臨床上引 繊固性感染。銅綠假單胞菌對多種贓素都具有耐藥性，在固相表面形成生物鵬魏戯多 重耐藥的重要原因之一。蹭行運(yùn)動在生物feM形成早期皿重要作用。在附著到固相表面之前， 銅綠假單胞菌借助鞭毛的游艇動(swimmingmotility)沿著固相表面游動，然后借助鞭毛或IV型菌 毛吸附到固相表面，并開始分裂、增殖。當(dāng)細(xì)菌在非生物表面形成了單層膜之后，它們并沒有在 固相表面靜止，而是繼纟辦動。這時，細(xì)菌不再娜鞭毛介導(dǎo)盼游》媳動(swimming motility),而 是 于IV型菌毛的伸展和收縮，推動或牽引自身在固相表面進(jìn)行位置移動,這種運(yùn)動，稱為蹭 t M動(twitching motility)。細(xì)菌3131^種運(yùn)動發(fā)育成微 :進(jìn)而形) 熟的生^^^，極^i也影 響了抗生素的作用效率。目前國際上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多，綠假單胞菌生辦鵬形成相錢因，我們發(fā) 現(xiàn)的蹭纟話動相關(guān)基因^75^會灘進(jìn)一歩豐富這1域，有助于揭示生物Sm藥性的機(jī)理。發(fā)明內(nèi)容1本發(fā)明目的是掛糊綠假單胞菌蹭fi^動相錢因iM/550，并用該基因為新藥耙點(diǎn)研制抗菌、iMi物豐鵬藥物，應(yīng)用于對銅綠假單胞菌的臨床治療。本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌蹭fi^動相關(guān)基因具有如序列表序列1所示核苷,列。戰(zhàn)的銅綠假單胞菌蹭fi^動相錢因iM7550可以用于以該基因為新藥靶點(diǎn)設(shè)計并制備能抑 制菌體蹭行的藥物，以阻斷生物 的形成，增 ^Jt生素的藥效。本發(fā)明基因iM"50的獲得方法^ffl人工Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)，造成銅綠假單胞菌基因突變， 突變子文庫。篩淑斷fM動能力喪失或減弱的突變子，{頓化nl酶切基因組DNA,酶切片段與pUC18 載體連接，ffi3i電轉(zhuǎn)化將連接;^導(dǎo)入^桿菌M5 a ，用卡那霉素和氨卡青霉素 LB固體培 養(yǎng)基篩選陽性克隆，測定插入片段的核苷,列，發(fā)現(xiàn)Mu插入的基因，確定皿因與銅綠假單胞 菌蹭摘動有相關(guān)性。本發(fā)明的有^tm:實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的基因失活后，菌體的蹭行運(yùn)動能力明顯減弱，說明此基因與銅綠假 單胞菌的蹭fi^動密切相關(guān)。M31本發(fā)明，可以針對/M"M基因設(shè)計藥物，限制其正常表達(dá)，使得細(xì)菌無法ililS斷話 動形成生物鵬，降低其耐藥性，超齢療銅綠假單胞菌弓胞的感染的目的。
圖1是突變子Y46的PCR檢測圖，其中，M是DNA M量標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 1是突變子Y46 PCR 產(chǎn)物；2皿生株P(guān)A68 PCR ^t/。圖2是IV型菌超曾動能力的檢測圖。圖3是重鄉(xiāng)服粒的檢測圖，其中，M是DNA肝量標(biāo)準(zhǔn)DL15000; 1是轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì) 私2是1用/^I酶切結(jié)果；3是線性pUC18片段。具體實(shí)l^實(shí)施例l: ^AXMu轉(zhuǎn)座^^進(jìn)行銅綠假單胞m^J^^t^的Ml將過夜液體培養(yǎng)的銅綠假單胞菌臨床分離株P(guān)A68 (卡那霉 感)按1 100接種于50 mL LB 培養(yǎng)基(10 g^L胰蛋白腺5 酵娜10^LNaCl)中，37X^00 rpm振蕩培養(yǎng)，{頓752誠 爐計測定細(xì)菌i歸鵬540nm處的吸爐,在OD540達(dá)到0.75時終止i歸。4'C 6000rpm離心 8miiVfeft菌體，分另偶H^f只、1/2 ^R、 1/6^R預(yù)冷的300mM蓆^;浮菌體，4°C 7000ipm 離心8min^棄上清，收集菌體，加Aii量的預(yù)冷的300mM蔗糖，使細(xì)M^濃度超'j 1X10"個細(xì) m/mL,將制備好的細(xì)胞5^K IOOmIV管。將0.5 u L(210ng)人工Mu轉(zhuǎn)座復(fù)，pKMF41 A Eco加入 到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后轉(zhuǎn)入到預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)化杯中，在2,6KV腿下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電擊后 將轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)入職37'C溫浴的900^L SOC培養(yǎng)教20g/L蛋白胨，5 g/L酵娜，0. 5 g^L NaCl， 20mMlSW塘，lmMMgCl2)中。37°C， 200rpm，培養(yǎng)1 h 。將細(xì)菌培養(yǎng)物按照500mL菌^/20mL 培養(yǎng)基的比例在含5(^g/mLKm的LB固體培養(yǎng)基JJ4疔凃布，37'C培養(yǎng)16h。挑取轉(zhuǎn)化子，以人 工Mu轉(zhuǎn)座子上的特異序列Pkl : 5'-ATGGGAAGCCCGATGC-3'禾Q Pk2 : 5'-AGCCGTTTCTGTAATGAAGG-3'作為引物，用PCR方法擴(kuò)增Mu轉(zhuǎn)座子片段、電泳檢測(圖 1)。實(shí)施例2:突變子的蹭瓶動能力檢測在無菌塑料培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上薄薄的一層蹭動檢測培養(yǎng)基[10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，5 g/L NaCl，l% (W/V) Grutulate-agar]，室溫晾干。用滅菌過的牙^f兆取在LB瓊月默咅養(yǎng)基JJl夜活化 的PA68的Mu轉(zhuǎn)座突變子，矛liiS曾動培養(yǎng)基，將細(xì)菌接種到培養(yǎng)基下面的塑料平皿上37r培養(yǎng) 24小時。細(xì)菌就會 IV型菌毛的收縮利申展在培養(yǎng)基TM的塑料表面以接種點(diǎn)為圓心，向周 圍蔓延生長，產(chǎn)生圓形的菌暈。將培養(yǎng)雜輕揭去，用考馬司結(jié)染色液(10%乙酸，0.06%考 馬司亮蘭)^fe塑料平皿20併中，倒掉染液，用自來水沖洗^F皿lmin，觀察細(xì)菌因蹭動產(chǎn)生的 菌圈，篩選得到蹭動能力減弱的突變子，編號Y46 (圖2)。實(shí)施例3:蹭fi^動相，因的克隆(1)克隆載體pUC18的大量提取將過夜i歸的200mL含有pUC18的大腸桿難,入250rnL離心管中4。C,12000ipm離心lmin^收集菌體。lOOmLSTE (lOOmMNaCl， 10mMTris.ClpH8.0,1 mMEDTA)洗滌，4。C， 12000g離心lmin，收集菌體。用預(yù)冷的25mL溶液I (50 mM g^糖，10mMEDTA， 25mMTris.Cl，pH8.0)懸浮洗滌菌沐力口入50mL的溶液II (0.2 MNaOH， 1%SDS)，輕鶴蕩混勻后冰浴5min;加入37.5 mL溶衝II (3 MKAc， 5 M乙酸，pH4.8)，溫和震蕩混勻，冰浴10 min后4'C ，12000ipm離心20min，四層紗布過濾收針清液。加入80mL的異丙醇，室i^B 10min后20。C,12000ipm離心15 min并收敏淀。用70%乙酸先滌沉淀2 娘真空千燥。將真空千燥后的沉淀溶于5 mLTE(10 mM Tris.Cl pH8.0,lmM EDTA)，分裝到2個11 mL離心管中，每管加120nLRNase( 10 mg/mL)，37。C水浴中保溫1 h;用，積的酚/氯fttt提兩次，收^h清液。每管中加入1/10體積的pH5.0 3MNaAc，在加入2倍^f只的預(yù)冷的無水乙醇，混勻后一20。CJ5[S 30min。 4°C， 12000 rpm離心10 min;棄上清，將質(zhì)粒沉淀用5mL的70"/。乙l^先兩次；在真空泵中抽干，溶于適量的TE中。取1^L質(zhì)粒在0.8%的瓊脂撤1|^1電泳，以DL15000做DNA肝量標(biāo)準(zhǔn)，對質(zhì)茅規(guī)行域的定量。(2) pUC18載體柳蹄勝內(nèi)切酶ApM消化及堿性磷酸酶處理pUC18的命nl酶切體系(50^L)如下pUC18 3^L (2嗎)10 XL buffer 5|jL爭I 2.5jiL (30U)ddH20 39.5 ^iL37。C鵬2曙3小時。65。C滅活/^1 15 min，補(bǔ)加150MLddH2O，再用等^lR的苯酚/氯仿抽提一次，加1/10 |^只的3 M NaAc (pH5. 0) ， 2 fg^f只的^zK乙醇，一20。C中^C置30 min. 4°C， 12000 ipm離心IO min， DNA沉淀用70^乙微滌兩次，真空千燥，將沉淀溶于KVLTE中。去磷酸化反應(yīng)體系(50|JJ如下pUC18 (拳I) lO(oL10 XCIAP Buffer 5pLCIAP 2pL (50U)ddH20 33 mL37。C反應(yīng)40min。 65。C滅活CIAP lOmin,補(bǔ)加150^膽20,再用^^的苯酚/氯細(xì)提一次，加1/10 #^只的3 M NaAc (pH5.0) ， 2倍^f只的^7K乙醇，一20。C中腿30 min. 4°C, 12000 rpm離心IO min, DNA沉淀用70^乙^^先滌兩次，真空千燥，將沉淀溶于50^LTE中。(3) 基因組的提取艮辦鮮歸的LB固體平社挑取Y46的單離，接種到lOmLLB液體i歸基中，37'C過夜 培養(yǎng),將菌條移至lOmL的離心管中。4°C, 12000ipm，離心2min，收集菌艦淀。用0. 8 mL 裂解緩沖液(20mMTris.HClpH8.0, 10mMEDTA， 10mMNaCl， 20%蓆糖)重繊浮菌體，加入 3(VL RNase (10mg/mL) ， 37。C保溫1小時。向離心管中緩漫加入0. 8mL的2% SDS，并輕輕振 蕩至溶液澄清，再加入8^iL蛋白酶K (20mg/mL) ， 37。C7K浴中過夜，其間不時搖動離心管,使蛋 白酶K能充分7]C解蛋白。等體積Tris飽和苯酚/氯仿混合艦提蛋白，4°C， 12000卬m，離心20 min，收ai:相。重復(fù)抽提歩驟，趕蛋白層消失為止。力口入2倍術(shù)只的^7K乙醇，用玻鴻織出 DNA沉淀。將沉淀用7(W乙^f先2次，真空千燥。將DNA溶ftf^ lmL TES溶液(50mM Tris.HCl pH 8.0， 5mMEDTA^0mMNaCl)中，再向其中加入10^LRNase (10mg/mL)， 37。C7JC浴1 h后， 用等^f只苯酚/氯仿抽提蛋白，12000卬m， 10rain，祉清，力口 2倍體積的5￡*乙醇，一20。C欣置半 小時，12000卬m, 10min，沉淀用70%乙|^先兩次。真空千燥后溶于20&的TE中，0.挑的瓊脂糖 1:電泳定新解酶切過夜。(4) 酶切后的突變子基因組DNA與去磷酸化pUC18的連接反應(yīng)反應(yīng)體系(20)JL)如下genome腿(/Cpnl ) 10|xL pUC18 (/fpnl) l單10 XT4Ligase Buffer 2|iLT4Ligase 1.5[xL 鵬0 5pL16。C反應(yīng)16h，向反應(yīng)液中補(bǔ)力口 80pLddHA等^f只苯酚/氯仿抽提一次，加1/10 3M NaAc和2丫，積的^7K乙,淀后，用70%乙,兩次，抽干后將DNA溶于5ioLddH20中。(5) 連接產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化將過夜液體培養(yǎng)的大腸桿菌DH5a按1:100接種量接種到200mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200 rpm振蕩i歸至OD540i.5左右，轉(zhuǎn)入200mL無麟心管中，4'C, 6000rpm離心6mii^收集菌體。 依7細(xì)預(yù)冷的^f只、1/2體積的ddH20和l/5體積的甘油(1W。) Sf^浮、洗滌菌體，4°C， 6000 ipm離心10min。最后將菌鵬于2mL 10%甘油溶液中混勻，條成100^17管，一70。C儲存。 取5&連接^&J^t/與IOOmL感受態(tài)細(xì)胞混勻加入到預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯中，2. 4KV電壓下電 擊。電擊混，與900mL SOC培養(yǎng)基混合，在37°C中復(fù)蘇45min后，涂布到LB固體蹄基(含 100ng/mLAmp， 30ng/mLKm)上，37。C培養(yǎng)16—18 h。挑取轉(zhuǎn)化子，MSI 法小量提M粒， 并4每質(zhì)粒用iT;ml酶切、電泳檢測(圖3)。(6) 克隆子質(zhì)粒的DNA測序，列分析 以AXMu轉(zhuǎn)座子兩端的反向重餅列做引物，測定轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)兩側(cè)的核苷,列。插入位點(diǎn)的每一側(cè)做一個測序反應(yīng)。測序采用Sanger ^^辭冬止法，j頓ABI—377XL全自動測 序儀，測序引物為Seql: 5， 一ATCAGCGGCCGCGATCC-3' Seq2: 5， -TTATTCGGTCGAAMGGATCC-3， 測序反應(yīng)委ILt海博亞生物技術(shù)有限公司完成。測序結(jié)mM過Intemet網(wǎng)上BLAST軟件在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索(網(wǎng)址為http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。基因功肖g在銅綠假單胞菌的基因 組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析(網(wǎng)址為http://www.pseudomonas.com/)。結(jié)果表明Mu轉(zhuǎn)座子插入到基因 PA1550中，這是一個目前功能完全未知的基因，與銅綠假單胞菌的蹭t話動能力相關(guān)。序列表<110>南開大學(xué)<120>銅綠假單胞菌蹭《話動相幾因E4"M ffi用<160> 1 <210>1 <211>540 <212>DNA<213>銅纟錄假單胞菌(戶鄉(xiāng)ifo附onas am/g^aya, PA ) <400>1atgcagtccg agacccaccc tcaaccctgg tacaaacact tdgggcctg 50 gttcatcgtg gccctcctgg cgaccteggt 鵬ctc鵬 ctgagcctgg 100 tcaccatcgc ggtgcgcaac c鄉(xiāng)acaccc tggtcaccga caactactac 150 gaggccggca agggcatcaa ccgctccctg gaacgcgaga acctggccgt 200 acgcctgcag gtgcacgcca ggtcaaggtgacgacctg accggcgaag 250 ccgaagtgcg cctgaccggc aacagccgtc cggagcagct caccctcaac 300 ctgatctcgccgacccagcc ggagaaggac cgccgcgtgg agctgctgcg 350 cagcaactcc gaccgcgagc gctacgtcgg ccagctgacc gacgccgtcg 400 ggggccgtcg cttcgtcgaa ctgctoggccaggaaggcag cggccagtgg 450 cgtcttttcgaggaagaggt ggtatcgccgaccgtggtca tggagctggg 500 tgacgaaccg ctccagggag cagaagcgaa gcgcccatga 540
權(quán)利要求
1、一種銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動相關(guān)基因PA1550，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
2、 權(quán)利要求l所述的銅綠假單胞菌蹭fi^動相關(guān)基因iM"W的應(yīng)用，用于以該基因為新藥 靶點(diǎn)設(shè)計并制，制菌體蹭fi^動的藥物，以阻斷生物被膜的形成，增 m生素的藥效。
全文摘要
本發(fā)明公開了銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動(twitching motility)相關(guān)基因PA1550。此基因具有如序列表序列1所示核苷酸序列，大小為540bp，目前國際上對此基因的功能尚無報道。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，該基因失活后，細(xì)菌的蹭行運(yùn)動能力明顯減弱。蹭行運(yùn)動是銅綠假單胞菌形成生物被膜的基礎(chǔ)運(yùn)動之一，而生物被膜的形成能使銅綠假單胞菌對抗生素的耐受力增加，用銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動相關(guān)基因PA1550為新藥靶點(diǎn)可以研制抗菌、抗生物被膜藥物，該藥物可應(yīng)用于對銅綠假單胞菌的臨床治療。
文檔編號A61P31/04GK101280314SQ20071006018
公開日2008年10月8日 申請日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者喬明強(qiáng), 姚宏明, 璐 張, 張秀明, 徐海津, 白艷玲 申請人:南開大學(xué)