專利名稱：一種miRNA序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)專業(yè)領(lǐng)域，涉及人源miRNA、 miRNA前體、miRNA反義寡核苷酸 序列及其表達(dá)載體，以及在制備治療肝癌疾病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
miRNA (microRNA，微RNA)是一類具有19~25nt的RNA分子，是由其前體分子在酶的 作用下加工生成，其前體序列一般為70 120nt，廣泛存在于生物體中。由于miRNA序列在 不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認(rèn)為miRNA的功能是參與生命的一些基本過程， 如發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、應(yīng)激反應(yīng)和脂肪代謝等，越來越多的證據(jù)表明miRNA 在細(xì)胞中起著調(diào)控基因表達(dá)的重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與細(xì)胞的癌變有著極為密 切的關(guān)系，起腫瘤抑制基因作用的miRNA下降或者缺失會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA 與肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、結(jié)直腸腫瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病等 腫瘤疾病有關(guān)。分析結(jié)果顯示約一半已發(fā)現(xiàn)的miRNA定位于染色體腫瘤基因相關(guān)區(qū)域及染 色體的脆性位點(diǎn)。這些研究結(jié)果都表明miRNA在細(xì)胞增殖、分化和癌變中發(fā)揮著重要的作 用。腫瘤相關(guān)miRNA的發(fā)現(xiàn)可能會對腫瘤的基因治療產(chǎn)生重大的影響。通過對腫瘤和正常 組織的大范圍的miRNA差異表達(dá)分析，可以鑒定腫瘤相關(guān)的miRNA。通過引入與具有癌基 因特性的miRNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸可以有效地抑制miRNA作用的發(fā)揮，抑制腫瘤的生長。 通過對反義寡核苷酸的修飾，可以獲得更加持續(xù)穩(wěn)定的抑制效果，比其它的治療手段的毒副 作用會更低。相反，通過病毒載體或質(zhì)粒載體過表達(dá)具有腫瘤抑制基因作用的miRNA或 miRNA前體，進(jìn)而抑制其調(diào)控的特定靶基因的表達(dá)，也可以達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。因此， 發(fā)現(xiàn)腫瘤特異的表達(dá)的miRNA對基于miRNA的腫瘤診斷和治療具有十分重要的意義。發(fā)明內(nèi)容肝癌是是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，針對肝癌的診斷和治療的生物分子的發(fā)現(xiàn)具有 重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的目的是提供一種miRNA、 miRNA前體和其反義寡核苷酸序列， 及其表達(dá)載體，該發(fā)明所涉及的miRNA、 miRNA前體和其反義寡核苷酸，及其表達(dá)載體在 制備治療肝癌疾病藥物中的用途。本發(fā)明以人肝癌和癌旁組織為材料進(jìn)行miRNA分子的克隆分析。采用分子生物學(xué)常規(guī) 技術(shù)，從人肝癌和癌旁組織分離獲得小分子RNA,將小分子RNA混合，經(jīng)過3'末端加Poly(A) 尾，5'端加RNA接頭，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，克隆測序，獲得基因片段的核酸序列。經(jīng)過測序 及生物信息學(xué)分析，我們得到了其中一條約22t的RNA分子。經(jīng)Blast比對，RNA 二級結(jié)構(gòu) 分析，Northern blot雜交得到證實(shí)其為miRNA分子，命名為miR-m30。 miRNA是由miRNA 前體RNA分子在細(xì)胞內(nèi)通過酶加工后形成的成熟體，經(jīng)過基因序列的同源分析，獲得 miR-m30相應(yīng)的前體RNA序列。此外，針對該miRNA序列設(shè)計(jì)合成了其2'-0-甲基化修飾 的反義寡核苷酸序列，以及該miRNA前體的質(zhì)粒表達(dá)載體，并對其對肝癌細(xì)胞生長的影響 進(jìn)行了分析。本發(fā)明所提供的miRNA克隆自人肝癌細(xì)胞，成熟miRNA序列長度為22nt，其前體序列 可以形成miRNA前體的典型二級結(jié)構(gòu)，符合miRNA的結(jié)構(gòu)特征。Northern blot和定量RT-PCR檢測結(jié)果表明該miRNA分別肝癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織中低表達(dá)。構(gòu)建miR-m30的真 核的細(xì)胞表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，結(jié)果表明在肝癌細(xì)胞中表達(dá)miR-m30能明顯刺 激肝癌細(xì)胞的增殖。合成miR-m30的反義2'-O-甲基RNA，并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，結(jié)果表 明在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-m30的反義寡核苷酸能明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖?；谏鲜龉ぷ鞅?發(fā)明得以完成。具體的說，本發(fā)明所提供的人源miRNA — miR-m30包含如下序列 5'ACUCGGCGUGGCGUCG GUCGUG。本發(fā)明所提供的人源tniRNA—miR-m30的前體RNA包含如下序列5'CUACCAAGUCGUGGUAG。本發(fā)明所提供的人源miRNA — miR-m30的反義寡核苷酸包含如下序列 5'CACGACCGACGCCACGCCGAGU。本發(fā)明所提供的人源miRNA前體基因在人染色體上定位于人染色體10q24。本發(fā)明提供的miRNA及其前體序列、反義序列也可采用化學(xué)合成的方法得到，為增強(qiáng) 其穩(wěn)定性、生物利用度、組織靶向性等藥學(xué)特征，可對其進(jìn)行硫代修飾或甲氧基修飾，也可 采取兩種方式結(jié)合修飾。例如采用DNA合成儀在合成時(shí)自動進(jìn)行硫代修飾。本發(fā)明提供的miRNA及其前體序列、反義序列及其表達(dá)載體可用于制備治療肝癌疾病 的藥物。例如以其單獨(dú)或混合形式為有效組分配制成非腸道給藥制劑，依據(jù)給藥模式、受者 年齡、體重、肝腎功能、疾病程度以適量劑量給藥；也可采用基因治療的方法，以質(zhì)?；蛳?病毒為表達(dá)載體，使其在癌變部位高效表達(dá)。


圖1.Northern blot檢測miR-m30在HepG2細(xì)胞中表達(dá) 圖2.定量PCR檢測miR-m30在肝癌及癌旁組織中的表達(dá) 圖3.過表達(dá)miR-m30促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖 圖4. miR-m30反義寡核苷酸抑制制肝癌細(xì)胞的增殖以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例一miRNA的克隆和分析1. 人肝癌細(xì)胞小RNA的提取純化使用mirVana miRNA Isolation(Ambion， Austin, TX)試劑盒從肝癌和癌旁組織提取小 RNA(^200nt)，溶于無RNase水，混合后于260nrn測定RNA濃度。2. 構(gòu)建小RNA分子cDNA文庫首先用Takara公司Poly(A)聚合酶在小分子RNA3'末端加上Poly(A)尾。在50 pi反應(yīng)體 系中加入 1.5嗎small RNA 、 5 U poly(A)聚合酶(Takara) 、 5^1 IOX緩沖液和Immol/L的 ATP，于37。C反應(yīng)30min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA。用T4 RNA ligase(Invitrogen) 再在RNA的5'端加上44nt的RNA接頭(CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGG ACUGAAGGAGUAGAAA),酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA。然后用含多個(gè)T的60nt RT錨定引物(ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)3oVN進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄使用 Superscript III(invitrogen)反轉(zhuǎn)錄酶，獲得cDNA。根據(jù)RT引物及RNA接頭設(shè)計(jì)PCR引物(引 物1: 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA陽3'，引物2: 5'-ATTCTAGAGGCCGAGG CGGCCGACATGT-3'),并以反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR。 PCR產(chǎn)物行非變性聚丙烯酰胺 凝膠電泳，回收大小約為109bp的PCR產(chǎn)物，并連接到T載體上，挑取陽性克隆測序。3. 獲得的克隆序列分析克隆測序獲得序列對人基因組序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行BLAST分析， 采用Mfold程序(.http:〃www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/forml .cgi)對可能的 miRNA前體RNA序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，參照miRNA分子標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得候選miRNA分子及其 前體分子。同時(shí)采用生物信息學(xué)方法對miRNA前體分子進(jìn)行了染色體定位。 其中獲得一條新的miRNA，及其前體RNA序列。miRNA命名為miR-m30。 miR-m30的長度 為22nt(miR-m30: 5'ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG)，其前體長度為74nt(miR-m30前體UGGCGUCGGUCGUGGUAG)， miR-m30前體可以形成miRNA前體的典型的發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 染色體定位分析表明，miR-m30前體基因定位于人染色體10q24。4. miR-m30的Northern blot鑒定使用tnirVanaTM miRNAIsolation(Ambion， Austin, TX)試劑盒從胎肝、肝癌及癌旁組織提 取small RNA(200nt)，以[ 32P]ATP標(biāo)記的miR-m30反向互補(bǔ)寡核苷酸為雜交檢測探針，按 照常規(guī)northern blot方法檢測miR-m30在人胎肝、肝癌及癌旁組織中的表達(dá)，檢測結(jié)果如圖 1。實(shí)施例二定量PCR檢測m股-m30在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)以肝癌組織及對應(yīng)癌旁組織為材料，用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA (操作方法見 其說明書)。各取lOpg總RNA用Poly(A)聚合酶(Ambion)在3'端加上Poly(A)，反應(yīng)條件如 下RNA10 pg, 5x緩沖液10 nl， 25mM MnCl2 5 nl， 10mM ATP 5 pl， Poly(A)聚合酶 2U，加DEPC處理的H20至總體積50以。于37°C反應(yīng)30分鐘后加入DEPC處理水， 再加入100nl (等量)的苯酚/氯仿(1:1),充分混勻。12000rpm離心5分鐘，取上清移至 另一微量離心管中，再加入100jil (等量)氯仿，充分混勻后以12000rpm離心5分鐘。取上 清移至另一微量離心管中，加入1(^1 (1 / 10體積)的3MNaAc (pH5.2)混勻。再加入250W 的冷無水乙醇，.20'C放置1小時(shí)。于4'C，以12000rpm離心20分鐘，用75%的乙醇漂洗沉 淀，室溫晾干后溶于適量DEPC處理的水中。以上述處理的RNA為模板，以GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GG(T)18VN為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(反應(yīng)條件參考逆轉(zhuǎn)錄酶的說明書)，合成的cDNA即為 定量PCR反應(yīng)的模板。以逆轉(zhuǎn)錄引物序列GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C為3'PCR引物，以miR-m30部 分序列ACT CGG CGT GGC GTC GGT C為5'PCR引物，以前述cDNA為模板用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。肝癌及癌旁組織miR-m30的表達(dá)情況見圖2。 屈2中LTP1， LTP2, LTP3為肝癌旁組織；LT1, LT2, LT3為對應(yīng)的肝癌組織。結(jié)果表明與 相應(yīng)的癌旁組織相比，miR-m30在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。這表明miR-m30在肝組 織和肝癌組織中的表達(dá)水平存在明顯差異。實(shí)施例三過表達(dá)miR-m30促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖PCR擴(kuò)增miR-m30的前體序列，連接到pcDNA3.0真核表達(dá)載體上構(gòu)建miR-m30的表 達(dá)載體pcDNA-miR-m30。 HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5%(302的37 'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天于96孔板中種入3000個(gè)細(xì)胞/孔，用lipofectamine 2000按其 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染0.1fig質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染72h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入MTT至終濃度5(Hig/ml， 37t溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入 DMS0 15(HU，室溫下于旋渦振蕩器上振蕩10min，于492nm處測其吸光值。結(jié)果見圖3。由 圖3可知，與轉(zhuǎn)染對照載體pcDNA3.0的HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-miR-m30過量表達(dá) miR-m30可以顯著促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖。這表明miR-m30在肝癌細(xì)胞中具有重要的 生物學(xué)功能。實(shí)施例四miR-m30反義寡核苷酸抑制制肝癌細(xì)胞的增殖 合成miR-m30及miR-21的2'-0-甲基修飾的反義寡核苷酸RNA及無關(guān)對照RNA。 miR-m30反義寡核苷酸序列5'CACGACCGACGCCACGCCGAGU; miR-21反義寡核苷酸序列為5'UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA;無關(guān)對照RNA序列為5'UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA。 HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5%C02的37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天于96孔板中種入3000個(gè)細(xì)胞/孔，用Oligofectamine按其說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，反義RNA濃度為100nM。轉(zhuǎn)染72h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入MTT至終濃度50嗎/ml， 37。C溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150W，室溫下于旋渦振蕩器上振蕩10min，于492nm處測其吸光值。結(jié)果見圖4，在圖中1為無關(guān)RNA對照，2為2'-0-甲基修飾的miR-21的反義寡核苷酸RNA， 3為2'-0-甲基修飾的miR-m30的反義寡核苷酸RNA 。由圖4可知，反義RNA抑制miR-m30后，HepG2細(xì)胞的增殖受到了一定程度的抑制，而對照RNA及miR-21的反義RNA均對HepG2細(xì)胞的增殖沒有影響。這表明miR-m30的反義寡核苷酸對肝癌細(xì)胞的生長具有抑制作用，具有治療肝癌相關(guān)疾病的用途。序列表<110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>—種miRNA序列及其用途<160> 3<210> 1 <211〉 22 <212> RNA <213>人<400>ACUCGGCGUG GCGUCGGUCG UG 22<210> 2<211> 74 〈212〉腿 <213>人〈400>CUACCMUCU CGACCGGACC UCGACCGGCU CGUCUGUGUU GCCAAUCGAC UCGGCGUGGC GUCGGUCGUG GUAG 74〈210〉 3 〈211〉 22 <212>腿 <213>人工序列<220><223>人源miR-m30反義寡核苷酸 <400>CACGACCGAC GCCACGCCGA GU 2權(quán)利要求
1. 一種人源miRNA-miR-m30，其特征在于包含如下miRNA序列5′ACUCGGCGUGGC GUCGGUCGUG。
2. 權(quán)利要求l所述miR-m30的前體RNA，其特征在于包含如下序列UGGCGUCGGUCGUGGUAG 。
3. 權(quán)利要求l所述miR-m30的反義寡核苷酸，其特征在于包含如下序列5'CACGACCGACGCCACGCCGAGU。
4. 權(quán)利要求3所述的的反義寡核苷酸，該核苷酸選自DNA或RNA。
5. 權(quán)利要求1 3所述任一核苷酸序列，其特征為該序列進(jìn)行了硫代修飾、甲氧基修飾、 或兩者的結(jié)合修飾。
6. 權(quán)利要求1 3所述任一核苷酸序列，其特征為該序列通過化學(xué)合成獲得。
7. 權(quán)利要求1 3所述任一核苷酸序列，其特征為該序列通過構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn) 行表達(dá)獲得。
8. 權(quán)利要求7所述任一核苷酸序列，其特征為所述載體為質(zhì)粒載體或病毒載體。
9. 任一 miR-m30、 miR-m30前體、miR-m30反義寡核苷酸和其表達(dá)載體在制備治療肝 癌疾病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝和肝癌細(xì)胞相關(guān)的miRNA序列、其前體序列和反義寡核苷酸序列，以及其在制備治療肝癌疾病藥物中的用途。
文檔編號A61K31/7088GK101270358SQ20071006455
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日
發(fā)明者付漢江, 捷 朱, 邢瑞云, 鄭曉飛, 軼 鐵 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所