專利名稱：無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽、其基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種無指盤臭蛙(Rana grahami)免疫調(diào)節(jié)肽、其基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用，屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在中國的傳統(tǒng)中藥和民族醫(yī)藥中，許多兩棲類動物被作為藥材而被廣泛的應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylaranaguentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，已報(bào)道藥理活性有廣譜抗菌作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、對心血管系統(tǒng)的作用等，另一方面，傳統(tǒng)中藥藥物成分的復(fù)雜性及其炮制方法的局限性也是造成藥物活性成分不能更好發(fā)揮作用的重要原因，因而從這些傳統(tǒng)藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已經(jīng)成為新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。國外學(xué)者已從東方鈴蟾中分離出一低分子量具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的多肽BSTI，而國內(nèi)學(xué)者從大蹼鈴蟾中分離到了具有絲氨酸蛋白酶抑制作用的多肽BMTI。從蟾蜍和林蛙皮膚中得到了具有舒張血管和降壓作用的bufokinin和ranakinin。從北美豹蛙和阿伯蛙中分離到了具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用的亮精肽和酪精肽。近十幾年對170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進(jìn)行了篩選，證明有40多種活性肽有較好的藥物開發(fā)前景。
我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對其皮膚活性蛋白肽類物質(zhì)的研究還較少。無指盤臭蛙主要分布于我國的云南，四川和廣西等省，是我國的特色資源動物之一。
發(fā)明人將本發(fā)明的無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)多肽及其變異體全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一組具有強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)活性，同時(shí)具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞生長抑制活性的無指盤臭蛙指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)多肽、其基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)多肽其特征是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量1791.12道爾頓，等電點(diǎn)9.84，具有強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的全序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽基因的克隆包括無指盤臭蛙皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法篩選無指盤臭蛙蛋白酶抑制劑基因。擴(kuò)增引物長度為23個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3‘PCR Primer引物，其序列為5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測定。基因測序結(jié)果表明編碼無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的基因由307個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggaccat ctccttatct60ctctgtgagc aagaaagaga tgccgatgaa gaaagcaatg aagaaaatgg agtagaagct 120aaagttaaag agctaaaaag gacctctaga tgctatatag gatatcggcg caaagtagtt 180tgttcataag atcaatcttg aattggaggt catctgatgt gaaatatcat ttagctaaat 240gctcaacaga tgtctaataa aaaataaaaa tgtcacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300aaaaaaa 307編碼成熟無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽序列的為第141-186位核苷酸，其氨基酸序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15利用蛋白組學(xué)方法設(shè)計(jì)無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的變異體，其變異體如下免疫調(diào)節(jié)肽2，第7位的甘氨酸突變?yōu)楣劝彼酺hr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體的制備方法根據(jù)編碼無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的基因推斷無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的氨基酸序列，利用蛋白組學(xué)方法設(shè)計(jì)無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的突變體，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱脫鹽、純化。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽、基因和變異體作為制備免疫調(diào)節(jié)、腫瘤治療、化療藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于由無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，利用蛋白組學(xué)方法設(shè)計(jì)無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的突變體，合成的無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其突變體具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤生長的作用。該組無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其突變體具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、抑制腫瘤效果明顯的有益特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽基因克隆I、無指盤臭蛙皮膚總RNA提取A.活體無指盤臭蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時(shí)，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。
B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為無指盤臭蛙皮膚總RNA。
II、無指盤臭蛙皮膚mRNA的純化無指盤臭蛙皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的PolyATtractmRNAIsolation Systems試劑盒。
A.取無指盤臭蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。
C.將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的無指盤臭蛙皮膚mRNA。
D.加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
III、無指盤臭蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNALibrary Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。
A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)1.在0.5ml無菌的離心管加入1μl無指盤臭蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl。
2.混勻離心管中的試劑并以12000rpm離心1分鐘，72℃保溫2分鐘。
3.將離心管在冰上孵育2分鐘。
4.在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、
4.在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶。
5.混合離心管中試劑并以12000rpm離心1分鐘，在42℃保溫1小時(shí)。
6.將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。
7.從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。
B.采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈1.95℃預(yù)熱PCR儀。
2.將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage2 PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。
3.在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增①95℃20秒鐘②22個(gè)循環(huán)95℃5秒鐘68℃6分鐘4.循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。
C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的WizardSV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下1.將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
2.加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
3.重復(fù)步驟2。
4.16,000g以12000rpm離心5分鐘。
5.將離心純化柱置于新的離心管中。
6.加入30μl超純水，在室溫下靜置5分鐘。
7.16,000g離心1分鐘，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。
D.大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備1.挑取單個(gè)DH5α菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時(shí)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。
2.將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。
3.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
4.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
5.每50ml初始培養(yǎng)液且30ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
7.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
8.每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀，分裝后備用。
E.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1.在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl無指盤臭蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。
2.加入5μl(等量)的連接酶緩沖混合物。
3.16℃反應(yīng)2小時(shí)。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。
5.42℃加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
6.加入37℃溫浴過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落。
8.每個(gè)LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×106個(gè)單獨(dú)克隆。
IV、無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽基因克隆篩選擴(kuò)增引物長度為23個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3’PCRPrimer引物，其序列為5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。
PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行94℃30秒鐘，60℃30秒鐘和72℃45秒鐘，35個(gè)循環(huán)。
首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升，和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。
V、無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽基因序列測定和結(jié)果提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國AppliedBiosystems373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBESTTMSequencing PrimerRV-M和BcaBESTTMSequencing Primer M13-47，BcaBESTTMSequencing Primer RV-M序列5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBESTTMSequencing Primer M13-475’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因測序結(jié)果自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggaccat ctccttatct60ctctgtgagc aagaaagaga tgccgatgaa gaaagcaatg aagaaaatgg agtagaagct 120aaagttaaag agctaaaaag gacctctaga tgctatatag gatatcggcg caaagtagtt 180tgttcataag atcaatcttg aattggaggt catctgatgt gaaatatcat ttagctaaat 240gctcaacaga tgtctaataa aaaataaaaa tgtcacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300aaaaaaa 307無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽基因核苷酸的序列表為序列長度為307個(gè)堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀，序列種類cDNA，來源無指盤臭蛀皮膚。
編碼成熟無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽氨基酸序列的為第141-186位核苷酸，其氨基酸序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽基因作為基因工程制備無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的應(yīng)用。
無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽變異體作為蛋白質(zhì)工程制備指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽變異體的應(yīng)用。
制備無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體I、無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法根據(jù)編碼無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的基因推斷無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的氨基酸序列，利用蛋白組學(xué)方法設(shè)計(jì)無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的突變體，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
II、分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，以甘油∶間硝基芐醇∶二甲亞砜(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。
III、純化的無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量1791.12道爾頓，等電點(diǎn)9.84，具有強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的全序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val CysSer(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽變異體是通過蛋白組學(xué)的方法設(shè)計(jì)的一種具有改良的免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性的環(huán)狀多肽，它們的全序列如下臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽2，Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的藥理實(shí)驗(yàn)
1.無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體的免疫調(diào)節(jié)作用肥大細(xì)胞在動物的先天性免疫過程中起著非常重要的作用，肥大細(xì)胞脫顆粒的同時(shí)會釋放組胺和其他一些炎癥原調(diào)節(jié)因子，這些物質(zhì)的釋放吸引炎癥細(xì)胞到發(fā)炎部位，最終炎癥部位炎癥的擴(kuò)散。所以肥大細(xì)胞釋放組胺可以作為活性檢測的一種手段。
健康Wistar大鼠斷頸處死，腹腔內(nèi)注射10ml臺氏液(Tyrode solution)，腹部按摩10分鐘，打開腹腔吸出含有肥大細(xì)胞的臺氏液，1000rpm離心5分鐘，重復(fù)用臺氏液洗一次，再用1-2ml的臺氏液懸浮肥大細(xì)胞。取10μl樣品和90μl細(xì)胞懸液在37℃孵育10分鐘，37℃孵育10分鐘，然后加1.9ml冷的臺氏液，3000rpm離心5min，吸出上清，沉淀用2ml臺氏液懸浮，并在開水上煮10min。上清或者沉淀分別加入0.6g NaCl、2.5mL正丁醇和0.2ml 2.5mol/L NaOH，立即混勻，振蕩后低速離心5min；取2mL有機(jī)相加到已加0.6mL0.1mol/L HCl和2.5mL正庚烷的試管，振蕩后低速離心5min，棄有機(jī)相；取0.5mL HCl相用雙蒸水稀釋1倍后，加入0.25mL 0.4mol/L NaOH和0.05mL 1mg/L OPT甲醇溶液，在20℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)10min后，加入0.25mL 0.5mol/L HCl終止反應(yīng)。空白管為先加入0.25mol/L HCl后，再加入鄰苯二甲醛。
利用PE公司的自動熒光分光光度計(jì)于激發(fā)波360nm，熒光波長450nm，狹縫10nm的條件下測定熒光強(qiáng)度讀數(shù)(T)。
組胺釋放率按下式計(jì)算組胺釋放率＝[(樣本的組胺釋放量-自發(fā)組胺釋放量)/組胺總含量]×100％該試驗(yàn)重復(fù)三次。
結(jié)果見表1。
表1 無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體的組胺釋放作用

2.無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體抑制腫瘤生長的作用在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測樣品用1640培養(yǎng)基進(jìn)行5倍或2倍倍比稀釋，共六個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對照。每孔滴加3×105個(gè)/ml的Hela、HepG2細(xì)胞100μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48小時(shí)后用MTT法測定待測化合物對細(xì)胞的毒性作用。EC50是對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生50％抑制作用時(shí)的濃度。
表2無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用

由表1可見，無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞(Hela)和肝腫瘤細(xì)胞系(HepG2)的生長，這表明無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體具有很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用，并表現(xiàn)出改良的性能，同時(shí)還具有序列簡單、合成方便等優(yōu)點(diǎn)?？勺鳛橹苽渲蚊庖哒{(diào)節(jié)、腫瘤治療和化療藥物的應(yīng)用。
無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽、其基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用_ST25SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院昆明動物研究所<120>無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽、其基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用<130>1<160>3<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>307<212>DNA<213>Rana grahami<400>1atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggaccat ctccttatct 60ctctgtgagc aagaaagaga tgccgatgaa gaaagcaatg aagaaaatgg agtagaagct120aaagttaaag agctaaaaag gacctctaga tgctatatag gatatcggcg caaagtagtt180tgttcataag atcaatcttg aattggaggt catctgatgt gaaatatcat ttagctaaat240gctcaacaga tgtctaataa aaaataaaaa tgtcacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaaaaa 307<210>2<211>15<212>PRT<213>Rana grahami<400>2Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>Rana grahami<400>3Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser1 5 10 1權(quán)利要求
1.無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽，其特征在于該無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽是一種環(huán)狀多肽，分子量1791.12道爾頓，等電點(diǎn)9.84，無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的全序列為Thr Ser Arg Cys TyrIle Gly Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
2.無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由307個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggaccat ctccttatct 60ctctgtgagc aagaaagaga tgccgatgaa gaaagcaatg aagaaaatgg agtagaagct120aaagttaaag agctaaaaag gacctctaga tgctatatag gatatcggcg caaagtagtt180tgttcataag atcaatcttg aattggaggt catctgatgt gaaatatcat ttagctaaat240gctcaacaga tgtctaataa aaaataaaaa tgtcacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaaaaa 307
3.權(quán)利要求2所述的無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼成熟無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽序列的為第141-186位核苷酸，其氨基酸序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15
4.權(quán)利要求1所述無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的變異體，其特征在于其變異體如下免疫調(diào)節(jié)肽2，無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽原始序列中第7位的甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?，Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Glu Tyr Arg Arg Lys Val Val Cys Ser5 10 15。
5.權(quán)利要求1所述無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的應(yīng)用，其特征在于無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽作為制備免疫調(diào)節(jié)、腫瘤治療和化療藥物的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽變異體的應(yīng)用，其特征在于無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽變異體作為制備免疫調(diào)節(jié)、腫瘤治療和化療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽、基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用，屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽是一種環(huán)狀多肽，分子量1791.12道爾頓，等電點(diǎn)9.84，無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽的全序列為Thr Ser Arg Cys Tyr Ile Gly Tyr Arg ArgLys Val Val Cys Ser(TSRCYIGYRRKVVCS)，其第4位的半胱氨酸和第14位的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。編碼的基因由307個(gè)核苷酸組成，其中編碼成熟部分的為第141－186位核苷酸。無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽原始序列中第4個(gè)氨基酸發(fā)生替代所產(chǎn)生的變異體，人工合成的無指盤臭蛙免疫調(diào)節(jié)肽及其變異體具有強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)活性和腫瘤抑制活性，作為制備免疫調(diào)節(jié)、腫瘤治療和化療藥物的應(yīng)用。本發(fā)明還具有序列簡單、合成方便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K38/12GK101037473SQ200710065669
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月12日
發(fā)明者賴仞, 李建許, 李東升, 宋玉竹 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所