專利名稱：苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物抗氧化保肝及保護(hù)腦損傷用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物的抗氧化、保護(hù)肝明和腦損傷活性，以及它們作為相關(guān)藥物的用途。該類化合物通過(guò)全合成和半合成的方法得到。本發(fā)明將該系列化合物對(duì)過(guò)氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細(xì)胞損體外模型進(jìn)行了肝細(xì)胞損傷保護(hù)活性篩選，該類化合物被發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)肝細(xì)胞和促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)的作用。本發(fā)明又對(duì)該類化合物抗氧自由基活性進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其具有體外清除超氧陰離子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性。以上活性表明該類化合物可以預(yù)期用于制備預(yù)防或治療急、慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的其他生理改變或疾病的藥物。該類化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。而且在與陽(yáng)性對(duì)照藥物槲皮素同一濃度下，其清除自由基保護(hù)細(xì)胞的能力比槲皮素還高。此外，該類化合物還表現(xiàn)為對(duì)鐵離子具有強(qiáng)效螯合作用，從而預(yù)期其可以延緩或阻斷Aβ蛋白堆積以及腦部神經(jīng)纖維糾結(jié)。說(shuō)明其對(duì)保護(hù)腦神經(jīng)、抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用。以上活性表明該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物可以預(yù)期用于制備預(yù)防或治療急、慢性肝損傷或腦損傷類疾病，以及由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的其他生理改變或疾病的藥物。
背景技術(shù)：
氧壓是由機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生和清除自由基之間的失調(diào)所引起的，可誘發(fā)多種疾病。氧壓可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如中風(fēng)，帕金森氏病，阿爾茨海默病。另外它還跟其它疾病的病理途徑有關(guān)，如心臟病、自身免疫性疾病、腫瘤、病毒性疾病(如AIDS、肝炎)。因此尋找新的高效抗氧化劑成為治療由氧壓引起的各種疾病的有效途徑。
姜科姜黃屬植物姜黃(Curcuma longa L.)是一種常用的中藥，姜黃素(Curcumin，簡(jiǎn)稱Cur)是從姜黃中提取的有效成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等廣泛的藥理作用。近年來(lái)有關(guān)姜黃素各種藥理作用的研究已越來(lái)越受到醫(yī)藥工作者的重視。
姜黃素除上述藥理作用外，尚有對(duì)肝臟保護(hù)作用的廣泛報(bào)道，Nanji等研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過(guò)抑制NF-κB基因的表達(dá)對(duì)酒精性肝疾病起到保到作用[Nanji等，Curcumin prevents alcohol-induced liver disease in rats by inhibiting the expression ofNF-kappa B-dependent genes，American Journal Physiology，Castrointes LiverPhysiology，2003，284(2)，G321-327]。Park等研究姜黃素對(duì)四氯化碳造成的大鼠急性或亞急性肝損傷的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)其能顯著降低血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶含量[Park 等，Protective effect of curcumin in rat liver injuryinduced by carbon tetrachloride，Journal ofPhamacy and Pharmacology，2000，52(4)，437-440]。提示姜黃素具有保肝、抗肝纖維化的作用。維生素A、C、E是體內(nèi)主要的非酶類抗氧化劑，可作為供氫體與自由基反應(yīng)而使其滅活。Kaul等發(fā)現(xiàn)給大鼠飼喂姜黃素或姜黃能夠抑制因維生素A缺乏所致的大鼠肝、腎、脾、大腦脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高[Kaul等，Influence of retinol deficiency and curcumin/turmeric feeding on tissue microsomal membrane lipid peroxidation and fatty acids inrats，Molecularand Cellular Biochemistry，1997，175(1&2)，43-48]。
此外，1985年Kuttan等報(bào)道了姜黃素的細(xì)胞毒作用[Kuttan等，Potentialanticancer activity of turmeric(Curcuma longa)，Cancer Letters(Shannon，Ireland)，1985，29(2)，197-202]，發(fā)現(xiàn)姜黃素在1.2μM可明顯抑制中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)的生長(zhǎng)。同樣濃度的姜黃素對(duì)淋巴細(xì)胞和Dalton淋巴廇細(xì)胞也產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒作用。后來(lái)，相繼有報(bào)道證明姜黃素在體外對(duì)許多腫瘤細(xì)胞株均有明顯的細(xì)胞毒作用，且一般的濃度范圍在0.03～0.3μM [Bhaumik等，Curcumin-mediatedapoptosis in AK-5 tumor cells involves the Production ofreactive oxygen intermediates，F(xiàn)EBS Letters，1999，456(2)，311-314；Fujisawa等，Cytotoxicity，ROS-generationactivity and radical-scavenging activity of curcumin and related compounds，Anticancer Research，2004，24(2B)，563-569]。
姜黃素除了存在潛在的細(xì)胞毒性之外，還有光毒性和皮膚毒性。Tonnesen研究發(fā)現(xiàn)低濃度(0.68-13.5μM)姜黃素即對(duì)傷寒沙門菌(S.typhimurium)和大腸埃希菌(E.coli)有光毒性作用[Tonnesen等，Studies on curcumin andcurcuminoids，IXInvestigation of the photobiological activity of curcumin usingbacterial indicator systems，Journal of pharmaceutical sciences，1987，76(5)，371-373]。姜黃素的光毒性在有氧的條件下，革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌更敏感；其機(jī)制可能是產(chǎn)生了過(guò)氧化氫。Goh等早在1987年就報(bào)道了1例職業(yè)性接觸姜黃素引起的皮膚過(guò)敏。隨后陸續(xù)有報(bào)道接觸含姜黃素成分的藥物、手術(shù)前皮膚消毒用的洗必泰和職業(yè)性暴露引起急性接觸性皮炎，往往表現(xiàn)為邊界清晰的水腫性紅斑、丘疹和/或水皰，常伴有瘙癢癥狀[Goh等，Allergic contact dermatitis to Curcumalonga(turmeric)，Contact dermatitis，1987，17(3)，186]。
由以上活性及不足，我們看到對(duì)姜黃素深入的合成改造，以期發(fā)現(xiàn)更高效抗氧化、低毒性、有新活性的的姜黃素類似物，對(duì)開發(fā)該類抗氧化天然產(chǎn)物衍性物新藥進(jìn)入保護(hù)肝損傷和腦損傷醫(yī)藥領(lǐng)域是十分必要的。因比我們根據(jù)以往的合成經(jīng)驗(yàn)，以從蓮葉橐吾醇啟發(fā)得到的二聚體進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)此類化合物與姜黃素有著極其相似的結(jié)構(gòu)組成，并且用酯基代替了姜黃素中的亞甲基，可能會(huì)給分子帶來(lái)新的活性。同時(shí)，在苯環(huán)上取代基的變化也能給我們更多機(jī)會(huì)找到新的抗氧化構(gòu)效關(guān)系，為開發(fā)此類新藥提供積累。有鑒于此，我們重新合成了一批如下圖所示類姜素結(jié)構(gòu)的蓮葉橐吾二聚體，并對(duì)其進(jìn)行了一系列活性測(cè)試。該類化合物及其制備方法已經(jīng)在本發(fā)明人的相關(guān)發(fā)明中予以公開[趙昱等，發(fā)明專利《苯丙烯酸苯丙烯酯和苯丙酸苯丙酯類化合物及其制備方法和用途》申請(qǐng)?zhí)?00410102894.1；公開號(hào)CN1796363A]，本發(fā)明中各化合物的制備方法與上述公開的內(nèi)容基本相同，在此不再贅述。
本發(fā)明用體外抑制黃嘌呤氧化酶作用、體外清除陰離子超氧化自由基的活性、體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-dupheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性、自由基誘導(dǎo)之脂過(guò)氧化物生成的抑制等試驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明權(quán)利要求中化合物的抗氧化活性；本發(fā)明還測(cè)定了化合物對(duì)雙氧水(H2O2)所致PC12(大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用、化合物對(duì)鐵離子的螯合作用試驗(yàn)以預(yù)測(cè)其延緩或阻斷Aβ蛋白堆積以及腦部神經(jīng)纖維糾結(jié)能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種苯丙烯酸苯丙烯酯和其類似物及其可藥用鹽或其溶劑化物的新用途。具體而言，本發(fā)明提供了一種式(1)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯和其類似物及其藥用鹽或其溶劑化物抑制黃嘌呤氧化酶、清除自由基活性、保護(hù)肝臟細(xì)胞及肝臟器質(zhì)性損傷、保護(hù)和治療腦損傷以及防治早老性癡呆癥的活性。
其中取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8可以相同或不同，分別獨(dú)立地選自氫，巰基，硝基，氰基，含1-8個(gè)碳的烷基，含1-8個(gè)碳的烷氧基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，1～15碳的不飽和烴基，1-15碳的不飽和烴氧基，含1-8個(gè)碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個(gè)碳的酰氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8，不能同時(shí)是氫；取代基X可以是氫(H)2，羥基(OH)2，氧，硫；基團(tuán)R可以是氧，硫，氮，含1～8個(gè)碳的亞烷基，含1～8個(gè)碳的亞烷胺基，含1～8個(gè)碳的亞烷氧基，含1～8個(gè)碳的亞烷硫基；其中用于取代的取代基可以是含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，鹵素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，或苯基。
本發(fā)明優(yōu)選的式(1)化合物及其可藥用鹽或溶劑化物是，其中當(dāng)式(1)中的取代基X為氧，取代基R為氧肘，為式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物 其中取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8可以相同或不同，分別獨(dú)立地選自氫，巰基，硝基，氰基，含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，1～15碳的不飽和烴基，1～15碳的不飽和烴氧基，含1～8個(gè)碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個(gè)碳的酰氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6，R7，和R8，不能同時(shí)是是氫；其中用于取代的取代基可以是含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，鹵素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，或苯基。
本發(fā)明優(yōu)選的式(I)化合物及其可藥用鹽或溶劑化物是，其中R6，R7，R8，R6′R7′或R8′可以相同或不同，分別獨(dú)立的選自氫，硝基，含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，含1～15個(gè)碳的不飽和烯氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個(gè)碳的烷氧基烷氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′不能同時(shí)是氫；其中用于取代的取代基可以是含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，鹵素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，或苯基。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的式(I)化合物及其可藥用鹽或溶劑化物是，其中R6，R7，R8，R6′，R7′或R8′可以相同或不同，分別獨(dú)立地選自氫，硝基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，含1～15個(gè)碳的不飽和烯氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個(gè)碳的烷氧基烷氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′不能同時(shí)是氫；其中用于取代的取代基可以是含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，鹵素，羥基，氨基，硝基。
本發(fā)明優(yōu)選的式(I)化合物包括I-a.(E)-7-甲氧基-苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-b.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-c.(E)-(7-硝基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-d.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′，8′-三甲氧基)苯丙烯酯；I-e.(E)-(7-甲氧基)苯丙烯酸-)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-f.(E)-(6，7-二甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-g.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-h.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；I-i.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；I-j.(E)-(7-羥基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-k.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；I-l.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；I-m.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)-苯丙烯酯；
I-n.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-o.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″，4″-二氯)芐基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_，4_-二氯)芐基)-苯丙烯酯；I-p.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(4″-溴)芐基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(4_-溴)芐基)-苯丙烯酯；I-q.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″-溴)芐基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_-溴)芐基)-苯丙烯酯；I-r.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(2″-碘，4″-溴)芐基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(2_-碘，4_-溴)芐基)-苯丙稀酯；I-s.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-香葉基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7-O-香葉基)-苯丙烯酯；I-t.(E)-(6，7-二羥基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了式(1)化合物用于制備防治肝臟細(xì)胞及肝臟器質(zhì)性損傷的藥物用途。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種含有式(1)化合物的用于制備基于抗氧化自由基、抑制Aβ蛋白生成和抑制腦部神經(jīng)糾結(jié)機(jī)制的抗衰老、防治早老性癡呆癥的藥物用途。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了一種含有式(1)化合物的用于制備基于抗氧化自由基、抑制Aβ蛋白生成和抑制腦部神經(jīng)糾結(jié)機(jī)制的抗衰老、防治早老性癡呆癥的藥物組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供了式(I)化合物的用于制備防治由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的生理改變或疾病特別是心血管及腦血管病變藥物的用途。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了一種含有式(I)化合物的用于制備防治由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的生理改變或疾病特別是心血管及腦血管病變藥物的藥物組合物。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用藥理實(shí)施例的形式說(shuō)明化合物活性測(cè)試的過(guò)程，藥理實(shí)施例給出了代表性化合物的部分生物活性數(shù)據(jù)。必須說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)和藥理活性上的簡(jiǎn)單擴(kuò)展和外延都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。式(1)化合物具有多種重要的生物活性，本發(fā)明將該系列化合物對(duì)過(guò)氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細(xì)胞損傷體外模型進(jìn)行了肝細(xì)胞損傷保護(hù)活性篩選，發(fā)現(xiàn)該類化合物具有保護(hù)肝細(xì)胞和促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)的作用。本發(fā)明又對(duì)該類化合物抗氧自由基活性進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其具有體外清除超氧陰離子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性。以上活性表明該類化合物可以預(yù)期用于制備預(yù)防或治療急性慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的其他生理改變或疾病的藥物。該類化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。而且在與陽(yáng)性對(duì)照藥物同一濃度下，其清除自由基保護(hù)細(xì)胞的能力比陽(yáng)性對(duì)照槲皮素還高。該類化合物還表現(xiàn)為對(duì)鐵離子強(qiáng)效螯合作用，從而預(yù)期其可以延緩或阻斷Aβ蛋白堆積以及腦部神經(jīng)纖維糾結(jié)。說(shuō)明其對(duì)保護(hù)腦神經(jīng)、抗氧化、抑制Aβ蛋白生成和抑制腦部神經(jīng)糾結(jié)、防治老年性癡呆癥有積極作用。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學(xué)上常用的輻料或載體結(jié)合，制備得到具有保護(hù)肝細(xì)胞急性和慢性傷活性、從而可以用于預(yù)防以及治療肝臟疾病的藥物組合物或者保健品。上述各類藥物組合物或者保健品可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物還以與現(xiàn)已上市的肝臟保護(hù)及肝病治療藥物藥物如聯(lián)苯雙酯、水飛薊素、水飛薊賓葡甲胺、雙環(huán)醇、齊墩果酸、二氯乙酸二異丙胺、原卟啉鈉(protoporphyrin disodium)、馬洛替酯(malotilate)、熊去氧膽酸、還原型谷胱甘肽、輔酶Q10、維丙肝、左旋肉堿及其復(fù)方制劑、肝泰樂(葡萄糖醛酸內(nèi)酯)、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、山豆根及其有效成分注射液、苦參素(氧化苦參堿)、五味子及其制劑、糖皮質(zhì)激素、促皮質(zhì)激素等聯(lián)合使用，制備得到具有保護(hù)肝臟活性的組合物，也可以與核苷類及非核苷類抑制乙肝病毒如拉米呋啶(lamivudine)、利巴韋林(ribavirin)、阿昔絡(luò)韋(acyclovir)、泛昔絡(luò)韋(pancyclovir)、更昔絡(luò)韋(gamcyclovir)、阿德福韋(adevovir)、特諾福韋(tenofovir)、恩替卡韋(entecavir)等原料藥物或其制劑聯(lián)合或交叉使用，均可用于治療急慢性病毒性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝極中毒性肝損傷疾病藥品或者保健品。上述各類藥物合物或者保健品可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其熔劑化物可以與現(xiàn)已上市的抗自由基氧化劑藥物如超氧化物歧化酶(SOD)、白黎蘆醇、天然Vitamin E、槲皮素、茶多酚、地塞米松、巴比妥類、維生素C、氯丙嗪、甘露醇等聯(lián)合使用，制備得到具有防御自由基引起的損害活性的抗氧化藥物合物或者保健品，用于治療上述肝部損傷疾病和治療傷類疾病如腦中風(fēng)和中風(fēng)后遺癥、帕金森氏病、腦神經(jīng)退化以及防治老年性癡呆癥阿爾茨海默病。本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物還可以與其他保護(hù)腦損傷藥物和防治老年性癡呆癥藥物如石杉?jí)A甲、他可林(tacrine)、多奈哌齊(donepezil)、加當(dāng)他敏、美曲磷脂、更斯的明、美金剛烷胺等聯(lián)合使用或交叉使用，用于治療上述疾病。上述各類藥物組合物或者保健品可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
藥理實(shí)施例1苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物I-t抑制黃嘌呤氧化酶(XO)活性試驗(yàn)取SD大鼠，斷頭處死，迅速取出肝臟至預(yù)冷的磷酸緩沖液(100mM，pH8.75)中，去除血管，剪碎后用磷酸緩沖液1∶1(w/v)稀釋后勻漿，用磷酸酸緩沖液(1∶4)稀釋，離心(12000rpm/10分鐘，4℃)，取上清作為酶原?；衔颕-t對(duì)XO的抑制作用測(cè)定采用酶聯(lián)免疫ELISA法。樣品孔中加入底物黃嘌呤(540μM，600微升)，酶(30微升)，化合物I-t用二甲亞砜溶解，用磷酸緩沖液稀釋，每孔30微升，使其終濃度為0.050毫克/毫升，加入硝基蘭四氮唑(NBT，100μM，30微升)和吩嗪甲硫酸酯(PMS，100μM，30微升，最后加入TritonX-100(0.4％，10微升L)，在37℃中水浴保溫2小時(shí)，于550nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。空白孔中用相同體積的磷酸緩沖液代替底物。溶劑對(duì)照孔中加入與化合物等濃度的二甲亞砜。化合物I-t抑制率由樣品OD值對(duì)于空白和對(duì)照OD值計(jì)算。其中化合物I-t對(duì)XOD的半抑制濃度(IC50)由劑量效應(yīng)曲線得到。姜黃素和別嘌醇為陽(yáng)性對(duì)照。三次測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)見表一。
表一

a)別嘌醇對(duì)XO半數(shù)抑制濃度為3.9微克/毫升。
試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I-t具有較強(qiáng)黃嘌呤氧化酶抑制作用，但是在同一濃度下，其清除能力和姜黃素相似而沒有別嘌醇對(duì)XO抑制活性高。結(jié)論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬于具有一定黃嘌呤氧化酶抑制能力的抗氧化物質(zhì)。
藥理實(shí)施例2苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物I-t體外清除超氧陰離子自由基的活性試驗(yàn)化合物I-t清除超氧陰離子自由基能力的檢測(cè)乃使用吩嗪-N甲硫酸鹽-NADH(phenazine methosulfate-NADH)系統(tǒng)，用四唑氮藍(lán)(nitroblue tetrazolium)還原方法檢定。用3毫升含有78μM的NADH、50μM四唑氮藍(lán)和10μM吩嗪-N甲硫酸鹽在pH值為8.0的16mM Tris-HCl緩沖液中中產(chǎn)生出超氧陰離子自由基，對(duì)不同濃度的化合物I-t檢測(cè)其活性。超氧陰離子自由基和四唑氮藍(lán)反應(yīng)生成物的顏色用分光光度計(jì)在560nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)，姜黃素和槲皮素被用作陽(yáng)性對(duì)照藥物。三次測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)見表二。
表二

試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I-t具有有一定的超氧陰離子自由基清除作用，但是在同一濃度下，其清除能力沒有姜黃素和槲皮素對(duì)超氧陰離子自由基清除活性高。
結(jié)論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬于具有一定超氧陰離子自由基清除活性的抗氧化物質(zhì)。
藥理實(shí)施例3苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物I-t體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性試驗(yàn)DPPH的甲醇溶液在517nm有強(qiáng)吸收值，其被抗氧化物還原時(shí)，吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越強(qiáng)。在250微升反應(yīng)體系中含有各種不同濃度的化合物I-t25微升，DPPH(0.4毫克/毫升)的甲醇溶腋40微升及甲醇溶液185微升，37℃水浴反應(yīng)30分鐘后，在517nm處測(cè)定吸光度。姜黃素和槲皮素作為陽(yáng)性對(duì)照，三次測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)見表三。
表三

試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I-t具有一定的二苯基苦基苯肼自由基清除作用，其清除能力略高于姜黃素但低于槲皮素。結(jié)論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬于具有較強(qiáng)二苯基苦基苯肼自由基清除活性的抗氧化物質(zhì)。
藥理實(shí)施例4苯丙烯酸苯丙烯酪類化合物I-t對(duì)雙氧水H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用活性試驗(yàn)H2O2是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡，PC12細(xì)胞(大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤)可模擬腦神經(jīng)細(xì)胞，因此常用它來(lái)作為研究藥物與神經(jīng)細(xì)胞之間關(guān)系的模型，用MTT測(cè)細(xì)胞的存活率，如果待測(cè)化合物有清除由H2O2引起的自由基，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，OD值高，細(xì)胞存活率就高，反之就低。對(duì)唐希燦所報(bào)道的方去(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Letter，1999，27573-76)加以改進(jìn)測(cè)定化合物的保護(hù)作用。PC12細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細(xì)胞以每孔8000個(gè)的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。細(xì)胞存活率用倒置顯微鏡觀察和改良的MTT法。細(xì)胞經(jīng)48小時(shí)的孵育后，分別加新配的化合物I-t的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時(shí)后加入新配的H2O2(終濃度為600μmol/L)作用3小時(shí)，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100微升，然后加入MTT10微升，3小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。用槲皮素作陽(yáng)性對(duì)照，三次測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)見表四。
試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I-t具有很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。而且在同一濃度下，其清除自由基保護(hù)細(xì)胞的能力比陽(yáng)性對(duì)照槲皮素還高。結(jié)論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬于具有強(qiáng)效保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化物質(zhì)。
表四 化合物I-t及陽(yáng)性對(duì)照槲皮素對(duì)雙氧水損傷PC12細(xì)胞保護(hù)率

測(cè)定化合物對(duì)H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可作為初步探討其保護(hù)中樞腦神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)理。故該類化合物表現(xiàn)出對(duì)雙氧水損傷所致PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，說(shuō)明其對(duì)老年性癡呆證的治療有積極作用。
藥理實(shí)施例5化合物I-t抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性試驗(yàn)5.1.實(shí)驗(yàn)原理脂質(zhì)過(guò)氧化是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，含量與自由基的生成正相關(guān)，由于機(jī)體有抗氧化的酶系及非酶系的保護(hù)作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除。隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質(zhì)過(guò)氧化作用則增強(qiáng)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多。因此，測(cè)定樣品抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，是篩選抗氧化，抗衰老藥物的重要指標(biāo)之一。
5.2化合物I-t抑制自由基誘導(dǎo)之脂過(guò)氧化物生成乃通過(guò)鼠肝微粒體檢測(cè)。(1)肝微粒體的制備實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭處死，迅速取出腦，用超速離心法制備腦微粒體。(2)樣品對(duì)鼠腦脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用在含硫酸亞鐵(4μmol/L)與維生素Vc(50μmol/L)的1毫升緩沖液中加入200μg/mL微粒體中，以誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)加入不同濃度的I-t樣品，37℃孵育30分鐘后加入1微升三氯醋酸(20％)中止反應(yīng)加入1.5微升硫代巴比妥酸(0.76％)，100℃沸水浴20分鐘，離心去除蛋白沉淀，在532nm波長(zhǎng)下測(cè)定上消吸光度。脂質(zhì)過(guò)氧化以反應(yīng)中生成的丙二醛表示，實(shí)驗(yàn)以槲皮素作為陽(yáng)性對(duì)照。三次測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)試驗(yàn)結(jié)果見表五。
表五.樣品對(duì)大鼠腦微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

5.3試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I-t具有很強(qiáng)的抑制自由基誘導(dǎo)之脂過(guò)氧化物生成能力，即對(duì)細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。而且在同一濃度下，其對(duì)細(xì)胞抗氧化損傷能力比陽(yáng)性對(duì)照槲皮素還高。結(jié)論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬于具有強(qiáng)效保護(hù)細(xì)胞抗氧化物質(zhì)。提示其具有保護(hù)腦細(xì)胞組織損傷以及預(yù)期用于制備預(yù)防或治療中風(fēng)后遺癥、早老性癡呆，還可用于治療急性慢性肝損傷類疾病的作用。
藥理實(shí)施例6化合物I-t對(duì)SD新生大鼠原代肝細(xì)胞雙氧水損傷模型的保護(hù)作用試驗(yàn)無(wú)菌取出SD大鼠新生乳鼠(5日齡內(nèi))肝臟，剪碎，用025％的胰蛋白酶消化，制成肝細(xì)胞懸液。將肝細(xì)胞懸液收集在錐形瓶中，用200目雙層尼龍過(guò)濾，再用清洗液清洗，離心3次，以培養(yǎng)液重懸，即可得到大部分為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的懸液。用1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10％小牛血清，105U/升青霉素，100毫克/克鏈霉素10毫克/克胰島素)稀釋純化的肝細(xì)胞懸液，每毫升含1.0×106個(gè)肝細(xì)胞。將上述肝細(xì)胞懸液加入96孔(每孔0.1毫升)培養(yǎng)板中，置5％CO2培養(yǎng)箱中，在37℃下培養(yǎng)12小時(shí)后，吸棄上清，加入0.6mmol/L的H2O2。作用1小時(shí)后，分別加入高、中、低3種不同濃度的I-t樣品試驗(yàn)藥液，每一濃度至少設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)溶劑和陽(yáng)性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，吸棄上清，收集干細(xì)胞樣品，570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀計(jì)算保護(hù)率和增生指數(shù)，三次測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)試驗(yàn)結(jié)果見表六。
試驗(yàn)結(jié)果表明化合物I-t具有較強(qiáng)的保護(hù)SD新生大鼠原代肝細(xì)胞免受雙氧水損傷模型的能力，即對(duì)SD新生大鼠原代肝細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。但在同一濃度下，其對(duì)細(xì)胞抗氧化損傷能力比陽(yáng)性對(duì)照槲皮素略低。結(jié)論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬于具有有效保護(hù)細(xì)胞抗氧化物質(zhì)。提示其具有保肝護(hù)肝以及預(yù)期用于制備預(yù)防或治療急性慢性肝損傷類疾病的作用。
表六 SD新生大鼠原代肝細(xì)胞雙氧水損傷模型的保護(hù)作用

藥理實(shí)施例7化合物I-t對(duì)鐵離子的螯合作用試驗(yàn)據(jù)報(bào)道在AD病人腦中鐵元素顯著升高，很可能鐵離子參與催化神經(jīng)糾結(jié)形成和Aβ蛋白堆積，從而加速早老性癡呆癥狀。對(duì)鐵離子的螯合清除作用也是抗氧化、防治早老性癡呆的作用機(jī)制之一。樣品以20～100微克/毫升的濃度加入含有2mM硫酸亞鐵(5微升)and80％二甲亞砜(200微升)的溶液中，向溶液中加入10微升濃度為5mM的ferrozine 室溫下劇烈搖動(dòng)10分鐘。在562nm波長(zhǎng)下測(cè)溶液吸收OD值，計(jì)算百分抑制率。三次測(cè)試結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)試驗(yàn)結(jié)果見表七。
表七化合物對(duì)鐵離子螯合作用的試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明化合物I-t具有非常強(qiáng)的螯合鐵離子活性，可預(yù)期具有保護(hù)腦細(xì)胞免受鐵離子催化神經(jīng)糾結(jié)形成和Aβ蛋白堆積的能力，從而可以減緩或預(yù)防早老性癡呆癥狀。其對(duì)鐵離子螯合能力比陽(yáng)性對(duì)照姜黃素和槲皮素都要高出許多。結(jié)論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬于具有強(qiáng)效鐵離子螯合劑。
權(quán)利要求
1.一種式(1)所示的化合物及其可藥用鹽或溶劑化物的抗氧化、清除自由基、保護(hù)肝及腦細(xì)胞氧化損傷的活性 式(1)其中取代R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′可以相同或不同，分別獨(dú)立地選自氫，巰基，硝基，氰基，含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，1～15碳的不飽和烴基，1～15碳的不飽和烴氧基，含1～8個(gè)碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個(gè)碳的酰氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8’不能同時(shí)是氫；取代基X可以是氫(H)2，羥基(OH)2，氧，硫；基團(tuán)R可以是氧，硫，氮，含1～8個(gè)碳的亞烷基，含1～8個(gè)碳的亞烷胺基，含1～8個(gè)碳的亞烷氧基，含1～8個(gè)碳的亞烷硫基；其中用于取代的取代基可以是含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，鹵素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，或苯基。
2.式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物的抗氧化、清除自由基、保護(hù)肝及腦細(xì)胞氧化損傷的活性，式(1)中的取代基X為氧，取代基R為氧時(shí)即為式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物， 其中取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′可以相同或不同，分別獨(dú)立地選自氫，巰基，硝基，氰基，含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，1～15碳的不飽和烴基，1～15碳的不飽和烴氧基，含1～8個(gè)碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個(gè)碳的酰氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8’不能同時(shí)是氫；其中用于取代的取代基可以是含1～8個(gè)碳的烷基，含1～8個(gè)碳的烷氧基，鹵素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個(gè)碳的烷胺基，或苯基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的生物活性，其特征為式(I)化合物是I-a.(E)-7-甲氧基-苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-b.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-c.(E)-(7-硝基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-d.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7，8′-三甲氧基)苯丙烯酯；I-e.(E)-(7-甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯脂；I-f.(E)-(6，7-二甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-g.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′二甲氧基)苯丙烯酯；I-h.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；I-i.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；I-j.(E)-(7-羥基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-k.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；I-l.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；I-m.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)-苯丙烯酯；I-n.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-o.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″，4″-二氯)芐基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_，4_-二氯)芐基)-丙烯酯；I-p.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(4″-溴)芐基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(4_-溴)芐基)-苯丙烯酯；I-q.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″-溴)芐基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_-溴)芐基)-苯丙烯酯；I-r.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(2″-碘，4″-溴)芐基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(2_-碘，4_-溴)芐基)-苯丙烯酯；I-s.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-香葉基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-香葉基)-苯丙烯酯；I-t.(E)-(6，7-二羥基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3所述之生物活性，其用于制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷類疾病、保肝護(hù)肝類藥物的用途；以及該類化合物用于制備防治由自由基引起或與自由基相關(guān)的其他生理改變或疾病、保護(hù)腦神經(jīng)包括抗氧化、防治中風(fēng)和中風(fēng)后遺癥、帕金森氏癥、防治老年性癡呆癥以及炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病藥物的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途所制備得到的保肝護(hù)肝藥、中風(fēng)和中風(fēng)后遺癥藥物、帕金森氏癥藥物、防治老年性癡呆癥以及炎癥藥物、抗自身免疫性疾病藥物、治療心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化藥物、治療心血管及腦血管病變藥物、抗衰老藥物、和/或抗腫瘤藥物或藥物組合物。
6.一種用于制備清除自由基、防治中風(fēng)和中風(fēng)后遺癥、帕金森氏癥、防治老年性癡呆癥以及炎癥、抗自身免疫性疾病、治療心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化、治療心血管及腦血管病變、抗衰老、和/或抗腫瘤、保護(hù)肝細(xì)胞損傷及急慢性肝損傷的藥物組合物，其含有作為活性成分的治療有效量的權(quán)利要求1～3所述之化合物或其可藥用鹽或溶劑化物或者它們的混合物和可藥用輔料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及苯丙烯酸苯丙烯酯型姜黃素類似物的抗氧化、保護(hù)肝臟和腦損傷活性的用途。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該類化合物具有保護(hù)大鼠乳鼠原代肝細(xì)胞損傷、促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)、體外清除超氧陰離子和二苯基苦基苯肼自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性，對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用，對(duì)鐵離子有強(qiáng)效螯合作用。因而可以預(yù)期用于制備防治急慢性肝或腦損傷類疾病、防治中風(fēng)和中風(fēng)后遺癥、帕金森氏癥、老年性癡呆癥以及炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P39/00GK101015543SQ20071006725
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日
發(fā)明者楊雷香, 張麗娟, 白驊, 呂旦旦, 趙昱 申請(qǐng)人:浙江海正天華新藥研發(fā)有限公司