專利名稱：從楊梅中分離制備矢車菊色素－3－葡萄糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，涉及楊梅深加工技術(shù)，特別是從楊梅中分離制備矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法。
背景技術(shù)：
楊梅是我國的傳統(tǒng)特產(chǎn)水果，其果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，甜酸適口，且具有很高的營養(yǎng)保健價(jià)值，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)，花色苷類化合物是其中最主要的一類活性成分。楊梅花色苷主要成分為矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)。國內(nèi)外研究表明C3G具有抗氧化、抗癌、抗突變等生物活性，并對(duì)DNA分裂有保護(hù)作用和減輕眼睛的疲勞、提高夜間視力和改善視覺瞬間改變適應(yīng)性。從楊梅分離制備C3G未有文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本較低、經(jīng)濟(jì)適用的從楊梅中分離制備矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案采用酸化甲醇或酸化乙醇浸提楊梅中的花色苷；用陽離子交換樹脂對(duì)浸提得到提取物進(jìn)行初步純化，得到楊梅花色苷粗提物；以逆流色譜儀為分離設(shè)備分離純化楊梅花色苷粗提物中的C3G，其溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下處于液態(tài)的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液組成，TBME、乙腈和正丁醇的體積比為1～2∶1∶1～4，水的用量應(yīng)至少保證使溶劑系統(tǒng)上下相分層，TFA水溶液的濃度為0.1％～1％。上相做固定相，下相做流動(dòng)相。
以上方案按步驟敘述如下1、采用酸化甲醇或酸化乙醇浸提楊梅中的C3G，得到C3G提取液。
2、將C3G提取液濃縮至含固形物60％左右；3、在上述濃縮液中加入適量的水(濃縮液體積的1-2倍)，用乙酸乙酯萃取兩次脫脂，水相用陽離子交換樹脂吸附和酸化甲醇解吸處理，得到初步純化的C3G洗脫液；4、將C3G洗脫液真空濃縮至糊狀，再冷凍干燥，獲楊梅C3G粗提物；5、采用逆流色譜方法分離純化C3G粗提物；6、收集逆流色譜分離的C3G組分進(jìn)行真空濃縮，直至固形物濃度達(dá)到40％以上，再采用冷凍干燥，得到C3G粉末。
步驟(1)所述的浸提過程是采用含5％甲酸的甲醇或含5％甲酸的乙醇做溶劑，浸提溶劑與楊梅的體積比為5～10∶1，條件為室溫、避光，浸提時(shí)間為24小時(shí)，浸提次數(shù)2～3次。
步驟(2)、步驟(4)和步驟(6)所述真空濃縮的真空度低于0.09Mpa，溫度為35～40℃。
步驟(4)和步驟(6)所述冷凍干燥的真空度低于50Pa，溫度低于-35℃。
步驟(5)所述逆流色譜方法為采用逆流色譜儀為分離設(shè)備，溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下處于液態(tài)的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液組成，TBME、乙腈和正丁醇的體積比為1～2∶1∶1～4，水的用量應(yīng)至少保證使溶劑系統(tǒng)上下相分層，TFA水溶液的濃度為0.1％～1％，上相做固定相，下相做流動(dòng)相；用泵將上述溶劑系統(tǒng)的上相注入逆流色譜儀的色譜柱，并取上述溶劑系統(tǒng)的部分下相溶解花色苷粗提物制備逆流色譜樣品溶液；開啟逆流色譜儀和流動(dòng)相輸液泵，將樣品溶液和流動(dòng)相輸入逆流色譜分離柱；用紫外-可見檢測(cè)器檢測(cè)逆流色譜流出液，根據(jù)所得的色譜圖收集C3G組分。
步驟(5)所述逆流色譜方法中的逆流色譜儀為高速逆流色譜儀(HSCCC)或低速逆流色譜儀(SRCCC)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是使用基于液-液分配的逆流色譜技術(shù)，分離重現(xiàn)性好，樣品回收率高，是一種經(jīng)濟(jì)、高效的從楊梅中分離制備高純度矢車菊色素-3-葡萄糖苷的方法。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
圖2為實(shí)施例1的HSCCC分離圖譜。
圖3為實(shí)施例1分離所得的C3G的HPLC圖譜。
圖4為實(shí)施例2的HSCCC分離圖譜。
圖5為實(shí)施例3的SRCCC分離圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明的工藝流程參考圖11、采用含5％甲酸的甲醇或含5％甲酸的乙醇做溶劑，浸提溶劑與楊梅的體積比為5～10∶1，在室溫條件下避光浸提，時(shí)間24小時(shí)，浸提次數(shù)2～3次。
2、將浸提液進(jìn)行真空濃縮，直至固形物濃度占花色苷濃縮液的60％以上。
3、步驟2所得到的楊梅花色苷濃縮液中按濃縮液體積計(jì)加入1～2倍量的水，再用乙酸乙酯萃取兩次脫脂，水相采用型號(hào)為DIAION HP2MGL的陽離子交換樹脂吸附，再用酸化甲醇解吸處理，得到初步純化的花色苷洗脫液。
4、將步驟3所得到的花色苷洗脫液進(jìn)行真空濃縮至糊狀，再采用冷凍干燥得到楊梅花色苷粗提物。
5、逆流色譜分離純化C3G。
本發(fā)明步驟1、步驟2和步驟5中真空濃縮過程的真空度低于0.09Mpa，溫度為35～40℃。
本發(fā)明步驟3和步驟5中冷凍干燥時(shí)的真空度低于50Pa，溫度低于-35℃。
為進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明步驟4的逆流色譜儀純化過程，以3例分述如下實(shí)施例1本實(shí)施例的溶劑系統(tǒng)采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝1.5∶1∶2∶5，TFA水溶液濃度為0.1％；逆流色譜儀為HSCCC-D1000高速逆流色譜儀，C3G粗提物中C3G約占36％。
量取TBME 300ml、乙腈200ml、正丁醇400ml，TFA 1ml和水1000ml，置于2000ml分液漏斗，充分搖勻，靜置分層后，將上下兩相分別裝入試劑瓶。將上相以40ml/min的流速注入高速逆流色譜的色譜柱。稱取C3G粗提物2.0g溶于50ml下相中制備逆流色譜樣品溶液，開啟逆流色譜儀至800轉(zhuǎn)/min，然后以1.0ml/min的流速輸入樣品溶液，待進(jìn)樣結(jié)束后，再以2.0ml/min的流速輸入流動(dòng)相以洗脫柱內(nèi)的組分，用紫外可見檢測(cè)器在520nm下檢測(cè)逆流色譜流出液，根據(jù)檢測(cè)器采集的圖譜收集C3G組分。分離得到C3G組分676mg，純度達(dá)96％以上。
實(shí)施例2本實(shí)施例的溶劑系統(tǒng)采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝2∶1∶4∶8，TFA水溶液濃度為1％，逆流色譜儀為HSCCC-D1000高速逆流色譜儀，楊梅花色苷提取物中C3G約占53％。
量取TBME 400ml、乙腈200ml、正丁醇800ml、TFA 16ml和水1600ml，置于3000ml分液漏斗，充分搖勻，靜置分層后，將上下兩相分別裝入試劑瓶。將上相以40ml/min的流速注入高速逆流色譜的色譜柱。C3G粗提物2.0g溶于50ml下相中制備逆流色譜樣品溶液，開啟逆流色譜儀至800轉(zhuǎn)/min，然后以1.0ml/min的流速輸入樣品溶液，待進(jìn)樣結(jié)束后，再以2.0ml/min的流速輸入流動(dòng)相洗脫柱內(nèi)的組分，用紫外可見檢測(cè)器在520nm下檢測(cè)逆流色譜流出液，根據(jù)檢測(cè)器采集的圖譜收集C3G組分。分離得到C3G組分656mg，純度達(dá)98％以上。
實(shí)施例3本實(shí)施例的溶劑系統(tǒng)采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝2∶1∶4∶10，TFA水溶液濃度為0.1％，逆流色譜儀為SRCCC-D3500低速逆流色譜儀，楊梅花色苷提取物中C3G約占53％。
量取TBME 1600ml、乙腈800ml、正丁醇3200ml、TFA 8ml和水8000ml，置于15000ml玻璃瓶，充分搖勻，靜置分層后，將上下兩相分別裝入試劑瓶。將上相以60ml/min的流速注入低速逆流色譜的色譜柱。稱取C3G粗提物6.5g溶于180ml下相中制備逆流色譜樣品溶液，開啟低速逆流色譜儀至80轉(zhuǎn)/min，然后以2.0ml/min的流速輸入樣品溶液，待進(jìn)樣結(jié)束后，再以5.0ml/min的流速輸入流動(dòng)相洗脫柱內(nèi)的花色苷組分，用紫外可見檢測(cè)器在520nm下檢測(cè)逆流色譜流出液，根據(jù)檢測(cè)器采集的圖譜收集C3G組分。分離得到C3G組分2225mg，純度在95％以上。
權(quán)利要求
1.從楊梅中分離制備矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于以下步驟(1)采用酸化甲醇或酸化乙醇浸提楊梅中的C3G，得到C3G提取液。(2)將C3G提取液濃縮至含固形物60％左右；(3)在上述濃縮液中加入濃縮液體積的1～2倍量的水，用乙酸乙酯萃取兩次脫脂，水相用陽離子交換樹脂吸附和酸化甲醇解吸處理，得到初步純化的C3G洗脫液；(4)將C3G洗脫液真空濃縮至糊狀，再冷凍干燥，獲楊梅C3G粗提物；(5)采用逆流色譜方法分離純化C3G粗提物；(6)收集逆流色譜分離的C3G組分進(jìn)行真空濃縮，直至固形物濃度達(dá)到40％以上，再采用冷凍干燥，得到C3G粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從楊梅中分離制備矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步驟(1)所述的浸提過程是采用含5％甲酸的甲醇，或含5％甲酸的乙醇做溶劑，浸提溶劑與楊梅的液料體積比為5～10∶1，條件為室溫，避光，浸提時(shí)間24小時(shí)，浸提次數(shù)2～3次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述從楊梅中分離制備矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步驟(2)、步驟(4)和步驟(6)所述真空濃縮的真空度低于0.09Mpa，溫度為35～40℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述從楊梅中分離制備矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步驟(4)和步驟(6)所述冷凍干燥的真空度低于50Pa，溫度低于-35℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述從楊梅中分離制備矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步驟(5)所述逆流色譜方法為采用逆流色譜儀為分離設(shè)備，溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下處于液態(tài)的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液組成，TBME、乙腈和正丁醇的體積比為1～2∶1∶1～4，水的用量應(yīng)至少保證使溶劑系統(tǒng)上下相分層，TFA水溶液的濃度為0.1％～1％，上相做固定相，下相做流動(dòng)相；用泵將上述溶劑系統(tǒng)的上相注入逆流色譜儀的色譜柱，并取上述溶劑系統(tǒng)的部分下相溶解花色苷粗提物制備逆流色譜樣品溶液；開啟逆流色譜儀和流動(dòng)相輸液泵，將樣品溶液和流動(dòng)相輸入逆流色譜分離柱；用紫外-可見檢測(cè)器檢測(cè)逆流色譜流出液，根據(jù)所得的色譜圖收集C3G組分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述從楊梅中分離制備矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步驟(5)所述逆流色譜方法所用的逆流色譜儀為高速逆流色譜儀(HSCCC)或低速逆流色譜儀(SRCCC)。
全文摘要
本發(fā)明為從楊梅中分離制備矢車菊色素－3－葡萄糖苷(C3G)的方法。采用酸化甲醇或酸化乙醇浸提楊梅中的花色苷，用陽離子交換樹脂對(duì)浸提物初步純化，用逆流色譜儀分離純化楊梅花色苷粗提物中的C3G，其溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下處于液態(tài)的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和含三氟乙酸(TFA)水溶液組成，TBME、乙腈和正丁醇的體積比為1～2∶1∶1～4，水的用量保證使溶劑系統(tǒng)上下相分層，TFA水溶液的濃度為0.1％～1％，用紫外－可見檢測(cè)器檢測(cè)洗出液，根據(jù)所得的色譜圖收集C3G組分。本發(fā)明使用基于液－液分配的逆流色譜技術(shù)，分離重現(xiàn)性好，樣品回收率高，是一種經(jīng)濟(jì)、高效的從楊梅中分離制備高純度矢車菊色素－3－葡萄糖苷的方法。
文檔編號(hào)A61K131/00GK101041678SQ20071006835
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日
發(fā)明者杜琪珍 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)