專(zhuān)利名稱(chēng)：：治療心腦血管疾病的中藥提取物的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療心腦血管疾病的中藥提取物的制備方法。技術(shù)背景心腦血管系統(tǒng)疾病是人類(lèi)最為常見(jiàn)的一類(lèi)疾病，已成為當(dāng)今世界人口的第一大死因。在我國(guó)，隨著人口老齡化加速，人民生活水平提高，生活節(jié)奏加快，飲食習(xí)慣向高熱、高脂化發(fā)展，人群中高血壓、高血脂、心力衰竭、腦卒中等心血管系統(tǒng)疾病也已成為危害人類(lèi)健康及生命的嚴(yán)重疾病之一。心血管疾病的高發(fā)生率與死亡率，引導(dǎo)了藥物研發(fā)與生產(chǎn)的方向，在世界藥品市場(chǎng)中，該類(lèi)藥物的研發(fā)、生產(chǎn)和市場(chǎng)狀況日益受到制藥企業(yè)、醫(yī)藥商業(yè)企業(yè)、投資機(jī)構(gòu)和廣大人民的關(guān)注。烏藥(XzWera(aggreg她(Sims)Kosterm)系樟禾斗(Lauraceae山胡椒屬(X/"cfera)植物，其膨大塊根入藥，具有溫中散寒、理氣止痛的功效。而烏藥葉在民間及其臨床也被廣泛使用，具有抗菌、消炎作用。通過(guò)對(duì)烏藥葉化學(xué)成分的系統(tǒng)研究及文獻(xiàn)整理，我們發(fā)現(xiàn)烏藥葉主要含有兩類(lèi)成分黃酮類(lèi)及內(nèi)酯類(lèi)，這與市場(chǎng)上公認(rèn)的對(duì)心腦血管疾病有良好治療效果的銀杏葉提取物成分類(lèi)型極為相近，且成分比例也較為近似。烏藥葉提取物的這些特征，激發(fā)了我們進(jìn)一步研究其藥理活性的興趣。藥理試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，烏藥葉提取物在抗氧化、擴(kuò)張血管、降低血清膽固醇、增加冠脈流量、抗心率失常等方面均表現(xiàn)出良好的作用，可用于制備治療心腦血管疾病的藥物。專(zhuān)利CN1857610(—種含烏藥葉提取物的保健品及其制備方法)公開(kāi)了采用烏藥葉提取物與多種中藥材配伍職稱(chēng)保健品的方法，其中所采用的烏藥葉的提取物系采用簡(jiǎn)單的方法提取而成，有效成分含量低(總黃酮含量18。％，倍半萜內(nèi)酯0.1848%)，。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種治療心腦血管疾病的中藥提取物的制備方法。它是烏藥葉加612倍體積百分比濃度為20%95%乙醇，冷浸或加熱回流提取14次，每次0.512小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并，濃縮至0.251.0§生藥/mL，過(guò)濾或離心分離后通過(guò)AB-8或DuM大孔樹(shù)脂柱，烏藥葉與大孔樹(shù)脂的重量比為1:15，上柱流速l4BV/h，樹(shù)脂柱徑高比為1:31:9;用水洗滌樹(shù)脂38BV，洗脫流速為24BV/h，水洗脫液棄去；用體積百分比濃度為20%95°%乙醇洗脫，流速為24BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所述的提取所用乙醇的體積百分比濃度優(yōu)選30%95%。所述的洗脫樹(shù)脂所用乙醇的體積百分比濃度優(yōu)選30%95%。烏藥葉提取物用于制備治療心腦血管疾病的藥物。本發(fā)明采用大孔樹(shù)脂精制的方法制備烏藥葉提取物，提取物中有效成分含量顯著提高，其總黃酮含量不低于20%(以蘆丁計(jì))；總內(nèi)酯含量不低于1%(以烏藥醚內(nèi)酯計(jì))。該提取物具有抗氧化、擴(kuò)張血管、降低血清膽固醇、增加冠脈流量、抗心率失常等作用，可用于制備治療心腦血管疾病的藥物。具體實(shí)施方式治療心腦血管疾病的提取物的制備方法是烏藥葉加612倍體積百分比濃度為20%95%乙醇，冷浸或加熱回流提取14次，每次0.512小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并，濃縮至0.251.0g生藥/mL，過(guò)濾或離心分離后通過(guò)大孔樹(shù)脂AB-8或Dun大孔樹(shù)脂柱，烏藥葉與大孔樹(shù)脂的重量比為1:15，上柱流速l4BV/h，樹(shù)脂柱徑高比為1:31:9;用水洗滌樹(shù)脂38BV，洗脫流速為24BV/h，水洗脫液棄去；用體積百分比濃度為20%95%乙醇洗脫，流速為24BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所制備的烏藥葉提取物中總黃酮含量不低于20%(以戸丁計(jì))，倍半萜內(nèi)酯不低于1%(以烏藥醚內(nèi)酯計(jì))。實(shí)施例1烏藥葉加6倍30%乙醇，加熱回流提取l次，提取時(shí)間為0.5小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并，濃縮至0.25g生藥/mL，過(guò)濾后通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂柱，烏藥葉與AB-8大孔樹(shù)脂的重量比為1:1，上柱流速lBV/h，樹(shù)脂柱徑高比為1:3;用水洗滌樹(shù)脂3BV，洗脫流速為2BV/h，水洗脫液棄去；用30%乙醇洗脫，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。該提取物中總黃酮的含量為21%，倍半萜內(nèi)酯的含量為1%。實(shí)施例2烏藥葉加12倍95%乙醇，加熱回流提取4次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并，濃縮至l.Og生藥/mL,離心后通過(guò)Dun大孔樹(shù)脂柱，烏藥葉與Dnn大孔樹(shù)脂的重量比為1:5，上柱流速4BV/h，樹(shù)脂柱徑高比為1:9;用水洗滌樹(shù)脂犯V，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用95%乙醇洗脫，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所制備的烏藥葉提取物中總黃酮含量為80%(以蘆丁計(jì))，倍半萜內(nèi)酯含量為12%(以烏藥醚內(nèi)酯計(jì))。實(shí)施例3烏藥葉加8倍70%乙醇，加熱回流提取3次，每次1小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并，濃縮至0.5g生藥/mL，離心后通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂柱，烏藥葉與AB-8大孔樹(shù)脂的重量比為1:2，上柱流速2BV/h，樹(shù)脂柱徑高比為1:5;用水洗滌樹(shù)脂5BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用70%乙醇洗脫，流速為3BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所制備的烏藥葉提取物中總黃酮含量為53%(以盧丁計(jì))，倍半路內(nèi)酯含量為8%(以烏藥醚內(nèi)酯計(jì))。實(shí)施例4烏藥葉加10倍50乙醇，加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并，濃縮至0.5g生藥/mL,過(guò)濾后通過(guò)Dun大孔樹(shù)脂柱，烏藥葉與Dnn大孔樹(shù)脂的重量比為1:3，上柱流速2BV/h，樹(shù)脂柱徑高比為1:7;用水洗滌樹(shù)脂6BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用70%乙醇洗脫，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所制備的烏藥葉提取物中總黃酮含量為24%(以蘆丁計(jì))，倍半萜內(nèi)酯含量為6%(以烏藥醚內(nèi)酯計(jì))。烏藥葉提取物藥效學(xué)試驗(yàn)通過(guò)對(duì)烏藥葉提取物開(kāi)展的一系列藥理試驗(yàn)證明，烏藥葉提取物具有良好的清除自由基、抗氧化的作用，同時(shí)，能有效的擴(kuò)張冠脈血管，增加冠脈流量、明顯改善心肌缺血缺氧、改善缺血腦組織損傷、延緩血栓形成和降低血黏度，具有作為防治心腦血管疾病的天然藥物的巨大潛力。1、抗氧化作用取昆明種小鼠40只，雌雄各半，體重(20士2)g，隨即分為4組鹽水組、小劑量組、大劑量組、銀杏葉提取物組(EGb)，每天給藥1次，連續(xù)給藥1周后，腹主靜脈取血lmL，離心分離出血清，測(cè)定MDA、NO及SOD含量。結(jié)果見(jiàn)表l。表l烏藥葉提取物對(duì)小鼠血清MDA、NO、SOD含量的影響(》士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注與生理鹽水比較，*P<0.05,**P<0.01試驗(yàn)證明，本品能使小鼠血清中SOD含量升高，具有清除氧自由基和抗氧化的能力。2、豚鼠離體心臟冠脈流量試驗(yàn)取豚鼠25只，每組5只，隨即分為5組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、中、高3個(gè)劑量組，EGb對(duì)照組。擊頭致昏，迅速取心臟，在4。C任洛氏液中清洗，排除積血。將主動(dòng)脈套入灌流裝置的套管上，并結(jié)扎固定，以純氧飽和的任洛氏液(Ringer-Locke，s)恒速灌流。灌流平衡10min后，連續(xù)測(cè)定3min的每分冠脈流量，以其平均值作為藥前值。加藥后，記錄13min的每分冠脈流量，取極值，作為藥后值，比較前后變化。表2烏藥葉提取物對(duì)豚鼠離體心臟冠脈流量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注與對(duì)照組相比*P<0.05,**P<0.01;與藥前相比#P<0.05,##P<0.01試驗(yàn)證明，不同劑量的烏藥葉提取物均可增加豚鼠離體心臟的冠脈流量。3、垂體后葉素所致大鼠心肌缺血試驗(yàn)取大鼠50只，雌雄各半，體重180-220g，隨即分成5組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、中、高3個(gè)劑量組，EGb對(duì)照組。分別靜脈注射給藥，給藥20min后，25烏拉坦5mL/kg.ip麻醉，固定于鼠臺(tái)上，記錄正常II導(dǎo)連心電圖后，舌靜脈注射垂體后葉素0.8單位/kg，5s注完。分別記錄0，15，30，60s，3，8min后的II導(dǎo)連心電圖，比較給予垂體后葉素前后，T波高度的變化，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。表3烏藥葉提取物對(duì)垂體后葉素所致大鼠心肌缺血的治療效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>10mg/kg100.193±0.0200.257±0.027*#0.412±0.024*#0.298±0.022#0.235±0.018#0.221±0.02820mg/kg100.198±0.0220.231±0.030*0.359±0.036**##0.241±0.031*#0.223±0.029*0.214±0.01840mg/kg100.197±0.0210.214±0.019**0.274±0.033**絲0.215±0.026**0.209±0.019**0.200±0.015*EGb纟Jl100.195±0.0180.231±0.020*#0.344±0.025*##0.291±0.030*#0.229±0.035*0.201±0.020注與對(duì)照組相比*P<0.05,**P<0.01;與藥前相比#P<0.05，##P<0.014、小鼠常壓缺氧試驗(yàn)取小鼠50只，雌雄各半，體重(20士2)g，隨即分成5組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、中、高3個(gè)劑量組，EGb對(duì)照組。尾靜脈注射給藥20min后分別放入盛有10g堿石灰的容量為250mL磨口瓶?jī)?nèi)，加蓋密封。觀察其存活時(shí)間，以呼吸停止為死亡特征。表4烏藥葉提取物對(duì)小鼠常壓缺氧存活時(shí)間的影響(》化)劑量ti生存時(shí)間(min)生理鹽水1024.9土4.0Omg/kg1030.8土3.5*20mg/kg1036.4土5.4**40mg/kg1041.4土6.3**EGb組1037.3士5,3**與對(duì)照組相比叩<0.05,**P<0.015、烏藥葉提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦梗死損傷的保護(hù)取大鼠(雄性，體重300350g)用戊巴比妥鈉40mg/kgip麻醉，然后在右眼和右耳之間的中點(diǎn)作1.5cm長(zhǎng)的切口，分開(kāi)顳肌，暴露顴突和顳骨，在顴突之頭端l2mm處，用牙科鉆開(kāi)一直徑為2mm的小孔，將軟腦膜開(kāi)一小孔，暴露中腦動(dòng)脈起始部位，用刮刀將腦組織輕輕移開(kāi)，用微小雙極電凝器灼斷大腦中動(dòng)脈，然后將顆肌和皮膚分層縫合。取手術(shù)成功的32只大鼠，分成4組:分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、高2個(gè)劑量組，腦血栓片對(duì)照組。連續(xù)用藥15d后，將動(dòng)物處死，取其大腦，以均等間距橫切5個(gè)斷面，用1。/。四氮唑藍(lán)(TTG)磷酸緩沖液在37"C染色10min后，分離梗死區(qū)與非梗死區(qū)，稱(chēng)重，用重量法計(jì)算梗死面積，最后將腦組織放入ll(TC烘箱內(nèi)連續(xù)烘干24h，取出稱(chēng)腦組織干重，算出腦含水量。結(jié)果見(jiàn)表5。表5烏藥葉提取物對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦梗死得保護(hù)作用(》h)劑量n梗死百分率％含水量％生理鹽水829.4±5.684.2±1.1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與對(duì)照組相比*P<0.01試驗(yàn)證明，烏藥葉提取物對(duì)大鼠腦梗死模型的損傷有明顯的保護(hù)作用，使病灶面積顯著縮小，組織含水量減少，水腫程度明顯減輕。6、對(duì)大鼠體內(nèi)血檢形成的影響取大鼠40只，雌雄各半，隨即分成5組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、中、高3個(gè)劑量組，腦血栓片對(duì)照組，各組連續(xù)灌胃7d，于末次給藥后lh進(jìn)行體內(nèi)血栓形成實(shí)驗(yàn)(戊巴比妥鈉40mg/kgip麻醉大鼠，切開(kāi)頸部皮膚，分離右側(cè)頸動(dòng)脈，在動(dòng)脈近心端下放置刺激電極，遠(yuǎn)心端下放連接儀器的溫度探頭，開(kāi)通體內(nèi)血栓形成測(cè)定儀，通過(guò)刺激電極給予1.5mV直流電刺激7min，以損傷動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，隨著動(dòng)脈管腔內(nèi)血栓逐漸形成，血流逐漸被阻斷，溫度突降，儀器報(bào)警，記錄堵塞形成時(shí)間。)最后將各組動(dòng)物頸總動(dòng)脈采血，肝素抗凝，測(cè)定血液黏度參數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表6。表6烏藥葉提取物對(duì)大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間集全血黏度的影響(》±"<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與對(duì)照組相比*戶(hù)<0.05,**戶(hù)<0.01試驗(yàn)說(shuō)明烏藥葉提取物能夠明顯延長(zhǎng)大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間，同時(shí)各給藥組動(dòng)物的全血黏度均有不同程度的降低，說(shuō)明烏藥葉提取物具有較好的抗血栓和改善血液流變學(xué)的作用。7、烏藥葉提取物對(duì)麻醉犬腦血流量及腦血管膽力的影響取犬20只，每組5只，分成4組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、高2個(gè)劑量組，腦血栓片對(duì)照組。犬用戊巴比妥鈉30mg/kgiv麻醉，氣管插管，分離股動(dòng)脈，插心導(dǎo)管至腹主動(dòng)脈，與壓力換能器相連，再接于多道生理記錄儀記錄血壓波形，并讀取主動(dòng)脈收縮壓(SAP)、舒張壓(DAP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)，同時(shí)，記錄標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)程心電圖;分離頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，將內(nèi)徑3mm的電磁流量計(jì)探頭放置在頸總動(dòng)脈上，以電磁流量計(jì)測(cè)定頸內(nèi)動(dòng)脈血流量(ICBF)。頸內(nèi)動(dòng)脈血管阻力(ICVR)=MAP/ICBF，手術(shù)后穩(wěn)定2030min，待上述各項(xiàng)穩(wěn)定后測(cè)正常值，然后進(jìn)行十二指腸給藥。給藥后30,60,90和120min分別記錄頸內(nèi)動(dòng)脈血流量及血管阻力。結(jié)果見(jiàn)表7、8。表7烏藥葉提取物對(duì)麻醉犬ICBF的影響(用藥后不同時(shí)間得ICBF值(ml/min-100g)劑量0min30min60min90min120min生理鹽水9.7土0.99.7土0.89.9±1.010.歸.99.8土1.110mg/kg10.2±1.0lt).5土1.012.3±1.4*12.5士1.2*40tng/kg10.0±0.910.4±0.912.8±1.5"腦血栓片組59,9±0.8lt).4士0.910.9±0.9*12.5±1."12.6土1.3*與對(duì)照組相比*尸<0.05,**尸<0.01表8烏藥葉提取物對(duì)麻醉犬ICVR的影響(》±"用藥后不同時(shí)間得ICBF值(tnl/min-100g)劑量生理鹽水10mg/kg40mg/kg腦血栓片組nOmin30min60min90min120min51.75±0.421.77±0.381.80±0.351.82±0.271.82±0.3051.77±0.291.72±0.331.68±0.29*1.55±0.36**1.57±0.25**51.74±0.341.69±0.291.60±0.31*1.51±0.22**1.48土0.19"51.72±0.211.68±0.261.66±0.31*1.56±0.27**1.54±0.21**與對(duì)照組相比*P<0.05，**尸<0.01與空白對(duì)照組相比，烏藥葉提取物組在各用藥時(shí)間點(diǎn)，對(duì)犬的血壓、心電、心律均無(wú)明改變，但有增加其ICBF和降低ICVR的作用。權(quán)利要求1、一種治療心腦血管疾病的提取物的制備方法，其特征在于烏藥葉加6～12倍體積百分比濃度為20％～95％乙醇，冷浸或加熱回流提取1～4次，每次0.5～12小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并，濃縮至0.25～1.0g生藥/mL，過(guò)濾或離心分離后通過(guò)AB-8或D101大孔樹(shù)脂柱，烏藥葉與大孔樹(shù)脂的重量比為1∶1～5，上柱流速1～4BV/h，樹(shù)脂柱徑高比為1∶3～1∶9；用水洗滌樹(shù)脂3～8BV，洗脫流速為2～4BV/h，水洗脫液棄去；用體積百分比濃度為20％～95％乙醇洗脫，流速為2～4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療心腦血管疾病的提取物的制備方法，其特征在于提取所用乙醇的體積百分比濃度30%95%。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療心腦血管疾病的提取物的制備方法，其特征在于洗脫樹(shù)脂所用乙醇的體積百分比濃度30%95%。4、一種如權(quán)利要求1所述的治療心腦血管疾病的提取物的用途，其特征在于用于制備治療心腦血管疾病的藥物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種治療心腦血管疾病的提取物的制備方法。它是將烏藥葉加乙醇，冷浸或加熱回流提取，提取液過(guò)濾，合并，濃縮，過(guò)濾或離心后通過(guò)大孔樹(shù)脂，先用水洗滌樹(shù)脂，水洗脫液棄去；再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。本發(fā)明采用大孔樹(shù)脂精制的方法制備烏藥葉提取物，提取物中有效成分含量顯著提高。該提取物具有抗氧化、擴(kuò)張血管、降低血清膽固醇、增加冠脈流量、抗心率失常等作用，可用于制備治療心腦血管疾病的藥物。文檔編號(hào)A61P9/10GK101129466SQ20071007062公開(kāi)日2008年2月27日申請(qǐng)日期2007年8月31日優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日發(fā)明者劉洪梅,孫銘遙,琳張,欣王,田景奎,鐳羅,谷希達(dá),金鑒璐申請(qǐng)人:浙江大學(xué)