專利名稱：：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制造治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥。
背景技術(shù)：
：香鱗毛蕨為鱗毛蕨科(Dryopterideceae)植物，香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott植株高2030cm，根狀莖粗短，直立或斜生，上部密被褐色三角狀披針形鱗片。鱗片邊緣疏生不整齊的齒，葉簇生。葉柄長58cm，連同葉軸或羽軸密被卵形至披針形淡黃色鱗片,有光澤。葉片長1218cm，寬24cm，長披針形或倒披針形，中部以上漸尖或短縮為鈍尖，向下漸狹至葉柄頂部，草質(zhì)，二回羽狀裂。羽片2535對，互生或少數(shù)近對生，寬披針型，長1.52cm，寬0.8lcm，先端鈍，基部楔形，小羽片57對，矩圓形，生于側(cè)脈中下部或基部，囊群蓋圓腎形，邊緣嚙蝕狀，被多數(shù)腺體，膜質(zhì)，灰白色，宿存。孢子橢圓形，具不規(guī)則的小瘤。植物略具香味，故有香鱗毛蕨之稱。香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，落葉多年生草本，生于高寒地區(qū)的滑石坡、森林中的碎石坡上和火山周圍的巖漿縫隙中(Fig.l-1)。香鱗毛蕨在我國分布廣泛，黑龍江、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古和河北地區(qū)均有分布，在我省香鱗毛蕨主要分布于五大連池、塔河縣白卡獸山、呼中大白山的高山地帶及小興安嶺北部地區(qū)。據(jù)北方民間驗(yàn)方記載，香鱗毛蕨能治療各種皮膚病，如牛皮癬、皮疹、皮炎、腳氣和干癬等。黑龍江省北部的居民把香鱗毛蕨視為"皮膚病的克星"，用香鱗毛蕨的水煎液涂擦患處以治療上述疾病。有的居民還用其水煎液洗頭,以達(dá)到去頭屑止癢的目的，有治病和美容的雙重功效，且無任何毒副作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種以野生香麟毛蕨為原料制造治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥制劑。上述的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)-一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥，將香鱗毛蕨的干藥材，粉碎，用10倍量水煎煮兩次，濃縮，進(jìn)行AB-8大孔吸附樹脂柱色譜，用30%乙醇溶液洗脫，得到30%乙醇洗脫組分，濃縮后，得到的有效物質(zhì)。這個(gè)技術(shù)方案有以下有益效果1.本發(fā)明的原料采用北方野生的植物香鱗毛蕨為原料，原料來源豐富，其原料成本低廉，生產(chǎn)周期小，產(chǎn)品出率高，充分的利用了原料，沒有造成浪費(fèi)。2.本發(fā)明的生產(chǎn)過程簡單易行適合大批量的工業(yè)生產(chǎn)，在生產(chǎn)過程中還不會造成環(huán)境污染。3.消炎效果的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備弗氏完全佐劑(CFA)制備CFA是用液體石蠟與無水羊毛脂按2:1比例混合的混合液lmL，高壓滅菌，加入80'C滅活1小時(shí)的減毒卡介苗或干燥結(jié)核死菌10mg制成。致炎方法將大鼠的空白對照組的右后足跖皮內(nèi)注射0.05ml生理鹽水，其余7組每只鼠均在右后足皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.05ml致炎。實(shí)驗(yàn)分組將80只大鼠(雌雄各半)按體重隨機(jī)分為8組(空白組10只、模型組10只、水洗脫部分組10只、30%乙醇洗脫部分組10只、60%乙醇洗脫部分組10只、95%乙醇洗脫部分組10只、雷公藤組10只、水煎膏組10只)。給藥方法-各組大鼠在致炎前先測量每只鼠右后足容積，測定兩次，求其平均值作為致炎前正常足容積。致炎7天后，按大鼠體重灌胃給藥，雷公藤組的給藥劑量為lml/100g藥液，其他各治療組的劑量為0.5ml/100g藥液，空白組和模型組分別給生理鹽水lml/100g。連續(xù)給藥14天，每天一次。對大鼠一般狀況的觀察觀察大鼠一般狀況。對于致炎前、致炎后7天、給藥3天、給藥6天、給藥9天的不同時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄各組大鼠的體重和繼發(fā)性的足腫脹。組織形態(tài)學(xué)觀察滑膜組織切片制備致炎后21d，處死大鼠，于兩側(cè)后足踝關(guān)節(jié)上方0.5cm處剪下炎性腫脹足，放入多聚甲醛溶液中固定后，進(jìn)行脫鈣處理，先用5%硝酸溶液脫鈣，每日更換脫鈣液，早晚各一次，直至用針刺入組織無阻力感為止。脫鈳后組織用流水沖洗過夜。室溫梯度酒精脫水，二甲苯透明，經(jīng)過脛骨和跗骨關(guān)節(jié)中心縱行切開，石蠟包埋，常規(guī)切片，將組織附于用防脫劑處理過的載玻片上，60'C恒溫烘箱烘片12h，備用于蘇木素-伊紅(HE)染色。HE染色(1)取材組織塊經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4nm切片；(2)切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，依次經(jīng)乙醇至水洗二甲苯(I)5min—二甲苯(II)5min—體積分?jǐn)?shù)100%乙醇2min—體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇lmin—體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇lmin—體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇lmin—蒸餾水洗2min;(3)蘇木素染色5min，自來水洗lmin;(4)鹽酸乙醇分化30s;(5)自來水浸泡15min或溫水(約50。C)5min;(6)置伊紅液2min;(7)常規(guī)脫水、透明、封片體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇(I)—lmiii—體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇(II)lmin—體積分?jǐn)?shù)10(T/。乙醇(I)lmin—體積分?jǐn)?shù)100%乙醇(II)lmin—二甲苯石碳酸(3:1)lmin—二甲苯(I)lmin—二甲苯(II)lmin—中性樹脂封固。血清細(xì)胞因子的測定血清制備將治療組大鼠分別用香鱗毛蕨的水煎膏、水洗脫組分、30%乙醇洗脫組分、60%乙醇洗脫組分、95%乙醇洗脫組分及雷公藤治療14天后，斷頭處死。動(dòng)脈取血，每只鼠6ml。采集的血樣室溫靜置2小時(shí)，以6000rpm離心20血清置于-30。C冰箱保存。待測各種血清細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素(IL-1P)測定(1)將大鼠血清用緩沖液充分溶解后的IL-ip標(biāo)準(zhǔn)品與^I-IL-ip及用緩沖液溶解的IL-ip抗血清一起混勻后，于4。C溫浴16h。(2)加入免疫分離劑，充分混勻，室溫放置15min，IL-ip與抗體產(chǎn)生復(fù)合物而被沉淀，在4-C經(jīng)離心機(jī)3500rpm離心15min，棄上清。(3)測定沉淀部分放射性強(qiáng)度。(4)按如下公式計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的結(jié)合率(B/B^/。)B/B0%=[B(cpm)-NSB(cpm)]/[Bo(cpm)國NSB(cpm)xl00%并用計(jì)算機(jī)Logit-log程序處理數(shù)據(jù)。腫瘤壞死因子(TNF)測定(1)將大鼠血清或用蒸餾水稀釋的緩沖液、用緩沖液溶解的TNF標(biāo)準(zhǔn)品與用緩沖液溶解的125I-TNF、抗TNF血清一起混勻后，放4。C24h，(2)加入PR分離劑后充分混勻，放室溫20min，4"C經(jīng)離心機(jī)3500rpm離心25min，棄上清。(3)以B/T計(jì)算NSB、Se結(jié)合百分率，以B/Bc^/。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)及樣品的結(jié)合百分率，在自動(dòng)Y記數(shù)器上測放射性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果大鼠一般狀況的觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)過程中，空白組動(dòng)物狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，體重增加，動(dòng)作自如，反應(yīng)靈敏。模型組大鼠毛發(fā)枯槁，進(jìn)食量減少，體重未有增加或反減輕，右后足及繼發(fā)病變關(guān)節(jié)紅腫明顯并逐日加重，動(dòng)作遲緩，反應(yīng)不靈敏，活動(dòng)減少。治療各組大鼠毛發(fā)欠光澤，進(jìn)食量尚可，體重略有增加，右后足及繼發(fā)病變關(guān)節(jié)紅腫較輕，反應(yīng)較靈敏(見Tab2-l)。Tab2-1治療前后AA模型鼠左后足爪腫脹度的比較?！纒)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與模型組比較*P<0.05,**P<0.01。由Tab2-l、Fig2-1可知，各組大鼠致炎前左足容積無顯著差異(PX).05)，實(shí)驗(yàn)第10天開始，造模各組大鼠繼發(fā)性左足爪腫脹，各治療藥物均具有不同程度的抑制模型鼠繼發(fā)左足爪腫脹的作用(PO.01);實(shí)驗(yàn)18天后，30%乙醇洗脫組分、水洗脫組分療效優(yōu)于其他治療組(P<0.05，P<0.01)。說明各治療藥物均能抑制因RA引起的AA模型鼠致炎對側(cè)后足的足腫脹，雷公藤組、水煎膏組、30%醇洗脫組及水洗脫組均顯示了較好的治療效果，且30%醇洗脫組、水洗脫組療效最佳。組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果凋亡檢測光鏡將所取大鼠右側(cè)滑膜用40%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木素伊紅(HE)染色，于顯微鏡下觀察并照相(見附錄)，進(jìn)行對比(1)水煎膏組接近正常，大鼠滑膜組織細(xì)胞無增生、滑膜細(xì)胞排列整齊。(2)水洗脫組接近正常，大鼠滑膜組織由13層構(gòu)成，排列略整齊。(3)30%醇洗脫組滑膜組織由12層滑膜細(xì)胞構(gòu)成，滑膜細(xì)胞排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤。(4)60%醇洗脫組滑膜組織細(xì)胞增生不明顯，有輕度炎癥，細(xì)胞充血。(5)95%醇洗脫組滑膜組織細(xì)胞有增生，炎癥不明顯，輕度水腫，有充血，滑膜細(xì)胞層次略有增多。(6)空白組大鼠的滑膜組織細(xì)胞無增生，細(xì)胞層次分明，排列整齊?；は聼o炎癥，軟骨表面光滑平整；細(xì)胞核完整，均一。(7)模型組模型組大鼠的滑膜組織中光鏡下可見滑膜細(xì)胞明顯增生，滑膜細(xì)胞層次增多，可達(dá)6-10層，排列紊亂，滑膜下層纖維組織增生，并可見到滑膜脂肪墊水腫，輕度充血。(8)雷公藤組滑膜組織細(xì)胞接近正常，有2-3個(gè)炎癥細(xì)胞。通過對AA大鼠滑膜組織HE染色，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香鱗毛蕨水煎膏、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫部位，均對AA大鼠繼發(fā)性滑膜組織損傷有一定抑制作用；與對照組雷公藤比較，香鱗毛蕨30%洗脫部位對AA大鼠繼發(fā)性滑膜組織損傷抑制作用更顯著。通過實(shí)驗(yàn)表明香鱗毛蕨提取物能改善機(jī)體自身免疫異常，以減輕AA大鼠炎癥反應(yīng)，使關(guān)節(jié)損傷逐漸減輕。其中，以30%洗脫部位為佳。血清細(xì)胞因子的測定結(jié)果Tab2-2各組AA模型鼠血清IL-10、TNF的比較P±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注與模型對照組比較*P<0.05，**P<0.01;與空白對照組比較#P<0.05,##P《0.01。由Tab2-2、Fig2-2和2-3可知，模型組大鼠血清IL-1(J、TNF與空白組比較明顯增高(P<0.01)。各治療組均可下調(diào)AA大鼠血清中IL-lp、TNF，水洗脫組、水煎膏組、雷公藤組及30%乙醇洗脫組均接近正常，說明各治療組能明顯抑制促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，改善機(jī)體自身免疫異常，以減輕RA患者炎癥反應(yīng)，使關(guān)節(jié)損傷逐漸減輕。其中，以30%醇洗脫物、水洗脫物療效最佳。圖1本發(fā)明提取與分離具體技術(shù)路線。圖2-l治療前后AA模型鼠左后足爪腫脹度的比較(；士S)。圖2-2各組AA模型大鼠IL-1的比較。圖2-3各組AA模型大鼠TNF的比較。本發(fā)明的具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥的制造方法，其過程是將香鱗毛蕨干藥材，粉碎，用10倍量水煎煮兩次，在常壓5(TC7(TC的溫度下，濃縮12小時(shí)，繼之進(jìn)行AB-8大孔吸附樹脂柱色譜，用30%乙醇溶液洗脫，得到30%乙醇洗脫組分，在常壓5(TC7(TC的溫度下，濃縮12小時(shí)，將得到的物質(zhì)，迸行包裝。權(quán)利要求1.一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥，其特征是將香鱗毛蕨的干藥材，粉碎，用10倍量水煎煮兩次，濃縮，進(jìn)行AB-8大孔吸附樹脂柱色譜，用30％乙醇溶液洗脫，得到30％乙醇洗脫組分，濃縮后，得到的有效物質(zhì)。全文摘要治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥。本發(fā)明涉及一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥制劑。治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥，將香鱗毛蕨干藥材，粉碎，用10倍量水煎煮兩次，濃縮，繼之進(jìn)行AB-8大孔吸附樹脂柱色譜，用30％乙醇溶液洗脫，得到30％乙醇洗脫組分，濃縮后，得到的有效物質(zhì)。本發(fā)明用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。文檔編號A61P19/04GK101327227SQ200710072378公開日2008年12月24日申請日期2007年6月22日優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日發(fā)明者張彥龍申請人:黑龍江大學(xué)