專利名稱：與人mhc－ⅰ類分子結(jié)合的肝素酶多肽表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，包括篩選獲得與人主要組織相容性復(fù)合物I(MHC-I)類分子結(jié)合的肝素酶多肽分子，以及編碼這些多肽的DNA、RNA，由于這些多肽與人MHC-I類分子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞)，從而有效殺傷肝素酶陽(yáng)性的腫瘤組織，達(dá)到治療進(jìn)展期腫瘤的目的。
背景技術(shù)：
目前的研究表明，CD8+T細(xì)胞所識(shí)別的靶抗原需先經(jīng)抗原提呈細(xì)胞處理，之后以“抗原肽-MHCI類分子”復(fù)合物的形式呈現(xiàn)在抗原提呈細(xì)胞或靶細(xì)胞表面，相應(yīng)的與MHC-I類分子結(jié)合的抗原肽即為CTL表位。
1999年，澳大利亞的Parish和以色列的Voldavsky同時(shí)首次克隆并鑒定出與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的肝素酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物屬內(nèi)β-D-葡萄糖苷酶，能特異性識(shí)別、切斷硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的硫酸肝素(HS)側(cè)鏈。HSPG是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)的主要成分之一，在組織構(gòu)成、血管形成和細(xì)胞粘附等諸多方面發(fā)揮重要的生理作用。高度水化的HS側(cè)鏈及所帶的負(fù)電荷形成結(jié)構(gòu)致密的選擇性分子篩，是阻止腫瘤細(xì)胞侵襲擴(kuò)散的首要屏障之一，同時(shí)，伸展的HS側(cè)鏈還儲(chǔ)備著大量生長(zhǎng)因子、趨化因子和酶類等生物大分子。肝素酶促腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制一方面在于它能降解HSPG，破壞ECM和BM的完整性，另一方面又間接地釋放和活化HS結(jié)合的多種生長(zhǎng)因子，如bFGF、EGF等，促進(jìn)腫瘤血管形成，為發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在局部定植提供營(yíng)養(yǎng)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細(xì)胞株其肝素酶基因表達(dá)是不同的，低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中測(cè)不到肝素酶mRNA表達(dá)和蛋白活性，而高轉(zhuǎn)移株中則明顯表達(dá)。將肝素酶全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移潛能的鼠淋巴瘤和黑色素瘤細(xì)胞株后，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)，而肝素酶的抑制劑如PI88、硫酸昆布多糖或反義分子則能明顯降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。將肝素酶cDNA轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移潛能的鼠淋巴瘤和黑色素瘤細(xì)胞株后，其腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)，而肝素酶的抑制劑如PI88、硫酸昆布多糖或反義分子則能明顯降低其轉(zhuǎn)移能力。綜上所述，肝素酶作為腫瘤相關(guān)抗原，與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此臨床上可對(duì)肝素酶表達(dá)陽(yáng)性且人類白細(xì)胞抗原(HLA)配型的進(jìn)展期腫瘤有一定的殺傷效果。而將肝素酶作為腫瘤相關(guān)抗原，采用生物信息學(xué)手段，研究其CTL表位，并將其作為腫瘤免疫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，到目前為止，未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。
隨著對(duì)免疫應(yīng)答分子機(jī)制研究的深入，人們已逐漸認(rèn)識(shí)到機(jī)體的免疫細(xì)胞并不是對(duì)應(yīng)于各種各樣的病原體或天然抗原的整體分子，而是針對(duì)各種各樣抗原分子的抗原表位。蛋白質(zhì)抗原是通過(guò)其表位來(lái)體現(xiàn)其免疫特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能與人MHC-I類分子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合、可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的多肽表位。
本發(fā)明的另一目的是提供所述多肽表位在制備用于臨床治療和檢測(cè)腫瘤性疾病疫苗中的用途。
本發(fā)明根據(jù)抗原肽與MHC-I分子相互作用的機(jī)理，從肝素酶的全長(zhǎng)基因序列中篩選出侯選多肽表位，最終得到能有效與MHC-I類分子結(jié)合并能激活特異性T淋巴細(xì)胞的多肽表位，該多肽表位長(zhǎng)度僅9個(gè)氨基酸序列，體外容易合成，方便臨床應(yīng)用。
既往的研究表明，肝素酶mRNA的表達(dá)水平與胃癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在此研究的基礎(chǔ)上，將肝素酶全長(zhǎng)基因序列構(gòu)建到pDC315腺病毒載體中，并在293細(xì)胞內(nèi)同源重組及擴(kuò)增后，感染樹(shù)突狀細(xì)胞，將負(fù)載了肝素酶全長(zhǎng)基因的DC細(xì)胞作用于T細(xì)胞，可以激發(fā)特異性的CTL反應(yīng)。因此，在肝素酶的全長(zhǎng)基因序列中，一定存在可以激活T細(xì)胞的特異的CTL表位。
根據(jù)上述研究，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，即能與人MHC-I類分子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合、可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的多肽表位，篩選自序列號(hào)為SEQ NO1的人肝素酶，為與SEQ NO1的人肝素酶具有同源性的下列氨基酸序列，包括SEQ No.68，Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val；SEQ No.46，Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala；SEQ No.37，Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala；SEQ No.53，Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu；SEQ No.54，Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu。
本發(fā)明涉及的多肽表位，還可以為選自SEQ No.68、SEQ No.46、SEQ No.37，、SEQ No.53、SEQ No.54中的游離型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以所述5條多肽之一為單體的各種形式的聚合體。
本發(fā)明所涉及的多肽表位與功能或性質(zhì)已知的蛋白質(zhì)融合或嵌合，即這些蛋白質(zhì)分子或嵌合分子包含了本發(fā)明涉及的多肽氨基酸序列，具有這些多肽的相同或相似活性。
與本發(fā)明有關(guān)的多肽序列，可通過(guò)任何已有的體外多肽合成設(shè)備和不同技術(shù)原理人工合成。其獲得方法主要有以下步驟，包括多肽的合成，純化以及最后產(chǎn)品的收集，這些技術(shù)已經(jīng)成熟并程式化，在相關(guān)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明的積極效果本發(fā)明使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，進(jìn)一步提高了預(yù)測(cè)多肽表位的準(zhǔn)確性，不單純考慮分子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)多肽表位的預(yù)測(cè)影響，同時(shí)從空間構(gòu)象上，預(yù)測(cè)了多肽表位。而且本發(fā)明的多肽物質(zhì)，僅為9肽的短肽，體外容易合成，經(jīng)靜脈給藥后容易被機(jī)體吸收，因此具有非常大的商業(yè)產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。


圖1為SEQ No.68多肽表位的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖2為SEQ No.68多肽表位和MHC分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖3為SEQ No.46多肽表位的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖4為SEQ No.46多肽表位和MHC分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖5為SEQ No.37多肽表位的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖6為SEQ No.37多肽表位和MHC分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖7為SEQ No.53多肽表位的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖8為SEQ No.53多肽表位和MHC分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖9為SEQ No.54多肽表位的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖10為SEQ No.54多肽表位和MHC分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖11為SEQ No.68多肽表位的質(zhì)譜分析圖；圖12為SEQ No.46多肽表位的質(zhì)譜分析圖；圖13為SEQ No.37多肽表位的質(zhì)譜分析圖；
圖14為SEQ No.53多肽表位的質(zhì)譜分析圖；圖15為SEQ No.54多肽表位的質(zhì)譜分析圖；圖16為5個(gè)篩選出的多肽對(duì)效應(yīng)細(xì)胞殺傷效果線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1多肽表位的篩選方法本發(fā)明所獲得的多肽序列是通過(guò)超基序法與量化基序法結(jié)合的方法，從肽庫(kù)中直接調(diào)取，保持了與MHC-I類分子結(jié)合特性。通過(guò)對(duì)這些多肽序列進(jìn)行概率統(tǒng)計(jì)分析，獲得多肽與MHC-I類分子的結(jié)合模型。
1、人肝素酶氨基酸序列的獲得自國(guó)際開(kāi)放共享基因庫(kù)NCBI GeneBank中查找出天然人肝素酶的全長(zhǎng)氨基酸序列(共543個(gè)氨基酸)表示為SEQ No.1Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro ProLeu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg ProAla Gin Ala Gin Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gin Glu Pro Leu His Leu ValSer Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe LeuIle Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr LeuArg Phe Gly Gly Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr PheGlu Glu Arg Ser Tyr Trp Gin Ser Gin Val Asn Gin Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser IlePro Pro Asp Trp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Pro Tyr Gin Glu Gin Leu Leu LeuArg Glu His Tyr Gin Lys Lys Phe Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp ValLeu Tyr Thr Phe Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu LeuArg Thr Ala Asp Leu Gin Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gin Leu Leu Leu Asp Tyr Cys SerSer Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys LysAla Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser Gin Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gin Leu His Lys LeuLeu Arg Lys Ser Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gin Pro ArgArg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp SerVal Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu AsnPro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val Gin Lys Val Phe Gin Val Val Glu SerThr Arg Pro Gly Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly AlaPro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu SerAla Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gin Val Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr HisLeu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys LysLeu Val Gly Thr Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gin Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu ArgVal Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly Asp Leu Thr LeuTyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser AsnLys Gin Val Asp Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys SerVal Gin Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gin Thr Leu Pro Pro Leu MetGlu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe PheVal Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile2、多肽表位預(yù)測(cè)的超基序的獲得超基序法是基于在同一人白細(xì)胞抗原(HLA)家族，甚至不同家族的HLA同種異性分子接納的抗原肽具有相同或相似的錨點(diǎn)殘基構(gòu)成的肽基序，超基序主要作用的錨點(diǎn)殘基是位于肽鏈2位(P2)氨基酸殘基及羧基末端9位(P9)氨基酸殘基。當(dāng)P2、P9的殘基為A、I、L、M、V、T時(shí)，且第二位為芳香族氨基酸，第九位為疏水性氨基酸，與HLA-A2分子有較高的親和力。這些氨基酸的特定序列是多肽分子與MHC分子結(jié)合的活性位點(diǎn)或關(guān)鍵性氨基酸，決定了與MHC-I類分子結(jié)合多肽的活性特征。超基序預(yù)測(cè)CTL表位雖然克服了以往采用簡(jiǎn)單基序法易產(chǎn)生的假陰性結(jié)果，但由于此預(yù)測(cè)法與基序法具有相同的弱點(diǎn)，即在預(yù)測(cè)中僅僅考慮了二、九位殘基的影響而忽略了其它位點(diǎn)的殘基結(jié)合情況，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，故應(yīng)聯(lián)合量化基序法提高CTL表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。
應(yīng)用www.bimas.com提供分析軟件對(duì)上述人肝素酶氨基酸序列進(jìn)行分析，得到以下69個(gè)超基序SEQ No.2-SEQ No.70Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu(1～9)，ProAla Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu(7～15)，Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu(8～16)，Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu(13～21)，Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu(16～24)，Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala(20～28)，Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala GinAla(27～35)，Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr(37～45)，Phe Thr Gin Glu Pro LeuHis Leu Val(44～52)，Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val(51～59)，Ser Val Thr Ile AspAla Asn Leu Ala(58～66)，Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr(59～67)，Asn Leu AlaThr Asp Pro Arg Phe Leu(64～72)，Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile(65～73)，Ala ThrAsp Pro Arg Phe Leu Ile Leu(66～74)，Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu(72～80)，LeuLeu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr(74～82)，Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu(79～87)，Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu(82～90)，Pro Ala Tyr Leu Arg Phe GlyGly Thr(89～97)，Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr(91～99)，Ser Val Asp Val LeuTyr Thr Phe Ala(169～177)，Tyr Thr Phe Ala Asn Cys Ser Gly Leu(174～182)，Phe AlaAsn Cys Ser Gly Leu Asp Leu(176～184)，Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu(183～191)，Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu(184～192)，Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg ThrAla(187～195)，Asn Ala Leu Leu Arg Thr Ala Asp Leu(189～197)，Asp Leu Gin Trp AsnSer Ser Asn Ala(196～204)，Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile(229～237)，Asp Ile PheIle Asn Gly Ser Gin Leu(234～242)，Gin Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gin Leu(241～249)，Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val(260～268)，Asp Val Gly Gin Pro Arg Arg Lys Thr(267～275)，Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu(275～283)，Lys Met Leu Lys Ser PheLeu Lys Ala(277～285)，Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile(282～290)，Ser Val ThrTrp His His Tyr Tyr Leu(292～300)，Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu(303～311)，Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile(310～318)，Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val(315～323)，Ser Val Gin Lys Val Phe Gin Val Val(322～330)，Lys Val Phe Gin Val ValGlu Ser Thr(325～333)，Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu(346～354)，Pro Leu Leu SerAsp Thr Phe Ala Ala(353～361)，Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu(363～371)，TrpLeu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala(365～373)，Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val(372～380)，Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gin Val(376～384)，Val Met Arg Gin Val Phe Phe GlyAla(380～388)，Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu(393～401，Pro Leu Pro Asp TyrTrp Leu Ser Leu(400～408)，Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu(405～413)，Leu LeuPhe Lys Lys Leu Val Gly Thr(408～416)，Lys Leu Val Gly Thr Lys Val Gly Thr(412～420)，Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg Val Tyr(413～421)，Gly Thr Lys Val Gly Thr Lys ValLeu(415～423)，Lys Leu Arg Val Tyr Leu His Cys Thr(430～438)，Phe Val Ile Arg AsnAla Lys Val Ala(432～440)，Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu(449～457)，Tyr Ala IleAsn Leu His Asn Val Thr(453～461)，Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu(456～464)，Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gin Leu(487～495)，Ser Val Gin Leu Asn Gly Leu Thr Leu(492～500)，Gin Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met(494～502)，Thr Leu Lys Met Val AspAsp Gin Thr(499～507)，Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val(525～533)，Phe Val Ile ArgAsn Ala Lys Val Ala(532～540)，Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala(533～541)。
3.CTL表位預(yù)測(cè)的量化基序方案量化基序法是基于IBS假設(shè)，即在抗原肽與HLA-A2分子的結(jié)合中，抗原肽的側(cè)鏈效應(yīng)(錨定、抑制或中性)主要依賴與相應(yīng)的氨基酸殘基在肽中所處的位置受相鄰的氨基酸殘基影響較小。這在一定的范圍內(nèi)可以假設(shè)在一個(gè)多肽序列中，每個(gè)氨基酸殘基相互獨(dú)立且影響整個(gè)肽與MHCI類分子的結(jié)合，而該抗原肽的結(jié)合能就是每個(gè)位置氨基酸殘基結(jié)合能的綜合?；谶@種假設(shè)，1993年P(guān)arker等用肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析154個(gè)九肽與HLA-A2分子的親和力，并得到一個(gè)包含180個(gè)系數(shù)的結(jié)合矩陣，其中每一個(gè)系數(shù)反應(yīng)了相應(yīng)氨基酸殘基在該位置時(shí)的相應(yīng)結(jié)合能。結(jié)合能越大，多肽表位與HLA-A2分子結(jié)合越緊密。對(duì)于某測(cè)定多肽各位置相應(yīng)氨基酸殘基結(jié)合系數(shù)相乘再乘標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)0.151，即為該肽與HLA-A2的結(jié)合力，當(dāng)結(jié)合系數(shù)大于或等于5時(shí)，可以確定為與HLA-A2分子結(jié)合穩(wěn)定，反之認(rèn)定為結(jié)合不穩(wěn)定。
用于分析與HLA-A2分子結(jié)合力的矩陣為FLA-A*0201分子限制性九肽結(jié)合系數(shù)

采用上述的結(jié)合矩陣分析法，對(duì)超基序法預(yù)測(cè)出的CIL表位進(jìn)一步采用量化基序法進(jìn)行驗(yàn)證，以尋求結(jié)合最好的表位。在量化基序結(jié)果中，高于50分的基序共有5個(gè)，即包括以下多肽表位SEQ No。68Pro Aa Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val該序列位于人肝素酶氨基酸序列中第525位與第533位之間，與HLA-A2分于的結(jié)合矩陣分析法評(píng)分為428.78分。
SEQ No.46Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala；該序列位于人肝素酶氨基酸序列中第353位與第361位之間，與HLA-A2分子的結(jié)合矩陣分析法評(píng)分為359.37分。
SEQ No.37Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala；該序列位于人肝素酶氨基酸序列中第277位與第285位之間，與HLA-A2分子的結(jié)合矩陣分析法評(píng)分為140.81分。
SEQ No.53Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu；該序列位于人肝素酶氨基酸序列中第400位與第408位之間，與HLA-A2分子的結(jié)合矩陣分析法評(píng)分為91.21分。
SEQ No.54Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu；該序列位于人肝素酶氨基酸序列中第405位與第413位之間，與HLA-A2分子的結(jié)合矩陣分析法評(píng)分為61.29分。
實(shí)施例2多肽表位與人MHC-I結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬分析對(duì)上述所得多肽表位用Silicon graphics工作站及Insight11軟件建立預(yù)測(cè)多肽表位與HLA-A2.1結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)并進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，包括以下方法①分子模型構(gòu)建，運(yùn)用Insight II軟件包中的Discover 3模塊(采用CVFF力場(chǎng))，對(duì)來(lái)自HPA的幾個(gè)九肽與HLA-A2.1的復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。HLA-A2.1的初始坐標(biāo)來(lái)自于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中HLA-A0201與流感病毒蛋白M1(58～66)復(fù)合物(Protein Data Bank entry1HHI)，各九肽分子運(yùn)用Bioploymer模塊對(duì)1HHI中的多肽表位進(jìn)行氨基酸替換而得。模擬過(guò)程如下首先將HLA與β2m固定，運(yùn)用最陡下降法對(duì)九肽進(jìn)行2000步優(yōu)化計(jì)算，然后用共扼梯度法優(yōu)化，直到能量RMS小于0.1kcal/mol·A；第二步，在復(fù)合物周圍加一層7.5A的水分子，固定HLA復(fù)合物對(duì)水分子進(jìn)行2000步能量?jī)?yōu)化，消除水分子之間以及水分子與蛋白質(zhì)之間的不合理接觸；第三步，對(duì)溶液狀態(tài)下的復(fù)合物進(jìn)行能量最小化計(jì)算，非鍵相互作用采用9.5A的截?cái)嘀?，先后運(yùn)用最陡下降法和共扼梯度法優(yōu)化，直到能量RMS小于0.1kcal/mol·A；第四步，在恒定溫度下進(jìn)行20PS的分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算；最后，對(duì)動(dòng)力學(xué)優(yōu)化得到的構(gòu)象進(jìn)行5000步分子力學(xué)優(yōu)化，得到HLA-A2.1與九肽復(fù)合物的最終構(gòu)象。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬，以已知的HLA-A2.1限制性CTL表位九肽為基礎(chǔ)，分析出MHC-肽復(fù)合物的可能結(jié)構(gòu)，構(gòu)建并分析HLA-A2限制性CTL表位多肽的三維模型，可發(fā)現(xiàn)大部分HLA-A2限制性CTL表位多肽的兩個(gè)錨定殘基間的距離為15～19A。第一位氨基酸殘基側(cè)鏈指向溶液，第二位氨基酸殘基定位于HLA-A2分子肽結(jié)合槽的凹槽B附近，羧基末端氨基酸殘基側(cè)鏈指向HLA-A2分子肽結(jié)合槽的凹槽F，符合這些條件的多肽與HLA-A2.1分子間有較好的親和力。②結(jié)合特征參數(shù)計(jì)算，借助Homology模塊，計(jì)算HPA的幾個(gè)多肽表位中各殘基的溶劑可及表面積、錨點(diǎn)間距、非鍵作用能及氫鍵數(shù)等結(jié)合特征參數(shù)。在對(duì)各殘基溶劑可及表面積的計(jì)算中，我們選擇水分子作為探針?lè)肿樱軇┌霃竭x為0.14nm。分子的溶劑可及表面積是指蛋白質(zhì)分子暴露到溶劑中的面積，將其定義為溶劑球(又稱探針?lè)肿?中心在蛋白質(zhì)分子表面滾過(guò)的面積。上述5條多肽的空間構(gòu)象圖可參見(jiàn)圖1、3、5、7、9。而上述5條多肽與人MHC-I類分子結(jié)合的模擬圖可參見(jiàn)圖2、4、6、8、10。從以上各圖可以看出，SEQ No.37的多肽表位其側(cè)鏈指向MHC-I類分子，其余4肽的側(cè)鏈均指向溶液。
分子動(dòng)力學(xué)結(jié)合特征參數(shù)計(jì)算結(jié)果如下所示

MHC-肽復(fù)合物模型中多肽各殘基的溶劑可及表面積(SAS of anchor Residue/A)直觀反映了肽與MHC分子的嵌合情況，各殘基尤其是錨點(diǎn)的溶劑可及表面積越小，說(shuō)明兩者嵌合越緊密。抗原肽與MHC分二于之間主要通過(guò)疏水作用、氫鍵(H-bondnumber)、鹽鍵等弱相互作用進(jìn)行分子間的識(shí)別。這些非鍵作用越強(qiáng)，相應(yīng)分子間的非鍵作用能就越低，結(jié)合則越緊密。從以上表格可以看出，上述5條多肽的錨點(diǎn)殘基距離均在15-19之間，5條多肽均能與MHC-I類分子很好的結(jié)合，尤其是SEQNo.68、SBQ No.37、SEQ No.54的多肽表位，與MHC-I類分子的結(jié)合尤其緊密。實(shí)施例3本發(fā)明多肽表位的獲得(1)多肽的合成多肽的合成在美國(guó)PE公司生產(chǎn)的ABI431A型多肽合成儀上進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，精氨酸兩次偶聯(lián)，按照多肽序列使肽鏈從羧基端向氨基端延伸。多肽合成后，選用相應(yīng)的切割酶進(jìn)行切割，同時(shí)去除多種保護(hù)基團(tuán)得到的多肽粗產(chǎn)品，在-20℃條件下儲(chǔ)存、備用。
(2)多肽表位的純化和分子量分析將上述實(shí)施例獲得的多肽表位通過(guò)RP-HPLC純化和分析即將各肽用DMSO溶解，濃度為20mg/mL，經(jīng)0.22μm纖維膜過(guò)濾后，在美國(guó)Waters公司產(chǎn)品Delta 600型HPLC上純化和進(jìn)行純度分析。流動(dòng)相選用含0.1％TFA的乙氰溶液。各肽的純化選用C18制備柱(美國(guó)Waters公司，7.0μm，100A，7.8mm×150mm)，各肽的純度分析選用C18分析柱(美國(guó)Waters公司，5μm，100A，3.9mm×150mm)。各純化后多肽的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定在API 2000型(美國(guó)Waters公司)質(zhì)譜儀上安常規(guī)方法進(jìn)行。其質(zhì)譜分析圖參見(jiàn)圖11至圖15，可以看出5條多肽的理論值均與實(shí)測(cè)值相近，在允許誤差范圍之內(nèi)，且純度均在95％以上，說(shuō)明合成效果好，可用于下步實(shí)驗(yàn)。
(3)多肽產(chǎn)品的收集純化上述多肽表位通過(guò)將收集液在常溫下減壓干燥至1～2mL后用至少50mL預(yù)冷后乙醚沉淀，G6玻砂漏斗過(guò)濾收集沉淀，再次完全真空干燥，所得的便是多肽表位純品，-70℃保存、備用。
實(shí)施例3本發(fā)明多肽表位與人MHC-I親和力檢測(cè)1、抗人MHC-I單克隆抗體的獲得T2細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5.0％CO2、飽和濕度，每隔2～3天傳代一次。分泌鼠抗人HLA-A2.1單抗的BB7.2雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)于含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、飽和濕度，每隔2～3天傳代一次，1000rPmin離心并收集其培養(yǎng)上清液作為抗HLA-A2.1的單克降抗體。
2、多肽表位與人MHC-I分子結(jié)合力的檢測(cè)本實(shí)施例為利用T2細(xì)胞系的特點(diǎn)，檢測(cè)多肽表位的親合力的實(shí)驗(yàn)。T2細(xì)胞表而積空載的HLA-A2分子表達(dá)極不穩(wěn)定，呈遞后很快降解?？乖呐c之結(jié)合后穩(wěn)定了HLA-A2的表達(dá)，抗原肽與HLA-A2的結(jié)合力越強(qiáng)，則T2細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達(dá)量就越高。因T2細(xì)胞的內(nèi)源性抗原呈遞途徑中必需的抗原多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)缺陷，所以T2表面HLA-A2分子表達(dá)量的增加直觀地反映了外來(lái)抗原肽與HLA-A2的結(jié)合力，能夠進(jìn)一步證明本發(fā)明的多肽的有效性。利用BB7.2雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗HLA-A2的單克隆抗體，間接熒光免疫法檢測(cè)HLA-A2的表達(dá)量，結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度為檢測(cè)指標(biāo)，以熒光系數(shù)(FI)為衡量指標(biāo)。
實(shí)施例中，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T2細(xì)胞表面的HLA-A2.1分子T2細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次后，在96孔培養(yǎng)板上按1×106/孔的密度種植，各九肽用50％乙醇稀釋后以10μg/mL的濃度加入到T2細(xì)胞的培養(yǎng)液中，并設(shè)置空白對(duì)照孔。T2細(xì)胞在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)18～24h后收集用作流式細(xì)胞儀檢測(cè)。孵育好的T2細(xì)胞用1000rpm離心10min后，沉淀細(xì)胞用冰PBS洗滌3次，同樣條件離心后在細(xì)胞沉淀中加入100μL BB7.2來(lái)源的鼠抗人HLA-A2.1單抗，4℃孵育1h，用同樣的方法PBS洗滌3次后加入100μL稀釋度為1∶50的FITC-羊抗鼠IgG，4℃孵育30min后洗滌3次，用1mL冰PBS稀釋，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度，波長(zhǎng)488nm，以單純的T2細(xì)胞加二抗為陰性對(duì)照，T2細(xì)胞加一抗和二抗為背景對(duì)照。
結(jié)果以FI作為衡量指標(biāo)，計(jì)算公式為熒光系數(shù)(FI)＝(樣本平均熒光強(qiáng)度-背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度，判斷標(biāo)準(zhǔn)FI＞1.5為多肽與HLA-A2.1分子結(jié)合力高，1.0＜FI＜1.5為中等結(jié)合力，F(xiàn)I＞0.5為低結(jié)合力。
親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SEQ No.37的多肽表位與MHC-I類分子的親和力最高，其次為SEQNo.68與SEQ No.53的多肽表位，SEQ No.46和SEQ No.53的多肽表位與MHC-I類分子的結(jié)合力較差。實(shí)施5多肽表位對(duì)胃癌細(xì)胞KATOIII的殺傷效果采用標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放法進(jìn)行。
1、效應(yīng)細(xì)胞的制備在人的DC細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10ug/ml的人HPA抗原肽，調(diào)節(jié)所培養(yǎng)的DC細(xì)胞數(shù)為1×109/L，培養(yǎng)于含100mL/L FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中。于培養(yǎng)第2天加入10mg/L的各候選肽，第3天加入3×104U/L的重組人IL-2。以后每周細(xì)胞全量換液1次，保持各候選肽和重組人IL-2的濃度，刺激3次后，于最后1次刺激的3d內(nèi)收集細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。
2、靶細(xì)胞的制備復(fù)蘇KATOIII細(xì)胞，培養(yǎng)于含100ml/L FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。
3、51Cr釋放實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放實(shí)驗(yàn)，將靶細(xì)胞濃度調(diào)整到1×106個(gè)/mL加入100U CiNa51CrO4，37℃，5％CO2孵育90min，將標(biāo)記好的靶細(xì)胞以1×104個(gè)/100ul加入96孔板，各靶細(xì)胞孔中加入不同稀釋度的效應(yīng)細(xì)胞，每孔100ul，使相應(yīng)的效/靶比分別為25∶1、50∶1和100∶1，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組的效應(yīng)細(xì)胞用重組人II～2刺激的DC。最大殺傷采用2N的HCL，自釋放為靶細(xì)胞加培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2孵育4h，以1000rpm離心10min，各取上清液10μL，用γ計(jì)數(shù)器分別測(cè)定脈沖數(shù)(CPM)。
51Cr特異釋放率按如下公式計(jì)算51Cr特異釋放率=(實(shí)驗(yàn)組的CPM 平均值一自釋放的CPM平均值)/(最大釋放的CPM平均值一自釋放的CPM平均值)×100％。
5條多肽對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷作用如下

權(quán)利要求
1.能與人MHC-I類分子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合、可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的多肽表位，為篩選自序列號(hào)為SEQNO1的人肝素酶，且與SEQ NO1的人肝素酶具有同源性的下列氨基酸序列，包括SEQ No.68，Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val；SEQ No.46，Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala；SEQ No.37，Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala；SEQ No.53，Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu；SEQ No.54，Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽表位，其特征是為選自SEQ No.68、SEQ No.46，、SEQ No.37、SEQ No.53、SEQNo.54中的游離型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以所述5條多肽之一為單體的各種形式的聚合體。
3.權(quán)利要求1中的多肽表位，其特征是所述的多肽表位通過(guò)原核細(xì)胞或真核細(xì)胞表達(dá)純化獲得，或人工合成。
4.權(quán)利要求1、2所述的多肽表位在制備用于臨床治療腫瘤性疾病疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及與人細(xì)胞膜表面主要組織相容性復(fù)合物I類分子結(jié)合的肝素酶多肽表位，以及編碼這些多肽表位的DNA序列，這些多肽表位通過(guò)與人MHC－I類分子結(jié)合，從而產(chǎn)生肝素酶特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，殺死肝素酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，因此可作為多肽藥物疫苗來(lái)治療進(jìn)展期腫瘤。
文檔編號(hào)A61K38/43GK101092450SQ20071007811
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月10日
發(fā)明者楊仕明, 陳婷 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院