專利名稱：一種制備含功能界面的組織工程骨軟骨仿生一體化支架的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備組織工程骨軟骨支架的方法，尤其是含功能界面的組織工程骨軟骨仿生一體化支架的制備方法。
背景技術(shù)：
由創(chuàng)傷或骨病所致關(guān)節(jié)部位骨軟骨缺損臨床常見，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，已成為目前肢體殘障的主要原因之一。美國發(fā)病率為1.5‰～3‰，我國約為美國的5～6倍，且呈逐年上升趨勢。臨床現(xiàn)有治療措施均存在明顯缺陷，其保守治療和關(guān)節(jié)清理術(shù)只能暫時緩解疼痛，不能阻止病程的發(fā)展；自體骨軟骨移植術(shù)可造成供區(qū)損傷，且來源有限，難以修復(fù)較大面積的缺損；異體骨軟骨移植術(shù)存在免疫排斥反應(yīng)及傳播疾病的可能；人工關(guān)節(jié)置換術(shù)則費用昂貴、并發(fā)癥較多、翻修率較高，特別是對年輕患者的身心影響大、經(jīng)濟負(fù)擔(dān)重。近年快速發(fā)展的組織工程技術(shù)，為其再生修復(fù)提供了新策略。
目前，單一組織工程軟骨和骨組織的構(gòu)建技術(shù)日趨成熟，部分成果已試用于臨床，為組織工程技術(shù)再生修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織缺損奠定了良好的基礎(chǔ)。組織工程骨軟骨復(fù)合組織的再造研究，已經(jīng)歷“分層構(gòu)建”的可行性初探和近年“一體化構(gòu)建”的動物實驗。然而實驗研究發(fā)現(xiàn)，其缺損區(qū)修復(fù)組織質(zhì)量缺陷、與宿主界面整合欠佳，并缺乏相應(yīng)的力學(xué)功能，致使這一關(guān)節(jié)部位骨軟骨缺損再生的治療策略難以由動物實驗向臨床應(yīng)用過渡。綜合分析推斷，導(dǎo)致上述問題的主要原因是制備的工程化骨軟骨支架不理想，即支架設(shè)計、選材和制備工藝尚存在不足。
理想的工程化骨軟骨復(fù)合組織構(gòu)建策略不是將再造的軟骨和骨組織簡單地縫合或粘合在一起，具有功能界面的一體化三維支架構(gòu)建是決定成敗的關(guān)鍵。因此，構(gòu)建仿生功能界面(鈣化層結(jié)構(gòu))的設(shè)想勢必解決再造組織質(zhì)量缺陷、移植物與宿主整合欠佳等問題，這是因為①通過仿生鈣化層特殊界面結(jié)構(gòu)可以將軟骨牢固地固定在軟骨下骨上，防止植入體內(nèi)后軟骨從軟骨下骨上脫離體，從而有利于移植物與宿主界面整合。②利用鈣化層結(jié)構(gòu)致密性使植入體內(nèi)的骨軟骨復(fù)合組織象宿主一樣自然分為氧和營養(yǎng)豐富的成骨微環(huán)境、氧和營養(yǎng)缺乏的成軟骨微環(huán)境，防止植入細(xì)胞在成骨性和成軟骨性支架間遷移，促進(jìn)特定區(qū)域細(xì)胞利用各自微環(huán)境向特定方向增殖、分化。
理想的支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性，利于細(xì)胞粘附、增生和分化；可降解吸收性，通過人工調(diào)控可以使其降解吸收速度與體內(nèi)新生組織生長速度相匹配；良好的機械特性，能滿足植入部位的力學(xué)要求。研究表明，正常關(guān)節(jié)骨軟骨復(fù)合組織中，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由II型膠原和蛋白多糖組成、鈣化層主要由II型膠原和羥基磷灰石組成、軟骨下骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由I型膠原和羥基磷灰石組成。目前，組成骨軟骨復(fù)合組織的醫(yī)用仿生材料業(yè)已上市，國內(nèi)外生物材料公司均有銷售，且具有良好的生物相容性和可控降解性能。因此，仿生材料選擇與應(yīng)用勢必解決上述不足。
理想個組織工程骨軟骨支架制備需與先進(jìn)的制備工藝相結(jié)合。以往研究多采用層壓、熔融鑄形及纖維粘結(jié)等傳統(tǒng)方法制作骨軟骨復(fù)合支架，工藝復(fù)雜、重復(fù)性較差，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；并且制造的三維支架形狀規(guī)則，常為長方形或圓柱形，難以滿足形狀多變的骨軟骨缺損。近年來三維打印技術(shù)逐漸成熟并在單一組織工程骨和軟骨構(gòu)建中試用，采用該技術(shù)不但可以實現(xiàn)骨軟骨復(fù)合支架一體化制造，同時還可以使其具有臨床需要的特定解剖外形和內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)。
實現(xiàn)組織工程骨軟骨支架的仿生制備，除了考慮支架仿生設(shè)計和仿生選材外，還必需考慮制備工藝即三維打印快速成型技術(shù)對生物材料理化性能的要求。如何使仿生支架材料即滿足三維打印技術(shù)要求，同時又不喪失其生物活性是本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對目前組織工程骨軟骨存在的不足，即再造組織質(zhì)量缺陷、與宿主界面整合欠佳、及缺乏相應(yīng)的力學(xué)功能等問題，采用仿生學(xué)原理設(shè)計工程化骨軟骨仿生支架、選擇仿生材料并對其進(jìn)行調(diào)控與修飾、然后應(yīng)用三維打印快速成型先進(jìn)制備工藝技術(shù)制備含功能界面的組織工程骨軟骨仿生一體化支架。最后通過體內(nèi)外實驗檢測并證實，采用本發(fā)明技術(shù)制備的組織工程骨軟骨支架即可以達(dá)到支架材料的理想標(biāo)準(zhǔn)，同時還可以實現(xiàn)其制備的規(guī)范化、程序化和產(chǎn)業(yè)化。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟(1)依據(jù)仿生學(xué)原理，根據(jù)骨軟骨缺損的大小和正常骨軟骨的超微結(jié)構(gòu)，應(yīng)用計算機輔助設(shè)計軟件建立具有特定解剖外形和仿生內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)的工程化骨軟骨一體化支架CAD模型；(2)根據(jù)正常骨軟骨各層的組分及比例購買或自制仿生支架原材料，即選用II型膠原和殼聚糖作為軟骨支架材料、II型膠原和羥基磷灰石作為鈣化層支架材料、I型膠原和羥基磷灰石作為軟骨下骨支架材料；然后采用理化交聯(lián)、礦化結(jié)晶及噴霧干燥等技術(shù)方法對選定生物材料進(jìn)行修飾，制成膠原/殼聚糖、膠原/羥基磷灰石微聚體干粉，使其即滿足三維打印技術(shù)要求又不喪失其生物學(xué)活性；(3)將設(shè)計好的工程化骨軟骨支架CAD模型轉(zhuǎn)化成快速成型文件格式(STL)輸入三維打印快速成型機，鋪粉裝置鋪設(shè)計定粉材，微型噴頭在每一層鋪好的粉末材料上有選擇地噴射粘合劑(戊二醛)，噴有粘合劑的位點被粘結(jié)在一起，其它地方仍為粉末起支撐作用，去除多余粉材后即可得到含功能界面組織工程骨軟骨仿生一體化支架。此外，除了用戊二醛對粉材進(jìn)行交聯(lián)外，還可以采用紫外線、溫控等輔助方法增加粉材的粘結(jié)速度和粘結(jié)強度。
(4)支架打印完成后去離子水反復(fù)漂洗，低溫凍干，X-射線消毒后密封低溫儲存。
本發(fā)明包括以下兩種關(guān)鍵技術(shù)方法(1)一種制備羥基磷灰石/膠原微聚體的方法原理膠原易溶于酸性溶液，堿性、高溫條件下膠原分子中帶負(fù)電荷的梭基游離出來并與羥基磷灰石的Ca2+形成穩(wěn)定具有高結(jié)合能的離子鍵；戊二醛具有兩個功能醛基，低溫和酸/中性條件下，能夠與膠原多肽鏈的賴氨酸和羥賴氨酸的氨基酸殘基反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵N-C，當(dāng)膠原分子的氨基與戊二醛反應(yīng)后，大量的原來與氨基結(jié)合的梭基游離出來，可以加強膠原與羥基磷灰石之間的鍵合，形成穩(wěn)定的羥基磷灰石/膠原“聚合體”。因此，利用羥基磷灰石和膠原的理化特性，通過調(diào)控反應(yīng)體系的溫度和pH值，使羥基磷灰石以共價鍵接合方式在膠原表面礦化結(jié)晶；戊二醛交聯(lián)羥基磷灰石周圍的膠原，從而形成內(nèi)為羥基磷灰外層膠原包裹的羥基磷灰石/膠原微聚體。
制備方法包括以下步驟①將膠原溶于0.01mol/L～0.1mol/L酸性溶液(鹽酸或醋酸溶液)中，充分?jǐn)嚢枋鼓z原完全溶解，制備成1％～10％膠原-酸溶脹液；②配制羥基磷灰石水溶液，濃度為3％～10％；③將膠原-酸溶脹液加入燒杯，置于溫控磁力攪拌機上；邊攪拌邊緩慢加入羥基磷灰石水溶液；必要時，用去離子水調(diào)整反應(yīng)體系體積；在將羥基磷灰石水溶液加入膠原-酸溶脹液中后，加入NaCI以提高溶液的穩(wěn)定性。
④充分混均后，啟動溫控按鈕，升高反應(yīng)體系溫度并控制在25℃～37℃；調(diào)整溶液pH值在8～12，繼續(xù)攪拌10～20min；⑤降低反應(yīng)體系溫度并控制在8℃～10℃，調(diào)整溶液pH值在7.35～7.45之間，邊攪拌邊滴加戊二醛水溶液，控制濃度在0.1％～0.5％之間，滴加完后繼續(xù)攪拌1h～2h；⑥升高反應(yīng)體系溫度并控制在25℃～37℃；靜置保溫16h～24h；
⑦用去離子水反復(fù)漂洗去除溶液中雜質(zhì)，噴霧干燥機干燥、收集、分裝密封，X-射線輻照消毒后低溫保存。
(2)一種制備膠原/殼聚糖微聚體干粉的方法原理戊二醛具有兩個功能醛基，低溫和酸性條件下，能夠與膠原多肽鏈的賴氨酸和羥賴氨酸的氨基酸殘基反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵N-C，當(dāng)膠原分子的氨基與戊二醛反應(yīng)后，大量的原來與氨基結(jié)合的梭基游離出來，于是膠原分子的梭基將與殼聚糖分子中活潑的羥基鍵合，形成穩(wěn)定的膠原/殼聚糖“聚合體”。因此，利用膠原和殼聚糖的理化特性，通過調(diào)控反應(yīng)體系的溫度和pH值，以及加入戊二醛作為交聯(lián)劑，制備殼聚糖和膠原共混“微聚體”。
制備方法包括以下步驟①將II型膠原溶于0.2mol/L～0.5mol/L酸性溶液(鹽酸或醋酸溶液)中，充分?jǐn)嚢枋鼓z原完全溶解，制備0.1％～0.5％膠原-酸溶脹液；同法配制0.1％～0.5％殼聚糖-酸溶脹液；②將膠原-醋酸溶脹液加入燒杯，置于溫控磁力攪拌機上；按比例緩慢加入殼聚糖-酸溶脹液；pH值控制器調(diào)整溶液pH值(pH＝2～6)，繼續(xù)攪拌10min～20min；③然后降低反應(yīng)體系溫度，并控制在4℃～10℃，邊攪拌邊滴加戊二醛水溶液終濃度為0.1％～0.5％，滴加完后繼續(xù)攪拌16h～24h；④去離子水反復(fù)漂洗去除雜質(zhì)，噴霧干燥機干燥、收集、分裝、低溫保存。
采用本發(fā)明技術(shù)制備含功能界面的組織工程骨軟骨仿生一體化支架，與現(xiàn)有的制備技術(shù)相比，具有以下特點(1)結(jié)構(gòu)--功能特點仿生一體化支架由軟骨層、鈣化層和軟骨下骨構(gòu)成，其中，①軟骨層支架具有適合軟骨細(xì)胞增殖、分化的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)；②軟骨下骨層支架具有適合成骨細(xì)胞增殖、分化的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)；③利用鈣化層凸凹不平的界面結(jié)構(gòu)增加支架間的連接面積和連接強度，將軟骨支架牢固地錨合在軟骨下骨上，植入體內(nèi)后利于組織間應(yīng)力分散，防止組織間分層。利用鈣化層致密結(jié)構(gòu)阻止植入細(xì)胞在成骨性和成軟骨性支架間遷移，利于特定區(qū)域的細(xì)胞利用各自微環(huán)境向特定方向增殖、分化，從而加強移植物與宿主之間的界面整合。
(2)組成--功能特點①選用II型膠原和殼聚糖作為軟骨層支架材料，一方面仿生材料具有良好的生物相容性利于軟骨細(xì)胞粘附、增生和分化；另一方面可以通過控制II型膠原和殼聚糖的組成比例來調(diào)控軟骨支架的降解速度和機械強度；②選用I型膠原和羥基磷灰石作為軟骨下骨層支架材料，一方面有利于成骨細(xì)胞粘附、增生和分化；另一方面可以增加支架的機械強度；③選用II型膠原和羥基磷灰石作為鈣化層支架材料，使界面組成同時具有與軟骨相同的II型膠原和與軟骨下骨相同的羥基磷灰石，即加強了組織間的連接強度，同時避免因不同組織伸縮性和溶脹性不同導(dǎo)致的界面分離。
(3)通過人工調(diào)控仿生材料的組成、比例及其理化特性，實現(xiàn)支架機械強度和降解吸收速度的可控性，使其具有良好的機械特性，移植到患者體內(nèi)后能夠承受正常狀態(tài)的應(yīng)力作用，滿足植入部位的力學(xué)要求；使其降解吸收速度與宿主體內(nèi)新生組織生長速度相匹配。例如，一體化支架中羥基磷灰石完全被膠原包裹，羥基磷灰石決定支架的剛性，為分散相；膠原決定支架的韌性，為連續(xù)相；外露膠原同時具有良好的生物相容性有利用細(xì)胞粘附、增殖。通過調(diào)整羥基磷灰石顆粒的大小、外層膠原的厚度，實現(xiàn)支架機械強度和降解吸收在一定范圍內(nèi)的可控性。微聚體中羥基磷灰石顆粒越大、外層膠原越薄，支架的機械強度就越大，降解吸收就越慢。
(4)采用本發(fā)明技術(shù)制備的組織工程骨軟骨支架能夠達(dá)到工程化支架材料的理想標(biāo)準(zhǔn)，同時具有操作簡單、成型精度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可以實現(xiàn)一體化支架制備的規(guī)范化、程序化和產(chǎn)業(yè)化。
具體實施例方式
結(jié)合實施例詳述本發(fā)明技術(shù)1.根據(jù)人體正常關(guān)節(jié)骨軟骨復(fù)合組織的超微結(jié)構(gòu)確定組織工程骨軟骨支架內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)，其外形限度為直徑為5mm、高為1cm圓柱狀，實際需要的解剖外形可以通過MRI影像技術(shù)獲得。然后應(yīng)用計算機輔助設(shè)計軟件(CAD)建立骨軟骨復(fù)合組織一體化支架模型。該支架自上至下由軟骨層、鈣化層和軟骨下骨層三部分組成，各層具有不同的組成成分和內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)，各層之間借助鈣化層特殊組成和結(jié)構(gòu)緊密連接。本發(fā)明所用的計算機輔助設(shè)計軟件(CAD)，是一種現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本文披露的內(nèi)容，能夠設(shè)計或編制出該設(shè)計軟件，在此不做詳述。
組織工程骨軟骨一體化支架主要結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.根據(jù)人體正常關(guān)節(jié)骨軟骨復(fù)合組織的基本組分確定支架各層構(gòu)成的仿生材料與組成比例，選用II型膠原和殼聚糖作為軟骨支架材料、II型膠原和羥基磷灰石作為鈣化層支架材料、I型膠原和羥基磷灰石作為軟骨下骨支架材料。然后依據(jù)仿生材料的理化特性，采用理化交聯(lián)、礦化結(jié)晶及噴霧干燥等技術(shù)方法對選定生物材料進(jìn)行修飾，制成膠原/殼聚糖、膠原/羥基磷灰石“微聚體”干粉，使其即滿足三維打印技術(shù)要求又不喪失其生物學(xué)活性；該制備過程采用的三維打印技術(shù)，是一種現(xiàn)有技術(shù)，可參閱名稱為“三維打印成型設(shè)備及方法”、專利申請?zhí)枮?00510029726.9的中國發(fā)明專利申請文件，或參閱名稱為“一種制作三維物體和支撐的打印成型方法”、專利申請?zhí)枮?00610038580.9的中國發(fā)明專利申請文件。
組織工程骨軟骨一體化支架組成成分及比例

注醫(yī)用納米羥基磷灰石(南京海泰納米材料有限公司)；醫(yī)用I型膠原和II型膠原(四川銘讓生物科技有限公司研制)(1)羥基磷灰石/膠原微聚體研制制備羥基磷灰石/膠原微聚體干粉的步驟①將膠原溶于0.01mol/L HCl溶液中，充分?jǐn)嚢枋鼓z原完全溶解，制備2％膠原-鹽酸溶脹液；配制5％羥基磷灰石水溶液。
②將膠原-鹽酸溶脹液加入燒杯，置于溫控磁力攪拌機上；邊攪拌邊緩慢加入羥基磷灰石水溶液。去離子水調(diào)整反應(yīng)體系中溶質(zhì)濃度，加入適量NaCI以提高溶液的穩(wěn)定性。
③升高反應(yīng)體系溫度并控制在25℃～37℃；pH值控制器調(diào)整溶液pH值(pH＝8～12)，繼續(xù)攪拌10～20min；④降低反應(yīng)體系溫度并控制在8℃～10℃，調(diào)整溶液pH值(pH＝7.35～7.45)，邊攪拌邊滴加戊二醛水溶液終濃度為0.1％～0.5％，滴加完后繼續(xù)攪拌1h～2h；⑤升高反應(yīng)體系溫度并控制在25℃～37℃；靜置保溫16h～24h；⑥去離子水反復(fù)漂洗去除溶液中雜質(zhì)，噴霧干燥機干燥、收集、分裝密封，X-射線輻照消毒后低溫保存。
⑦掃描電鏡(SEM)檢測微聚體大小、形態(tài)及表面膠原和羥基磷灰石分布情況；透射電鏡(TEM)檢測微聚體內(nèi)部膠原和羥基磷灰石的大小、形態(tài)及分布情況；X-射線衍射儀(XRD)檢測微聚體內(nèi)羥基磷灰石結(jié)晶情況；X-射線光電子能譜(XPS)檢測微聚體構(gòu)成元素的組成情況；傅利葉變換紅外光譜(FT-IR)檢測微聚體內(nèi)各分子基團之間鍵合能改變情況；差示掃描量熱分析(DSC)檢測微聚體熱差改變情況。
⑧根據(jù)檢測結(jié)果對微聚體制備技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，通過調(diào)整物相顆粒大小，組成比例，聚合、交聯(lián)的溫度和pH值等使制備的微聚體滿足項目設(shè)計要求。
(2)II型膠原/殼聚糖微聚體研制制備II型膠原/殼聚糖微聚體干粉的步驟①將II型膠原溶于0.5mol/L醋酸溶液中，充分?jǐn)嚢枋鼓z原完全溶解，制備0.5％膠原-醋酸溶脹液；同法配制0.5％殼聚糖-醋酸溶脹液。
②將膠原-醋酸溶脹液加入燒杯，置于溫控磁力攪拌機上；按比例緩慢加入殼聚糖-醋酸溶脹液；pH值控制器調(diào)整溶液pH值(pH＝2～6)，繼續(xù)攪拌10min～20min；。
③降低反應(yīng)體系溫度并控制在4℃～10℃，邊攪拌邊滴加戊二醛水溶液終濃度為0.1％～0.5％，滴加完后繼續(xù)攪拌16h～24h；④去離子水反復(fù)漂洗去除雜質(zhì)，噴霧干燥機干燥、收集，雙層聚乙烯薄膜小袋分裝，低溫保存。
⑤對制備的微聚體進(jìn)行相關(guān)檢測，根據(jù)檢測結(jié)果對微聚體制備技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，通過調(diào)整物相顆粒大小，組成比例，交聯(lián)的溫度和pH值等使制備的微聚體滿足項目設(shè)計要求。
3.將設(shè)計好的關(guān)節(jié)骨軟骨復(fù)合支架CAD模型轉(zhuǎn)化成快速成型文件格式(STL)輸入三維打印機。鋪粉裝置鋪設(shè)上述研制粉材，0.25％戊二醛使粉材使粉材中的膠原交聯(lián)粘結(jié)，還可以通過紫外線照射和溫控等措施增加交聯(lián)速度和提高交聯(lián)強度。支架打印完成后去離子水反復(fù)漂洗，低溫凍干，X-射線消毒后密封低溫儲存。
4.依據(jù)ISO10993系列標(biāo)準(zhǔn)，采用SEM、XRD、FTIR、力學(xué)實驗、降解性試驗、細(xì)胞毒性試驗、遺傳毒性試驗等方法對支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、生物安全性和降解吸收性等理化性能進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果證明本發(fā)明的骨軟骨復(fù)合組織工程支架具有設(shè)計要求的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)和組成比例；具有良好的組織相容性和生物安全性，利于細(xì)胞粘附、增生；具有良好的機械強度，能夠滿足植入部位的力學(xué)要求；具有可控降解吸收性，通過人工調(diào)控可以使其降解吸收速度與體內(nèi)新生組織生長速度相匹配。
5.采用該支架結(jié)合種子細(xì)胞制備技術(shù)、雙相凝膠接種技術(shù)及組織塊體外培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建工程化骨軟骨復(fù)合組織；大動物(豬)體內(nèi)植入修復(fù)實驗結(jié)果表明采用本發(fā)明的骨軟骨復(fù)合組織工程支架構(gòu)建的工程化骨軟骨復(fù)合組織植入體內(nèi)后與周圍正常組織完全整合，降解時間與周圍新生組織生長速度基本匹配；修復(fù)組織軟骨部分具有類似天然關(guān)節(jié)軟骨的生物學(xué)特性、軟骨下骨部分能夠在較短時間內(nèi)與宿主骨組織產(chǎn)生骨性結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種制備含功能界面的組織工程骨軟骨仿生一體化支架的方法，其特征在于包括以下步驟(1)依據(jù)仿生學(xué)原理，根據(jù)骨軟骨缺損的大小和正常骨軟骨的超微結(jié)構(gòu)，應(yīng)用計算機輔助設(shè)計軟件建立具有特定解剖外形和仿生內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)的工程化骨軟骨一體化支架CAD模型；(2)根據(jù)正常骨軟骨各層的組分及比例購買或自制仿生支架原材料，選用II型膠原和殼聚糖作為軟骨支架材料、 II型膠原和羥基磷灰石作為鈣化層支架材料、I型膠原和羥基磷灰石作為軟骨下骨支架材料；然后采用理化交聯(lián)、礦化結(jié)晶及噴霧干燥技術(shù)方法對選定生物材料進(jìn)行修飾，制成膠原/殼聚糖、膠原/羥基磷灰石微聚體干粉，使其即滿足三維打印技術(shù)要求又不喪失其生物學(xué)活性；(3)將設(shè)計好的工程化骨軟骨支架CAD模型轉(zhuǎn)化成快速成型文件格式(STL)輸入三維打印快速成型機，鋪粉裝置鋪設(shè)計定粉材，微型噴頭在每一層鋪好的粉末材料上有選擇地噴射粘合劑(戊二醛)，噴有粘合劑的位點被粘結(jié)在一起，其它地方仍為粉末起支撐作用，去除多余粉材后即可得到含功能界面組織工程骨軟骨仿生一體化支架；(4)支架打印完成后去離子水反復(fù)漂洗，低溫凍干，X-射線消毒后密封低溫儲存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的制備膠原/羥基磷灰石微聚體干粉包括以下步驟(1)將膠原溶于0.01mol/L～0.1mol/L酸性溶液(鹽酸或醋酸溶液)中，充分?jǐn)嚢枋鼓z原完全溶解，制備成1％～10％膠原-酸溶脹液；(2)配制羥基磷灰石水溶液，濃度為3％～10％；(3)將膠原-酸溶脹液加入燒杯，置于溫控磁力攪拌機上；邊攪拌邊緩慢加入羥基磷灰石水溶液；必要時，用去離子水調(diào)整反應(yīng)體系體積；(4)充分混均后，啟動溫控按鈕，升高反應(yīng)體系溫度并控制在25℃～37℃；調(diào)整溶液pH值在8～12，繼續(xù)攪拌10～20min；(5)降低反應(yīng)體系溫度并控制在8℃～10℃，調(diào)整溶液pH值在7.35～7.45之間，邊攪拌邊滴加戊二醛水溶液，控制濃度在0.1％～0.5％之間，滴加完后繼續(xù)攪拌1h～2h；(6)升高反應(yīng)體系溫度并控制在25℃～37℃；靜置保溫16h～24h；(7)用去離子水反復(fù)漂洗去除溶液中雜質(zhì)，噴霧干燥機干燥、收集、分裝密封，X-射線輻照消毒后低溫保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的制備膠原/殼聚糖微聚體干粉包括以下步驟(1)將II型膠原溶于0.2mol/L～0.5mol/L酸性溶液(鹽酸或醋酸溶液)中，充分?jǐn)嚢枋鼓z原完全溶解，制備0.1％～0.5％膠原-酸溶脹液；同法配制0.1％～0.5％殼聚糖-酸溶脹液；(2)將膠原-醋酸溶脹液加入燒杯，置于溫控磁力攪拌機上；按比例緩慢加入殼聚糖-酸溶脹液；pH值控制器調(diào)整溶液pH值(pH＝2～6)，繼續(xù)攪拌10min～20min；(3)然后降低反應(yīng)體系溫度，并控制在4℃～10℃，邊攪拌邊滴加戊二醛水溶液終濃度為0.1％～0.5％，滴加完后繼續(xù)攪拌16h～24h；(4)去離子水反復(fù)漂洗去除雜質(zhì)，噴霧干燥機干燥、收集、分裝、低溫保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的酸性溶液是鹽酸或醋酸溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的制備羥基磷灰石/膠原微聚體的方法，其特征在于在將羥基磷灰石水溶液加入膠原-酸溶脹液中后，加入NaCI以提高溶液的穩(wěn)定性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備含功能界面的組織工程骨軟骨仿生一體化支架的方法，先依據(jù)仿生學(xué)原理，建立骨軟骨一體化支架CAD模型；選用II型膠原和殼聚糖制成膠原/殼聚糖、II型膠原和羥基磷灰石制作膠原/羥基磷灰石微聚體干粉；骨軟骨支架CAD模型轉(zhuǎn)化成快速成型文件格式(STL)輸入三維打印快速成型機，鋪粉裝置鋪設(shè)計定粉材，微型噴頭在每一層鋪好的粉末材料上有選擇地噴射戊二醛，噴有粘合劑的位點被粘結(jié)在一起，去除多余粉材后即可得到含功能界面組織工程骨軟骨仿生一體化支架。本發(fā)明具有良好的生物相容性利于軟骨細(xì)胞粘附、增生和分化；能調(diào)控軟骨支架的降解速度和機械強度，有利于成骨細(xì)胞粘附、增生和分化，可以增加支架的機械強度；移植到患者體內(nèi)后能夠承受正常狀態(tài)的應(yīng)力作用，滿足植入部位的力學(xué)要求；使其降解吸收速度與宿主體內(nèi)新生組織生長速度相匹配。
文檔編號A61L27/00GK101032430SQ20071007839
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日
發(fā)明者王富友, 段小軍, 楊柳, 戴剛 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院