專利名稱：一種百日咳基因工程融合亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，特別是涉及一種百日咳基因工程融合亞單位疫苗及 其制備方法.
背景技術(shù)：
百曰咳是由革蘭氏BI性桿菌百曰咳軒菌引起的一種具有強(qiáng)傳染性的呼吸系性的呼吸系 統(tǒng)疾病，其流行周期為2~5年的區(qū)域性疾病，人類是百日咳桿菌的唯一宿主，主要H過飛沫 經(jīng)空氣傳播，患病對(duì)象主要為5歲以下耍幼兒.百曰咳具有極強(qiáng)的傳染性，與百曰咳病人密 切接觸的未免疫成員中，90 no賴的人將iUL為百日咳；由于疫苗免疫保護(hù)時(shí)間的限制，
在密切接觸病人的完成免疫注射者中，5W以上的人可能會(huì)發(fā)生亞眵床感染.雖然疫苗的應(yīng)用 對(duì)控制百日咳的流行起到了顯著的效果，但百曰咳患病率近年來仍呈現(xiàn)出明顯的上升趁勢(shì)， 出現(xiàn)了所謂的"復(fù)燃"現(xiàn)象.并JLilA百曰咳患者所占比鋼不斷增加，由于這類患者的癥狀 不典型，常使百曰咳的診斷與治療受到延誤而使他們成為最主要的傳染源(Crwcfoft HS, SteinC,et al. Lancet Infect Dis. 2003, 3:413 - "8 ).據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，近年來全球 每年都有超過4000萬的百日咳患者，其中死亡者在30萬左右，絕大部分為兒童，^A和青 少年死亡比例有所上升.
疫苗是預(yù)防和控制傳染性疾病流行的最有效的手段.傳統(tǒng)的百日咳疫苗主要包括全細(xì)胞 百曰咳疫苗《1W》和無細(xì)胞百曰咳疫苗(APV),且都以百白破三聯(lián)疫苗的形^在.其中， 肝V雖^^應(yīng)用于臨床，但由于其是滅活的全菌^L苗，接種時(shí)剁反應(yīng)大，導(dǎo)致接種爰蓋率 的下降及近年來百S咳發(fā)病率的上升；APV是直接從細(xì)菌中^^各種皿成分，經(jīng)物^jpyl 后按不同的種類和剩量組合而成.這些M成分主要有百日咳毒素(PT)、絲狀M素(PHA)、 百曰咳軒菌耱著素(Pra》以及凝!Ut (MJC豕》等，其中PT是各種APf中共有的威余，夠床 研究證實(shí)，這些無細(xì)胞疫苗具有良好的免疫原性，輛反應(yīng)少.但以下兩個(gè)罔素制約了其^JL: (l)對(duì)純化工藝、設(shè)備要求高，純化費(fèi)竭高，增加了^HI生產(chǎn)jM^ U)細(xì)菌本身產(chǎn)生的某 些抗原成分太少，尤其是PT等毒素抗原，不利于疫苗的idftM生產(chǎn).
基國(guó)x^疫苗的研制首先^重要的是逸擇安全有效的抗屨，^*基闥組學(xué)，蛋白質(zhì)組 學(xué)，分子免疫學(xué)以JL^向疫苗學(xué)、生物信息學(xué)的不斷U，給^fe原的idS^預(yù)測(cè)或鋒選帶來 了便利.目苗，關(guān)于百日咳軒菌^Jt成^^研究最多的主J^是PT、 F似和Pnu由于逸些^S 成分分子量都很大，直接重Ul^ill^不可能，現(xiàn)主要是研究從中錄選具有免疫原性的片段
并對(duì)其保護(hù)，
FHA由百日咳軒菌fhaB基因編碼，是百曰咳軒菌合成并分泌的一種主要的凝附分子，與 百曰咳軒菌粘糖和定居在呼吸道上皮細(xì)胞有關(guān)，J^沒有毒性，MA分子量大，前體蛋白為
370-kDa,經(jīng)蛋白酶作用后的成體蛋白分子量為22(Hd)a,難于直接異源表達(dá)(Sylvie A, Nathalie R， infection and i,n"y， 2002,70(8): 4142-4147),研究發(fā)現(xiàn)FHA具有兩 個(gè)主要的免疫活性位點(diǎn)，分別命名為typel、 n結(jié)構(gòu)域，研究顯示，位于FHA的C末端的包 含456個(gè)4UI^酸的type 1結(jié)構(gòu)域《以下記為冊(cè)A')具有更好的免疫原性，含有大部分活<^ 位《早在1997年，Elizabeth等(ElizabethL， StevenB，et al- The Jour旭l of Infectious Diseases 1997; 175:1423-31 )錢過合成肽段的方狄這一片段的免錢性進(jìn)行了證實(shí). Knight 等 (Knight JB, Huang YY，et al. Clinical and experinental i咖unology. 2,6,144《3): 543-550》將其與麥芽糖結(jié)合蛋白(他P)融合表達(dá)后，在血清和唾
液中都檢測(cè)到了高效價(jià)的抗體，動(dòng)物^也證實(shí)，其支氣管百a咳桿菌清除率高于對(duì)照組，
提示其具有良好的免疫原性.天然的PMA*兩樣存在表達(dá)閨難的問趙，前瓶岍究中，申請(qǐng)人 已將冊(cè)A，構(gòu)建到PET-22b, PET-28a以及PQB30栽體中，^未見8的蛋白的^Ji.
FT是由6個(gè)亞單位(SI - S5》構(gòu)成的A-B型毒素，其中，A原體由一分子的SI組成，B 寡聚體為兩分子的S4分別與一分子的S2、 S3結(jié)合后再與S5結(jié)合所形成的五聚體，介導(dǎo)毒素 吸附至宿主細(xì)胞膜上并輔助A原體進(jìn)入把細(xì)胞fTMia P, Mark Jf. accine, 1997,15 ( 9) :966-975).天然的PT具有多種生物學(xué)活性，如ADP-核糖轉(zhuǎn)移蘇活性，iaJ^K 感性、胰為素增多活性以及促白細(xì)胞增多活性等.研究表明，這些生物學(xué)活性均由S1亞單位 介導(dǎo)，而且PT的主要保護(hù)性決^位于SI亞單位上，另外ADP-核糖轉(zhuǎn)移絳^"表明，所有 天然序列的si亞單位均具有蘇活性，而部分變異的SI亞單位辦顯示出不同程度的酶活性 (Castro MG， Mc la魁ra U. Cell Microbiol 2001; 3(1): 45 - 54.),罔此，突變的SI可能是 良好的候選抗原.通過點(diǎn)突變技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)獲得多個(gè)S1亞單位的突變體，其中S1-兆A29G 最受關(guān)注，該雙突變體失去了天然S1生物學(xué)活性，卻保留了^的免疫保護(hù)活性(Pizza A Cov逸cci矗，BarttfkMi A et al. Science, 19豕9;246《492J》497 — 5(MI), SI亞##^"有2.35 個(gè)^JJ^殘基，研究表明，其主要的抗原表位位于M端的180個(gè)氨基酸^，而上迷S1突變
體的兩+突變位點(diǎn)正好在這一區(qū)域內(nèi)，闊此這一片段可作為良好的免疫原，以下記為sr.
LEE等(Lee SF, Scott風(fēng)M呵F， et al. Infection aM iamnity, 2003 ，71 (4): 2272
-M75》構(gòu)建表達(dá)了一個(gè)Sr SI* CT扱融合蛋白，其中，CTB為霍C^^素砂亞稱，為一種良
好的粘膜佐剩，可有效的謙導(dǎo)體^ut疫和扭糢sigA應(yīng)答.將該蛋白鼻內(nèi)免疫小a^，血清和
唾液中檢測(cè)到了 IgtJ和sIgA抗體，而且這些拔體體外可中和天然FL這些研究都證實(shí)Sl,
有良好的免疫原性.但闔內(nèi)外研究都it實(shí)，si'極難異源表達(dá).

發(fā)明內(nèi)容
為i^l以上8的，本發(fā)明采用的*1術(shù)方案是 一種百日咳Jfe4tMf苗雙亞^基H工程
疫苗，該疫苗是由已知的百曰咳毒素Sl亞拳&突變體連接一個(gè)JBL徵Fs所構(gòu)威的融合蛋白.
所迷的融合蛋白的C端帶有6~Bis純《 #簽，并且具有S塊ID敝1所示的ajMt序列.
所迷的融^JE"白的IM^加論為S, IB M: 2所示的核 序^或者鳊碼相闊蛋白廣的與 其具有遣傳密碼簡(jiǎn)并性的序列，
所述的百日咳毒素Sl亞單位突變體為9K/129G, AL法Fs為來自絲狀血凝素的包括138 個(gè)M酸的肽段，具有SEQ ID恥3所示的M酸序列組成的蛋白。
所述的肽敬Fs的編碼DNA為SEQ ID恥4所示的核苷酸序列或者編碼相同蛋白質(zhì)的與 其具有遣傳密碼簡(jiǎn)并性的序列，肽段Fs位于百曰咳毒素Sl亞單位突變體的^端或位于百 曰咳毒素Sl亞單位突變體的l^端.
所述的肽段Fs與百日咳毒素Sl亞單位突變H間通過編碼連接子的一段核苷酸序列相 連接，其編碼連接子的一段核苷酸序列為PQDPP.
本發(fā)明另一個(gè)目的，是提供百曰咳1&#氏桿菌雙亞單位基因工程疫苗的制備方法，包括 如下步猱:構(gòu)建S1突變體;預(yù)測(cè)和鑒定冊(cè)A，中的Fs片段;構(gòu)建重組工程菌pET-22b(+)-FsSl， /BL21;測(cè)定重組質(zhì)粒的基國(guó)序列；謙導(dǎo)重組工程菌，表達(dá)獲得疫苗候選蛋白FsSl，；純化分 離目的蛋白，采用親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化；筌定目的蛋白的純度；鑒定融合蛋白的 免疫原性；制成百日咳lfe^氏桿菌雙亞單位基因工程疫苗.
在融合蛋白的構(gòu)建中，本發(fā)明采用以下的連接方式及連接子
(1) 融合蛋白FsSl'的連接方iUi: Ps的編碼基西通過編碼連接子的一段核苷酸序列 與S1，編碼基因連接，從而獲得融合蛋白FsSl，，其中，Ps位于5，端，Sl，通過編碼連接 子(CCTCMC!ATCrGCCA，脯氨酸-谷J^Sfe胺-天門冬氨酸-脯氨酸-脯氨酸，PQDPP )的一段核 苷酸序列連接于Fs基因的3，端，在FsSl，融^^基因3，端連接6 ^iR^tJl編碼序列.困l 為重組質(zhì)粒成T-22M+)-FsSr構(gòu)建策略國(guó).
(2) 融合蛋白FsSl， Sl，的連接方式是上Hftfe合蛋白FsSl'編碼基因通過編碼連接 子的一^t核苷酸序到與另一個(gè)SF編i^基罔連^ft從而獲得融務(wù)蛋白FsSF Sl'的編碼基因. 其中，F(xiàn)sSl，融合基因位于5,端，Sl'編碼基罔通過編碼連接子(TACGCGCCGCAGGATCCT,
iMUil-丙殺麋-膽IUil-谷^jy^天冬^Jl-脯^J脧，MPQDP)的一段核苷H^列連接于融合
基因的3，端，在FsSl， Sl，融合基B 3，端連接6 mMAM編碼序列.爾2為重組質(zhì)粒 pBT-Mb(+)-FsSl， Sl'構(gòu)建策略閨*所迷的融合蛋白的錄構(gòu)是SEQ ID敝5所示的氨基酸 序列；編碼所述融合蛋白的基西序列是SEQ ID敝6所示的核普酸序列或者編碼相兩蛋白質(zhì) 的與其^^有遺傳密碼簿^H的序列.
本發(fā)明的基罔工程重組菌及重組融合蛋白FsSl'的Jj^特性①宿主菌為BU1，4^達(dá)栽 體為pET-Mb;②重組蛋白以包涵體形i^逸，F(xiàn)sSl，分子量為3狄Da;③重組蛋白FsSl， 的表達(dá)量在30%以上；④PsSl，蛋白的等電點(diǎn)為6.2.
與e^T^bMi比，本發(fā)噴的優(yōu)#* 下
由于本發(fā)明通il^西工程手段，鋒選百B咳軒菌多^H^護(hù)性抗原中的活性片段構(gòu)建融合 蛋白作為基B工程痰苗的^t逸蛋白，突破了傳統(tǒng)的直接從百日咳軒翁中提取各種毒力園子及 后續(xù)的化學(xué)減毒和物理融合方式，本發(fā)明的發(fā)明AiCH—系列實(shí)驗(yàn)對(duì)FsSl，的生物學(xué)活性和
免疫學(xué)活性作了一個(gè)初步的研究，結(jié)果表噴，F(xiàn)ssi， ！^喪失了天然sr的^#生物學(xué)*#， 并具有良好的免疫學(xué)活性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，與傳統(tǒng)疫苗免疫效果相當(dāng)，說明
該蛋白可作為百日咳基因工程疫苗的候選抗原.因此，與傳統(tǒng)的疫苗相比，本發(fā)明一種百日
咳胞特氏桿菌雙亞單位基西工程疫苗具有可以;t^生產(chǎn)、搮作簡(jiǎn)便、安全性高、副作用小、 不存在回復(fù)突變等優(yōu)勢(shì)，罔此擁有良好的市場(chǎng)前景，具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益.
由于本發(fā)明從FHA'出發(fā)，采用生物信息學(xué)手m其蛋白結(jié)構(gòu)和抗原性進(jìn)行預(yù)測(cè)，成功 預(yù)測(cè)出了一個(gè)138個(gè)氨基酸片段Fs，免疫印跡證實(shí)其具有良好的免U應(yīng)性，更為重要的是， 該蛋白表達(dá)量在5將以上，成功實(shí)現(xiàn)了抗原的高a達(dá)，克厥了百曰咳桿菌抗原成分難以表 達(dá)的技術(shù)難趙，
由于本發(fā)明采用上迷筌定的Fs片段與百日咳毒素Sl亞單位突變體(在本發(fā)明的說明書 中簡(jiǎn)稱Sl，)融合，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-22b(+)-FsS1，，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pET-22b《+)-FsSl， SI', 二者均在大麝軒菌BL21中得到了高效表達(dá)，后者表達(dá)量相對(duì)低于 前者，這兩個(gè)蛋白從根本上降低了天然S1的各種生物學(xué)毒性，而保留了良好的免疫原性，成 功突破了單一的S，，難以異源表達(dá)這一技術(shù)瓶頰，使得百曰咳基西工程疫苗的研究成為可能.
由于目前公認(rèn)可使用的理想的百白破亞單位疫苗(DTaP)候選抗原僅有白喉毒素 (IH沐tlieriaToxin,DT)A片段突變體和4fe傷Jl^素(Tetanus Tojdn, TT)的重鏈C端《He), 本發(fā)明百日咳胞特氏桿菌雙亞單位基理工程疫苗候選蛋白的成功構(gòu)建，將為百白破三聯(lián)基因 工程疫苗的研制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下面特舉實(shí)施例，并配^L 明書附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1:重組質(zhì)粒pET-22M+)"FsSl'構(gòu)建策略圖。 圖2:重組質(zhì)粒pET-22b(+)-FsSl， Sl，構(gòu)建策略困. 苗3: 1突變體兆/129G重^達(dá)質(zhì)粗的酵切養(yǎng)定. 泳道1為核酸(冊(cè)A)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker ); 泳道2為重MJf粒pMD18-T-Sl兆/129G
泳道3為重組質(zhì)粒plfl)18-T-Sl兆/129G的JSJH3筌定(約7仰bp)。
街4: pM018-T—Sl兆/129G測(cè)序結(jié)果.
圖5:冊(cè)A'蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原性預(yù)測(cè)結(jié)果.
倒6A: Fs PCR tH9筌定結(jié)果，
泳道1為核酸(DHA)^"量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)
泳道2為Fs PCR擴(kuò)增結(jié)果
圖6B: pET-22b(+)-Fs絳切筌定結(jié)果.
泳道1為核酸(DM)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker )
泳道2、 3為重組質(zhì)粒pET -22b-Fs的雙fiH5筌定(約400bp).
圖7: pET-22b(+)-Fs測(cè)序結(jié)果。
圖8: pET -22b(+)-Fs誘導(dǎo)表it^達(dá)形式鑒定結(jié)果，
泳道1為破菌上清；
泳道2為破菌沉淀；
泳道M為低分子蛋白Marker;
泳道3為PET-22b空栽體；
泳道4-7分別為IPTG謙導(dǎo)0、 1、 3、 5h取樣。
圖9: west-blotting筌定Fs
泳道M為低分子蛋白Marker;
泳道1-5依次為pET-22b空栽體，PET-22b(+)-Fs謙導(dǎo)0、 1、 3、 5小時(shí)取樣。 圖10: pET-22b(+)-FsSl'酶切鑒定結(jié)果. 泳道M為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)。
泳道l、 2、 3、 4為重組質(zhì)粒pET-22M+)-FsSl，的雙酶切鑒定(約1000bp)。
圖11: pET-22b(+)-Fs Sl，測(cè)序結(jié)果.
圖12: pET-22b(+)-FsSl'請(qǐng)導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式鑒定結(jié)果。
泳道l為破菌上清；
泳道2為破菌沉淀；
泳道M為低分子蛋白Marker;
泳道3為pET-22b空栽體；
泳道4-7分別為IPTG謙導(dǎo)0、 1、 3、 5h取樣。
圖13:蛋白FsSl'純化結(jié)果，
圖14:白細(xì)lfe^多實(shí)驗(yàn)結(jié)果.
困15: pET-22b(+)-FsSl， Sl， i^切鑒定結(jié)果。
泳道M為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)
泳道l、 2、 3、 4為重組質(zhì)粒pCT-22b(+)-FsSr的JSJl切筌定(約1000bp),
圖16: pET-22b(+)-Fs Sl， Sl，測(cè)序結(jié)果.
圖17: pET-22b(+)-FsSl， Sl，謙導(dǎo)表i^JL表達(dá)形式筌定結(jié)果。
泳道1為破菌上清；
泳道2為破菌沉淀；
泳道M為低分子蛋白Marker;
泳道3為pET-22b空栽體；
泳道4-7分別為IPTG謙導(dǎo)0、 1、 3、 5h取樣。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附困及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)--步的描述，
所用材料和試劑
胰蛋白胨、酵母提取物英國(guó)Oxoid公司
EB美國(guó)Sigma 7〉司
大連Takara 7〉司
瓊脂糖Pro坦ega公司
￡r-ra《DNA聚合醉大連Takara公司
DNA Marker天為時(shí)代/〉司
膠回收試劑盒Omega公司
質(zhì)粒抽提試劑盒Omega公司
Ampicillin國(guó)產(chǎn)分析純
T4 DM連接酶Fermentas公司
Na廁A 2H20國(guó)產(chǎn)分析純
小分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)上海升正生物公司
DTTSig鵬公司
CaCl2國(guó)產(chǎn)分析純
Tris華美公司進(jìn)口分裝
SDS華美公司進(jìn)口分裝
丙烯itJ晚、亞甲雙丙烯SU^華美公司進(jìn)口分裝
考馬斯亮藍(lán)R-250國(guó)產(chǎn)分析純
狄酸銨國(guó)產(chǎn)分析純
X-Gal上海生工進(jìn)口分裝
IPTG上海生工進(jìn)口分裝
TEMBD上海生工進(jìn)口分裝
溴酴藍(lán)國(guó)產(chǎn)分析純
麗春紅S國(guó)產(chǎn)分析純
Tween-20國(guó)產(chǎn)分析純
BSA上海生工進(jìn)口分裝
DAB上海生工進(jìn)口分裝
HA國(guó)產(chǎn)分析純
鼠抗及FHA、 Sl單抗 中國(guó)生物藥品檢定所
PVDF膜 Roche公司
肌P標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體 武漢博士德公司
大場(chǎng)桿菌DH5a， BL21 本室M
表達(dá)栽體pET22b 本室M
pMM8簡(jiǎn)單T栽體 大連Takara公司
實(shí)施例l. SI突變體9K/129G的構(gòu)建
1. 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank注冊(cè)的AY879289基因序列，^改計(jì)通過重疊延伸原理，運(yùn)用突變?cè)噭┖?Mutan腿ST Kit(TaKaRa)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物I和II，獲得含有雙位點(diǎn)(9/129G)突變的重組子。 另設(shè)計(jì)引物III，分別引入BamHI和PstI的蘇切位點(diǎn).引物由上海生工生物工程公司合成. I5, -ATAGCCGCTCTGGTAGGTCGCCCAT-3,
5' ~CTGGCACACCGGCGCATTCCG-3，
II 5, ~CCCCCGCCGGAGCACGTTTTCCAG-3，
5' -GGAGTCATACTTGTATACGGTGGCCAT-3'
III 5， ~GTA<7"7aGACGATCCTCC-3'
5' -C7iC^6CTAGAACGAATACGCGATG-3， ,W /
2. 目的基因片段的擴(kuò)增
以PT-PGEM轉(zhuǎn)化至朋5 a菌液抽提的質(zhì)粒為模板,用引物I和II進(jìn)行重疊延伸獲得突變 的PT片段，方法按Mutan腿ST Kit(TaKaRa)說明書.以上述產(chǎn)物為模板，運(yùn)用5l物in進(jìn)行 SI亞單位突變體(rSl)的擴(kuò)增，在700bp左右得到了目的條帶.以上PCR U條件均為94 C預(yù)變性5Bin， 94TC30s —56TC3(Js —721C30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后721C延伸lOiaiiu
3. PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序
將獲得的S1突變體S1'基園片段克隆入pMD18-T vector,轉(zhuǎn)化E. coli DH5a,氨芐 抗性擇選陽性重組子，抽提質(zhì)粒，采用Ba旭H I和Pst I雙醉切筌定正確(困3)，將醉切筌 定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果如困4所示除了兩個(gè)突變位點(diǎn)成功 突變外(cgc—aaa, gaa—ggc)，其余^SSJ^序列與GenBank注冊(cè)的AY879289基罔序列完全一 致，提示突變體構(gòu)建成功.
實(shí)施例2. Fs片段的預(yù)測(cè)和筌定
采用冊(cè)Astar軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)FHA'蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原性作綜合預(yù)測(cè)， 結(jié)果如圖5所示從圖中可以發(fā)現(xiàn)，冊(cè)A，第320位以后的氨基酸富含a螺旋，親水性、柔韌 性以M面可及性都乾高，M性分析明顯高于其^fcUL據(jù)此可判斷該段(含138個(gè)M酸)
具有良好的抗原性，因此確定對(duì)該段進(jìn)行克隆表達(dá).
1. 引物設(shè)計(jì)
本發(fā)明中采用的菌林為百曰咳CS菌株，其尚未完成全基因組測(cè)序，但據(jù)報(bào)導(dǎo)百日咳菌 抹中FHA基因的同源性比較高.因此，本發(fā)明的發(fā)明人以國(guó)際上通用的Toha鵬菌抹fhaB基 因序列為模板，采用軟件Primer Premier5. 0設(shè)計(jì)引物如下(引物由上海生工生物工程公司 合成)
PI 5， "CATATGCTGAAGAACCTCGACCTGGGC-3, AWW P2 5， ~CTCGAGCTGCACCCGCACCCC-3， JAoJ
2. 目的基因的PCR擴(kuò)增
采用從百日咳CS菌株中提取的基因組作為模板，PCR條件為94TC預(yù)變性5min， 94C 30s — 56TC30s —72TC30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72tl延伸lOmin,擴(kuò)增出了 400bp左右的目的 基罔片段，如困6-A所示.
3. 克隆鑒定及表達(dá)
(1 >將獲得的Fs基因片段克隆入pMM8-T vector,轉(zhuǎn)化￡ co// DH5 a ,氨千抗性篩 選陽性重組子，抽M粒，用j^e/和J力o/做雙i^鑒定，筌定正確后回收目的基因片段.
(2)將U )中回收的Fs基因片段構(gòu)建于表達(dá)栽體pET-22b，用Aife/和J力o/做雙酶切 鑒定(酶切結(jié)果如圖6-B所示).
(3>將蘇切鑒定無誤的基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌Aco7/ BL21 (DE3)獲得重組工程 菌.并將重組質(zhì)粒pET-22b(+)-Fs送上海生工生物工程公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果(圖7)表明 除了有兩個(gè)密碼子發(fā)生無義突變外，其他序列與GenBank公布的Toha鵬菌棘相應(yīng)序列完全一 致。
4. 重組工程菌pET-22b (+) -Fs/BL21的誘導(dǎo)表達(dá)及形式鑒定
重組工程菌在含有氨節(jié)青霉素(50叫/旭1 )的LB液M養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌液ODw 0. 6 時(shí)加入IPTG至終濃度為1. 0bmo1/L，謙導(dǎo)不同時(shí)間收集菌液，超聲波破菌，差速離心分別留 取上清和沉淀，處理后進(jìn)行皿電泳鑒定表達(dá)形式;SL^達(dá)量(謙導(dǎo)表i^^形式筌定如困8所 示)*結(jié)果表明蛋白Fs得到了高3^達(dá)，表達(dá)量在50%以上，謙導(dǎo)3小時(shí)表達(dá)量最高，且 多以包涵體形式表達(dá).
5. Western Blot筌定
由于本發(fā)明的發(fā)明人沒有抗FHA全長(zhǎng)的多抗，本試驗(yàn)中采用的是中國(guó)生物制品檢定所血 清室張庶明主胃贈(zèng)的一只抗PHA單抗，Western Blot結(jié)果顯示，該單抗能與發(fā)明人所預(yù)測(cè) 的蛋白相結(jié)合，如困9所示表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子量15000處有一條明顯的條帶，空栽體對(duì) 照無條帶，說明已得到了目的蛋白，并且該蛋白具有良好的免疫原性。
實(shí)施例3.重組工程菌pET-22b(+)-FsSl， /BL21的構(gòu)建
1. 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增
以上實(shí)施例1、2中構(gòu)建的重組質(zhì)粒沐D18-T-S1，和pMD18-T-Fs為模板，采用軟件Primer Premier5. 0進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和分析。將linker (CCTCAAGATCCGCCA )序列設(shè)計(jì)在Fs編碼基因 的3'端以及S1，編碼基罔的5，端，利用重疊延伸PCR方法將Fs編碼基因與Sl，編碼基因 通過linker連接起來.引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下
Fs 上游引物PI: 5~CATATGCTGAAGAACCTCGACCTCGGC-3 Ndel 下游引物P2: 5-TCTGGCGGATCTTGAGGCTGCAGTCGCACCG-3 linker
Sl' 上游引物P3: 5-CAGCCTCAAGATCCGCCAGACGATCCTCCCGC-3 linker 下游引物P4: 5~CTCGAGTGTGTAGGGGTTGG-3 Xhol
2. 目的基因的PCR擴(kuò)增
分別以步壤1、 2中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-T-Sl，和pMD18-T-Fs為模板，以Fs和Sl， 的上下游引物分別擴(kuò)增Fs和Sl'基因片段.PCR ^務(wù)降為94TC預(yù)變性5min， 94C30s —60t:30s —72TC30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸lOmin.將Fs和Sl，擴(kuò)增產(chǎn)物回收并 采用二者作為^^板，以Pl、 P4為引物，94X:預(yù)變性5整in,按照94tJ50s —60XM0s —72tMniin 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72TC延伸10min，擴(kuò)增出FsSl，融合基因.
3. 克隆答定及表達(dá)
(1淋荻得的FsSl，融合基因片段克隆入pMD18-T vector構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-FsSl，， 轉(zhuǎn)化￡ coi/'M5a,氨爺抗性錄選陽性重組子，抽提質(zhì)粒，用Atfe/和JS0/做J8JI切鑒定， 鑒定正確后回收基因片段.
(2 )將(1 )中回收的FsSl，基目片段構(gòu)建于表達(dá)栽體pBT-22b，用射e/和i2ro/做雙 酶切鑒定* (鰷切結(jié)果如圖IO所示)
(3)將SH 養(yǎng)定無誤的基H重^Lt粒轉(zhuǎn)化至宿主菌￡co// BL21 (DE3)獲得重組工程 菌pET-22b(+)-FsSl' /BL21，并將質(zhì)粒pET-22b(+)-FsSl'送上海生工生物工程乂^司測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果(困11 )表明FSS1共1011個(gè)堿基，編碼336個(gè)氨基酸，有三個(gè)密碼子發(fā)生了突 變，其他序列與GenBank公布的相應(yīng)序列完全一致.突變密碼子分別為
GCC-GCT (無義突變>
CGG-CGA (無義突變)
GCA-GGA (丙氨酸---甘氨酸)
> ^—致性為999/1002-99.7% M酸一致性為332/333 = 99. 7%
4. 重組工程菌pET-22b(+)-FsSl， /BL21的謙導(dǎo)表達(dá)及形式筌定
重組工程菌在^^有4t爺青霉素(50pg/鵬l )的LB液M養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌液0D<M 0. 6 時(shí)加入IPTG至終濃度為1. O咖ol/L，誘導(dǎo)不同時(shí)間收集菌液，超聲波破菌，差速離心分別留 取上清和沉淀，處理后進(jìn)行亂歐電泳筌定表達(dá)形式;5L^達(dá)量(誘導(dǎo)表i^L形式鑒定如圖12所 示)。結(jié)果表明蛋白Fs得到了高效表達(dá)，表達(dá)量在30%以上，誘導(dǎo)3小時(shí)表達(dá)量最高，且 多以包涵體形式表達(dá)，
5.融合蛋白FsSl，的純化
重組菌的發(fā)酵，采用德國(guó)B.BraunlOL發(fā)酵罐，按照本實(shí)驗(yàn)室工程菌發(fā)酵常規(guī)工藝進(jìn)行。 發(fā)酵結(jié)束后離心收集細(xì)菌，稱重后凍存?zhèn)溆?用pH值7.5的TE緩沖液重懸細(xì)菌，經(jīng)高壓勻 漿儀進(jìn)行破菌，差速離心收集包涵體，分別用含lWTritonX100的TE緩沖液和含lM、 2M尿 素TE緩沖液洗滌包涵體，用8M尿素溶解包涵體，透析后利用蛋白所帶的6個(gè)His標(biāo)簽，采 用親和層析的方法進(jìn)行蛋白純化.純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,檢定其純度，由圖13 可見目的蛋白純度達(dá)到90%以上.
實(shí)施例4.融合蛋白的生物學(xué)活性檢測(cè)
1. CH0細(xì)胞4^r測(cè)i^
(1 )用含IOX胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基睹養(yǎng)C恥細(xì)胞，在37t:5XC02下培養(yǎng)使鋪成單層。 (2 )細(xì)胞用PBS液清洗一次，然后0.1X胰酵消化5min,從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至離心管. (3)離心后，用PBS液清洗細(xì)胞一次。
(4 )離心后一部分加入凍存液盛于凍存管懸于液氮罐口過夜，第二天沉于液氮內(nèi)保存； 另 一部分用完全培養(yǎng)基重懸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
(5)將同樣數(shù)量的細(xì)胞(每孔200 p 1細(xì)胞懸液含104個(gè)細(xì)胞)加于48孔板，
(6 )待細(xì)胞鞋附4h后吸千孔內(nèi)液體,加入200 p 1毒素稀釋并繼續(xù)在37TC5%C02的環(huán)堍 中培養(yǎng)24h,毒素每一濃度作復(fù)孔檢測(cè).
(7)細(xì)胞用PBS液沖^,用甲醇固定,再用0.0將臺(tái)盼藍(lán)染色。
(8 )染色后清洗細(xì)胞,晾干,顯微鏡下現(xiàn)察并照相。
C恥細(xì)胞務(wù)汰實(shí)驗(yàn)表明PT只要濃度達(dá)20ng/鵬l即可使C恥細(xì)胞變形超過50、而FsSl， 即使到了 100ng/ml只有少數(shù)細(xì)胞變形，與對(duì)照組差異不明顯，認(rèn)為FsSl，基本喪失了對(duì)CHO 細(xì)胞的毒性.
2. 小鼠白細(xì)胞增多(LP)^J^
每組10只5至8周齡雌性BALB/c小鼠，接種于小鼠腹部JSjftiS:溝皮下，注射抗原蛋白 (PT 0. 5pg混于PBS中，其余抗原量為3pg )在注射后3日，每組每只小鼠^C靜脈血20 Hi并測(cè)定白細(xì)J!&JL
組號(hào) 免疫抗原 每組動(dòng)物數(shù)
I Sl 10只/組 n Fssr 10只/組
in pt 10只/組
IV PBS 10只/組
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)sSl，組與PBS組無顯著差異(P >0. 05)，與PT和Sl組有顯著差異(P < 0. 01), Sl組與PBS組有顯著差異(P <0. 01)，與PT組無顯著差異.可認(rèn)為FsSl， ^失去 了誘導(dǎo)白細(xì)胞增多的活性(圖14)。
這樣，通過生物工程技術(shù)得到的抗原FsSl'基本上喪失了天然s1所具有的不良的生物 學(xué)毒性，而且與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)ft^方式相比，其最大的優(yōu)勢(shì)在于不存在回復(fù)突變，性質(zhì) 相對(duì)穩(wěn)定。
實(shí)施例5.融合蛋白的免^性鑒定
1免疫小鼠
目的蛋白FsSl'經(jīng)過純化后免疫4~5周齡的Balb/c小鼠，100pg/只/次，IOOmL抗 原與等量福氏完全佐劑混合，小鼠腹部和腹股溝皮下免疫.免疫程序是0、 1、 2周，共3 次，第l、 2次加入福氏完全佐劑，第3次不加佐刑，接種于小鼠腹部^ift股溝皮下，注射抗 原和佐劑的量約為0. 2ml.第3次免疫后6天斷尾iMt， ELISA檢測(cè)血清特異性抗體效價(jià)的改 變。動(dòng)物分組如下
組號(hào) 免疫抗原 每組動(dòng)物數(shù)
I FsSl' 22只/組
n 全細(xì)胞百日咳疫苗 22只/組
ID PBS 22只/組
疫苗組按體重?fù)Q算，抗原量均為100pg/只/次，對(duì)照組PBS濃度為5O咖ol/L。 2.特異性免疫應(yīng)答的檢測(cè)
(1) ELISA抗原包被板的準(zhǔn)備
將pt抗原用包被液稀釋至5ng/ml, 100m 1/孔包被EL1SA板，4t:過夜。洗滌液洗4 次。每孔加入300nl 1仰SA, 37C封閉2h，洗滌液洗4次后，4TC^M"備用。
(2) 小鼠血清標(biāo)本的采集
血清采集分別于免疫前及免疫2、 3次后7天，將每只小鼠斷尾采血約100nl， 1.5ml 無菌EP管收集，室溫放置lh， 5000gxl0ain，收集血清，分裝，-70t:flb^
(3) 血清特異性抗體IgG的檢測(cè)
血清抗原特異性IgG的檢測(cè)從l: S000開始，以抗體稀釋液倍比稀釋待檢血清，1: 100 稀釋陰'lijfc清，100nl/孔，37TC孵育60min,洗滌液洗4次，加入冊(cè)P標(biāo)記的羊抗鼠IgG(l: 20 000)， 100nl/孔，37TC孵育30min，洗滌液洗4次，加入OPD底物顯色液，室溫避;3t^應(yīng)30inin，50pl終止液終止反應(yīng)，以PBS孔作空白對(duì)照，492咖測(cè)定各孔OlHt. 3.結(jié)果
Groups I FsSl'組
n 全細(xì)胞百日咳疫苗 m PBS
IgG
0. 756 ± 0. 056
0. 873 ±0.132
0.143 ± 0. 0184
如上表所示所有免疫組的小鼠血清特異性IgG水平均有不同程度升高，其中FsSl，組 與PBS組比較相差顯著(p<0. 01)，疫苗免疫組與PBS組比較相差顯著(p<0. 01),說明所用免 疫組均能夠在一定程度上謙發(fā)系統(tǒng)免疫應(yīng)答；FsSl，免疫組的抗PT抗體應(yīng)答相似.以上結(jié)果 提示FsSl，能有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，基本上達(dá)到了與傳統(tǒng)疫苗相當(dāng)?shù)拿庖咝?果，是一種良好的疫苗候選抗原.雖然疫苗組的抗體應(yīng)答略強(qiáng)，但FsSl，抗原的優(yōu)勢(shì)在于其 可以大規(guī)模生產(chǎn)，安全性高，副作用小、不存在傳統(tǒng)疫苗的回復(fù)突變等，所以其擁有良好的 市場(chǎng)前景.
實(shí)施例6.重組工程菌pET-22b(+)-FsSl， Sl， /BL21的構(gòu)建
1. 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增
以實(shí)施例1、3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-T-S1，和pMD18-T-FsSl，為模板，采用軟件Primer Premier5. 0進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和分析.將linker (TACGCGCCGCAGGATCCT)序列設(shè)計(jì)在Fs編碼 基因的3'端以及S1， 編碼基因的5，端，linker中引入勘加W的蘇切位點(diǎn)，利用蘇連方法 將FsSl，編碼基西與S1'編碼基因通過linker連接起來.引物由上海生工生物工程公司合 成，引物序列如下
Fs Sl，上游引物PI: 5， -arv(7*(5CTGAAGAACCTCGACCTGGGC-3， )Vrfe/
下游引物P2: 5， -T(^CW7n771W^7a fl77XTGCAGTCGCACCG"3， linker
Sl'上游引物P3: 5， "CAG"a7fl70Y^^"r07GACGATCCTCCCGC-3， linker
下游引物P4: 5' -C7lK<CTGTGTAGGGGTTGG-3，
2. 目的基因的PCR擴(kuò)增
分別以實(shí)施例l、 3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-T-Sl，和pMD18-T-FsSl，為模板，以Sl， 和FsSl'的上下游引物分剁擴(kuò)增Sl，，和FsSl，，基因片段.PCR M條件為94TC預(yù)變性5min， 94"C50s —60*C40s —72XHmin進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，^ 72TC延伸10鵬in,
3. 克隆答定及表達(dá)
(1)將獲得的Sl，，和FsSl，，基因片段分別克隆入pMD18-T vector構(gòu)建重組質(zhì)粒
pMD18-T-Sl，,和pMD18-T-FsSl， B，轉(zhuǎn)化￡ co//DH5a，氨千抗性篩選陽性重組子，抽提 質(zhì)粒，前者采用勘邁^/和JAo7作酶切鑒定，后者采用AWe7和勘/aW作酶切鑒定，鑒定正確 后回tt因片段。
(2) 將(1)中回收的FsSl，，基因片段構(gòu)建于表達(dá)栽體pET-22b，用AWe/和勘邁W做 雙酶切鑒定，薟定正確后將質(zhì)粒pET-22b(+)-FsSl，，采用勘加W斧ifto/雙醉切后與(1)中 回收的Sl， B片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b(+)-FsSl， Sl，，用A4fe/和J力o/做雙酶切鑒定。
(酶切結(jié)果如圖15所示)
(3) 將酶切鑒定無誤的基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌￡ co// BL21 (DE3)獲得重組工程 菌pET-22b(+)-FsSl， Sl， /BL21,并將質(zhì)粒pET-22b(+)-FsSl， Sl，送上海生工生物工程公 司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果(圖16)表明FSS1S1全長(zhǎng)1566個(gè)械基，編碼521個(gè)氨基酸，有四個(gè)密 碼子發(fā)生了突變，其他序列與GenBank/^布的相應(yīng)序列完全一致.突變的密碼子分別為
CAC-CTC (組氨酸---亮氨紛
GCC-"GCT (無義突變)
CGG-CGA (無義突變)
CGC----TGC (半胱氨酸---精氨酌
< ^—致性為1562/1566 = 99. 7%
氨基酸一致性為519/521 = 99. 6%
4.重組工程菌pET-22b(+)-FsSl， Sl， /BL21的誘導(dǎo)表達(dá)及形式鑒定
重組工程菌在含有氨節(jié)青霉素(S0畔/ml)的LB液M養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌液0Dw 0. 6 時(shí)加入IPTG至終濃度為1. 0ffl啦l/L,誘導(dǎo)不同時(shí)間收集菌液，超聲波破菌，差速離心分別留 取上清和沉淀，處理后進(jìn)行皿電泳筌定表達(dá)形式及表達(dá)量(謙導(dǎo)表5^形式筌定如圖17所 示)*結(jié)果表明蛋白Fs得到了高^t^達(dá)，表達(dá)量在15%左右，誘導(dǎo)3小時(shí)表達(dá)量最高，且 多以包涵體形式表達(dá).
當(dāng)然，本發(fā)明還可有其他實(shí)施例，在不背離本發(fā)明41#神及實(shí)質(zhì)的情況下，所屬技術(shù)領(lǐng) 域的技術(shù)人員當(dāng)可根據(jù)本發(fā)明作出各種相應(yīng)的改變和變形，M些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬 于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍.序列表
<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
<120> —種百日咳胞特氏桿菌雙亞單位基因工程疫苗及其制備方法
<130〉
<160> 6
<170> Patentlii version 3. 2
<210> 1
<211> 333
<212〉 PRT
<213> FsSl'蛋白序列
<400> 1
His Met Leu Lys Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Gin Ala Lys Pro Ala Pro
15 10 15
Thr Ala Pro Pro Met Pro Lys Ala Pro Glu Leu Asp Leu Arg Gly His
20 25 30
Thr Leu Glu Ser Ala Glu Gly Arg Lys lie Phe Gly Glu Tyr Lys Lys
35 40 45
Leu Gin Gly Glu Tyr Glu Lys Ala Lys Met Ala Val Gin Ala Val Glu
50 55 60
Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Arg Arg Val His Asp Gin Leu Gly Gin Arg 65 70 75 80
Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Gly Met Asp Ala Glu Thr Lys Glu Val Asp
85 恥 95
Gly lie lie Gin Glu Phe Ala Ala Asp Leu Arg Thr Val Tyr Ala Lys
100 105 110
Gin Ala Asp Gin Ala Thr lie Asp Ala Glu Thr Asp Lys Val Ala GinArg Tyr 130 Pro Asp 145
Glu Asp
115 120 125
Lys Ser Gin lie Asp Ala Val Arg Leu Gin Pro Gin Asp Pro
135 140 Asp Pro Pro Ala Thr Val Tyr Arg Tyr Asp Ser Arg
Ala 150
Val Phe Gin Asn Gly Phe Thr
Gin 165
Val Leu Asp His Leu Thr Gly Arg Ser Cys Gin Val Gly
Ala 170 Cys
Tyr 155
Trp Gly Asn Asn
Pro Pro 160 Asp Asn 175
Ser Asn
His Leu Thr Gly Arg Ser Cys Gin Val Gly Ser 180 185 190
Ser Ala Phe Val Ser Thr Ser Ser Ser Arg Arg Tyr Thr Glu Val Tyr 195 200 205
His Arg Met Gin Glu Ala Val Glu Ala Glu Arg Ala Gly Arg
Leu Glu 210 Gly Thr 225
Asn Phe
Glu Ala Val Glu Ala Glu 215 220 Gly His Phe lie Gly Tyr lie Tyr Glu Val Arg Ala
lie 230
Tyr Gly Ala Ala Ser Ser Tyr
Ala 245
Gly Asp Asn Ala Gly Arg lie Leu Ala Gly Ala Leu Ala
Phe 250 Gly
Glu 235
Glu Tyr Val Asp
Ala Gly Arg lie Leu Ala 260 265 Leu Ala His Arg Arg lie Pro Pro Glu
Asp Ser 240 Thr Tyr 255 Thr Tyr Gin 270
lie Arg Arg
Ser Glu Tyr Leu Ala His Arg Arg lie Pro Pro Glu Asn 275 280 285
Val Thr Arg Val Tyr His Asn Gly lie Thr Gly Glu Thr Thr Thr Thr
290 295 300
Glu Tyr Ser Asn Ala Arg Tyr Val Ser Gin Gin Thr Arg Ala 305 310 315
Asn Pro Tyr Thr Ser Leu Glu His His His His His His
Asn Pro 320
Ser 325
His 330
〈210〉 2 <211> 1002
〈212> DNA
<213> FsSl'基因序列
<400〉 2
catatgctgaagaacctcgacctgggctaccaggccaagccggctcccac tgcgccgccg60
atgcccaaggctcccgaactcgacctgcgt ggccatacgctggagtcggc cgaaggccgg120
aagatctttggcgagtacaagaagctgcaa ggcgagtacgagaaggcgaa gatggccgtc180
caggccgtggaggcttacggcgaggctactcggcgcgtccatgatcagct gggccaacgt240
tatggtaaggccctgggcggcatggatgccgagaccaaggaggtcgacgg catcatccag300
gagttcgccgcggatctgcgaacggtctatgcg幼gcaggccgaccaggc gaccatcgac360
gcagagacggac卿gtcgcccagcgctacaagtcgcagatcgacgcggt gcggctgcag420
ccacaggaccctccggacgatcctcccgccaccgtataccgctatgactc ccgcccgccg480
gaggacgttttccagaacggattcacggcgtggggaaacaacgacaatgt gctcgaccat540
ctgaccggacgttcctgccaggtcggcagcagcaacagcgctttcgtctc caccagcagc600
agccggcgctataccgaggtctatctcgaacatcgcatgcaggaagcggt cgaggccgaa660
cgcgccggcaggggcaccggccacttcatcggctacatctacgaagtccg cgccgacagc720
aatttctacggcgccgccagctcgtacttcgaatacgtcgacacttatgg cgacaatgcc780
ggccgtatcctcgccggcgcgctggccacctaccagagcgaatatctggc acaccggcgc840
attccgcccgaaaacatccgcagggtaacgcgggtctatcacaacggcat caccggcgag900
accacgaccacggagtattccaacgctcgctacgtcagccagcagactcg cgcc幼tccc960
aacccctacacatcgctcgagcaccaccaccaccaccactga1002
<210> 3
〈211〉 138
<212〉 PRT
<213> Fs蛋白序列
〈400〉 3 Leu Lys Asn Leu Asp Leu Gly 1 5 Pro Pro Met Pro Lys Ala Pro 20
Glu Ser Ala Glu Gly Arg Lys 35
Gly Glu Tyr Glu Lys Ala Lys 50 55 Gly Glu Ala Thr Arg Arg Val 65 70 Lys Ala Leu Gly Gly Met Asp 85
lie Gin Glu Phe Ala Ala Asp 100
Asp Gin Ala Thr lie Asp Ala 115
Lys Ser Gin lie Asp Ala Val 130 135
<210〉 4
<211〉 540
〈212> DM
<213> Fs基因序列
<400> 4
gacgatcctc ccgccaccgt ataccgctat gactcccgcc cgccggagga cgttttccag 60
aacggattca cggcgtgggg aaacaacgac aatgtgctcg accatctgac cggacgttcc 120
tgccaggtcg gcagcagcaa cagcgctttc gtctccacca gcagcagccg gcgctatacc 180
gaggtctatc tcgaacatcg catgcaggaa gcggtcgagg ccgaacgcgc cggcaggggc 240
20
Tyr Gin Ala Lys Pro Ala Pro Thr Ala
15 Thr
Glu
Leu 25 Phe
Ala 10
Asp Leu Arg Gly
Gly
lie 40
Met Ala Val
His Thr Leu 30
Lys Leu Gin
Glu Tyr Lys 45
Gin Ala Val Glu Ala Tyr 60
His Asp Gin Leu Gly Gin Arg Tyr 75
Lys Glu Val
Ala Glu Thr 90
Leu Arg Thr Val Tyr Ala 105 Thr
Asp
Gly 95 Gin
Gly
80
lie
Ala
Glu Thr Asp 120
Arg Leu Gin
Lys Val Ala 125
110
Gin Arg Tyr
accggccacttcatcggcta catctacgaagtccgcgccg acagcaattt ctacggcgcc300
gccagctcgtacttcgaata cgtcgacacttat鵬gaca atgccggccg tatcctcgcc360
ggcgcgctggccacctacca gagcgaatatctggcacacc ggcgcattcc gcccgaaaac420
atccgcagggtaacgcgggt ctatcacaacggcatcaccg gcgagaccac gaccacggag柳
tattccaacgctcgctacgt cagccagcagactcgcgcca atcccaaccc ctacacatcg540
〈210〉 5 <211> 521 <212> PRT
〈213> FsSl'Sl'蛋白序列 〈400> 5
His Met Leu Lys Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Gin Ala Lys Pro Ala Pro
15 10 15
Thr Ala Pro Pro Met Pro Lys Ala Pro Glu Leu Asp Leu Arg Gly His
20 25 30
Thr Leu Glu Ser Ala Glu Gly Arg Lys lie Phe Gly Glu Tyr Lys Lys
35 40 45
Leu Gin Gly Glu Tyr Glu Lys Ala Lys Met Ala Val Gin Ala Val Glu
50 55 60
Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Arg Arg Val His Asp Gin Leu Gly Gin Arg 65 70 75 80
Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Gly Met Asp Ala Glu Thr Lys Glu Val Asp
85 90 95
Gly lie lie Gin Glu Phe Ala Ala Asp Leu Arg Thr Val Tyr Ala Lys
100 105 110
Gin Ala Asp Gin Ala Thr lie Asp Ala Glu Thr Asp Lys Val Ala Gin
115 120 125
Arg Tyr Lys Ser Gin lie Asp Ala Val Arg Leu Gin Pro Gin Asp Pro130
Pro Asp Asp Pro Pro 145
Glu A鄧Val Phe Gin 165
Val Leu Asp His Leu 180
Ser Ala Phe Val Ser 195
Leu Glu His Arg Met
210 Gly Thr Gly 225
Asn Phe Tyr
135 Ala Thr Val 150
Asn Gly Phe
140
Tyr Arg Tyr Asp Ser 155
Trp Gly Asn
Thr Ala 170
Thr Gly Arg Ser Cys Gin Val Gly 185
Arg
Asn
Thr Ser Ser 200
Gin Glu Ala 215
His Phe lie Gly Tyr lie Tyr 230
Ala Ser Ser Tyr
Pro Pro 160 Asp Asn 175 Ser Ser Asn 190
Glu Val Tyr
Gly
Ser Arg Arg Tyr Thr 205
Val Glu Ala Glu Arg Ala Gly Arg 220
Glu Val Arg Ala Asp 235
Glu Tyr Val
Ala Ala Ser Ser Tyr Phe 245 250 Gly Asp Asn Ala Gly Arg lie Leu Ala Gly Ala Leu Ala
Asp
Ala Gly Arg lie Leu Ala 260 265 Leu Ala His Arg Arg lie Pro
Thr 255 Tyr
Ser 240 Tyr
Gin
Thr
His Asn 295 Arg Tyr 310
Glu Tyr
Arg 280 Gly
lie Thr
Ser Glu Tyr 275
Val Thr Arg Val Tyr 290
Glu Tyr Ser Asn Ala Arg Tyr Val Ser Gin 305
Asn Pro Tyr
Ala Pro
Ser 325
Ala Thr Val Tyr Arg Tyr Asp Ser Arg Pro Pro Glu Asp
Gin 330 Pro
Thr 270
Pro Glu Asn lie Arg Arg 285
Gly Glu Thr Thr Thr Thr 300
Gin Thr Arg Ala Asn 315
Asp Pro Asp
Asp
Asn Gly Phe 355
Tyr Arg Tyr Asp Ser Arg 340 345 Thr Ala Trp Gly Asn Asn Asp 360
Asn Val Leu 365
Pro 335 Val Phe 350
Asp His
Pro 320 Pro
Gin
LeuThr Gly Arg Ser Cys Gin Val Gly Ser Ser Asn Ser Ala Phe Val Ser
370 375 380
Thr Ser Ser Ser Arg Arg Tyr Thr Glu Val Tyr Leu Glu His Arg Met 385 390 395 400
Gin Glu Ala Val Glu Ala Glu Arg Ala Gly Arg Gly Thr Gly His Phe
405 410 415
lie Gly Tyr lie Tyr Glu Val Arg Ala Asp Ser Asn Phe Tyr Gly Ala
420 425 430
Ala Ser Ser Tyr Phe Glu Tyr Val Asp Thr Tyr Gly Asp Asn Ala Gly
435 440 445
Arg lie Leu Ala Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Gin Ser Glu Tyr Leu Ala
450 455 柳
His Arg Arg lie Pro Pro Glu Asn lie Arg Arg Val Thr Arg Val Tyr 465 470 475 480
His Asn Gly lie Thr Gly Glu Thr Thr Thr Thr Glu Tyr Ser Asn Ala
485 4恥 495
Arg Tyr Val Ser Gin Gin Thr Arg Ala Asn Pro Asn Pro Tyr Thr Ser
500 505 510
Glu Leu Glu His His His His His His 515 520
<210> 6 <211> 1566 〈212〉腿
〈213> FsSl' Sl'基因序列 <400> 6
catatgctga ag幼cctcga cctgggctac caggccaagc cggctcccac tgcgccgccg 60 atgcccaagg ctcccgaact cgacctgcgt ggccatacgc tggagtcggc cgaaggccgg 120 aagatctttggcgagtacaa gaagctgcaa
c鄉(xiāng)ccgtggaggcttacgg c卿gctact
tatggtaaggccctgggcgg catggatgcc
gagttcgccgcggatctgcg aacggtctat
gcag卿cggacaaggtcgc ccagcgctac
CC8C8gg8CCctccggacga tcctcccgcc
g鄉(xiāng)8Cgttttccagaacgg attcacggcg
ctgaccggacgttcctgcca ggtcggcagc
agccggcgctataccgaggt ctatctcgaa
cgcgccggcaggggcaccgg ccacttcatc
aatttctacggcgccgccag ctcgtacttc
ggccgtatcctcgccggcgc gctggccacc
attccgcccgaaaacatccg cagggtaacg
8CC3cgaccacggagtattc caacgctcgc
aacccctacacatcggagta cgcgccgcag
cgctatgactcccgcccgcc ggaggacgtt
aacgacaatgtgctcgacca tctgaccgga
gctttcgtctccaccagcag cagccggcgc
c鄉(xiāng)aagcggtcgaggccga acgcgccggc
tacgaagtccgcgccgacag caatttctac
gacacttatggcgacaatgc cggccgtatc
gaatatctggcacaccggcg cattccgccc
cacaacggcatcaccggcga gaccacgacc
cagcagactcgcgccaatcc caacccctac
cactga
ggcgagtacg agaaggcgaa gatggccgtc 180
cggcgcgtcc atgatcagct gggccaacgt 240
gagaccaagg aggtcgacgg catcatccag 300
gcgaagcagg ccgaccaggc gaccatcgac 360
卿tcgc卿tcgacgcggt gcggctgcag 420
accgtatacc gctatgactc ccgcccgccg 480
tggggaaaca acgacaatgt gctcgaccat 540
agcaacagcg ctttcgtctc caccagcagc 600
catcgcatgc aggaagcggt cgaggccgaa 660
ggctacatct acgaagtccg cgccgacagc 720
gaatacgtcg acacttatgg cgacaatgcc 780
taccagagcg aatatctggc acaccggcgc 840
cgggtctatc acaacggcat caccggcgag 900
tacgtcagcc agcagactcg cgccaatccc 960
gatcctgacg atcctcccgc caccgtatac 1020
ttccag幼cg gattcacggc gtggggaaac 1080
cgttcctgcc aggtcggcag cagcaacagc 1140
tataccgagg tctatctcga acatcgcatg 1200
aggggcaccg gccacttcat cggctacatc 1260
ggcgccgcca gctcgtactt cg幼tacgtc 1320
ctcgccggcg cgctggccac ctaccagagc 1380
gaaaacatcc gcagggt幼c gcgggtctat 1440
acgg^tatt ccaacgctcg ctacgtcagc 1500
acatcggagc tcgagcacca ccaccaccac 1560
156權(quán)利要求
1.一種百日咳胞特氏桿菌雙亞單位基因工程疫苗，其特征在于，該疫苗是由已知的百日咳毒素S1亞單位突變體連接一個(gè)肽段Fs所構(gòu)成的融合蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基目工程疫苗，其特征在于，所述的百日咳毒素Sl亞單位突變體為9K/129C.
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基西工程疫苗，其特征在于，所迷的肽段Ps為來自絲狀血凝素素的包括138個(gè)氨基酸的肽段.
4.根據(jù)權(quán)利要求3所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基西工程疫苗，其特征在于，所述的肽段Ps為具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列組成的蛋白.
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基西工程疫苗，其特征在于，所述的肽段Fs的編碼,DNA為SEQIDNO: 4所示的核苷酸序樹或者編碼相同蛋白質(zhì)的與其具 有遣傳密碼筒并性的序列.
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基西工程疫苗，其特征在 于，所述的肽段Fs位于百曰咳毒素Sl亞單位突變體的氨基端.
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基因工程疫苗，其特征在 于，所迷的肽段Fs與百日咳毒素Sl亞單位突變體之間間通過編碼碼連接子的一段核香酸序列相 連接.
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基因工程疫苗，其特征在于，所迷的編碼連接子的一段核苷酸序辨為PQDDP,
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基因工程疫苗，其特征于，所述的融合蛋白的C端帶有6-His純化標(biāo)簽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基B工程疫苗，其特征在于，所述的融合蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列.
11. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所迷的一種百日咳特氏桿菌雙亞單位基B工程疫苗，，其特征 在于，所述的融合蛋白的編碼DMA為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或者編碼相兩蛋白質(zhì)的與其具有遣傳密碼簡(jiǎn)并性的序列.
12. —種百日咳胞特氏桿菌雙亞單位基西工程痰苗的制備方法，其特征在于，包括如下 步樣步樣一，構(gòu)建Sl突變體；步驟二，預(yù)測(cè)和審定冊(cè)A，中的Fs片段；步u^，構(gòu)建重組工程菌f>ET-22 >《+)~FsSr /BL21;步樣四，測(cè)定重組質(zhì)粒的基西序列；步驟五，誘導(dǎo)重組工程癘，表iim得疫苗候逸蛋白FsSl';步*六，純化分離目的蛋白，采用親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化;步驟七》答定商的蛋白的^fe度；步樣八，鑒定融合蛋白的免疫原性.步樣九，制成百曰咳胞特氏軒菌雙亞單位基因工程疫苗.
全文摘要
本發(fā)明涉及一種百日咳基因工程融合亞單位疫苗，該疫苗是由已知的百日咳毒素S1亞單位突變體連接一個(gè)肽段Fs所構(gòu)成的融合蛋白。本發(fā)明還涉及一種百日咳胞特氏桿菌雙亞單位基因工程疫苗的制備方法。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)疫苗及其制備方法中的種種缺陷，具有可以大規(guī)模生產(chǎn)、操作簡(jiǎn)便、安全性高、副作用小、不存在回復(fù)突變等優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A61K39/10GK101199843SQ200710092479
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日
發(fā)明者張衛(wèi)軍, 張曉麗, 毛旭虎, 云 石, 章金勇, 平 羅, 迪 葛, 鄒全明, 剛 郭, 鷹 郭 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)