專利名稱：：高純度連翹酯苷在制備抑菌、抗病毒及其它藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及高純度連翹酯苷有效成分在制備解熱、抗炎、提高免疫力、抑菌、抗病毒藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：連翹酯苷(ForsythosideA)是從木犀科連翹屬植物連翹(FructusForsythiae)中提取的有效成分。以前是以連翹苷作為考察連翹提取工藝的指標(biāo)，近年來隨著連翹有效成分研究的深入，發(fā)現(xiàn)連翹苷無抗菌活性，發(fā)揮抗菌活性的是連翹酯苷。而連翹酯苷中幾乎全部是連翹酯苷A在起作用，但是連翹酯苷A又很難單獨穩(wěn)定存在，因此在習(xí)慣上，常把含有連翹酯苷A的連翹酯苷類有效成分稱作連翹酯苷。連翹酯苷(A)的結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>文獻中提到連翹酯苷為咖啡酸的衍生物，分子結(jié)構(gòu)中具有酯鍵和糖苷鍵，在酸、堿和高溫條件下容易分解，而分解后產(chǎn)生的咖啡酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖和一次級苷的抗菌活性大大減弱。由于以前未能注意到此問題，所以銀翹解毒丸、銀翹解毒片等成藥只檢出咖啡酸，而連翹酯苷(A)可能在加工過程中已發(fā)生了水解。發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)研究，認為如果能夠把連翹酯苷最大程度分離出來，得到高純度的連翹酯苷有效成分，必將發(fā)揮更好的藥理藥效作用，其抗菌抗病毒的療效也將增強。在以往的技術(shù)研究中，發(fā)明人已經(jīng)獲得了提取高純度連翹酯苷的工藝方法，并已申報多項中國發(fā)明專利如CN200610027024.1、CN200610027036.4、CN200610027037.9、CN200510030815.5、CN200610148179.0。以上專利技術(shù)可以使連翹酯苷有效成分純度達到90%以上。但是目前沒有現(xiàn)有技術(shù)對這種高純度連翹酯苷的抑菌抗病毒、解熱抗炎藥理活性進行過研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供高純度連翹酯苷在制藥中的用途，具體涉及高純度連翹酯苷在制備抑菌、抗病毒、解熱、抗炎藥物中的用途。本發(fā)明所涉及的高純度連翹酯苷是用各種方法從連翹屬植物中提取的、純度在90%以上的連翹酯苷單體。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案施行(l)采用2，4-二硝基苯酚致熱大鼠及細菌內(nèi)毒素致熱大鼠造模，觀察高純度連翹酯苷的退熱作用；(2)采用小鼠耳腫脹法和對小鼠毛細管通透性影響的試驗觀察高純度連翹酯苷的抗炎作用；(3)采用小鼠炭廓清能力的影響試驗及小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，觀察高純度連翹酯苷對免疫功能的影響；(4)選擇呼吸系統(tǒng)常見病毒病原包括流感乙型病毒、單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇B-3病毒，進行高純度連翹酯苷的體外抗病毒試驗；(5)選擇呼吸系統(tǒng)常見病原菌包括肺炎克雷柏、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌，進行高純度連翹酯苷體外抑菌試驗；(6)用小鼠呼吸道合孢病毒感染性支氣管炎、肺泡炎療效模型，進行高純度連翹酯苷的體內(nèi)抗病毒試驗。結(jié)果證明(1)高純度連翹酯苷對2，4-二硝基苯酚致熱大鼠及細菌內(nèi)毒素致熱家兔均有較好的退熱作用；(2)高純度連翹酯苷具有抑制二甲苯致小鼠耳腫脹的作用，對醋酸致小鼠毛細管通透性增高也有較好的抑制作用；(3)高純度連翹酯苷能較好的增加小鼠炭廓清能力，增加淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，提示對免疫功能有一定增強作用；(4)高純度連翹酯苷體外有抗病毒作用；(5)高純度連翹酯苷體外有抑制溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌和表皮葡萄球菌的作用；(6)高純度連翹酯苷可使模型鼠肺組織病毒含量減少，減輕炎性損害程度、增加脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。本發(fā)明的有益效果突出體現(xiàn)在(1)高純度連翹酯苷在連翹屬植物中含量高且易提取，其抗菌抗病毒提高免疫力作用顯著，未見急性、長期毒性，將其進一步開發(fā)應(yīng)用于治療感染性疾病、發(fā)熱性、炎癥性疾病的藥物，縮短疾病周期，改善癥狀具有重要意義。(2)病毒感染可以造成脾指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，導(dǎo)致機體免疫力下降，而高純度連翹酯苷用于干預(yù)治療，顯示連翹酯苷對感染引起的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)降低有顯著的調(diào)節(jié)作用，具有增強了免疫力功能，更有利于病毒的清除。(3)高純度連翹酯苷顯示在體內(nèi)對呼吸道合胞病毒有良好的抑制作用。此病毒是引起呼吸系統(tǒng)感染的重要病原。將高純度連翹酯苷用于呼吸道合胞病毒感染性支氣管、肺泡炎模型，結(jié)果顯示連翹酯苷可以抑制呼吸道合胞病毒在動物肺組織的增殖，減輕病毒引起的肺組織損傷,使動物免于呼吸道合胞病毒感染性肺炎，并呈良好的量效關(guān)系。(4)高純度連翹酯苷的解熱抗炎、抑菌抗病毒作用比低純度連翹酯苷好，高純度連翹酯苷還有低純度連翹酯苷所沒有的提高免疫力的作用。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例1(解熱、抗炎)l.l實驗?zāi)康挠^察高純度連翹酯苷在解熱、抗炎方面的用途。1.2實驗材料1.2.1藥品受試藥物高純度連翹酯苷為連翹有效成分提取物；純度〉90%;上海玉森新藥開發(fā)有限公司提供。理化性質(zhì)本品為黃色粉末。保存條件4°C,避光保存。批號060425。試驗設(shè)三個劑量組(以下簡稱高純度組)。①大鼠給藥配制方法按10ml/(kg尾靜脈注射給藥，低、中、高劑量組分別相當(dāng)于臨床日用量的3、6、12倍；②小鼠給藥配制方法按10ral/(kg*d)給藥，低、中、高劑量組分別相當(dāng)于臨床日用量的5、10、20倍。陽性對照藥物雙黃連注射液(以下簡稱雙黃連)，黑龍江多多藥業(yè)責(zé)任有限公司，批號:2005091512，試驗時給藥劑量大鼠為相當(dāng)于臨床日服劑量的6倍；小鼠為相當(dāng)于臨床日用劑量的10倍。連翹酯苷粗提藥物(以下簡稱粗提物組)經(jīng)HPLC測定，純度低于90%。試驗時給藥劑量大鼠為相當(dāng)于臨床曰服劑量的6倍；小鼠為相當(dāng)于臨床日用劑量的10倍。1.2.2動物KM小鼠，雌雄各半，體重1822g，SPF級。SD大鼠，體重18(T220g，清潔級。1.2.3儀器塞多利斯BS124S電子天平、分光光度計。1.2.4試劑2，4-二硝基苯酚、二甲苯、冰醋酸、印度墨汁。.1.3數(shù)據(jù)處理采用組間T檢驗，以^士s表示。1.4方法及結(jié)果1.4.12，4-二硝基苯酚致熱大鼠解熱試驗分組雄性大鼠200土20g，用水銀體溫計測正常體溫，每日2次，連續(xù)3天。試驗前每小時測體溫一次，連續(xù)2次，選取體溫在37.338.6。C之間者隨機分6組，每組10只，即NS對照組、雙黃連對照組、粗提物組、高純度低、中、高劑量組，取其均值作為基礎(chǔ)體溫。造模大鼠給藥后，立即背部皮下注射臨時配制的1.5mg/ml2，4-二硝基苯酚10ml/kg，測量并記錄O.5、1、1.5、2、3、4小時動物體溫。結(jié)果顯示，給藥后0.5h,高純度中、高劑量組與NS對照組比較即出現(xiàn)顯著性差異(P〈0.05)，給藥后lh~3h，高純度低、中、高劑量組與NS對照組比較均出現(xiàn)不同程度顯著性差異(P<0.05，P〈0.01);粗提物組給藥12小時與NS對照組比較均出現(xiàn)不同程度差異(P〈0.05，P<0.01)，與高純度組相比，起效慢，解熱維持時間短。結(jié)果見表l.1。表i.i2，4-二硝基苯酚致熱大鼠解熱試驗給藥后各時相體溫變化rc^土s)組別藥前2次給藥后各時相體溫差值體溫均值0.5hlh1.5h2h3h4hNS纟且38.19±0.250.77±0.131.47±0.261.45±0.261.37±0.221.12±0,230.68±0.253又黃連對38.18±0.280.51±0.26*0.81±0.28**0.84±0.28**0.64±0.32林0.59±0.21**0.47±0.20照組粗提物組38.17±0.140.74±0.121.OO士O.12**1.20±0.24*1.12±0.27*1,05±0.140.67±0.22高純度低38.29±0.330.62±0.281.17±0.23*1.12±0.38*0.97±0.34**0.89±0.310.62±0.29劑量組高純度中38.15±0.250,56±0.22*1.02±0.23林0.82±0.28林0.78±0.28林0.56±0.30料0.46±0.28劑量組高純度高38.25土0.220.55±0.23*1.06±0.18**1.06±0.17**0.83±0.34**0,59±0.37**0,41±0.32劑量組_注與NS組比較，*P〈0.05，**P<0.011.4.2細菌內(nèi)毒素致熱大鼠的解熱試驗內(nèi)毒素溶液的配制取定量內(nèi)毒素標(biāo)準管一只，用注射用生理鹽水溶液稀釋至lOeu/ml,現(xiàn)用現(xiàn)配。分組同1.4.1。造模靜脈注射給藥后lh，每只動物靜脈注射細菌內(nèi)毒素lml/kg(10eu/ml)，于內(nèi)毒素攻擊后l、1.5、2、3及4h各測體溫l次。結(jié)果顯示，與NS對照組比較，高純度高劑量組及雙黃對照組給藥0.5h后即出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，給藥lh至4h，高純度中、高劑量組及雙黃對照組與NS對照組比較均出現(xiàn)不同程度顯著性差異(P<0.05、P<0.01);高純度低劑量組給藥1.5h至4h與NS對照組出現(xiàn)極顯著性差異(P〈0.Ol);粗提物組給藥1.5h和2h與NS對照組比較出現(xiàn)顯著性差異(P〈0.05)。結(jié)果見表1.2:表1.2細菌內(nèi)毒素致熱大鼠的解熱試驗給藥后各時相體溫變化('C，X±s)_藥前2次給藥后各時相體溫差值組別-體溫均值0.5hlh1.5h2h3h4hNS組38.2±0.310.30±0.180.67±0.241.06±0.241.20±0.301.13±0.340.69±0.42雙黃連對38.2±0.280.12±0.14*0.36土0.20**0.35±0.15**0.44±0.19**0.37±0.29林0.23±0,22**照組粗提物組38.1±0.240.240±0.110.49±0.260.61±0.15**0.54±0.13**0.82±0.200.70±0.22高純度低38.3±0.330.18±0.130.53±0.300.62±0.33**0.67±0.23**0.58±0.19**0.41±0.23**劑量組高純度中一38.2±0.250.16±0.160.32±0.24**0.43±0.27**0.59±0.15**0.56±0.26林0.47±0.24*劑量組高純度高38.3±0.220.13±0,14*0.21±0.20**0.32±0,25林0.41±0.39**0.27±0.24**0.29±0.30**劑量組注與NS組比較，*P<0.05,**P<0.011.4.3高純度連翹酯苷對二甲苯致小鼠耳腫脹的作用分組同1.4.1造模10ml/kg連續(xù)靜脈給藥4天，末次給藥后30min每只小鼠左耳涂二甲苯50ul，右耳作空白對照，致炎15min后將小鼠脫頸椎處死，剪下兩耳，用打孔器(直徑7腦)分別在兩耳同一部位打下耳片，稱重，計算腫脹度和腫脹抑制率。公式腫脹度=左耳片重量_右耳片重量空白對照組耳腫脹度一給藥組耳腫脹度腫脹抑制率=-X100%空白對照組耳腫脹度結(jié)果顯示，NS組小鼠左耳紅腫，耳腫脹度高達0.0145土0.0037g，而高純度連翹酯苷高、中、低劑量組小鼠及雙黃連對照組的耳腫脹度均小于NS對照組，且與NS組比較中劑量有不同的顯著性差異(P〈0.05，P〈0.01);連翹酯苷粗提物組與NS組比較無顯著性差異。結(jié)果見表丄.3:表1.3連翹酯苷對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與NS組比較，*P〈0.05,**P〈0.011.4.4高純度連翹酯苷對小鼠血管通透性影響的實驗取體重18-22g小鼠，分組同1.4.1。動物給藥后lh尾靜脈注射0.5%伊文思藍生理鹽水溶液0.lml/10g體重，隨即腹腔注射0.6y。醋酸0.20ml/只，20min后脫頸椎處死，剪開腹部皮膚肌肉，用6ml生理鹽水分3次洗滌腹腔，吸管吸出洗滌液、合并后加入生理鹽水至10ral，3000rpm離心15min;取上清液與590nm比色測定，記錄OD值進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，高純度中、高劑量組與NS組比較有顯著性差異(P〈0.05)，低劑量組無顯著性差異(p>0.05)，雙黃連對照組與NS組比較有顯著性差異(P〈0.05);粗提物組與NS組比較無差異(P〉0.05)。結(jié)果見表1.4。表1.4連翹酯苷對腹腔注射醋酸致小鼠腹腔毛細管通透性增高的影響(^土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與NS組比較，*P<0.05，**P<0.-011.5結(jié)論高純度連翹酯苷對2，4-二硝基苯酚致熱大鼠及大腸桿菌內(nèi)毒素致熱家兔均有較好的退熱作用；高純度連翹酯苷具有抑制二甲苯致小鼠耳腫脹的作用，對醋酸致小鼠毛細管通透性增加也有較好的抑制作用。而粗提物有一定退熱作用，但是效果不如高純度連翹酯苷好；且對二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠毛細管通透性增加沒有抑制作用實施例2(增強免疫力試驗)2.l實驗?zāi)康挠^察高純度連翹酯苷在增強免疫力方面的用途。2.2實驗材料同實施例1中的1.2實驗材料2.3數(shù)據(jù)處理同1.3。2.4方法及結(jié)果2.4.1高純度連翹酯苷對小鼠碳廓清能力的影響分組同1.4.1。10ml/kg連續(xù)尾靜脈注射給藥l周，取各組小鼠，分別經(jīng)尾靜注射20%印度墨汁0.lml，于注射后1分鐘和5分鐘各采血20ul置2ml0.l%Na2C03溶液中混勻，于680nm下測定OD值，并按下式計算K值。公式K=(logODl-1ogOD5)/(t5-tl)結(jié)果顯示，高純度高劑量組與NS組比較有極顯著性差異(P<0.01)，低、中劑量組無顯著性差異(P〉0.05);粗提物組與NS組比較無顯著性差異(P〉0.05);雙黃連對照組與NS組比較有顯著性差異(P〈0.05)。結(jié)果見表2.1。表2.l連翹酯苷對碳廓清能力的影響(^士s)組別n體重K值NS組1021.8±1.150.0950±0.0320雙黃連對照組1021.3±1.%0.0604±0.0399*粗提物組1021.6±1.560.0850±0.0270高純度低劑量組1021.4±1.530.0767±0.0464高純度中劑量組1021.4±1.280.0730±0.0288高純度高劑量組1021.8±0.910.0577±0.0235**注與NS組比較，*P<0.05，**P<0.012.4.2淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗分組同1.4.1，每組12只。于給藥的前3d，每鼠均加肌注植物血凝素(PHA)8mg/kgd，連續(xù)給藥8天，于最后l次給藥后2h，小鼠剪尾取血，推片，瑞氏染色，油鏡觀察，計算外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。公式轉(zhuǎn)化細胞數(shù)淋巴細胞轉(zhuǎn)化率％=-X100%轉(zhuǎn)化細胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化細胞數(shù)結(jié)果顯示，高純度低、中、高劑量組及雙黃連對照組與NS組比較均有極顯著性差異(P〈0.01);粗提物組與NS組比較無顯著性差異(P〉0.05)，結(jié)果見表2.2表2.2連翹酯苷對PHA致小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響(^土s)組別n體重(g)轉(zhuǎn)化率(％)NS組1227.2±2.443.5±11.2雙黃連對照組1228.0±2.568.8±8.1**粗提物組1227.1±2.248.5±10.7高純度低劑量組1226.8±2.365.1±14.6**高純度中劑量組1227.9±2.176.3±12.0**高純度高劑量組1227.1±2.178.5±11.6**注與NS組比較，*P〈0.05,**P〈0.012.5結(jié)論本實驗結(jié)果表明，高純度連翹酯苷能較好的增加小鼠炭廓清能力，抑制PHA對小鼠淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，具有增強免疫抵抗力的作用；而連翹酯苷粗提物沒有這個作用。實施例3(體外抗病毒試驗)3.1病毒增殖將流感甲型接種MDCK細胞上，加維持液置37。C、5%0)2培養(yǎng)，在96h后出現(xiàn)90%以上的病變，凍融3次后吹打離心，定量分裝，-8(TC冰箱凍存?zhèn)溆谩?.2病毒毒力測定將備用流感病毒甲型病毒用維持液做10倍比系列稀釋，縱向重復(fù)3孔，橫向依次接種在96孔板內(nèi)的單層細胞上，37°C、5免C02培養(yǎng)，每日觀察病變，48-恥h后，將板孔內(nèi)液體吸棄，加W中性紅100ul置37'C染色2h，棄染液，用洗液將多余染料充分洗脫，加脫色液100ul，室溫脫色10min，用酶標(biāo)儀在540nm波長測定0D值，用公式1、2計算細胞病變率，然后公式3計算比距，比距與高于50%的病變率病毒稀釋度指數(shù)相加，獲得TCID50(Reed-Muench方法)。結(jié)果流感甲型TCID50為10-3/ml。細胞存活率八各組OD值-空白對照OD值)/(正常細胞OD值-空白對照OD值)(公式l)細胞病變率=1-細胞存活率.............."…(公式2)細胞比距=(高于50%病變率-50%)/(高于50%病變率-低于50%病變率)…(公式3)3.3藥物細胞毒性測定將藥物用細胞培養(yǎng)液l:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560稀釋，接種于多孔板中已經(jīng)長成單層的MDCK細胞上，37°C、5。/。C02培養(yǎng)，每日觀察細胞病變，連續(xù)7d觀察藥物毒性，細胞出現(xiàn)病變者判為藥物毒性，并根據(jù)公式l、2計算藥物半數(shù)中毒濃度，結(jié)果見表3，1。表3.1藥物毒性試驗(半數(shù)中毒濃度IC50(mg/ml))<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表3.2看出，三種藥物對流甲有一定抑制效果，連翹酯苷抑制流感甲型病毒的抑制指數(shù)為13.8，略高于感冒退熱顆粒，但略低于利巴韋林。3.5結(jié)論與評價連翹酯苷可以抑制流感甲型病毒在MDCK細胞上的繁殖，抑毒指數(shù)為13.8，略高于感冒退熱顆粒，但略低于利巴韋林。綜上所述，在體外連翹酯苷對流感甲型病毒具有一定的抑制作用。實施例4(體內(nèi)抗病毒試驗)4.1實驗材料實驗動物昆明種鼠，雄性，體重1314g，潔凈級。受試藥物高純度連翹酯苷由上海玉森新藥開發(fā)有限公司提供，批號分別為060425，連翹酯苷純度90%。陽性對照藥利巴韋林注射液產(chǎn)地山東省魯抗辰欣藥業(yè)有限公司批號國藥準字H20003176。病毒株呼吸道合胞病毒(Long株)。細胞株HEL:人胚肺細胞，為呼吸道合胞病毒宿主細胞株；H印-2:人喉癌細胞系，為呼吸道合胞病毒宿主細胞株。培養(yǎng)液PH7.2的磷酸鹽生理鹽水(PBS):含NaCL8g、KCL0.2g、KH2P040.2g、Na2HP042.9g，加雙蒸水至1000ml，除菌過濾，分裝置4'C備用。細胞消化液胰酶(Diffico公司產(chǎn)品)1.25g用1000mlPBS溶解，除菌過濾，分裝青霉素瓶，置-2(TC冰箱備用。儀器C02恒溫培養(yǎng)箱；分光光度計；恒溫培養(yǎng)箱；凈化工作臺；離心機；-8(TC冰箱；_20°C冰箱；酶標(biāo)儀；722分光光度計。實驗室P2實驗室。4.2試驗方法與結(jié)果4.2.l細胞復(fù)蘇傳代將液氮凍存的H印-2、服L細胞在37'C水浴lmin內(nèi)迅速融化，懸浮于培養(yǎng)液中，于細胞培養(yǎng)瓶中37'C、5%<:02靜止培養(yǎng)，3d后長成單層，用0.25%胰酶消化，1:3(HEL細胞1:2)傳代，細胞長成單層時用于試驗。4.2.2病毒活化和傳代將凍干保存的呼吸道合胞病毒毒種0.5ml接種于已經(jīng)長成單層的H印-2細胞上，37'C、5%0)2培養(yǎng)，3-5d后出現(xiàn)細胞病變，用同樣方法將病毒傳代擴增。收獲的病毒凍融3次、吹打離心(10000r/min，20min)、定量分裝、-8(TC冰箱凍存?zhèn)溆谩?.2.3病毒毒力測定制備多孔板內(nèi)單層細胞備用。用維持液將病毒液做10倍比系列稀釋，縱向重復(fù)3孔，橫向依次接種在96孔板內(nèi)單層細胞上，37°C、5。/。C02培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞病變和病變率，公式1計算比距，比距與低于50%的病變率病毒稀釋度指數(shù)相加，獲得TCID50。結(jié)果見表4.1。細胞比距=(高于50%病變率-50%)/(高于50%病變率-低于50%病變率)……公式(1)表4.1:病毒毒力測定(TCID50/ml)24h48h呼吸道合胞病毒10-5.610-8.8由表1看出，呼吸道合胞病毒24hTCID50為10-5.6;48hTCID50為10-8.8。4.2.4體內(nèi)療效模型的建立和病毒感染劑量的確定昆明種小鼠40只，雄性，體重1314g，隨機分為4組，每組10只，分別為病毒大劑量組、病毒中劑量組、病毒小劑量組和正常對照組。各組動物乙醚麻醉下分別鼻腔接種上述呼吸道合胞病毒毒液50ui1、30ul、10ul和細胞培養(yǎng)液50"1，常規(guī)喂養(yǎng)，每日觀察動物存活情況，死亡動物及時解剖。在第7d末次給藥40min后，將動物眼動脈叢放血，牽頸臼處死，無菌取肺組織。結(jié)果見表4.2:表4.2病毒重分離結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從上述結(jié)果和上表可以看出，接種50y1病毒為造模最適劑量。4.2.5體內(nèi)抗病毒藥效學(xué)試驗昆明種鼠70只，雄性，體重1314g。將動物按體重隨機分為7組正常對照組、病毒模型對照組、利巴韋林對照組和高純度連翹酯苷大、中、小劑量組，連翹酯苷粗提物組，每組10只。各組動物經(jīng)尾靜脈注射給藥(給藥劑量見表4.3)3天后，各組動物在乙醚麻醉下造模，正常組動物鼻腔接種細胞培養(yǎng)液50"1，其余動物均鼻腔接種呼吸道合胞病毒毒液50u1，各組動物繼續(xù)按表4.3劑量尾靜脈注射給藥7天。表4.3動物給藥劑量正常對照組陽性藥物對照組高純度組(mg/kg體重)粗提物組(生理鹽水ml)(mg/kg體重)大劑量組中劑量組小劑量組給藥劑量0.158.31.500.750.3750.75在第7d末次給藥2h后，將動物稱重后取血、取胸腺、脾稱重計算免疫學(xué)指數(shù)(表4.4);表4.4免疫學(xué)指數(shù)檢測結(jié)果(i±s,『10)正常對照組病毒模型組陽性藥物組受試藥物粗提物組(生理鹽水)(生理鹽水)(利巴韋林)大劑量組~中劑量組~小劑量組體重25.54±2.58*15.84±1.9520.57±3.8823.36±4.84*21.59±5.1820.78±4.4520.12±3.21脾重O.19±0.090.07±0.010.18±0.090.15±0.050,12±0.080.15±0.040.11±0.10脾指數(shù)0.64±0.240.38±0.13*0.90±0.5*0.67±0.15*A0.62±0.21*A0.61±0.11*A0.45±0.24胸腺重O.ll土O.020.05±0.020.08±0.040.10±0.030.10±0.030.07±0.040.08±0.06胸腺指數(shù)0.43±0.07*0.28±0.080.38±0.180.45±0.11*A0.41±0.07*A0.32±0.140.30±0.12*與病毒組比較大劑量組體重t=2.595,p<0.05;正常組體重t=3.460，p<0.05;大劑量組脾指數(shù)t=3.333,p<0.05;中劑量組脾指數(shù)t=2.479，p<0.05;小劑量組脾指數(shù)t=2.712,p<0.05;正常對照組脾指數(shù)，t=4.55，p<0.05;大劑量組胸腺指數(shù)t=2.742,p<0.05;中劑量組胸腺指數(shù)t=6.190，p<0.05;正常組組胸腺指數(shù)t=2.545，p<0.05。與正常對照組比較大中小劑量組脾指數(shù)以及大劑量組胸腺指數(shù)t值分別為1.20，0.85，0.46，1.081，p>0.05。從上表可以明顯看出，動物感染病毒后，生長發(fā)育受到影響，體重小于正常對照組，具有顯著性差異。而給與高純度連翹酯苷干預(yù)后，大中小劑量組動物體重都有增加，其中大劑量組具有顯著性差異；同時，感染病毒的小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)降低，與正常對照組比較具有顯著性差異。而給與高純度連翹酯苷干預(yù)后，大、中、小劑量組動物脾和胸腺指數(shù)都有增加，其中大、中、小劑量組的脾指數(shù)和大劑量組的胸腺指數(shù)與病毒對照組比較均有顯著性增加，達到正常水平(與正常對照組比較P〉0.05),表明連翹酯苷對病毒感染引起的免疫力低下有顯著的調(diào)節(jié)作用。而連翹酯苷粗提物則無提高免疫力的作用。將各組肺組織用玻璃勻漿器勻槳，加lOOul的細胞維持液吹打懸浮，高速離心(lOOOOr/rain)lOmim，做1:10稀釋，再做連續(xù)2倍比系列稀釋(2-1、2-2、2-3、2-4)后橫向依次加入96孔板孔內(nèi)己經(jīng)長成單層的HEL細胞上，縱向重復(fù)3孔。37°C、5%C02培養(yǎng)，每日觀察細胞病變，第7d記錄終末含毒濃度，計算終末含毒指數(shù)的幾何均數(shù)，判斷體內(nèi)抗病毒效果，結(jié)果見表4.5。表4.5連翹酯苷體內(nèi)抗病毒試驗結(jié)果(5土s,n-10)正常對照組病毒對照動物陽性藥物組高純度組粗提物組(利巴韋林)大劑量組中劑量組~~小劑量組動物死亡率(％)020000010病毒陽性率(％)0(0/10)80(8/10)70(7/10)20(2/10)30(3/10)50(5/10)終末含毒01.55±1.11l.OO士O.970.20±0.44*0.40土0.710.50±0.881.IO土O.52承與病毒模型組比較t-2.85，p<0.05.由表4.5看出，高純度連翹酯苷具有良好的體內(nèi)抗病毒作用，且效果優(yōu)于利巴韋林。4.2.6動物肺組織病理學(xué)檢査將石蠟包埋HE染色組織切片做顯微鏡檢測，按照如下組織病例學(xué)評分系統(tǒng)進行評分，結(jié)果見表4.6。表4.6動物病理學(xué)檢測評分結(jié)果(^土s，n-10)對照組病毒模型動物陽性藥物組受試藥物組粗提物組(利巴韋林)大劑量組中劑量組小劑量:組細支氣管、支氣管周圍浸潤01.80±0.601.80±0.670.70±0.670.80±0.601.OO土O.781.60±0.54細支氣管、支氣管周圍浸潤02.0±0.601.50±0.880.60±0,500.90±0.71l.OO士O.781.60±0.83細支氣管、支氣管腔滲出01.40±0.531.20±0.440.70±0,500.80±0.331.30±0.500.90±0.45血管周圍浸潤01.70±0.671.40±0.710.70±0.441.20±0.671.50±0.531.40±0.66實質(zhì)性肺炎00.90±0.780.30±0.710.20±0.670.20±0.440.20±0,440.30±0.37病理指數(shù)014.60±4.7411.60±5.295.50±3.157.00±4.159.60±5.0410.20±0.22表明大、中、小劑量的高純度連翹酯苷均具有減輕病毒引起的肺組織損傷的所用，并表現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系，效果明顯優(yōu)于陽性藥物利巴韋林和連翹酯苷粗提物。附組織病理學(xué)評分標(biāo)準A.細支管、支氣管周圍浸潤(部位的百分率)0=無；1=少許(〈25%);2=許多(25%75%);3=所有(>75%)。B.細支氣管、支氣管浸潤的定性0=無偶見輕微的浸潤，或支氣管周圍淋巴樣細胞團塊見于正常動物；1=輕不正常，常常伴有間斷的環(huán)；2=中度完整的環(huán)或新月形的環(huán)，伴有〈5個細胞的厚度；3=嚴重完全的環(huán)，伴有〉510個細胞厚度。C.細支氣管/支氣管腔滲出O二無；1=輕度，《25%腔閉合；2=重度，》25%腔閉合。D.血管周圍浸潤，(部位的百分率)O-無；1=少(<10%);2=許多(10%50%);3二大多數(shù)(〉50%)E.實質(zhì)性肺炎0=無；1=輕度斑狀實質(zhì)性浸潤；2=重度。斑和融合的實質(zhì)性浸潤。分數(shù)的計算二A+3(B+C)+D+E=0-26分實施例5(體外抑菌試驗)5.1實驗材料5.1.1受試藥物連翹酯苷的高純度藥品和粗提物見1.2.15.1.2細菌菌種細菌菌種和病毒毒種乙型溶血性鏈球菌(SDCDC02410—5)、金黃色葡萄球菌(SDCDC25923)、草綠色鏈球菌(SDCDC02404)、表皮葡萄球菌(SDCDC02519)。5.1.3培養(yǎng)液MEM細胞培養(yǎng)液，含10%新生牛血清、MEM細胞維持液，含2%新生牛血清；營養(yǎng)肉湯。5.1.4儀器恒溫培養(yǎng)箱、凈化工作臺、-8(TC冰箱、-2(TC冰箱、722分光光度計。、5.2試驗方法與結(jié)果5.2.1活化菌種及菌液制備將凍干保存的菌種接種于營養(yǎng)肉湯，37'C培養(yǎng)過夜，重復(fù)接種培養(yǎng)，獲得活化菌種。5.2.2抑菌試驗將藥物用細菌培養(yǎng)基稀釋成20mg/ml濃度，然后做2倍比系列稀釋(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128)，取lml分別加等容量的菌液乙型溶血性鏈球菌(1.35X107/ml)、金黃色葡萄球(l.18X108/tnl)、表皮葡萄球菌(4.05Xl07/ral)、草綠色鏈球菌(1.9X107/ml)。每個藥物稀釋度、每株菌重復(fù)3個試管；同時設(shè)藥物對照，即上述相同濃度的藥物中加等量滅活菌液；菌液對照，即菌液加等容量培養(yǎng)液；培養(yǎng)液對照。37。C培養(yǎng)24h，用722分光光度計于600nm檢測吸光度，用公式③計算細菌抑制率，并將獲得的數(shù)據(jù)代人公式①計算比距，比距與低于50%的病變率病毒稀釋度指數(shù)相加，獲得半數(shù)抑菌濃度。(抑菌試驗OD值一藥物對照OD值)/菌液對照OD值一空白對照OD值)…公式③5.2.3結(jié)果見表5.1。表5.1體外抑菌試驗結(jié)果金黃色葡萄球菌草綠色葡萄球菌表皮葡萄球菌溶血性鏈球菌半數(shù)抑菌濃度2-2.5(3.54mg/ml)2-3.5(1.77g/ml)2-4.5(0.88g/ml)2-2.6(3.30g/ml)從上述內(nèi)容和上表可以看出，連翹酯苷具有一定的體外抑菌效果。5.3結(jié)論與評價連翹酯苷對乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、表皮葡萄球菌有抑菌活性，而這些細菌都屬于革蘭氏陽性菌，故提示連翹酯苷對革蘭氏陽性菌效果更為顯著。權(quán)利要求1.高純度連翹酯苷在制備解熱、抗炎藥物中的應(yīng)用。2.高純度連翹酯苷在制備增強免疫力藥物中的應(yīng)用。3.高純度連翹酯苷在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述高純度連翹酯苷的用途，其特征是高純度連翹酯苷在制備抗呼吸道合胞病毒、流感甲型病毒藥物中的應(yīng)用。5.高純度連翹酯苷在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述連翹酯苷的用途，其特征是高純度連翹酯苷在制備抗革蘭氏陽性菌藥物中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述高純度連翹酯苷的用途，其特征是高純度連翹酯苷在制備抗乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、表皮葡萄球菌藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了高純度連翹酯苷在制備抑菌、抗病毒及其它藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過實驗證明了高純度連翹酯苷的解熱、抗炎、提高免疫力、抑菌、抗病毒的作用，包括高純度連翹酯苷(1)對致熱大鼠的退熱實驗；(2)抑制二甲苯致小鼠耳腫脹、降低小鼠毛細管通透性作用的實驗；(3)增加小鼠炭廓清能力，增加淋巴細胞轉(zhuǎn)化率實驗；(4)體外抗流感甲型病毒、體內(nèi)抗呼吸道合胞病毒作用的實驗；(5)體外抑制乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌和表皮葡萄球菌的實驗。文檔編號A61K36/634GK101390869SQ200710094089公開日2009年3月25日申請日期2007年9月19日優(yōu)先權(quán)日2007年9月19日發(fā)明者玄振玉,勇王申請人:上海玉森新藥開發(fā)有限公司