專利名稱：：梔子苷元的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用梔子苷制備梔子苷元的方法，屬中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景中藥梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)，含梔子苷(geniposide)、梔子苷酸(geniposidicacid)、羥異梔子苷(gardenoside)、京尼平-l-釤-D-龍膽雙糖苷(genipin-1-3-D-gentiobioside)等環(huán)烯醚萜苷類成分。以往研究認(rèn)為中藥梔子的保肝功效是梔子苷發(fā)揮作用的。但是隨著研究深入，逐漸發(fā)現(xiàn)梔子苷在大鼠肝組織勻漿中不能代謝，梔子中的環(huán)烯醚萜苷類成分如果離開腸道菌群，其治療作用將難以發(fā)揮，以及直接靜脈給予梔子苷并不產(chǎn)生利膽作用。深入研究表明，梔子苷是在腸道細(xì)菌.(真桿菌sp.A-44等)所含活性酶的作用下轉(zhuǎn)化為梔子苷元，從而發(fā)揮出治療效果。還有研究表明中藥梔子的抗肝纖維化、抑制星狀細(xì)胞活性的起效成分也是梔子苷元，而不是梔子苷。梔子苷和京尼平-l-P-D-龍膽雙糖苷有可能是在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成梔子苷元而起效的。梔子苷、梔子苷元、京尼平-1-P-D-龍膽雙糖甙的結(jié)構(gòu)式為COOCH3梔子苷梔子苷元京尼平-l-P-D-龍膽雙糖甙但是梔子苷元的獲得卻是本行業(yè)人員感到閑難的地方。由于梔子苷元性質(zhì)活潑，本身容易和蛋白質(zhì)(酶)發(fā)生聚合反應(yīng)，采用常規(guī)的酶解提取方法來提取梔子苷元時(即條件是37°C、pH5.0的環(huán)境中用葡萄糖苷酶反應(yīng)2小時)，得率非常低，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此，如果用梔子苷元直接作為藥用活性成分進(jìn)行保肝和抗肝纖維化的預(yù)防和治療，必需首先發(fā)明一種高得率的梔子苷元制備方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用梔子苷制備高得率梔子苷元的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的用梔子苷制備梔子苷元的方法包括如下步驟(1)酶解將梔子苷和葡萄糖苷酶，混合加入pH3.75-4.95醋酸緩沖溶液中，'在37.5-55.(TC水浴中反應(yīng)0.5-1.9小時；(2)萃取用無水乙醚萃取，合并乙醚提取液，加入無水硫酸鈉，干燥30分鐘，濾過，再用微孔濾膜精濾；(3)結(jié)晶低溫減壓回收溶劑，然后置于2-6。C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，30-7(TC干燥，得到酶解產(chǎn)物梔子苷元。本發(fā)明的優(yōu)選的技術(shù)方案包括如下步驟(1)酶解將梔子苷和P-葡萄糖苷酶，混合加入pH3.80-4.80醋酸緩沖溶液中，在40-53。C水浴中反應(yīng)0.8-1.8小時；(2)萃取用無水乙醚萃取3次，合并乙醚提取液，加入無水硫酸鈉，干燥30分鐘，濾過，再用0.22ym微孔濾膜精濾；(3)結(jié)晶低溫減壓回收溶劑，然后置于3-4-C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，40-5(TC干燥，得到酶解產(chǎn)物梔子苷元。進(jìn)一步，本發(fā)明在步驟(1)的酶解步驟的最優(yōu)選的條件為將梔子苷和e-葡萄糖苷酶，混合加入pH4.5醋酸緩沖溶液中，在5(TG水浴中反應(yīng)1.0小時。本發(fā)明人經(jīng)過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)篩選，得到本發(fā)明上述優(yōu)選和最優(yōu)選技術(shù)方案的1.1溫度對酶水解的影響分別精密稱取梔子苷0.5g，B-葡萄糖苷酶1g，于圓底燒瓶中，加入50mlpH值為4.50的緩沖溶液，分別于25。C;3CTC;37°C;45°C;50°C;55°C;65。C的不同溫度下，加熱磁力攪拌2h，放冷后用無水乙醚萃取三次(50ml*3)，合并乙醚層溶液，加入適量無水硫酸鈉，減壓回收乙醚，收集結(jié)晶。見表l。表l反應(yīng)溫度對酶水解的影響溫度(。C)25°C30°C37°C40。C45°C50°C55°C65°C結(jié)晶質(zhì)量(mg)--46.8105.819.2126.496.1-*"-"表示沒有結(jié)晶或者乳化嚴(yán)重，不能正常萃取結(jié)果表明適宜的酶解溫度為4(TC-55。C，其中5CTC時酶解效果最好。1.2反應(yīng)時間對酶水解的影響分別精密稱取梔子苷0.5g，！3-葡萄糖苷酶lg，于圓底燒瓶中，加入50mlpH值為4.50緩沖溶液，反應(yīng)時間分別為1小時；2小時;2.5小時；3小時；4小時，加熱磁力攪拌，反應(yīng)溫度為50。C，放冷后用無水乙醚萃取三次(50ml*3)，合并乙醚層溶液，加入適量無水硫酸鈉，減壓回收乙醚，收集結(jié)晶。結(jié)果見表2。表2反應(yīng)時間對酶水解的影響時間0.5小時1小時L5小時2.O小時2.5小時結(jié)晶質(zhì)量(mg)51.6129.3121.590.662.1結(jié)果表明適宜的酶解時間為0.8-1.8小時，其中酶解l小時效果最好。反應(yīng)超過2小時，得率反而下降，這是由于梔子苷元在水溶液中不穩(wěn)定，易與氨基結(jié)合所致。1.3pH值對酶水解的影響說明書第4/7頁分別精密稱取梔子苷0.5g，J3-葡萄糖苷酶1g，于圓底燒瓶中，加入50ml緩沖溶液，緩沖溶液的pH值分別為8.0;5.7;5.3;5.1;4.7;4.5;4.3;3.8的，加熱磁力攪拌反應(yīng)l小時，反J^溫度為5(TC，，放冷后用無水乙醚萃取三次(50ml*3)，合并乙醚層溶液，加入適量無水硫酸鈉，減壓回收乙醚，收集結(jié)晶。結(jié)果見表3。表3pH值對酶水解的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*"-"表示沒有結(jié)晶或者乳化嚴(yán)重，不能正常萃取結(jié)果表明適宜的酶解pH為3.80-4.80，其中pH4.50時酶解效果最好。采用常規(guī)提取梔子苷元時，酶解條件為37。C、pH5.0、反應(yīng)2小時，由于溫度低，反應(yīng)時間長，梔子苷元性質(zhì)活潑，與酶發(fā)生聚合反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明梔子苷元提取率非常低，小于10%，通常只有6%-9%。采用本發(fā)明的制備方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)中梔子苷元得率不高的技術(shù)缺陷，在本發(fā)明提供的最佳工藝條件下，采用本發(fā)明方法使梔子苷元的得率較常規(guī)工藝條件提高了近3倍。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1稱取500g梔子苷和500g的P-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.50的醋酸緩沖溶液中，在5CTC水浴中反應(yīng)1小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入lkg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22iim微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于4'C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，5CTC干燥，稱重，得梔子苷元125g，得率為25.0%。注梔子苷分子量388，梔子苷元分子量226，梔子苷完全轉(zhuǎn)化為梔子苷元的理論得率58.2%。實(shí)施例2稱取500g梔子苷和200g的e-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.50的醋酸緩沖溶液中，在4(TC水浴中反應(yīng)1.5小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入lkg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22um微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于4"C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，45X:干燥，稱重，得梔子苷元106g，得率為21.2%。實(shí)施例3稱取500g梔子苷和100g的P-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.10的醋酸緩沖溶液中，在45。C水浴中反應(yīng)L5小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入lkg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22ym微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于2"C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，30。C減壓干燥，稱重，得梔子苷元105g，得率為21.0%。實(shí)施例4稱取500g梔子苷和80g的3-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為3.75的醋酸緩沖溶液中，在55。C水浴中反應(yīng)0.5小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為50L、50U50L)，合并乙醚提取液，加入lkg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22um微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于2'C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，7(TC干燥，稱重，得梔子苷元108g，得率為21.6%。實(shí)施例5稱取500g梔子苷和50g的0-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.95的醋酸緩沖溶液中，在52X:水浴中反應(yīng)1.9小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為50U50L、50L)，合并乙醚提取液，加入lkg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22ym微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于6。C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，3(TC減壓千燥，稱重，得梔子苷元98g，得率為19.6%。實(shí)施例6稱取500g梔子苷和300g的P-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.50的醋酸緩沖溶液中，在37.5X:水浴中反應(yīng)1.0小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入lkg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22um微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于6。C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，7CTC干燥，稱重，得梔子苷元112g，得率為22.4%。實(shí)施例7稱取300g梔子苷和300g的P-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.50的醋酸緩沖溶液中，在40。C水浴中反應(yīng)1.5小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為30L、30L、30L)，合并乙醚提取液，加入0.6kg無水硫酸鈉，千燥30min，濾過，再用0.22um微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于3X:的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，4(TC千燥，稱重，得梔子苷元69g，得率為23.0%。實(shí)施例8稱取500g梔子苷和150g的P-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.51的醋酸緩沖溶液中，在45i:水浴中反應(yīng)1.5小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入lkg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22um微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于3"C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，5(TC干燥，稱重，得梔子苷元105，得率為21.0^g。實(shí)施例9稱取200g梔子苷和200g的3-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.50的醋酸緩沖溶液中，在50。C水浴中反應(yīng)1.0小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為20L、20L、20L)，合并乙醚提取液，加入0.2kg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22um微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于4'C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，4(TC干燥，稱重，得梔子苷元50g，得率為25.0%。實(shí)施例10稱取500g梔子苷和350g的e-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH為4.51的醋酸緩沖溶液中，在53'C水浴中反應(yīng)1.0小時，用無水乙醚萃取3次(用量分別為50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入lkg無水硫酸鈉，干燥30min，濾過，再用0.22nm微孔濾膜精濾。低溫減壓回收溶劑，然后置于4'C的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，5(TC干燥，稱重，得梔子苷元lllg，得率為22.2%。權(quán)利要求1.一種梔子苷元的制備方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)酶解將梔子苷和β-葡萄糖苷酶混合加入pH3.75-4.95醋酸緩沖溶液中，在37.5-55.0℃水浴中反應(yīng)0.5-1.9小時；(2)萃取用無水乙醚萃取，合并乙醚提取液，加入無水硫酸鈉，干燥30分鐘，濾過，再用微孔濾膜精濾；(3)結(jié)晶低溫減壓回收溶劑，然后置于2-6℃的環(huán)境中，析晶，收集結(jié)晶，30-70℃干燥，得到酶解產(chǎn)物梔子苷元。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的梔子苷元的制備方法，其特征是，步驟(1)中醋酸緩沖溶液的PH值為3.80-4.80，水浴溫度為45-53°C，酶解時間為0.8-1.8小時；步驟(2)中萃取次數(shù)為3次，微孔濾膜的孔徑為0.22iim;步驟(3)中析晶環(huán)境溫度為4°C，干燥溫度為40-5CTC。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的梔子苷元的制備方法，其特征是，步驟(1)中水浴溫度為5CTC。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的梔子苷元的制備方法，其特征是，步驟(1)中醋酸緩沖溶液的pH值是4.5。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的梔子苷元的制備方法，其特征是，步驟(1)中酶解時間是1小時。全文摘要本發(fā)明涉及一種將梔子苷制備成梔子苷元的方法，包括酶解、萃取、結(jié)晶等步驟，其優(yōu)點(diǎn)是提供了更佳的梔子苷酶解條件，提高了梔子苷元的得率。文檔編號A61K36/744GK101396455SQ20071009411公開日2009年4月1日申請日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日發(fā)明者毅盧,彤張,玄振玉,陶建生申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)