專利名稱：激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一種可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白及其編碼基因與其在制備鼠疫疫苗中的應用。
背景技術(shù)：
耶爾森氏鼠疫桿菌(Y.pestis)是一種革蘭氏陰性菌，屬于enterobacteriacae家族，直接或間接(通過跳蚤)在動物之間傳播。該菌會引起某些動物(如老鼠、松鼠或旱獺等)的慢性病，若從這些動物傳播到其它動物則會引起這些動物的急性病，即鼠疫。
鼠疫是一種烈性傳染病，近年來感染人數(shù)有不斷上升的趨勢。在人類中傳播的鼠疫有三種。腺鼠疫是其中最常見的形式，通常由感染了鼠疫的跳蚤叮咬人引起。細菌從叮咬位置傳播到流經(jīng)的淋巴結(jié)點，引起腫大，可以有一個雞蛋大小，是腺鼠疫的典型特征。如果沒有形成腫大，就會發(fā)展成敗血病鼠疫，特征是發(fā)熱、傷寒、頭痛、虛弱和腸胃不適。正是因為癥狀的大眾化，導致患者常被誤診，死亡率很高。最可怕的是當細菌在肺泡中增殖導致肺炎，就成為肺鼠疫。肺鼠疫導致了相當高傳染性的血痰，咳嗽導致含有細菌的飛沫傳播到易感人群，在極短的時間內(nèi)(1-3天)就可發(fā)病，具有高死亡率和高傳染率的特點。同時由于其可能作為潛在的生物恐怖武器而引起了各國政府和人民的高度關(guān)注。
鑒于目前還沒有治療肺鼠疫的特效藥，同時也為了防御可能的生物恐怖襲擊，研制有效的預防鼠疫的疫苗成為當前生命科學研究的重要領域。迄今為止，已經(jīng)生產(chǎn)并使用了多種藥物和疫苗來預防鼠疫，并已取得了令人鼓舞的效果。過去常用疫苗和抗生素來預防和治療鼠疫。其中，鏈霉素就是一種很好的治療腺鼠疫的藥物。但抗生素在治療敗血型鼠疫和肺鼠疫過程中很少成功，可能是因為疾病發(fā)展太快，而且治療必須是在疾病發(fā)生的早期階段。而免疫接種死疫苗需要一個超過六個月的免疫過程。因此，死疫苗主要用于那些可能暴露于致病原的人員。研究認為這種疫苗對預防腺鼠疫感染有一定效果，但因副反應較大后來停止使用，如1961-1971年在侵越美軍中使用的USP疫苗。Baca-Estrada等(Baca-Estrada ME，F(xiàn)oldvari MM，Snider MM，et al.Vaccine.2000，18(21)2203-11.)采用脂質(zhì)體過濾甲醛溶液滅活的全菌體死疫苗(KWCV)給小鼠進行鼻腔內(nèi)接種，然后測定免疫抗體和免疫細胞，并用氣溶膠攻擊，結(jié)果顯示，用脂質(zhì)體過濾的KWCV較單獨用KWCV引起的粘膜免疫顯著增強，經(jīng)測定肺部和鼻腔洗液中的特異分泌性IgG和IgA抗體，以及肺內(nèi)分泌特異性抗體的細胞均有明顯增加。另外，在脂質(zhì)體疫苗免疫的小鼠中，不僅脾細胞特異性增值，分泌TNF-γ的細胞也顯著增加，經(jīng)鼻腔免疫的小鼠對鼻腔感染攻擊也有明顯的保護作用，證明了粘膜免疫對于抗吸入性感染的重要性，以及脂質(zhì)體劑型可以改進傳統(tǒng)疫苗的免疫效果。
EV76減毒活疫苗是陰性染色的耶爾森氏菌突變株，它起源于耶爾森氏菌全毒菌株。自1908年起開始使用這種疫苗，用EV76疫苗免疫小鼠誘導免疫應答能夠抵抗皮下和呼吸道攻擊，研究結(jié)果表明用EV76疫苗免疫能夠保護人抵抗腺鼠疫和肺鼠疫。然而，這種疫苗對人的安全性還存在疑問，據(jù)報道在研究鼠疫疫苗的研究人員中這種疫苗的致死率約為1％。
近年來，研究人員主要集中發(fā)展用亞單位疫苗預防鼠疫，這是基于毒性因子可能定位于細菌表面，因此用這些成份免疫小鼠可以誘導產(chǎn)生保護性抗體，這些抗體在III型分泌系統(tǒng)中起調(diào)節(jié)作用。
粘膜免疫系統(tǒng)(mucosal immune system)與系統(tǒng)免疫系統(tǒng)(systemic immunesystem)是機體的兩大免疫系統(tǒng)，兩者至少在兩個方面具有不同的免疫功能。一是粘膜免疫常常激發(fā)粘膜和系統(tǒng)免疫應答，而系統(tǒng)免疫僅僅激發(fā)系統(tǒng)免疫反應，不激活粘膜免疫系統(tǒng)或很弱；二是粘膜免疫反應主要產(chǎn)生sIgA，而系統(tǒng)免疫不產(chǎn)生或產(chǎn)生很少的sIgA。
但是絕大數(shù)非復合抗原(如純蛋白質(zhì)抗原)經(jīng)粘膜供給時免疫原性弱，特別是經(jīng)口服途徑，只有大量和反復接種后才可能引起免疫應答，且應答持續(xù)時間短，易引起免疫耐受。尋找能夠增強疫苗粘膜免疫原性的粘膜佐劑成為粘膜疫苗開發(fā)中的關(guān)鍵問題。比較理想的粘膜佐劑應高效、安全，能激活粘膜免疫系統(tǒng)，在其存在的情況下抗原經(jīng)粘膜供給可引發(fā)抗原特異性全身和粘膜的體液和細胞介導的免疫應答，同時能避免誘導粘膜耐受?？乖瓕φ衬っ庖呦到y(tǒng)有效的刺激是產(chǎn)生sIgA的必要條件，對粘膜免疫系統(tǒng)的有效刺激需要兩個條件，一是疫苗抗原能夠有效的傳遞到粘膜淋巴組織；二是需要合適的粘膜佐劑。
在許多情況下，鼻腔免疫更為有效，而且所需的疫苗量和佐劑量一般較小。
粘膜免疫系統(tǒng)擔負著哨兵的責任，區(qū)分無害與有害以決定是放過去(耐受)還是攔下來(免疫反應)，粘膜免疫系統(tǒng)主要是通過分泌sIgA和IgM發(fā)揮作用，slgA可以阻止微生物在粘膜上皮層駐扎繁殖，禁止它們進入上皮層。特殊的位置、極其重要的作用使粘膜免疫系統(tǒng)形成與外周免疫系統(tǒng)形成迥然不同的解剖學結(jié)構(gòu)、淋巴細胞和免疫反應分子機制。從數(shù)量上說，粘膜免疫系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)中最大的，這里淋巴細胞的數(shù)量比其他部分的總和還要多，60％T細胞的工作崗位在粘膜。
此外，以注射方式在小鼠模型中取得成功的鼠疫疫苗，往往在靈長類動物或人身上并不理想。原因可能就在于靈長類動物或人類身體中含有體積巨大的粘膜系統(tǒng)，鼠疫桿菌通過粘膜感染人類，而普通的注射方式并不能激發(fā)靈長類動物或人體內(nèi)的粘膜免疫反應。因此，研究有效的粘膜疫苗不僅僅要引發(fā)體內(nèi)的系統(tǒng)免疫，更重要的是引發(fā)長時間有效的局部粘膜免疫應答。
霍亂毒素(Cholera toxin，CT)是由霍亂弧菌產(chǎn)生的一種分子量為84KD的腸毒素，由一個A亞單位(CTA)和5個B亞單位(CTB)形成的五聚體連接而成。CTA為毒性亞單位，CTB為無毒性的受體結(jié)合亞單位，通過與哺乳動物小腸上皮細胞上的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合而介導CTA進入細胞。CT及其CTB均具有較強的免疫佐劑作用，由于CT具有腸毒性，限制了其作為免疫佐劑的應用，因而無毒性的CTB就成為研究的熱點。許多研究發(fā)現(xiàn)，單獨的CTB就具有較強的免疫活性，但當其經(jīng)化學方法或基因融合技術(shù)與不相關(guān)抗原形成偶聯(lián)蛋白或融合蛋白時，CTB的免疫活性大大高于單獨CTB的佐劑活性。因此，CTB是一種良好的蛋白半抗原和弱抗原的載體，同時還可以賦予半抗原免疫原性，增強弱抗原的免疫原性。CTB是一種良好的粘膜免疫佐劑和輸送抗原載體，通過粘膜途徑免疫效果最佳，將其與目的抗原偶聯(lián)或表達成融合蛋白后可增強其佐劑和載體的作用能夠誘導粘膜和全身免疫應答。采用重組CTB作為佐劑，不引起巨噬細胞的毒性反應，不使血管通透性增加，而且在鼻腔、小腸和肌肉的給藥部位沒有明顯的局部組織病理反應。CT引發(fā)粘膜免疫非常有效，CT與非關(guān)聯(lián)蛋白抗原經(jīng)口、鼻共用，可促進分泌IL24、IL25的抗原特異性CD4+Th細胞的出現(xiàn)，引發(fā)極強的粘膜S2IgA和血清IgG應答。CT發(fā)揮佐劑效應主要通過誘導抗原特異性CD4+Th2型細胞，活化的CD4+Th2型細胞不僅相應產(chǎn)生IL24、IL25、IL26和IL210，而且支持全身IgG1和IgG2b亞類、IgE和粘膜S2IgA應答的出現(xiàn)。由于天然毒性的存在，目前許多研究正嘗試將這兩種分子的致腹瀉活性(毒性)與佐劑活性分開。有一種方法是將毒素的A、B亞基分開，單獨使用其無毒的B亞基作為粘膜佐劑。Millar DG等應用CTB作為粘膜佐劑與雞蛋溶菌酶共用經(jīng)鼻免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)兩者可增強血清和分泌抗體滴度，刺激脾臟和淋巴結(jié)淋巴細胞增殖。本發(fā)明的發(fā)明者構(gòu)建和表達了霍亂毒素B亞單位(CTB)，進行了佐劑特異性和活性的鑒定以及動物實驗，證明了其在鼠疫亞單位疫苗中的作用。
因生物相容性好，美國FDA已批準用于注射給藥的PLGA(乙交酯-丙交酯)和在PLGA中加入親水性的PEG(聚乙二醇)制備成嵌段聚物PELA(聚乙二醇-聚丙交酯)為材料，包裹不同抗原成分，研究其免疫原性，目的是制備出最佳的微球疫苗?？梢院愣ǖ摹⒗^續(xù)的、預定的方式將抗原傳遞至特定組織；釋放前可很好地保護抗原，不僅提高抗體，也可提高細胞免疫反應。以毒副作用小、生物可降解、生物相容性好的高分子材料制作的微球或納米粒子載體，因粒徑小、表面積大、吸附能力強、生物活性高，有著較高的生物醫(yī)學價值，已成為疫苗載體研究的新熱點。微球疫苗能特異性靶向APCs，提高用藥安全性，延長抗原表達時間，保護抗原，增加免疫途徑還起免疫佐劑作用。PLGA已經(jīng)用于破傷風類毒素，結(jié)核病的蛋白疫苗，百日咳和親肺炎細菌的抗原，流感、麻疹以及馬腦炎等病毒，瘧原蟲的環(huán)狀子孢子DNA疫苗的微球包裹。也有與其他佐劑合用的情況，例如Tobio等報道破傷風類毒素以PLGA包裹微球與磷酸鋁合用，比單獨使用磷酸鋁產(chǎn)生的抗體水平高出2-3倍并可持續(xù)性26周以上(Tobio M，Sanchez A，Vila A，et al.Colloids Surf B Biointerfaces.2000，18(3-4)315-323.)。PLGA不僅用于注射免疫，而且可用于粘膜免疫。Partidos(Partidos CD，Vohra P，Anagnostopoulou C，et al.Mol Immunol.1996，33(6)485-91.和Hilbert(Hilbert AK，F(xiàn)ritzsche U，Kissel T.Vaccine.1999，17(9-10)1065-73)等報道PLGA用于麻疹和流感疫苗，不僅增強抗體的產(chǎn)生，而且能增強細胞免疫和粘膜免疫。DNA疫苗PLGA包裹可將DNA疫苗引入體內(nèi)固定位置并可以控制其逐漸釋放，起到增強免疫反應的效果。
蛋白體是一種純化的腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)，具有能增強免疫原性的生物傳遞和免疫刺激特性，而且還能明顯減弱如脂多糖(LPS)這樣抗原的毒性。蛋白體是疫苗投遞和佐劑系統(tǒng)，由純化的細菌外膜蛋白形成豪微粒。蛋白體同時具有疫苗投遞載體和佐劑獨特的特征，這個特征使蛋白體提供所有的信號增強免疫反應---在系統(tǒng)上缺乏這種能力，它只提供投遞或只提供佐劑刺激功能。免疫系統(tǒng)在識別微粒比可溶性蛋白更有效。蛋白體作為疫苗投遞載體是由于它的豪微粒性質(zhì)，形成小泡或小泡群的大小比得上小病毒的大小。蛋白體疫苗小泡和小泡群的大小在20-800nm，依據(jù)抗原的類型和量形成蛋白體。蛋白體疏水的性質(zhì)使細胞外膜孔道蛋白也有助于疫苗投遞能力，易于疫苗微粒的相互作用，疫苗的攝取，細胞激活啟動免疫應答。蛋白體是有效的鼻用疫苗的事實被認為它與增強識別和攝取提供通過蛋白體的微粒和疏水性質(zhì)相關(guān)。疫苗抗原的免疫應答被增強是由于被佐劑免疫刺激。蛋白體發(fā)揮它的佐劑活性有三種途徑①蛋白體蛋白質(zhì)的促進，促進在抗原提呈細胞(APC’s)表面的配位體分子的表達，因此增強APC的功能。APC的功能關(guān)鍵是刺激免疫反應，由于APCs負責加工和提呈抗原到其它免疫細胞。蛋白體增加某一表面蛋白的密度，負責APCS與其它免疫細胞的有效相互作用。②蛋白體蛋白質(zhì)的活化，活化B細胞的增生和分泌。B細胞也具有APCS的提呈抗原到T細胞的功能，另外，刺激B細胞的分化和成熟，細胞能產(chǎn)生抗體蛋白。這些抗體在血液中循環(huán)，也出現(xiàn)在粘膜表面中和微生物的侵害。③蛋白體也刺激免疫反應，通過提供額外或?qū)Ｓ蠺細胞輔助分子，是T細胞自己缺乏有效刺激T細胞的能力。蛋白體的似蛋白質(zhì)的成分非共價復合使分子易于刺激作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的融合蛋白，命名為F1-V，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO12)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的蛋白質(zhì)。
所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
序列表中的SEQ ID NO1由478個氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第2-149位為鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1(GenBank號X61996)的氨基酸殘基序列，自氨基端第152-478位為鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V(GenBank號M26405)的氨基酸殘基序列。
編碼本發(fā)明融合蛋白的基因(F1-V)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在激發(fā)機體產(chǎn)生鼠疫免疫力中起重要作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由1437個堿基組成，其編碼框為自5’端第1-1437位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第4-450位堿基編碼鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1，自5’端第457-1434位堿基編碼鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V。
含有上述融合蛋白基因F1-V的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌以及擴增所述融合蛋白基因F1-V中任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明還提供了一種表達上述可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的表達上述融合蛋白的方法，是將含有上述融合蛋白基因F1-V的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α或E.coli Top10等。
用于構(gòu)建所述含有可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白基因F1-V的表達載體的出發(fā)載體可為任意一種可在大腸桿菌中表達外源基因的原核表達載體，如pET-11c、pET-22b或pET-32a等。
其中，以pET-11c為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白基因F1-V的表達載體為pET-11c-F1-V。
上述重組表達載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
將上述重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌的方法可為生物工程領域中常用的轉(zhuǎn)化方法，如熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法或PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等。
培養(yǎng)含有本發(fā)明的可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白基因F1-V的宿主細胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
發(fā)酵重組大腸桿菌時需加入IPTG誘導劑，所加入IPTG的濃度為0.8-1.2mM，誘導溫度為30-37℃，誘導時間為3-4小時。
本發(fā)明的融合蛋白F1-V可用于制備鼠疫亞單位疫苗，編碼融合蛋白F1-V的基因可用于制備鼠疫DNA疫苗。
所述鼠疫DNA疫苗中的融合蛋白基因F1-V可存在于真核表達載體中。
用于構(gòu)建攜帶有融合蛋白基因F1-V的真核表達載體的出發(fā)載體可為PVAX1(Novagen，www.novagen.com，ordering800-526-7319)等。
需要的時候，在上述疫苗中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進劑等。
為獲得更好的免疫效果，本發(fā)明的疫苗中還可以加入Al(OH)3、CTB、脂多糖(LPS)和蛋白體(Proteosome)等佐劑中的一種或多種作為免疫佐劑。其中，LPS和蛋白體混合佐劑的制備方法可為將去毒的LPS溶于TEEN緩沖液中，無菌過濾除菌，將LPS溶液與等量的蛋白體混合，加入3-5倍體積的冷無水乙醇，沉淀混合物，收集沉淀，用無水乙醇洗滌，最后用無菌蒸餾水溶解沉淀，超聲，使蛋白體與LPS相互結(jié)合和溶解，最后去除不可溶的物質(zhì)，得到佐劑，命名為Protollin。所述LPS的來源是廣泛的，如減毒痢疾菌、減毒大腸桿菌等。
本發(fā)明的疫苗可以制成注射液、噴劑、涂抹劑、貼片劑或口服液等多種劑型，上述各種劑型的疫苗可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。
在制備口服劑型的疫苗時，可將攜帶有融合蛋白基因F1-V的真核表達載體轉(zhuǎn)化進減毒鼠傷寒沙門氏菌，從而實現(xiàn)對人或動物的直接免疫。
此外，本發(fā)明疫苗的免疫途徑也是多種多樣的，如注射、鼻內(nèi)、透皮或口服等，并可將不同的免疫途徑聯(lián)合應用，以獲得更好的免疫效果。
本發(fā)明提供了一種可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白及其編碼基因。實驗證明，該融合蛋白可激發(fā)動物機體產(chǎn)生特異性抗體，對鼠疫菌具有較好的免疫保護效果，可用于鼠疫的預防和治療中。該融合蛋白穩(wěn)定、制備方法簡便易行，可應用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。可以該融合蛋白或其編碼基因為活性成分制備成鼠疫疫苗，該疫苗的劑型和免疫途徑的選擇多種多樣，并均可獲得較好的免疫效果及免疫保護作用。本發(fā)明在醫(yī)學領域具有重要的應用前景和實際意義。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1A為工程菌F1-V/pET-11c表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖1B為工程菌F1-V/pET-11c表達產(chǎn)物的免疫印跡鑒定結(jié)果圖1C為經(jīng)純化的F1-V融合蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖2為經(jīng)純化的F1-V融合蛋白的HPLC反相色譜純度測定色譜3A為不同劑量的F1-V抗原引發(fā)的血清抗體水平檢測結(jié)果圖3B為50μgF1-V免疫劑量組的小鼠末次免疫后IgG抗體的亞型分析結(jié)果圖4A為經(jīng)IPTG誘導前、后的pCTB/pET-32a表達菌體培養(yǎng)上清和菌體沉淀的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖4B為不同濃度咪唑梯度洗脫產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖5為表達蛋白CTB的Western blotting鑒定結(jié)果圖6A為鼠疫F1-V黏膜疫苗滴鼻免疫后血清抗體IgG水平的變化圖6B為鼠疫F1-V黏膜疫苗滴鼻免疫后血清抗體IgA水平的變化圖7A和7B為鼠疫F1-V黏膜疫苗滴鼻免疫后抗體亞型的檢測結(jié)果圖8A-圖8D為鼠疫F1-V黏膜疫苗滴鼻免疫后黏膜IgA抗體水平變化的檢測結(jié)果圖9為鼠疫F1-V黏膜佐劑疫苗滴鼻免疫后不同時間血清抗體水平變化的檢測結(jié)果圖10A為鼠疫F1-V黏膜佐劑疫苗滴鼻免疫末次后各佐劑疫苗組小鼠的IgG1和IgG2a水平變化的檢測結(jié)果圖10B為鼠疫F1-V黏膜佐劑疫苗滴鼻免疫末次后各佐劑疫苗組小鼠的IgG1/IgG2a變化的檢測結(jié)果圖11為不同劑量的F1-V對受強毒鼠疫菌攻擊小鼠的免疫保護作用的檢測結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物均由上海生工合成，所有測序工作均由三博遠志生物技術(shù)有限責任公司協(xié)助完成。
實施例1、可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白基因F1-V的獲得及其編碼蛋白的原核表達一、可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白基因F1-V的獲得根據(jù)鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1(GenBank號X61996)和鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V(GenBank號M26405)的氨基酸殘基序列，以及載體pET-11c(購自Novagen公司)的酶切圖譜設計2對引物，分別用于擴增鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1基因片段和鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V基因片段，引物序列如下用于擴增鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1基因片段的引物P1(上游引物)5’-GCCATATGATGAAAAAAATCAGTTCC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Nde III的識別位點)P2(下游引物)5’-CGGAATTCTTATTGGTTAGATACGGT-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoR I的識別位點)；用于擴增鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V基因片段的引物P3(上游引物)5’-CGGAATTCATGATTAGAGCCTACGAA-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoR I的識別位點)P4(下游引物)5’-GCGGATCCTCATTTACCAGACGTGTCA-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamH I的識別位點)。
以鼠疫耶爾森氏菌EV76減毒活疫苗(購自蘭州生物制品研究所)為模板，在引物P1和P2的引導下進行PCR擴增，反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)PCR擴增獲得了長度約為500bp的DNA片段，與預期結(jié)果相符，用凍融法回收該目的片段，將其連接入載體pGEM-T(Promega公司)中，再將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pGEM-F1，再對其進行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1基因片段。
再以鼠疫EV76減毒活疫苗為模板，在引物P3和P4的引導下進行PCR擴增，反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)PCR擴增獲得了1000bp左右的DNA片段，與預期結(jié)果相符，用凍融法回收該目的片段，將其連接入載體pGEM-T中，再將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pGEM-V，再對其進行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V基因片段。
最后，將上述PCR擴增的鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1基因和鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V基因用限制性內(nèi)切酶EcoR I進行酶切后，將兩個基因片段的EcoR I酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶共同連接入載體pET-11c的Nde I和BamH I酶切位點之間，再將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pET-11c-F1-V，再對其進行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1和鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V融合蛋白基因，該融合基因具有序列表中的SEQ ID NO2的核苷酸序列，由1437個堿基組成，其編碼框為自5’端第1-1437位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中自5’端第4-450位堿基編碼鼠疫耶爾森氏菌膜蛋白F1，自5’端第457-1434位堿基編碼鼠疫耶爾森氏菌毒力蛋白V，將該融合基因命名為F1-V，其編碼蛋白命名為F1-V。
二、融合蛋白F1-V的原核表達1、工程菌的構(gòu)建將步驟一構(gòu)建的質(zhì)粒pET-11c-F1-V用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含0.1mg/L氨芐青霉素的LB平板上進行抗性篩選，長出單克隆后，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I進行雙酶切鑒定，結(jié)果經(jīng)酶切獲得了大小約為1400bp的DNA片段，與預期結(jié)果相符，再對其用測序的方法做進一步鑒定，結(jié)果序列正確，證明獲得了攜帶有pET-11c-F1-V的工程菌，命名為F1-V/pET-11c。
2、F1-V的原核表達及鑒定挑取步驟1構(gòu)建的工程菌F1-V/pET-11c，將其接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)12-24小時，然后再按1∶100的比例將菌液接種于含0.1mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)3-4小時至A600達0.8-1.0，加入IPTG誘導劑至終濃度為1mmol/L，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時，同時，以用上述方法培養(yǎng)的pET-11c空載體轉(zhuǎn)化菌作為陰性對照。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，將菌體在冰浴條件下超聲破碎，分別收集沉淀和上清，進行12％SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖1A所示(泳道1為表達外源蛋白的細菌原液，泳道2為陰性對照，泳道3為低分子量蛋白Marker)，經(jīng)表達獲得了分子量約為50KD的目的蛋白，與預期結(jié)果相符，外源表達的目的蛋白占細菌總蛋白的20％以上。對該目的蛋白用免疫雜交的方法做進一步鑒定，具體方法為在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移儀上用半干膠轉(zhuǎn)移法將各蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后用1.5％(W/V)的酪蛋白封閉12-24小時，再用按1∶50比例稀釋的兔抗鼠的F1-V多抗(按常規(guī)方法制備)作為一抗及按1∶800比例稀釋的辣根過氧化酶標記的羊抗兔抗抗體(購自Sigma-Aldrich公司)作為二抗進行逐級標記，DAB顯色，結(jié)果如圖1B所示(泳道1為表達外源蛋白的細菌原液，泳道2為陰性對照，泳道3為低分子量蛋白Marker)，結(jié)果表達的目的蛋白可與兔抗鼠的F1-V多抗特異結(jié)合，證明經(jīng)表達獲得了正確的融合蛋白F1-V。
3、F1-V融合蛋白的色譜柱層析純化將步驟2大量培養(yǎng)的F1-V/pET-11c工程菌超聲裂解，離心留取上清，首先將超聲上清用0.8M的硫酸銨處理后通過Source 30Q離子交換層析柱(購自美國GE公司)，再將收集的樣品通過HiPrep Butyl FF 16/10疏水層析柱(購自美國GE公司)，然后將收集的樣品濃縮后通過Sephadex G-25F脫鹽柱(購自美國GE公司)，最后將收集的F1-V融合蛋白進行12％SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖1C所示(泳道1為細菌表達原液，泳道2為陰性對照，泳道3為純化穿透峰，泳道4-6為經(jīng)純化的目的蛋白，泳道7為低分子量蛋白Marker)，經(jīng)HPLC分析融合蛋白的純度(色譜柱規(guī)格為150×4.6mm，Century SIL BDS C8柱(購自美國GE公司)，粒徑為5μm，孔徑為300-。流動相A液為0.1％三氟乙酸的5％乙腈水溶液，B液為0.1％三氟乙酸的95％乙腈水溶液，流速為0.7mL/min。)，結(jié)果如圖2所示(橫坐標為時間，縱坐標為280nm下的AU值)，表明獲得了純度較高的F1-V目的蛋白，純度可達90％以上。
實施例2、以Al(OH)3為佐劑檢測F1-V的免疫效果一、血清抗F1-V抗體的效價測定及抗體亞型檢測實驗分組實施例1獲得的經(jīng)純化的重組F1-V蛋白+Al(OH)3組及Al(OH)3對照組。
免疫方案將不同劑量的重組融合蛋白抗原與氫氧化鋁佐劑混合，使氫氧化鋁佐劑的濃度保持在1.2mg/mL，輕輕攪拌過夜(12小時以上)，得到F1-V重組融合蛋白亞單位疫苗候選株。融合蛋白抗原的濃度由每只小鼠的免疫劑量決定，分別為50μg、20μg和10μg/只。采取肌肉注射的方式對小鼠進行免疫。實驗組的小鼠于后腿肌肉注射相應劑量的上述氫氧化鋁佐劑吸附的融合蛋白抗原，而對照組則注射氫氧化鋁(或PBS)。小鼠初次免疫后每隔2周進行相同劑量的加強免疫，共加強免疫3次。
每次免疫后第10天斷尾取血分離血清，通過間接ELISA法測定血清中抗F1-V抗體效價。F1-V重組蛋白用包被液稀釋后(5μg/mL，每孔100μl)包被酶聯(lián)板，免疫后血清作為一抗，以HRP標記的二抗IgG、IgG1、IgG2a(均購自美國Bethyl公司)鑒定結(jié)合的抗體。用酶標儀在450nm波長處測A值。陽性的判定標準為實驗孔A比陰性對照A≥2.1。
間接ELISA法測定不同劑量F1-V重組融合蛋白免疫的小鼠血清，比較每次免疫后450nm波長處測得的A值。按照上述方法測定血清的抗體效價，結(jié)果如圖3A所示(橫坐標為免疫次數(shù)，縱坐標為OD450值)，在所有測試的F1-V濃度中，50μg劑量誘導的抗體效價要高于其它兩個劑量，50μg免疫劑量組小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生高達102400的IgG抗體效價，而20μg和10μg免疫劑量組小鼠血清中的IgG抗體效價平均為51200，說明高濃度劑量的F1-V蛋白抗原可以刺激產(chǎn)生更高水平的抗原特異性IgG抗體。
其中，50μg劑量組的IgG抗體的亞型分析結(jié)果如圖3B所示，血清樣本來自末次免疫后取血，IgG1效價平均為50000，而IgG2a組的效價平均僅為6000，免疫小鼠的IgG1和IgG2a的比值平均值為5.0，IgG1的數(shù)量顯著性高于IgG2a(p＜0.01)，說明抗體反應趨向Th2型反應，重組抗原誘導的免疫應答以體液免疫為主。
二、T淋巴細胞的亞型分析采用細胞表面不同抗原分子熒光標記抗體，對上述不同F(xiàn)1-V免疫劑量組的小鼠脾細胞的淋巴細胞亞群進行染色分析，方法為采集小鼠脾淋巴細胞，置于含有5％胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。過濾，離心去除上清。加入5mL含有5％胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮并洗滌細胞2次，并最終使細胞濃度達到105個/mL。向脾細胞懸浮液中加入FITC-CD3+、PE-CD4+和PerCP-CD8+雙染熒光抗體(購自美國Bethyl公司)，4℃避光孵育40min，PBS洗2次，1％多聚甲醛固定，流式細胞儀測定，Cellquest軟件分析。
其中，50μg F1-V免疫劑量組的小鼠脾細胞的淋巴細胞亞群的染色分析結(jié)果如表1所示，CD4+含量的均值為74.79±1.46％，CD8+含量的均值為21.61±1.25％，CD4+/CD8+均值為3.74±0.25；而對照組(注射氫氧化鋁)的CD4+含量、CD8+含量和CD4+/CD8+的均值則分別為62.83±0.37％、33.53±1.26％和1.87±0.18。統(tǒng)計學分析表明，實驗組的CD4+/CD8+比值與對照組相比有顯著性差異(*表示P＜0.01)，說明脾細胞的T淋巴細胞主要為CD4+細胞，從而主要在小鼠體內(nèi)引發(fā)體液免疫應答。20μg和10μg F1-V免疫劑量組的實驗結(jié)果與50μg F1-V免疫劑量組相似。
表1 50μg F1-V免疫劑量組的小鼠脾細胞T淋巴細胞的流式細胞分析結(jié)果

*P＜0.01實施例3、以霍亂毒素B亞單位(CTB)為佐劑檢測F1-V的粘膜免疫效果一、重組CTB的獲得1、CTB基因的擴增根據(jù)基因文庫中提供的CTB基因序列(AY804244，序列表中的SEQ ID NO3)設計引物，引物序列如下P5(上游引物)5′-GGCGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamH I識別位點)P6(下游引物)5′-GGCAAGCTTTTAATTTGCCATACTTAATA-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識別位點)以埃爾托霍亂弧菌稻葉血清型(購自中國藥品生物制品檢定所)的基因DNA組為模板，在引物P5和P6的引導下，PCR擴增CTB基因，擴增結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)PCR擴增獲得了約375bp的DNA片段，與預期結(jié)果相符，用凍融法回收該目的片段，將其連接入載體pGEM-T中，再將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pGEM-CTB，再對其進行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的CTB基因。
2、CTB原核表達載體及工程菌的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III對pGEM-CTB進行雙酶切，回收約375bp的目的片段，將回收片段與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET-32a(+)(Novagen公司)用T4 DNA連接酶連接16h，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含0.1mg/L氨芐青霉素的LB平板上進行抗性篩選，長出單克隆后，在引物P5和P6的引導下進行菌落PCR鑒定，結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得了約375bp的DNA片段，與預期結(jié)果相符。再提取陽性克隆的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III進行雙酶切鑒定，與預期結(jié)果相符。最后用測序的方法做進一步鑒定，結(jié)果序列正確，證明獲得了攜帶有CTB基因的工程菌，命名為CTB/pET-32a，將CTB基因的原核表達載體命名為pET-CTB。
3、CTB的原核表達挑取步驟2構(gòu)建的工程菌CTB/pET-32a，將其接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)12-24小時，然后再按1∶100比例將菌液接種于含0.1mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)至A600達0.4-0.6，加入IPTG誘導劑至終濃度為1mmol/L，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)約4.5小時。培養(yǎng)結(jié)束后，8000rpm離心15min收集菌體，將菌體在冰浴條件下超聲破碎，12000rpm離心10min，分別收集沉淀和上清，進行15％SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖4A所示(泳道M.蛋白分子量標準；泳道1.IPTG誘導前的CTB/pET-32a；泳道2.IPTG誘導后的CTB/pET-32a；泳道3.經(jīng)IPTG誘導后的pCTB/pET-32a的培養(yǎng)上清；泳道4.經(jīng)IPTG誘導后的pCTB/pET-32a細菌沉淀)，結(jié)果經(jīng)表達獲得了34KD的目的蛋白，與預期結(jié)果相符。
4、表達產(chǎn)物的純化及ELISA鑒定用Hitrap HP親和層析柱(購自GE公司)對步驟3獲得的表達產(chǎn)物進行純化，洗脫液為濃度分別為15％、25％、40％、50％、60％、70％和80％的咪唑溶液，然后對不同濃度咪唑的梯度洗脫產(chǎn)物進行15％SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如圖4B所示(泳道1-7分別為親和層析中咪唑濃度分別為15％、25％、40％、50％、60％、70％和80％的梯度洗脫的CTB蛋白樣品)，表明獲得了純度較高的CTB蛋白，分子量約為34KD。再對純化蛋白進行ELISA鑒定，方法為用牛GM1(購自Sigma公司)包被酶標板，然后加入純化的重組蛋白，重復3孔，以CTB免疫家兔獲得的多抗血清為一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research)為二抗，以鄰苯二胺為底物進行顯色反應，測定490nm的吸光值，以不加重組蛋白的作為陰性對照，重復3孔。檢測結(jié)果表明重組蛋白可與兔抗CTB多抗特異結(jié)合，證明經(jīng)表達獲得了正確的CTB蛋白。
5、表達產(chǎn)物的免疫印跡鑒定對步驟3獲得目的蛋白用免疫印跡(Western blotting)的方法做進一步鑒定，具體方法為在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移儀上用半干膠轉(zhuǎn)移法將各蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后用5％(W/V)的脫脂奶粉封閉2小時，PBST振洗3次(每次5min)，加入兔抗CTB多抗血清(一抗)作用2小時，PBST振洗3次(每次5min)，再加入辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG(購自Sigma公司，二抗)作用2小時，DAB顯色。結(jié)果如圖5所示(泳道M.蛋白分子量標準，泳道1.兔抗霍亂毒素血清抗體特異性結(jié)合原核系統(tǒng)表達的CTB蛋白)，結(jié)果表達的目的蛋白可與兔抗CTB多抗特異結(jié)合，證明經(jīng)表達獲得了正確的CTB蛋白。
二、以CTB為佐劑檢測F1-V的粘膜免疫效果選取8周齡的雌性Balb/C小鼠為實驗動物，乙醚輕度麻醉后通過鼻腔吸入按5∶2、5∶1、1∶1、1∶2和1∶5不同比例混合的F1-V融合蛋白和CTB，以PBS、CTB為對照組，分別于免疫后第0、7、14、21天摘除眼球放血，收集血清。然后暴露小鼠的氣管，從喉頭部位切開，用EP吸頭從喉頭插入，以0.6mL PBS(含有1％牛血清白蛋白)注入小鼠的下呼吸道，反復沖洗3次，制備肺沖洗液。用ELASA法檢測血清和肺沖洗液的IgG和IgA，并進行抗體亞型分類和T細胞亞群分類。
1、小鼠血清總IgG和IgA水平的測定用rCTB與鼠疫F1-V重組蛋白制備的黏膜疫苗滴鼻初次免疫后10d各組小鼠均可檢測到特異性抗體產(chǎn)生，4次免疫后抗體水平明顯升高。小鼠血清IgG、IgA抗體水平的檢測結(jié)果如圖6A和圖6B所示，黏膜疫苗各組均能使小鼠血清IgG、IgA抗體水平顯著高于F1-V組(P＜0.01)，而且各個疫苗組間也有差異，其中，5∶1疫苗組和1∶2疫苗組的免疫應答水平最強?？梢?，rCTB佐劑能顯著提高鼠疫F1-V重組蛋白黏膜疫苗的體液免疫應答水平。rCTB不僅可增強系統(tǒng)的IgG抗體水平，而且可顯著提高全身的IgA抗體水平。
2、抗體亞型分類用rCTB與鼠疫F1-V重組蛋白制備的黏膜疫苗滴鼻第四次免疫后采集血清進行抗體亞類分析。結(jié)果如圖7A和圖7B所示，疫苗組小鼠的IgG1水平遠遠高于IgG2a水平，說明黏膜疫苗組小鼠的特異性抗體是以IgG1為主，趨向Th2型反應；而各疫苗組中，5∶1疫苗組IgG1/IgG2a顯著高于其它3組，說明F1-V抗原與黏膜佐劑5∶1比例的疫苗引起的Th2型反應更加強烈。
3、小鼠呼吸道、消化道、生殖道特異性sIgA的測定結(jié)果鼠疫F1-V重組蛋白黏膜疫苗滴鼻免疫四次后，黏膜沖洗液檢測結(jié)果如圖8A-圖8D所示(縱坐標為OD450nm值，橫坐標為按5∶2、5∶1、1∶1、1∶2不同比例混合的F1-V融合蛋白和CTB，以及PBS和F1-V實驗組)，其中，圖8A為小鼠肺沖洗液中IgA抗體變化的檢測結(jié)果，圖8B為小鼠鼻咽沖洗液中IgA抗體變化的檢測結(jié)果，圖8C為小鼠陰道沖洗液中IgA抗體變化的檢測結(jié)果，圖8D為小鼠小腸沖洗液中IgA抗體變化的檢測結(jié)果，黏膜疫苗組小鼠肺沖洗液中產(chǎn)生較高sIgA的水平，但比F1-V抗原組無顯著性差異(P＞0.05)；在鼻咽喉沖洗液中在1∶25效價時疫苗組檢測到sIgA，但各疫苗組比F1-V抗原組無顯著性差異(P＞0.05)；消化道小腸沖洗液中疫苗組sIgA顯著高于F1-V組(P＜0.01)，并且1∶1疫苗組和1∶2疫苗組極顯著高于其它疫苗組；在生殖道陰道沖洗液中，疫苗組sIgA比F1-V組有顯著差異(P＜0.01)，并且5∶1和5∶2組的sIgA顯著高于其它疫苗組(P＜0.01)。結(jié)果說明，rCTB可使鼠疫F1-V重組蛋白抗原誘導呼吸道、消化道和生殖道黏膜分泌型IgA抗體，使疫苗有效誘導局部黏膜的免疫應答。
采用細胞表面的不同抗原分子熒光標記抗體(所用抗體均購自美國BD公司)，對不同免疫組小鼠SP、NA、PP、MLN中的淋巴細胞亞群進行染色分析。結(jié)果如表2所示，在SP中各疫苗組CD4+/CD8+細胞比值比F1-V組顯著降低(P＜0.01)，而F1-V組比PBS對照組顯著升高；但在NA和PP各疫苗組CD4+/CD8+細胞比值比F1-V組無顯著差異(P＞0.05)，但比PBS正常組顯著升高(P＜0.01)；在MLN中CD4+/CD8+細胞比值比PBS對照差異無顯著性。結(jié)果說明，單獨滴鼻免疫F1-V蛋白會引起局部鼻黏膜相關(guān)組織、小腸PP結(jié)和脾臟中CD4+細胞顯著增加，免疫應答趨向Th2型反應；但是加有rCTB佐劑的疫苗組，脾臟中的CD8+細胞會顯著升高，表明rCTB佐劑也能使疫苗增強脾臟的細胞免疫水平，所以rCTB佐劑既有Th1型又有Th2型免疫應答。
表2 鼠疫F1-V重組蛋白疫苗滴鼻免疫4次后T細胞表型變化

實施例4、粘膜佐劑Protollin的制備及以其為佐劑檢測F1-V的免疫效果一、LPS的提取及檢測1、LPS的提取采用熱酚水法提取減毒痢疾菌的LPS，具體方法包括以下步驟1)將減毒痢疾菌用普通營養(yǎng)瓊脂(潘勁草，黃志成，余文炳等，中國人獸共患病雜志，1999，15(3)59-61)培養(yǎng)24h，收集菌體，用滅菌生理鹽水適量洗1-2次，3000rpm離心30min，沉淀稱濕重。
2)將細菌收集物按每克加3mL蒸餾水進行懸浮，然后反復凍融3-5次。每250mL菌液加45％酚水作用5min，再加等量的95％酚，在68℃下水浴30min，水浴過程中不斷攪拌，然后冷卻至約10℃，7000rpm離心45min，分為三層上層水相LPS，中層為變性蛋白，下層為沉淀。小心吸取上層水相，下層沉淀依上法反復提取，至少2次。
3)將總的水層溶液裝透析袋，流水沖洗48h，然后用蒸餾水透析2天，每天換水6-10次。
4)用聚乙二醇2000濃縮，提取液中加DNAase 50ug/mL和RNAase 50ug/mL，在37℃下作用4h，100℃水浴10min，冷卻至室溫，1500rpm離心30min，棄沉淀，收集上清，4℃保存。
2、LPS的脫毒稱取凍干的步驟一提取的LPS 66mg，溶于14.5mL 0.1M NaOH中，60℃水浴3h，再用等體積的乙酸中和NaOH，加入5倍體積的冷無水乙醇沉淀，7000rpm離心30min，收集沉淀，再用冷無水乙醇洗2次，用無菌蒸餾水溶解，在4℃下用100體積的蒸餾水透析12-24小時。
3、LPS的檢測A.脫毒檢測對LPS進行14％SDS-PAGE，銀染，再用免疫雙擴散試驗進行脫毒檢測，結(jié)果表明福氏2a痢疾桿菌LPS經(jīng)脫毒得到LPS中不含類脂A部分。
B.蛋白質(zhì)含量的測定用牛血清白蛋白為標準蛋白，系列稀釋，具體操作見BCA法試劑盒(購自碧云天)，然后做標準曲線，測出LPS提取物560nm的OD值，從標準曲線找出其蛋白含量。結(jié)果蛋白含量為0.028mg/mL。
C.糖含量的測定①標準曲線的繪制分別取100mg/L葡萄糖溶液0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mL，用蒸餾水補足到1mL，再加入3mL蒽酮試劑，迅速浸入冰水中冷卻，待每只試管均加完后，一起浸入沸水浴中維持10min，取出，用自來水沖冷，室溫下平衡約10min，用分光光度測定620nm的OD值，然后用重蒸水為空白進行比色，繪制標準曲線；②測定LPS糖含量取1mL提取的LPS加入3mL蒽酮試劑(稱取蒽酮溶于濃硫酸(AR95-98％)，使其終濃度為2g/L)，迅速浸入冰水中冷卻，然后浸入沸水浴中維持10min，取出用自來水沖冷，室溫下平衡約10min，再用測定620nm的OD值，用重蒸水為空白進行比色，然后根據(jù)標準曲線中得到糖含量。結(jié)果糖含量為0.484mg/ml，符合標準。
D.核酸含量測定取一定量的LPS用紫外分光光度儀測定在260nm和280nm波長處吸光度，根據(jù)DNA濃度＝OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000(μg/ul)RNA濃度＝OD280×稀釋倍數(shù)×40/1000(μg/ul)計算核酸含量。結(jié)果核酸含量為0.846％，核酸含量低于1％，符合標準。
E.異常毒性試驗取Balb/c小鼠10只，體重18-22g，分兩組，每組5只，分別腹腔注射0.5m含1mg、2mg的LPS，注射前稱取每只小鼠體重，觀察7天。結(jié)果小鼠觀察期間全部健存，無異常反應，觀察結(jié)束時每只小鼠體重增加，合格。
上述檢測結(jié)果表明所提取的LPS符合標準，可作為佐劑使用。
二、蛋白體(Proteosome)的提取和純化1、腦膜炎球菌的培養(yǎng)按常規(guī)方法對腦膜炎奈瑟氏菌B群2b型腦膜炎球菌(購于中國藥品生物制品檢定所，菌號29353)進行復蘇、接種和培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中和殺菌前取樣進行純菌試驗，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應廢棄。培養(yǎng)物于對數(shù)生長期后或靜止期前期收獲。將培養(yǎng)物加入苯酚殺菌，以確保殺菌安全并不損傷菌體蛋白體為宜。
2、外膜蛋白復合物的制備取培養(yǎng)菌液，用0.5％的苯酚滅活2小時，8000rpm離心20min收集菌體，懸浮用0.15M NaCl，8000rpm離心20min，棄上清；將菌體用1V(相同菌體體積)的1M的乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)和9V的6％Empigen BB(EBB)的1M的CaCl2懸浮，加入乙醇使終濃度為20％，在室溫攪拌1h。12000rpm離心10min，棄沉淀。在上清中加入乙醇終濃度為45％，12000rpm離心10min，收集沉淀。溶解在1％E的TEEN(0.15M的NaCl，0.01M的EDTA，0.05M的Tris·HCl，pH 8.0)中，12000rpm離心10min，棄去不溶的物質(zhì)，得到外膜蛋白復合物。
3、外膜蛋白的純化將外膜蛋白復合物溶解在1％EBB的TEEN，短暫超聲，12000rpm離心20min，棄沉淀，再重復上述步驟一次，加入50％硫酸銨，攪拌混勻，直到完全溶解，室溫放置1h，然后12000rpm離心20min，將沉淀溶解在1％EBB的TEEN中(1-2mg/mL)，用20V的含0.1％EBB的TEEN透析，換4次液，除去硫酸銨，15000rpm離心20min，將上清依次用孔徑為0.45um、0.22um的濾膜過濾，再用0.22um的濾膜在無菌條件下過濾，-70℃儲存。
4、外膜蛋白鑒定對步驟3純化的蛋白體進行下述鑒定1)HPLC和非還原SDS-PAGE鑒定，結(jié)果純度大于90％；2)電鏡觀察或掃描大小為60-300nm的球形囊泡；3)核酸含量檢測，結(jié)果含量低于1％；4)用微量測磷含量的方法檢測莢膜多糖的含量，結(jié)果低于1％；5)異常毒性試驗，結(jié)果該蛋白無毒，安全性較高；6)穩(wěn)定性檢測，各取4份濃度為2.0mg/mL的蛋白體，分別放置在-70℃、-20℃、4℃和25℃4種溫度條件下，分別在1周、2周、4周和8周取一定量，檢測蛋白體的濃度，用SDS-PAGE檢測純度變化，結(jié)果4種條件下不同時間檢測蛋白體的穩(wěn)定性在量和性上都沒有變化；7)蛋白體組分鑒定，將蛋白體進行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍染色，從膠上切取蛋白體的三條帶，用胰蛋白酶酶切，待測定的蛋白質(zhì)樣品送國家生物醫(yī)學分析中心經(jīng)MALDI-TOF-MS，使用Matrixscience-Macot數(shù)據(jù)庫搜索，進行蛋白體組分的定性鑒定，結(jié)果證明，這三個蛋白分別是腦膜炎B群2b型奈瑟氏雙球菌外膜蛋白的PorA、PorB和Class 4孔道膜蛋白。上述檢測結(jié)果表明用上述方法獲得的蛋白體符合標準，可作為佐劑使用。
三、粘膜佐劑Protollin的制備將去毒的LPS溶于TEEN緩沖液中，無菌過濾除菌，將LPS溶液與等量的蛋白體混合，加入4倍體積的冷無水乙醇，沉淀混合物，收集沉淀，再用無水乙醇洗3次，最后用無菌蒸餾水溶解，用超聲儀溫和超聲，使蛋白體與LPS相互結(jié)合和溶解，將可溶的溶液10000rpm離心10min，去除不可溶的物質(zhì)，得到粘膜佐劑，命名為Protollin。
四、粘膜佐劑Protollin及F1-V的免疫效果檢測動物8-10周齡的雌性BALB/c小鼠。
免疫方案分四組，具體免疫方案見表3(將F1-V重組蛋白與佐劑按4∶1在4℃下疏水混合)。
表3 Protollin佐劑疫苗滴鼻免疫方案

1、小鼠血清總IgG水平的檢測用proteosome，LPS和Protollin與F1-V重組蛋白制備的粘膜疫苗滴鼻免疫后不同時間各組小鼠的血清特異性抗體的變化如圖9所示(橫坐標為免疫時間，縱坐標為抗體效價)，F(xiàn)1-V組、proteosome組和Protollin組血清IgG抗體水平隨時間變化顯著增強，而且proteosome組和新型佐劑組顯著高于F1-V組(P＜0.01)，Protollin佐劑組顯著高于proteosome組(P＜0.01)，LPS組血清IgG抗體水平隨時間變化血清特異性抗體無顯著差異，表明Protollin佐劑比proteosome佐劑更顯著提高鼠疫F1-V重組蛋白粘膜疫苗的系統(tǒng)免疫應答。
2、抗體亞型分類用proteosome，LPS和Protollin與F1-V重組蛋白制備的粘膜疫苗第四次免疫后采集血清進行抗體亞類分析，各佐劑疫苗組小鼠的IgG1和IgG2a水平的檢測結(jié)果如圖10A所示，各佐劑疫苗組小鼠的IgG1水平顯著高于IgG2a水平，說明粘膜疫苗組小鼠的特異性抗體是以IgG1為主，趨向Th2型反應。各佐劑疫苗組小鼠的IgG1/IgG2a的統(tǒng)計結(jié)果如圖10B所示，proteosome，LPS和Protollin佐劑疫苗組IgG1/IgG2a顯著低于F1-V組，說明proteosome，LPS和Protollin佐劑疫苗組產(chǎn)生的IgG1抗體水平顯著低于F1-V抗原組。
3、小鼠血清IgA和呼吸道、消化道、生殖道特異性sIgA的測定用proteosome，LPS和Protollin佐劑與鼠疫F1-V重組蛋白制備的粘膜疫苗滴鼻第四次免疫后，粘膜抗體水平檢測結(jié)果見表4，粘膜疫苗組中Proteosome佐劑組和Protollin佐劑組小鼠能產(chǎn)生較高的血清IgA，而且顯著高于F1-V組(P＜0.01)。Proteosome佐劑組和Protollin佐劑組肺沖洗液和陰道沖洗液中產(chǎn)生較高的IgA抗體，顯著高于F1-V組。在鼻咽喉沖洗液中和小腸沖洗液中沒有檢測到IgA，與F1-V組無顯著差異(P＞0.01)。上述檢測結(jié)果表明，Protollin佐劑與Proteosome佐劑作用相同，可使鼠疫F1-V重組蛋白抗原誘導呼吸道和生殖道粘膜分泌型IgA抗體，可使疫苗有效誘導局部免疫應答。
表4 鼠疫F1-V重組蛋白粘膜疫苗滴鼻免疫4次后粘膜IgA的抗體變化


*P＜0.01，和F1-V抗原組比較4、淋巴細胞亞群分析采用細胞表面的不同抗原分子熒光標記抗體，對用proteosome、LPS和Protollin佐劑與鼠疫F1-V重組蛋白制備的粘膜疫苗免疫組小鼠SP中的淋巴細胞亞群進行染色分析，結(jié)果見表5，在SP中LPS和Protollin佐劑疫苗組CD4+、CD8+細胞及CD4+/CD8+比PBS對照組顯著降低(P＜0.01)，而F1-V組比PBS對照組顯著升高，說明單獨滴鼻免疫F1-V蛋白會引起脾臟中CD4+細胞顯著增加，免疫應答趨向Th2型反應；但是加有LPS和Protollin佐劑的疫苗組，脾臟中的CD8+細胞會相對升高，表明LPS和Protollin佐劑能使疫苗增強機體的細胞免疫水平。
表5 鼠疫F1-V重組蛋白疫苗滴鼻免疫4次后T細胞表型變化

5、小鼠脾臟淋巴細胞增殖試驗對用proteosome，LPS和Protollin佐劑與鼠疫F1-V重組蛋白制備的粘膜疫苗用MTT法進行小鼠脾臟淋巴細胞增殖試驗，免疫組小鼠以ConA+組與ConA-組的A570值的比值(即為刺激指數(shù)SI)表示淋巴細胞的增殖能力。檢測結(jié)果見表6，表明用proteosome，LPS和Protollin佐劑與鼠疫F1-V重組蛋白制備的粘膜疫苗對小鼠脾細胞在體外有促進生長和增殖能力。
表6 ConA刺激的鼠疫F1-V重組蛋白疫苗免疫小鼠脾細胞增殖(A570值)

實施例5、F1-V鼠疫疫苗粘膜佐劑的篩選試驗將CTB佐劑的F1-V鼠疫疫苗、可生物降解F1-V鼠疫微球疫苗和蛋白體F1-V鼠疫疫苗及蛋白體聯(lián)合CTB佐劑的F1-V鼠疫疫苗進行動物試驗，以檢測各佐劑的免疫保護效果。取Balb/C小鼠60只，隨即分為6組，每組10只，免疫分組及其免疫方案見表5，免疫方法將小鼠乙醚輕度麻醉后，通過鼻腔吸入不同粘膜佐劑的上述F1-V鼠疫疫苗，以PBS為對照組，免疫后14天加強免疫一次，共免疫三次。結(jié)果如表7所示，氫氧化鋁佐劑組、蛋白體組、蛋白體/CTB聯(lián)合組可至少對200LD50耶爾森氏菌141強毒株的皮下攻毒產(chǎn)生100％的保護；CTB同樣條件下的保護率僅為60％，而可生物降解鼠疫微球疫苗組則只有40％，PBS對照組小鼠全部死亡。這說明，蛋白體是一種很好的鼠疫黏膜疫苗佐劑。
表7 鼠疫F1-V疫苗粘膜佐劑篩選試驗的分組及其免疫劑量

實施例6、強毒鼠疫菌攻毒試驗檢測不同劑量的F1-V對受強毒鼠疫菌攻擊小鼠的免疫保護作用，試驗分注射攻毒試驗和氣溶膠攻毒試驗，實驗F1-V劑量分別為10、20、50μg具體試驗方法如下一、注射攻毒試驗對免疫后的小鼠2周內(nèi)用鼠疫耶爾森氏菌141強毒株(保存于中國疾病預防控制中心)進行皮下攻毒，攻毒劑量為25-600LD50。記錄小鼠死亡時間。
實驗組和對照組小鼠在末次免疫兩周后用鼠疫耶爾森氏菌141強毒株進行皮下攻毒實驗，觀察60天以上，記錄小鼠存活情況，并計算平均死亡時間(MTD)。存活率統(tǒng)計結(jié)果如圖11所示，50μg劑量組的小鼠相對其它兩個劑量組的小鼠對鼠疫強毒株的皮下攻毒有更好的保護性。20μg的劑量足以使小鼠對400LD50的鼠疫耶爾森氏菌141強毒株產(chǎn)生完全的保護，這表明，結(jié)合經(jīng)濟性和有效性，20μg劑量是最合適的。10μg的劑量只能對100LD50的鼠疫耶爾森氏菌141強毒株產(chǎn)生100％的保護，當攻毒劑量升高時，這個劑量產(chǎn)生的保護率急劇下降，然而，與對照組相比，皮下攻毒后的平均死亡時間被顯著的延遲。比如，在200LD50的攻毒劑量下，10μg劑量的小鼠平均死亡時間為13.6±0.4，而PBS對照組則為3.6±0.6。實驗結(jié)果表明本發(fā)明的融合蛋白F1-V對受強毒鼠疫菌皮下攻擊小鼠(腺鼠疫模型)具有較好的免疫保護作用。
二、氣溶膠攻毒試驗試驗分5組F1-V組，F(xiàn)1組，V組，F(xiàn)1+V組和對照組。先對小鼠按組別接種上述不同蛋白，接種量為20ug/只，免疫后14天加強免疫一次，共免疫4次，對照組不接種，對免疫后的小鼠2周內(nèi)用鼠疫耶爾森氏菌141強毒株進行皮下攻毒，攻毒劑量為400LD50，觀察25天內(nèi)動物死亡情況。結(jié)果經(jīng)四次免疫后，抗原接種組接受高達400LD50強毒鼠疫菌攻擊小鼠的健康狀況良好，體重正常增加，注射部位無脫毛、硬結(jié)等異常表現(xiàn)，而對照組10只小鼠在6-16天內(nèi)相繼死亡，實驗組數(shù)據(jù)結(jié)果見表8，該實驗結(jié)果進一步證明本發(fā)明的融合蛋白F1-V對受強毒鼠疫菌氣溶膠攻擊小鼠(肺鼠疫模型)具有較好的免疫保護作用。
表8 氣溶膠攻毒試驗數(shù)據(jù)

序列表<160>3<210>1<211>478<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Ala Asp Leu Thr Ala Ser Thr Thr Ala Thr Ala Thr Leu Val Glu1 5 10 15Pro Ala Arg Ile Thr Leu Thr Tyr Lys Glu Gly Ala Pro Ile Thr Ile20 25 30Met Asp Asn Gly Asn Ile Asp Thr Glu Leu Leu Val Gly Thr Leu Thr35 40 45Leu Gly Gly Tyr Lys Thr Gly Thr Thr Ser Thr Ser Val Asn Phe Thr50 55 60Asp Ala Ala Gly Asp Pro Met Tyr Leu Thr Phe Thr Ser Gln Asp Gly65 70 75 80Asn Asn His Gln Phe Thr Thr Lys Val Ile Gly Lys Asp Ser Arg Asp85 90 95Phe Asp Ile Ser Pro Lys Val Asn Gly Glu Asn Leu Val Gly Asp Asp100 105 110Val Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp Phe Phe Val Arg Ser Ile Gly115 120 125Ser Lys Gly Gly Lys Leu Ala Ala Gly Lys Tyr Thr Asp Ala Val Thr130 135 140Val Thr Val Ser Asn Gln Glu Phe Met Ile Arg Ala Tyr Glu Gln Asn145 150 155 160Pro Gln His Phe Ile Glu Asp Leu Glu Lys Val Arg Val Glu Gln Leu165 170 175Thr Gly His Gly Ser Ser Val Leu Glu Glu Leu Val Gln Leu Val Lys180 185 190Asp Lys Asn Ile Asp Ile Ser Ile Lys Tyr Asp Pro Arg Lys Asp Ser195 200 205Glu Val Phe Ala Asn Arg Val Ile Thr Asp Asp Ile Glu Leu Leu Lys210 215 220
Lys Ile Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Asp Ala Ile Leu Lys Gly Gly225 230 235 240His Tyr Asp Asn Gln Leu Gln Asn Gly Ile Lys Arg Val Lys Glu Phe245 250 255Leu Glu Ser Ser Pro Asn Thr Gln Trp Glu Leu Arg Ala Phe Met Ala260 265 270Val Met His Phe Ser Leu Thr Ala Asp Arg Ile Asp Asp Asp Ile Leu275 280 285Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala Arg Ser Lys290 295 300Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys Ile Tyr Ser305 310 315 320Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn Lys His Leu Ser Ser Ser Gly Thr Ile325 330 335Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn Leu Tyr Gly340 345 350Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr Lys Ile Leu355 360 365Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser Glu Lys Lys370 375 380Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys Arg Thr Gly385 390 395 400Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys Asp Asn Asn405 410 415Glu Leu Ser His Phe Ala Thr Thr Cys Ser Asp Lys Ser Arg Pro Leu420 425 430Asn Asp Leu Val Ser Gln Lys Thr Thr Gln Leu Ser Asp Ile Thr Ser435 440 445Arg Phe Asn Ser Ala Ile Glu Ala Leu Asn Arg PheIle Gln Lys Tyr450 455 460Asp Ser Val Met Gln Arg Leu Leu Asp Asp Thr Ser Gly Lys465 470 475<210>2<211>1437<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atggcagatt taactgcaag caccactgca acggcaactc ttgttgaacc agcccgcatc 60actcttacat ataaggaagg cgctccaatt acaattatgg acaatggaaa catcgataca120gaattacttg ttggtacgct tactcttggc ggctataaaa caggaaccac tagcacatct180gttaacttta cagatgccgc gggtgatccc atgtacttaa catttacttc tcaggatgga240aataaccacc aattcactac aaaagtgatt ggcaaggatt ctagagattt tgatatctct300cctaaggtaa acggtgagaa ccttgtgggg gatgacgtcg tcttggctac gggcagccag360gatttctttg ttcgctcaat tggttccaaa ggcggtaaac ttgcagcagg taaatacact420gatgctgtaa ccgtaaccgt atctaaccaa gaattcatga ttagagccta cgaacaaaac480ccacaacatt ttattgagga tctagaaaaa gttagggtgg aacaacttac tggtcatggt540tcttcagttt tagaagaatt ggttcagtta gtcaaagata aaaatataga tatttccatt600aaatatgatc ccagaaaaga ttcggaggtt tttgccaata gagtaattac tgatgatatc660gaattgctca agaaaatcct agcttatttt ctacccgagg atgccattct taaaggcggt720cattatgaca accaactgca aaatggcatc aagcgagtaa aagagttcct tgaatcatcg780ccgaatacac aatgggaatt gcgggcgttc atggcagtaa tgcatttctc tttaaccgcc840gatcgtatcg atgatgatat tttgaaagtg attgttgatt caatgaatca tcatggtgat900gcccgtagca agttgcgtga agaattagct gagcttaccg ccgaattaaa gatttattca960gttattcaag ccgaaattaa taagcatctg tctagtagtg gcaccataaa tatccatgat 1020aaatccatta atctcatgga taaaaattta tatggttata cagatgaaga gatttttaaa 1080gccagcgcag agtacaaaat tctcgagaaa atgcctcaaa ccaccattca ggtggatggg 1140agcgagaaaa aaatagtctc gataaaggac tttcttggaa gtgagaataa aagaaccggg 1200gcgttgggta atctgaaaaa ctcatactct tataataaag ataataatga attatctcac 1260tttgccacca cctgctcgga taagtccagg ccgctcaacg acttggttag ccaaaaaaca 1320actcagctgt ctgatattac atcacgtttt aattcagcta ttgaagcact gaaccgtttc 1380attcagaaat atgattcagt gatgcaacgt ctgctagatg acacgtctgg taaatga 1437<210>3<211>375<212>DNA<213>埃爾托霍亂弧菌<400>3atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt atagttttac tatcttcagc atatgcacat 60ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaagacc acaacacaca aatacatacg120ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc180attactttta agaatggtgc aacttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat240tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa300gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt360agtatggcaa attaa 37權(quán)利要求
1.激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在激發(fā)機體產(chǎn)生鼠疫免疫力中起重要作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌。
5.一種表達權(quán)利要求1所述的激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白的方法，是將含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白。
6.一種預防性鼠疫疫苗，其活性成分為權(quán)利要求1所述的融合蛋白或權(quán)利要求2所述的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于向所述疫苗中添加Al(OH)3、CTB、LPS和蛋白體中的一種或多種佐劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的疫苗，其特征在于所述佐劑為LPS和蛋白體的混合型佐劑，其制備方法為將去毒的LPS溶于TEEN緩沖液中，無菌過濾除菌，將LPS溶液與等量的蛋白體混合，加入3-5倍體積的冷無水乙醇，收集沉淀，用無水乙醇洗滌，最后用無菌蒸餾水溶解沉淀，超聲，去除不可溶的物質(zhì)，得到混合型佐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于所述LPS來源于減毒痢疾菌或減毒大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白及其編碼基因與應用。其目的是提供一種可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的融合蛋白及其編碼基因與其在制備鼠疫疫苗中的應用。該融合蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加可激發(fā)機體對鼠疫產(chǎn)生免疫力的蛋白質(zhì)。實驗證明，該融合蛋白可激發(fā)動物機體產(chǎn)生特異性抗體，對鼠疫菌具有較好的免疫保護效果，可用于鼠疫的預防和治療中。該融合蛋白穩(wěn)定、制備方法簡便易行，可應用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明在醫(yī)學領域具有重要的應用前景和實際意義。
文檔編號A61P31/00GK101062951SQ20071009914
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者王棟, 邢麗, 王希良 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所