專利名稱：一種從小球藻藻粉中提取純化葉黃素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種從小球藻藻粉中提取純化葉黃素的方 法，在采用小球藻生產(chǎn)重要生命活性物質(zhì)葉黃素方面具有重要的應(yīng)用價值和前景。
技術(shù)背景葉黃素屬于一種不對稱的二羥基類胡蘿卜素，是人眼視網(wǎng)膜中黃斑色素的主要組成 成分。目前研究發(fā)現(xiàn)葉黃素主要有以下三個方面的醫(yī)藥價值1)防止老年人視黃斑退 化；2)具有抗癌作用；3)對心腦血管疾病有防治作用。另外，葉黃素作為高價值的純 天然色素，可以廣泛應(yīng)用于食品著色、化^(品和醫(yī)藥等行業(yè)中。目前葉黃素的價格與黃 金價格基本相當(dāng)，有食物黃金的美稱，其國內(nèi)市場年需求達10萬噸，但生產(chǎn)量僅6千 噸，遠遠滿足不了國內(nèi)外市場的需要，因此具有廣闊的市場潛力。目前，葉黃素的化學(xué)合成技術(shù)尚未取得成功，因此只能主要從萬壽菊等植物中提取 提純得到。葉黃素生產(chǎn)工藝是首先將萬壽菊青貯、壓搾、干燥制粒，然后采用正己烷提 取和蒸餾后獲得。因為萬壽菊生長緩慢，因此研究生長速度快和葉黃素含量高的其它生物物種來取代萬壽菊作為生產(chǎn)葉黃素的生物資源已經(jīng)成為一個非常重要的研究課題。我 們研究發(fā)現(xiàn)小球藻細胞中葉黃素含量基本與萬壽菊中的葉黃素含量相當(dāng)，特別是我們采 用異養(yǎng)發(fā)酵方法培養(yǎng)超高細胞濃度小球藻的技術(shù)已經(jīng)成熟，可以快速培養(yǎng)出大量的小球 藻生物量。因此采用小球藻作為一種生產(chǎn)葉黃素的生物資源以替代萬壽菊是完全可能 的。國內(nèi)外學(xué)者在從萬壽菊中提取葉黃素的優(yōu)化控制方法方面進行了大量的研究，但在 從小球藻中如何高效提取并純化葉黃素方面的研究報道卻不多見。小球藻中的葉黃素經(jīng) 過有機溶劑的萃取后，大部分是以酯類性形式存在的。由于葉黃素的水溶性非常差，葉 黃素酯類衍生物不能被人體直接吸收代謝，不能發(fā)揮藥用價值，葉黃素酯在人體內(nèi)酶的 作用下，水解為游離態(tài)葉黃素，繼而被吸收參與代謝。該方面的轉(zhuǎn)化研究集中于將葉黃 素酯置于堿性環(huán)境中，通過皂化反應(yīng)得到游離態(tài)葉黃素。目前，主要的皂化方法有兩種， 一種是冷皂化，即在提取的葉黃素酯中按照預(yù)定比例加入堿溶液，攪拌后反應(yīng)過夜。另 一種是熱皂化，與冷皂化不同的地方是對加入堿液后的混合溶液加熱直至反應(yīng)結(jié)束。常 用皂化劑為40%氫氧化鉀甲醇溶液或飽和的氫氧化鈉溶液。經(jīng)皂化后，得到的皂化品中仍存在著部分酯溶性雜質(zhì)，因此還要做進一步純化處理。在成功篩選出能夠異養(yǎng)生長小球藻種并通過優(yōu)化培養(yǎng)控制獲得超高細胞濃度小球藻 的基礎(chǔ)上，我們在選擇冷皂化、熱皂化和最佳皂化條件從小球藻藻粉中提取純化葉黃素方面進行了比較系統(tǒng)和全面的研究，發(fā)現(xiàn)采用熱皂化利用20%的氫氧化鈉水溶液可以從 藻粉中高效地將葉黃素酯轉(zhuǎn)化為葉黃素，這為進一步采用小球藻生產(chǎn)葉黃素奠定了非常 重要的基礎(chǔ)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從小球藻藻粉中提取純化葉黃素的方法，采用一種小分子量的極性有機溶劑乙醇和一種非極性試劑正己垸進行混合作為提取劑，20%氫氧化鈉 溶液作為皂化劑，通過進一步純化處理，可以高效地將小球藻藻粉中葉黃素酯類轉(zhuǎn)化 為葉黃素,提取量達到3.2mg/g。實現(xiàn)了從小球藻細胞中高效地將葉黃素酯轉(zhuǎn)化為葉黃素 的皂化工藝。為采用異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)葉黃素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明先利用混合試劑進行葉黃素及其酯類的提取，然后用5 30%的氫氧化鈉進 行皂化，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，洗滌，結(jié)晶后獲得較高純度葉黃素晶體。從小球藻藻粉中提取葉黃 素工藝為稱取0.2 2 g藻粉放入50 500 ml離心管中，加入8.0 80.0ml混合液 體溶劑進行提取，溫度為10 4(TC，時間為0.5 2小時。皂化工藝為向加入混合提 取劑的試管中加入10 100 ml的5~30%氫氧化鈉水溶液，30 7(TC皂化3 8小時， 低溫離心5 10分鐘，有機相中獲得從藻粉中提取出的葉黃素。本發(fā)明所述的混合液體溶劑為極性溶劑乙醇，非極性溶劑正己烷；二者溶劑中的碳 原子和氧原子比值20: 1。1、不同皂化劑對小球藻藻粉中葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果向50 500ml離心管中加 入0.2 2g藻粉，在加入混合提取劑提取后，分別向離心管中加入10 100ml的5 30%氧氧化鈉溶液、氫氧化鈉-水-乙醇溶液或氫氧化鈉-水-甲醇溶液，30 7CTC皂化3~ 8小時，提取溶劑上清液直接在高壓液相色譜上測定葉黃素濃度，以確定不同皂化劑對 藻粉中葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果。研究結(jié)果顯示，在測試的不同溶劑中，氫氧化鈉溶液作為 皂化劑時上層有機相中的葉黃素濃度最高，皂化效果最好。2皂化劑濃度對小球藻藻粉中葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果確定了皂化劑后，采用同樣的 方法，分別測試5%、 10%、 20%、 30%、 40%的氫氧化鈉溶液的皂化效果。綜合實驗 效果和成本，我們認(rèn)為采用20%氫氧化鈉溶液進行皂化比較合適。3皂化溫度對小球藻藻粉中葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果采用同樣的方法，分別對25'C、5crc、 7crc、 8crc下葉黃素酯的轉(zhuǎn)化效果進行了比較。隨著溫度升高有利于葉黃素脂的轉(zhuǎn)化，但溫度進一步升高會造成游離的葉黃素的分解，測試結(jié)果顯示50 6(TC時葉黃素酯的轉(zhuǎn)化效果最好，測定的上層有機相中葉黃素濃度最高。4皂化時間對小球藻藻粉中葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果采用同樣的方法分別測試2h、 4 h、 6h、 8h、 10h的皂化效果。因為時間短使葉黃素酯的皂化不徹底，而時間過長葉 黃素本身具有易被氧化和不穩(wěn)定的特性使得其含量下降，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6小時為最合適的皂化時間。工作原理皂化反應(yīng)可以使葉黃素酯水解為游離的葉黃素，是因為酯在堿性條件下水解，生成 醇和一種脂肪酸鹽。隨著堿溶液氫氧化鈉濃度的增高，葉黃素的量不斷增加并在某一濃 度時葉黃素的量達到最高，但之后葉黃素的量開始下降下降。其原因是在一定濃度氫氧 化鈉下，可以使葉黃素酯發(fā)生水解，脂肪酸甘油配基及游離脂肪酸被除去，有利于轉(zhuǎn)化 為葉黃素。但堿的濃度過高會增加葉黃素的不穩(wěn)定性，因為當(dāng)脂肪酸配基被皂化后，葉 黃素失去保護而被強堿破壞，容易發(fā)生降解。對于溫度，在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高有利于葉黃素脂的轉(zhuǎn)化，但溫度進一步升高會造成游離的葉黃素的分解，因此5(rc為比較 適宜的皂化溫度。時間短葉黃素皂化不徹底，時間長葉黃素量反而下降。這是因為在常溫下葉黃素主要以反式結(jié)構(gòu)存在，在受熱、光照及化學(xué)作用下約有7%的葉黃素由反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為順式結(jié)構(gòu)，而起活性作用的主要是反式結(jié)構(gòu)。如果在較高的溫度下皂化時間 過長，會有較多的葉黃素由反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為順式結(jié)構(gòu)，從而影響葉黃素的質(zhì)量，降低其 抗氧化活性和抗癌效果。 本發(fā)明的優(yōu)點由于葉黃素在小球藻內(nèi)大部分以酯的形式存在，通過皂化反應(yīng)將大部分葉黃素酯轉(zhuǎn) 化為游離地葉黃素，可以從小球藻細胞中更有效提取出葉黃素，確定了從小球藻細 胞中高效提取出葉黃素最佳皂化工藝，在采用小球藻生產(chǎn)葉黃素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方 面具有重要的價值。


圖1為本發(fā)明采用不同皂化溶劑時小球藻中葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果。橫坐標(biāo)為皂化溶劑種類，縱坐標(biāo)為皂化后上層有機相中的葉黃素濃度mg/L。圖中顯示，在測試的皂化 劑中，氫氧化鈉溶液作為皂化劑時上層有機相中的葉黃素濃度最高，葉黃素酯的轉(zhuǎn)化效 果最好。圖2為本發(fā)明采用不同皂化劑濃度時小球藻葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果。橫坐標(biāo)為皂化劑 濃度，縱坐標(biāo)為皂化后上層有機相中的葉黃素濃度mg/L。圖中顯示，在測試的不同皂 化劑濃度時，氫氧化鈉溶液濃度為20%時上層有機相中的葉黃素濃度最高，葉黃素酯的 轉(zhuǎn)化效果最好。圖3為本發(fā)明采用不同溫度時小球藻中葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果。橫坐標(biāo)為不同的溫度， 縱坐標(biāo)為化后上層有機相中的葉黃素濃度mg/L。圖中顯示，5CTC時葉黃素酯的轉(zhuǎn)化效 果最好。圖4本發(fā)明采用為不同皂化時間時。小球藻中葉黃素酯轉(zhuǎn)化的效果。橫坐標(biāo)為不同 的皂化時間，縱坐標(biāo)為化后上層有機相中的葉黃素濃度mg/L。圖中顯示葉黃素酯的轉(zhuǎn) 化率在1h到6 h內(nèi)呈上升趨勢并在6 h達到最大，但6 h后隨時間的延長葉黃素的量 逐漸下降，因此6h為最合適的皂化時間。
具體實施方式
1、小球藻藻粉實驗材料本發(fā)明實驗所用藻種為一株我們自己篩選的能夠無光照異養(yǎng)生長的小球藻-USTB01 (C/7/0A"e//a sp)， cgmcc N。1448，保藏日期2005年8
月25日。經(jīng)過2天的異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的小球藻經(jīng)噴霧干燥獲得藻粉。2、從小球藻藻粉中提取葉黃素:在離心管中加入0.2g藻粉和混合提取試劑8 ml, 室溫下靜置1小時。3、葉黃素酯的轉(zhuǎn)化向提取后的離心管中，加入20%的氫氧化鈉，50'C進行皂 化6小時，結(jié)束后取上層有機相進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溫度43'C，時間8分鐘。用正己烷溶 解附于瓶壁上的葉黃素，放到-8'C冰箱結(jié)晶過夜，即得到純度較高的葉黃素。4、提取劑中的葉黃素測定采用HPLC測定葉黃素的濃度，測定的條件是:高效液 相色譜(HPLC)儀(島津LC-10ATvp泵，SPD-M10Avp 二極管陣列檢測器)，Zorbax SB-C18 (4.6mmx25cm)分離柱，流動相是乙腈-甲醇-乙酸乙酯(45:10:45)，流速為1 mL.min-1，進樣量20iJL，檢測波長:474nm。實驗中根據(jù)測定樣品的峰高代入建立的葉 黃素峰高(y)與葉黃素濃度(x)的一元線性回歸方程(y-4.0408x-0.8169， R2=0.9987)， 即可計算出葉黃素的濃度。5、采用小球藻生產(chǎn)葉黃素采用極性溶劑乙醇與非極性溶劑正己烷按照碳原子與 氧原子比為20: 1混合作為提取溶劑，20%氫氧化鈉溶液作為皂化劑，5(TC皂化6小時， 皂化劑用量與藻粉的比為(v:w 10:1)可以高效地將小球藻藻粉中的葉黃素酯轉(zhuǎn)化為葉 黃素，為采用小球藻生產(chǎn)葉黃素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了非常重要的基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用 價值。
權(quán)利要求
1、一種從小球藻藻粉中提取純化葉黃素的方法，其特征在于先利用混合試劑進行葉黃素及其酯類的提取，然后用5～20％的氫氧化鈉進行皂化，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，洗滌，結(jié)晶后獲得較高純度葉黃素晶體；從小球藻藻粉中提取葉黃素工藝為稱取0.2～2g藻粉放入50～500ml離心管中，加入8.0～80.0ml混合液體溶劑進行提取，溫度為10～40℃，時間為0.5～2小時；皂化工藝為向加入混合提取劑的試管中加入10～100ml的5～30％氫氧化鈉水溶液，30～70℃皂化3～8小時，離心5～10分鐘，有機相中獲得從藻粉中提取出的葉黃素。
2、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合液體溶劑為 極性溶劑乙醇，非極性溶劑正己垸；二者溶劑中的碳原子和氧原子比值SO.-
全文摘要
一種從小球藻細胞中提取純化葉黃素的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。先利用混合試劑進行葉黃素及其酯類的提取，然后用5～20％的氫氧化鈉進行皂化，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，洗滌，結(jié)晶后獲得較高純度葉黃素晶體；從小球藻藻粉中提取葉黃素工藝為稱取0.2～2g藻粉放入50～500ml離心管中，加入8.0～80.0ml混合液體溶劑進行提取，溫度為10～40℃，時間為0.5～2小時；皂化工藝為向加入混合提取劑的試管中加入10～100ml的5％～30％氫氧化鈉水溶液，30～70℃皂化3～8小時，低溫離心5～10分鐘，有機相中獲得從藻粉中提取出的葉黃素。優(yōu)點在于，確定了從小球藻細胞中高效提取出葉黃素最佳皂化工藝。
文檔編號A61K36/02GK101130513SQ200710120740
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日
發(fā)明者碩 劉, 賓 張, 張明忠, 許倩倩, 海 閆, 鋼 陸 申請人:北京科技大學(xué);北京科大方興科技孵化器有限責(zé)任公司