專利名稱：：一種刺五加的有效組分及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療腫瘤疾病的中藥提取物,具體地說(shuō)涉及從刺五加中提取的有效組分，制劑及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
：腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。目前業(yè)內(nèi)對(duì)惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學(xué)抗癌藥物在作用于靶細(xì)胞時(shí)往往累及正常細(xì)胞，造成嚴(yán)重的副反應(yīng)。植物藥的逮傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，而且中藥在對(duì)腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現(xiàn)已開發(fā)為擾腫瘤藥物，目前我國(guó)危害性最為嚴(yán)重的腫癯為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸痛、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等，特別是肝癌的發(fā)生率近年來(lái)有所增加，值得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)及其防治，均為我國(guó)腫瘤研究的重點(diǎn)。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當(dāng)前胂瘤研究的重要內(nèi)容。我國(guó)藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化學(xué)物，開發(fā)新藥的天然寶庫(kù)。目前，我國(guó)從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開發(fā)成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開發(fā)成具有抗腫癍療效的新藥，具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊發(fā)展前景。刺五加,別名五加皮、刺拐棒。其化學(xué)成分為含剌五加武(eleutherosideA,B，c,D，E,P,G)和多糖等，其性味為性溫，味辛、微苦-其功能主治為-益氣健脾，補(bǔ)腎安神。用于脾腎陽(yáng)虛、體虛乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多夢(mèng)
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的在于提供一種刺五加的有效組分。本發(fā)明的另一目的在于提供上述刺五加有效組分的制備方法。本發(fā)明還提供含有上述刺五加有效組分的制劑及該組分的用途。本發(fā)明的刺五加有效組分，其制備過(guò)程包括以下步驟-步驟l:用S酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)刺五加進(jìn)行提取，步驟2:提取液經(jīng)過(guò)色譜柱層析得洗脫液歩驟3:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集28.0~32.0分鐘洗脫液得到有效組分(或稱為C07)a其中步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5,優(yōu)選為乙酸ZJI:乙醇-1-2:1-2,最優(yōu)選為乙酸乙酯乙醇-l:l。所述步驟中，步驟l具體為取刺五加藥材，以乙酸乙酯:乙醇=卜5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l，步驟2具體為將提取物l過(guò)正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯-47-53:l作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇8-13:l作為流動(dòng)相，得洗脫液，步驟3具體為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動(dòng)相為水-A和乙腈-B,進(jìn)行梯度洗脫，流速為9-11ml/rain,柱溫為室溫，收集28.0-32.0分鐘洗脫液得到有效組分。步驟3中所述梯度洗脫程序如下表1洗脫梯度表Time(min)_Af/o)_B(%)48020195050605956459S流速為10ml/ndn，柱溫為室溫；樣品用100i乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段28.0-32.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明優(yōu)選的刺五加有效組分制備方法，包括下列歩驟將刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.8-1.2),加熱回流0.8-1.2小時(shí)，提取1-3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸裔，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47-53:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(8-13:l)作為流動(dòng)相，得洗脫液II,將洗脫液n濃縮千燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品制備色譜的分離條件:色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9-llml/niin,柱溫為室溫，本發(fā)明最優(yōu)選的刺五加有效組分制備方法，包括下列步驟將刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l),加熱回流l小時(shí)，提取2次，合并濾液得提取液:將提取液濃縮成浸裔，并將其與桂膠迸行拌樣，用正相掛膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸S酯(50:1)作為流動(dòng)相，得洗脫碰I,棄之，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品:制備色譜的分離條件:色譜柱為制備柱(ZorbaxSB-C18:21.2咖x250咖)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序如下-Time(min)_A(%)_B(%)480201950506059564595流速為10ml/ndn,柱溫為室溫樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段28.0-32.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明28.0-32.0分鐘收集的有效組分成分如下表表2成分表組分Rt(鵬in)含雖A4站化合物結(jié)構(gòu)式C0716.125-鄉(xiāng)474鄰inog6ninC6本發(fā)明還提供用本發(fā)明的中藥有效組分作為藥物活性成分制備成的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物，包括有效組分，根據(jù)需要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，是單位劑量的藥物制劑形式，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠蹇的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。本發(fā)明的組合物其中的有效組分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.1-99.9%,其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，通過(guò)將上述有效組分和藥物可接受的載體混合制備得到。本發(fā)明的組合物,其藥物制劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟裔劑、硬#劑、霜?jiǎng)?、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制劑，優(yōu)選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、裔劑等。本發(fā)明的組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤(rùn)劑，必要時(shí)可對(duì)片劑進(jìn)行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤(rùn)滑劑包括，例如硬脂酸鎂a適宜的藥物可接受的濕潤(rùn)劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^(guò)混合，填充，壓片等常用的方法制備畫體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合可使活性物質(zhì)分布在整個(gè)使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對(duì)于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無(wú)菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過(guò)將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過(guò)濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的組合物，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醉、山梨醇、焦亞琉酸鈉、亞硫酸氨鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱貧酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTAfl鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸辨、碳酸氨鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、0—環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸fl、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的組合物在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如1-20袋或粒或片。本發(fā)明還提供本發(fā)明的中藥有效組分和藥物組合物在抗腫瘤方面的應(yīng)用，以下為抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)-對(duì)28.032.0分鐘段組分的活性篩選，在細(xì)胞水平上檢測(cè)有效組分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。藥效鵬藥理模型HL60腫癯細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用RP礎(chǔ)■(Glbco)降加2g/L碳酸翁鈉〗亂胎牛血清(四季靑)10呢混合培養(yǎng)HL60細(xì)胞，密度儺低于106個(gè)/亂，計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcM，NnL-1xVT0tJ-2x1C4個(gè)/mL),其中VT-0.1m"孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量，吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10處，加胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4"04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min,10min),吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL,吹打，使細(xì)胞泡勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT7NxV1。在細(xì)胞槽中再加入W-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入150//1_,種板后選取4孔加入200/iL培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剰余孔加入200itiLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)a給藥方案刺五加C07有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mLa簾蕩溶解，若有大量液滴粘壁,可適當(dāng)離心,可儲(chǔ)存-20-C,在新的96孔板中加入22Q^U孔的培養(yǎng)液，將吸取0.8^1_藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入5Q/rf_，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終雌為50ng/mL,孵育幼h,每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法一加入200//L的培養(yǎng)液，將吸取0.8勤LDMSO加入混勻)，及陽(yáng)性對(duì)照組(順銷終濃度4/ig/mU,SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)衝體積)的三氯&酸(TCA)1加"固定細(xì)胞，室溫放置5min，4"冰箱中放置1h,培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA,在空氣中干燥后，每孔加0.4W的SRB100iiL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫卜'放踅20min,棄i各孔內(nèi)液體后裕1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTris150uL/孔溶解，振蕩5min,使用酶標(biāo)儀(ELx800》測(cè)定，所用波長(zhǎng)為4恥nm。抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％)-藥物^值一空白^^值"qqw陰性對(duì)照f(shuō)i^值一空白ffi^值藥效結(jié)果見表3,根據(jù)HL"60腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果，刺五加C07有效組分對(duì)抑制HL"60腫癯細(xì)胞增殖有非常顯著效果，表3,HL60腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>藥理模型H鄰G2腫癯細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM離糖飛(Gibco)添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%,胎牛血清(四季青)10%,非必霱氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)11鄰G2細(xì)胞，計(jì)算需要細(xì)胞總量NI^pcellinl^xVT0^2xl03個(gè)/mL),其中VIMUmLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量，吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10^L,加10-胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,W離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL^104x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積，離心(900rad/mta,ltoin),吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL,吹打，使細(xì)胞泡勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NTVNxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入咖&,鮮育24h,種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剰余孔加入l加pLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)，給藥方案剌五加G07有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重Jt,根據(jù)所稱量的藥品的重量,加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mgtoL。簾蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心,可儲(chǔ)存-20"C,96孔板換液,每孔加入,培養(yǎng)液150*,在新的鄰孔板中加入220~孔的培養(yǎng)液，將吸取0J8ML藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每L加入50/tL,此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)jl組(細(xì)胞中加入空A溶液，空白溶液配法~加入200mL的培養(yǎng)液，將吸取0.8%(LDMSO加入泡勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿霧素終濃度4pg/mL),MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液=10:1)1加mL,孵育4h,吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150^L的DMSO，振蕩10min,550nm酶標(biāo)儀(Elx8加)測(cè)定，抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>藥效結(jié)果見表4。根據(jù)H印G2腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果，剌五加C07有效組分對(duì)抑制H鄰G2腫癯細(xì)胞增殖有非常顯著效果，表4，H鄰G2腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g^L拔酸級(jí)鈉9(m,小牛血清(賽樂(lè))10%,非必霜?dú)饣?Gibco)1HM合培養(yǎng)K562細(xì)胞，計(jì)算霈要細(xì)胞總量NT-pcel!nnL-lxVT0^8xl03個(gè)AnL),其中VTMUmLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量，吹打培養(yǎng)瓶幾上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10mL,加10ML胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中v為離心前離心管中的溶液體積，離心(900rad/mto,10min),吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，毎孔加入100mL,孵育24h。種板后選取4孔加入培自作為空白對(duì)照，剩余孔加入100^LPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)，給藥方案刺五加C07有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解'濃度為約50mgtoL,簾蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心。可儲(chǔ)存-20^C,96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220ML/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88mL藥液加入泡勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔毎孔加入50ML,此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為5(^gtoL,孵育48h,每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200&的培養(yǎng)液，將吸取0.88mLDMSO加入泡勾)，陽(yáng)旨照組(阿毒素終濃度4/tg/mL),srb染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)影體積)的三氯&酸(TCA)70"L固定細(xì)胞，化冰箱中放置lh,培養(yǎng)板各孔用去離子水麟S遍，以去除TCA,在空氣中千燥后，每孔加0.4%的8旭100"(m色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍,去除未結(jié)合的染料，空氣中.干燥后用ltomol/LTrisl50ixU孔溶解，振蕩5min,使用稱標(biāo)儀(EI^800)測(cè)定，所用波長(zhǎng)為490ran,抑制率的計(jì)算抑制率按如卜'公式計(jì)算-(%)=藥物歸-空白隨嗎陰性對(duì)照^值一空白組^ft藥效結(jié)果見表5。根據(jù)K562腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果，刺5JiC07有效組分對(duì)抑制K562腫癯細(xì)胞增殖有非常顯著效果，表5，K562腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>藥理模荊KB腫癯細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)添加3.7g/L碳酸氣鈉190%,小牛血清(賽樂(lè))10%,非必霈氣基酸(Gibco)1效混合培養(yǎng)KB細(xì)胞，計(jì)算需要細(xì)胞總量NT^pcell，mL4xVT(^2xl03個(gè)/mL),其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10;tL,加10^L胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)鷹數(shù)N為NU4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積a離心(900rad/min,吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxV1,在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、泡勻，取該液，每孔加入100pL,孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入10CPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)，給藥方案刺五加C07有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約SOmgtoL,簾蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心，可儲(chǔ)存-訓(xùn)，96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150ML,在新的鄰孔板中加入220ML/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88^藥液加入混勻，稀釋2鄰倍，將上述##好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50mL,此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50/tgtoL,賻育4幼，每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)瓶組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法~~加入200疼的培養(yǎng)液，將吸取0.8雌LDMSO加入混勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素終濃度,g/mL),MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT泡合溶液(培養(yǎng)液-MTT溶液-l(h1)100-,孵育4h,吸棄培養(yǎng)液，毎孔加入150mL的DMSO，振蕩lOmio,550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測(cè)定，抑制率的i十算抑制率按如下公式計(jì)算(%)-藥物細(xì)值-舶鳊值x，陰性對(duì)照組/l值一空f(shuō)!組^值藥效結(jié)果見表6。根據(jù)KB腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，刺五加C07有效組分對(duì)抑制KB腫癯細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表6,KB腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>藥理模型MCF-7腫癯細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Qibco)添加3.7g/L碳酸氨鈉卯％,小牛血清(賽樂(lè))10%,非必霈貧基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，計(jì)算需要細(xì)胞總量,pcdlnnL4xVT&>=2xl03個(gè)AnL),其中VTM).lmLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量，吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10疼，加10^L胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)肌，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NU4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積，離心(900rad/min,lOmin),吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT—V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入1加ML,孵育24h,種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100/tLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)，給藥方案剌五加C07有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mgfaL,簾蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心，可儲(chǔ)存-200,96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150ML,在新的訴孔板中加入220ML/IL的培養(yǎng)液，將吸取0.88^藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50^L,此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50MgAnL,孵育4能，每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)明性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空A溶液，空內(nèi)溶液配^~~加入200mL的培養(yǎng)液，將吸取0.88mLDMSO加入混勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿毒素終濃度4jtg/mL),MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液slO:1)l加/iL,孵育4h,吸棄培養(yǎng)液，每孔加入ISO-的DMSO,振蕩Itota,550nm酶標(biāo)儀(Elx800》測(cè)定，抑制率的計(jì)貧抑制率按如卜'公式計(jì)算-藥物鎖值一空白&4值綱率(％)陰性對(duì)照綜值一空白ft4值翼100%藥效結(jié)果見表7。根據(jù)MCF-7腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果,刺五加C07有效組分對(duì)抑制MCF-7腫癯細(xì)胞增殖有非常顯著效果，表7,MCF-7腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發(fā)明的有益效果為-1.本發(fā)明的提取分離工藝中使用了正相硅膠柱，能有效地除去糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，提商有效成分的含量，同時(shí)采用了制備色譜，能快速準(zhǔn)確的得到有效成分。2.本發(fā)明提供的刺五加有效組分化學(xué)成分簡(jiǎn)單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機(jī)制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。本發(fā)明提供的方法首次從刺五加藥材中得到含有C05有效組分,并首次將其在多種腫瘤細(xì)胞株上進(jìn)行藥效篩選，由于成分確切，含量明確，制備工藝便捷，活性好，適宜開發(fā)成抗腫癯中藥新藥a圖1為本發(fā)明刺五加有效組分的HPLC分析圖。具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容,該實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而對(duì)本發(fā)明并沒(méi)有限制a實(shí)施例1刺五加有效組分的制備取刺五加藥材250g，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l),加熱回流l小時(shí)，提取2次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸裔得12.8g,將浸裔和硅膠拌樣，用正相硅膠柱進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(W:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II,濃縮干燥后得2.18樣品。用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品。制備色譜的分離條件色譜柱為Agient制備柱(ZorbaxSB-Cl():21.2mrax250ram),流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>流速為10ml/min，柱溫為室溫，樣品用10W乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段28.0-32.0分鐘收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分0.15g。實(shí)施例2刺五加有效組分的分析對(duì)實(shí)施例1的刺五加有效組分的HPLC-ELSD聯(lián)用分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6咖X150咖,5nm);采用梯度洗脫，流動(dòng)相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動(dòng)相B相為含0.2旨醋酸的乙腈溶液梯度洗脫程序如下-O分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為10%的0.2琳醋酸的乙腈溶液；IO分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為5(m的0.戰(zhàn)冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為5%的0.,醋酸水溶液、流動(dòng)相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL，irf、檢測(cè)波長(zhǎng)全波長(zhǎng)；柱溫30"C;ELSD漂移管溫度105C;氮?dú)饬魉?.0L/min供試品溶液的制備稱取本發(fā)明有效組分，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定。實(shí)施例3刺五加有效組分制劑取實(shí)施例1的剌五加有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-8TC液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實(shí)施例4刺五加有效組分制劑取實(shí)施例1的刺五加有效組分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml,上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。實(shí)施例5刺五加有效組分制劑取降香油1.5g,加入到13ml飽和的羥丙基0-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過(guò)，濾葉低溫干燥，的降香油和羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取實(shí)施例1的刺五加有效組分0.5g、甘露醇5.5g、依地酸銬鈉0.98和蒸餾水21111,上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實(shí)施例6刺五加有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l,條件改為乙酸乙酯和乙醇(1:5),正相硅膠柱分離,首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動(dòng)相，實(shí)施例7刺五加有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l,條件改為乙酸乙酯和乙醇(5:1),正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動(dòng)相。實(shí)施例8刺五加有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l,條件改為乙酸ZJ旨和乙醇(1:2)，正相掛膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動(dòng)相。實(shí)施例9刺五加有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l,條件改為乙酸乙酯和乙醇(2:1),正相硅膠柱分離,首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醉(13:1)作為流動(dòng)相。權(quán)利要求1、一種刺五加有效組分，其特征在于，其制備過(guò)程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)刺五加進(jìn)行提取，步驟2提取液經(jīng)過(guò)色譜柱層析得洗脫液；步驟3用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集28.0-32.0分鐘洗脫液得到有效組分。2、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇-l-5:l-5。3、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，歩驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇-l-2:l-2。4、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇-l:l。5、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，所述步驟中，步驟1為取刺五加藥材，以￡酸乙酯:乙=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l,步驟2為將提取物l過(guò)正相桂膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47~53:1作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇8~13:1作為流動(dòng)相，得洗脫液，歩驟3為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動(dòng)相為水-A和乙腈-B,進(jìn)行梯度洗脫。6、權(quán)利要求5的有效組分，其特征在于，所述梯度洗脫程序如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>流速為10ml/mto,柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段28.0-32.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。7、含有權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)有效組分的藥物組合物。8、權(quán)利要求1的有效組分的制備方法，其特征在于，其制備過(guò)程包括以下歩驟:歩驟l:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)刺五加進(jìn)行提取，步驟2:提取液經(jīng)過(guò)色譜柱層析得洗脫液；歩驟3:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液,流動(dòng)相為水和乙腈,收集28.0-32.0分鐘洗脫液得到有效組分。9、權(quán)利要求8的有效組分的制備方法，其特征在于，所述歩驟中，歩驟l為-取刺五加藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l,步驟2為將提取物l過(guò)正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酸=47~53:1作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇8~13:1作為流動(dòng)相，得洗脫液，步驟3為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動(dòng)相為水-A和乙腈-B,梯度洗脫,如下:_<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>流速為10ml/min,柱溫為室溫樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段28.0-32.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。10、權(quán)利要求9的有效組分的制備方法，其特征在于，步驟如下將剌五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯乙醇-l:l,加熱回流l小時(shí)，提取2次，合并濾液得提取液將提取液濃縮成浸裔，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚乙酸&酯=50:1作為流動(dòng)相，得繊液I,棄之,然后改換氯仿甲醇=10:1作為流動(dòng)相，得洗脫液n，將洗脫液n濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱ZorbaxSB-C18;21.2mmx25Qmm,流動(dòng)相為水A和乙腈B,梯度洗脫程序如<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>流速為10ml/min,柱溫為室溫樣品用100%&醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段28.0-32.0分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。全文摘要本發(fā)明涉及一種刺五加的有效組分及其制備方法與用途，本發(fā)明的刺五加有效組分，其制備過(guò)程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)刺五加進(jìn)行提取，步驟2提取液經(jīng)過(guò)色譜柱層析得洗脫液；步驟3用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集28.0-32.0分鐘洗脫液得到有效組分。文檔編號(hào)A61P35/00GK101347479SQ200710123278公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者靂劉,強(qiáng)史,水文波,程翼宇,靜竇,葛志偉,慶賀,陽(yáng)霍申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司