專利名稱：草花有效部位及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種草花(棉花花)有效部位及其制備方法和用途，尤其是該有效部位在制備預防或治療老年期癡呆藥物中的用途。
背景技術：
老年期癡呆是危害老年人身心健康的常見病，多發(fā)病。目前全世界65歲以上人群中老年期癡呆患病率約為10％，85歲以上可達47％，在發(fā)達國家中，該病在死亡原因中名列第4位，僅次于心臟病，癌和中風。我國的老年期癡呆患病率略低于發(fā)達國家，但隨著我國經(jīng)濟、文化事業(yè)的發(fā)展，壽命延長，老年人口占總人口的比例將加大。隨著老年人口增加，老年期癡呆患者急劇地增多。老年期癡呆患者的癥狀主要表現(xiàn)為進行性認知功能減退，并伴有行為障礙及情緒異常波動等，直至生活不能自理，給家庭和社會造成了巨大的壓力。因此開發(fā)治療老年期癡呆藥物是當務之急。在國外開發(fā)治療老年期癡呆藥物的焦點主要集中在乙酰膽堿酯酶抑制劑，如1996年首次上市的乙酰膽堿酯酶抑制劑一他可林(Tacrine)，1997年上市的多奈哌齊以及正在進行的乙酰膽堿酶抑制劑有Metrifonate，Velnacrine maleate等。由于乙酰膽堿酯酶全身分布，其副作用較大，限制了它們的治療效果。
草花(又稱棉花花)為錦葵科錦屬植物草棉或陸地棉的花瓣。維吾爾醫(yī)用于治療益心補腦，安神養(yǎng)神，消腫祛炎。用于腦弱神疲，心悸心煩，機體炎腫，皮膚瘙癢，燒傷熱痛等。草花的天然資源豐富，未見有毒性報告，迄今為止，從草花中提取有效部位用于預防或治療老年期癡呆癥未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于，提供一種草花有效部位及其制備方法和用途，是在中國專利031591949基礎上的進一步研究。本發(fā)明采用溶劑提取或大孔吸附樹脂法或溶劑提取和大孔吸附樹脂組合集成法制備的草花有效部位，該有效部位按常規(guī)制藥方法制成膠囊或片劑或口服液或沖劑或注射液或緩釋制劑或控釋制劑；或將有效部位與中、西藥配伍制成膠囊或片劑或口服液或沖劑或注射液或緩釋制劑或控釋制劑用于治療老年期癡呆的藥物。
本發(fā)明所述的采用溶劑提取或大孔吸附樹脂法或溶劑提取和大孔吸附樹脂組合集成法制備的草花有效部位，該有效部位含有50-90％重量的總黃酮成分，制備方法按下列步驟進行a、將草花原藥材加6-10倍量的溶劑水或醇或水與醇的混合物，浸泡提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；b、將濃縮提取物用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇進行萃?。籧、將萃取物減壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量為50-90％有效部位；d、或將步驟a的濃縮物過濾并稀釋后通過大孔樹脂，用水或5-10％乙醇洗脫除掉雜質后，再用濃度為15-95％乙醇洗脫，蒸干，得到含有50-90％草花總黃酮的有效部位。
步驟a的醇為甲醇或乙醇或異丙醇或丁醇，其濃度為45-95％。
步驟b中所述大孔樹脂是D101型或具有苯乙烯骨架的大孔樹脂。
將提取有效部位按常規(guī)制藥方法制成膠囊或片劑或口服液或沖劑或注射液或緩釋制劑或控釋制劑；或將有效部位與中、西藥配伍制成膠囊或片劑或口服液或沖劑或注射液或緩釋制劑或控釋制劑。
一種草花有效部位的制備方法，按下列步驟進行a、將草花原藥材加6-10倍量的溶劑水或醇或水與醇的混合物，其中醇為甲醇或乙醇或異丙醇或丁醇，濃度為15-95％，浸泡提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；b、將濃縮提取物用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇進行萃?。籧、將萃取物減壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量為50-90％有效部位；d、或將步驟a的濃縮物過濾并稀釋后通過D101型或具有苯乙烯骨架大孔樹脂，用水或5-10％乙醇洗脫除掉雜質后，再用濃度為15-95％乙醇洗脫，蒸干，得到含量為50-90％草花總黃酮有效部位。
一種草花有效部位作為制備預防和治療老年期癡呆的藥物的用途。
本發(fā)明草花(棉花花)原藥材經(jīng)干燥并粉碎，以利增大與溶劑的接觸面積，提高效率。
原藥材的提取溶劑使用水、醇類、或水與醇類的混合物，優(yōu)選的醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等或水與醇類的混合物，例如濃度為20-99％(體積比)的醇；提取時溶劑浸過藥材為宜，溶劑量為原藥重量的2-14倍；提取可以在靜態(tài)或動態(tài)下，優(yōu)選在動態(tài)條件下；為了提高提取的效率，可以使用超聲波等；提取的溫度是從室溫(例如20℃)到溶劑回流溫度的范圍內，優(yōu)選在回流的溫度下；提取可連續(xù)或間歇進行，間歇提取時可重復1-4次，優(yōu)選2-3次。
合并濾液，濾去藥渣，濃縮至無醇味，合并濃縮液過濾并稀釋后通過大孔樹脂，用水或5-10％乙醇洗脫除掉雜質后，用30-80％乙醇洗脫，優(yōu)選是50-70％的乙醇洗脫，蒸干，得到含有50％-90％草花總黃酮的有效部位。
草花，加6-10倍量40-95％乙醇浸泡24h后滲漉，合并滲漉液，提取液減壓濃縮至無醇味，用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇翠取，優(yōu)選使用正丁醇翠取，減壓蒸干，得到草花總黃酮含量為50％-90％有效部位。
本發(fā)明以草花有效部位作為活性成份的藥物組合物。該藥物組合物可根據(jù)本領域公知的方法制備?？赏ㄟ^將草花有效部位與一種或多種藥學上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結合，制成適于人或動物使用的任何劑型。草花有效部位在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95％重量。
草花有效部位或含有它的藥物組合物以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。
給藥劑型為液體劑型或固體劑型或半固體劑型。液體劑型為溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型為片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑和噴霧劑等；半固體劑型為軟膏劑、凝膠劑和糊劑等。
草花有效部位制成普通制劑或緩釋制劑或控釋制劑或靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將草花有效部位制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑和助流劑；稀釋劑包括淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣和碳酸鈣等；濕潤劑包括水、乙醇和異丙醇等；粘合劑包括淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇等；崩解劑包括干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯和十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟和聚乙二醇等。
還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元制成膠囊劑，將有效成分草花有效部位與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中；也可將有效成分草花有效部位先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆?；蛭⑼?，再置于硬膠囊或軟膠囊中；用于制備草花有效部位片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備草花有效部位的膠囊劑。
為將草花有效部位制成注射劑，用水或乙醇或異丙醇或丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入常用的增溶劑、助溶劑、pH調劑劑、滲透壓調節(jié)劑；增溶劑或助溶劑為泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精等；pH調劑劑為磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調節(jié)劑為氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。
此外，如需要向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。
草花有效部位可增強環(huán)己酰亞胺、東莨菪堿所致學習記憶障礙小鼠的記憶能力。明顯提高Aβ腦室注射所致癡呆小鼠記憶能力作用。草花總黃酮以140mg/kg劑量連續(xù)給藥14天對Aβ側腦室注射所致大鼠學習記憶障礙有明顯影響。
草花總黃酮35mg/kg和140mg/kg劑量連續(xù)給藥14天對IBO基底前腦Meynert核注射所致大鼠學習記憶障礙有明顯改善作用。
本實驗室大鼠預實驗給藥，給藥劑量為5.4g·kg-1，一次給藥后動物未見明顯異常，犬灌胃單次給藥毒性試驗，最大給藥劑量為5g·kg-1，藥后動物未見異常。說明草花有效部位毒副作用低。
為達到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
草花有效部位藥物組合物的給藥劑量依照所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，草花有效部位的每天的合適劑量范圍為0.001-150mg/Kg體重，優(yōu)選為0.1-100mg/Kg體重，更優(yōu)選為1-60mg/Kg體重，最優(yōu)選為2-30mg/Kg體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。
本發(fā)明的草花有效部位或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對癥藥物合并使用。當本發(fā)明的草花有效部位與其它治療藥物存在協(xié)同作用時，應根據(jù)實際情況調整它的劑量。
具體實施例方式
實施例1(溶劑法制備有效部位)將草花1公斤加10倍量55％乙醇浸泡24h后滲漉提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；將濃縮提取物用石油醚脫脂，溶于水后，用乙酸乙酯萃取進行萃??；將萃取物減壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量過50％有效部位；實施例2(大孔樹脂法制備有效部位)將草花1公斤加6倍量水浸泡24h后滲漉提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮；將步驟a的1公斤用水提取3遍，每遍1小時，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液稀釋10倍后，緩慢通過預先處理好的2kg大孔樹脂柱，藥液全部通過D101大孔樹脂柱后用蒸餾水洗滌，再用5％乙醇洗脫，除掉雜質，再用5倍柱體積20％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干，得到草花總黃酮含量為60％有效部位。
實施例3(溶劑法制備有效部位)將草花1公斤加8倍量95％乙醇浸泡24h后滲漉提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；將濃縮提取物用石油醚脫脂，再用正丁醇進行萃??；將萃取物減壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量為70％有效部位；實施例4(溶劑法制備有效部位)將草花1公斤加8倍量95％乙醇浸泡24h后滲漉提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；將濃縮提取物用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯、正丁醇混合液進行萃取；將萃取物減壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量為65％有效部位；實施例5(溶劑法和大孔樹脂組合集成制備有效部位)將草花草花1公斤加7倍量15％甲醇浸泡24h后滲漉提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；將濃縮提取物用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯進行萃?。粚⑤腿∥餃p壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量為60％有效部位；將步驟c中的有效部位溶解、過濾并稀釋后，緩慢通過預先處理好的2kg大孔樹脂柱D101，藥液全部通過大孔樹脂柱后用蒸餾水洗滌，再用5％乙醇洗脫，除掉雜質，再用5倍柱體積20％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干，得到草花總黃酮含量過90％有效部位。
實施例6(溶劑法和大孔樹脂組合集成制備有效部位)將草花1公斤加8倍量95％乙醇浸泡24h后滲漉提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；將濃縮提取物用石油醚脫脂，再用正丁醇進行萃?。粚⑤腿∥餃p壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量為70％有效部位；將步驟c中的有效部位溶解，過濾并稀釋倍后，緩慢通過預先處理好的2kg大孔樹脂柱，藥液全部通過具有苯乙烯骨架大孔樹脂柱后用蒸餾水洗滌，再用5％乙醇洗脫，除掉雜質，再用5倍柱體積20％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干，得到草花總黃酮含量90％有效部位。
實施例7(藥物制劑)取0.5-2份微晶纖維素，與1份草花有效部位混勻，以水為粘合劑，14目篩制粒，18目篩整粒，常規(guī)壓片，然后包衣即得。
實施例8(藥物制劑)取0.5-2份淀粉，與1份草花有效部位混勻，以水為粘合劑，14目篩制粒，18目篩整粒，裝入膠囊，即得。
實施例9(藥物制劑)取1-3份聚乙二醇7000，加熱溶化，加入草花有效部位1份，攪拌均勻，然后倒入滴丸機，90℃保溫，常規(guī)滴制，硅油冷卻，即得。
實驗例10(藥理實驗)本發(fā)明草花有效部位作為制備預防和治療老年期癡呆的藥物的用途的藥理試驗。
受試品草花總黃酮對環(huán)己酰亞胺致小鼠記憶獲得障礙動物記憶能力的影響目的觀察受試品草花有效部位對記憶獲得障礙動物記憶能力的影響。
材料及方法材料受試品草花總黃酮，黃色粉末，使用時用蒸餾水配制成均勻混懸液。
試劑環(huán)己酰亞胺，Sigma公司，批號091001；陽性對照藥多奈派齊(安理申)，英國Boots公司制造，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司分裝，批號5817182。
動物昆明種小鼠，雄性，體重20-24克，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號SCXK(京)2004-0001。儀器Passive Avoidance Control，大正制藥株式會社贈送。
方法小鼠隨機分為六組正常對照組、模型組、多奈派齊(0.75mg/kg)組、草花總黃酮低劑量(25mg/kg)組、草花總黃酮中劑量(50mg/kg)、草花總黃酮高劑量(100mg/kg)組。灌胃給藥，正常對照組和模型組給予同體積蒸餾水。連續(xù)給藥三天，每天給藥一次，末次給藥后1小時(h)，模型組和給藥組腹腔注射(i.p.)環(huán)己酰亞胺(120mg/kg)一次，正常對照組i.p.同體積生理鹽水。注射后10分鐘，進行避暗訓練，記錄小鼠從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間，24h后重新測試，記錄進入暗室的潛伏期和5min內的電擊次數(shù)。
結果與正常組小鼠第一次觸電潛伏期(285±34s)和5min內觸電次數(shù)(0.2±0.4次/5min)比較，模型組第一次觸電潛伏期(36±24s)和5min內觸電次數(shù)(3.4±2.2次/5min)有極顯著性差異(P＜0.01)，說明造模成功。草花總黃酮高、中、低三個劑量組第一次觸電潛伏期分別為162±109s、133±128s和126±121s，與模型組比較均有顯著性差異，而多奈派齊為111±121s，與模型組比較有所升高，但沒有統(tǒng)計學差異。
草花總黃酮高劑量組、中劑量組以及多奈哌齊組小鼠5min內觸電次數(shù)為1.3±1.7次/5min、1.5±1.5次/5min和1.5±1.0次/5min，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，而草花總黃酮低劑量(1.8±1.8次/5min)對小鼠5min內觸電次數(shù)沒有影響。(見表1)表1.受試品草花總黃酮對環(huán)己酰亞胺所致學習記憶障礙小鼠記憶能力的影響

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01結論受試品草花總黃酮口服給藥(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)可明顯增強環(huán)己酰亞胺所致學習記憶障礙小鼠的記憶能力。
受試品草花對對東莨菪堿致小鼠記憶獲得障礙動物記憶能力的影響目的觀察受試品草花總黃酮對M受體阻斷劑東莨菪堿所致記憶獲得障礙小鼠記憶能力的影響。
材料及方法材料受試品草花總黃酮，黃色粉末，使用時用蒸餾水配制成均勻混懸液。
試劑東莨菪堿，Merck公司，批號K29367747。
陽性對照藥多奈派齊(安理申)，英國Boots公司制造，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司分裝，批號5817182。
動物昆明種小鼠，雄性，體重20-24克，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號SCXK(京)2004-0001。
儀器Passive Avoidance Control，日本大正制藥株式會社贈送。
方法小鼠隨機分為六組正常對照組、模型組、多奈派齊(0.75mg/kg)組、草花總黃酮低劑量(25mg/kg)組、草花總黃酮中劑量(50mg/kg)、草花總黃酮高劑量(100mg/kg)組。灌胃給藥，正常對照組和模型組給予同體積蒸餾水。連續(xù)給藥三天，每天給藥一次，末次給藥后1小時(h)，模型組和給藥組腹腔注射(i.p.)東莨菪堿(5mg/kg)一次，正常對照組i.p.生理鹽水。注射后10min，進行避暗訓練，記錄小鼠從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間(s)。24h后重新測試，記錄進入暗室的潛伏期和3min內的電擊次數(shù)。
結果與正常組小鼠第一次觸電潛伏期(223±114s)和5min內觸電次數(shù)(0.6±0.9次/5min)比較，模型組第一次觸電潛伏期(26±19s)和5min內觸電次數(shù)(3.4±1.8次/5min)有極顯著性差異(P＜0.01)，說明造模成功。草花總黃酮高、中、低三個劑量組第一次觸電潛伏期分別為127±134s、109±132s和96±112s，而多奈派齊為108±118s，與模型組比較均有顯著性差異。
草花總黃酮高劑量組小鼠5min內觸電次數(shù)為0.9±0.8次/5min，與模型組比較有極顯著差異(P＜0.01)，多奈派齊組為1.3±1.0次/5min，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)，而AB-8-2中劑量組(2.0±1.7次/5min)和低劑量組(2.2±1.6次/5min)對小鼠5min內觸電次數(shù)沒有影響。(見表1)表1.受試品AB-8-2對東莨菪堿所致學習記憶障礙小鼠記憶能力的影響

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01結論受試品草花總黃酮口服給藥在25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg劑量下可明顯增強東莨菪堿所致學習記憶障礙小鼠的記憶能力。
草花總黃酮對Aβ腦室注射致癡呆小鼠記憶能力的影響目的觀察受試品草花總黃酮對癡呆小鼠記憶能力的影響。
材料及方法材料受試品草花總黃酮，黃色粉末，使用時用蒸餾水配制成均勻混懸液。
試劑Aβ25-35，Sigma公司產(chǎn)品，貨號A-4559，批號114K4773。多奈派齊(安理申)，法國PFIZER PGM公司生產(chǎn)，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司分裝，批號4221903。水合三氯乙醛，北京市旭東化工廠產(chǎn)品，批號020327。
動物昆明種小鼠，雄性，體重20-24克。由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號SCXK(京)2004-0001。
儀器小鼠水迷宮中國醫(yī)學科學院藥物研究所制作。SR-6N腦立體定位儀日本成茂公司(NARISHIGE)生產(chǎn)。
方法聚集態(tài)老化Aβ25-35制備1mg Aβ25-35肽段溶于500μl滅菌生理鹽水中，濃度為10μg/μl。封口膜封好后，置于37℃孵育7天，使其聚集、老化。
Aβ25-35腦室注射所致小鼠癡呆模型制備小鼠用10％水合氯醛(450mg/kg)麻醉，75％酒精局部消毒，以微量注射器于單側側腦室(AP1.0mm，L 4.5mm，H 3.0mm)緩慢注入3μl已老化的凝聚態(tài)Aβ25-35，注射時間為30s，留針30s，緩慢起針。局部消毒后縫合皮膚，肌注抗生素抗感染。假手術組的小鼠同側腦室注射等量的滅菌生理鹽水。
分組及給藥小鼠隨機分為四組假手術組、模型組、多奈派齊(0.75mg/kg)組、受試品草花總黃酮(100mg/kg)組。按上述劑量灌胃給藥，假手術和模型組給予同體積蒸餾水。連續(xù)給藥十二天，從第七天開始，于給藥后1h，進行水迷宮訓練，第一天設置一個盲端，第二、三天設置三個盲端，第四天設置四個盲端，并在此條件下于第五天(給藥第十二天)進行正式實驗，記錄小鼠從放入至爬上臺階所需的時間(s)及進入盲端次數(shù)。每次實驗均重復兩次，每次間隔2-3分鐘。
數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)分析采取t檢驗。
結果模型組小鼠爬上臺階所需時間(55.9±47.4s)和進入盲端次數(shù)(6.2±6.4次)與假手術組小鼠(15.1±9.9s和1.4±1.0次)比較有顯著性差異(P＜0.05)，陽性對照藥多奈派齊組小鼠(0.75mg/kg)的爬上臺階所需時間(19.9±8.6s)和進入盲端次數(shù)(1.7±1.3次)與模型組小鼠比較有顯著性差異(P＜0.05)，說明本實驗造模是成功的。與模型組相比，草花總黃酮(100mg/kg)組小鼠爬上臺階所需時間(21.3±12.4s)和進入盲端次數(shù)(0.9±1.1次)明顯減少，統(tǒng)計學顯示有顯著性差異(P＜0.05)(見表1)。
表1.草花總黃酮對Aβ腦室注射所致癡呆小鼠記憶能力的影響

N＝12，與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01結論受試品草花總黃酮口服給藥在100mg/kg劑量下具有明顯提高Aβ腦室注射所致癡呆小鼠記憶能力作用。
草花總黃酮對腦室注射Aβ致大鼠記憶獲得障礙學習記憶能力的影響
材料及方法材料受試品草花總黃酮，黃色粉末，由中國科學院理化技術研究所提供，以蒸餾水配制成濃度分別為14mg/mL，7mg/mL，3.5mg/mL和1.75mg/mL的均勻混懸液備用。
陽性對照藥鹽酸多奈哌齊片劑(商品名安理申)，法國PFIZER PGM公司制造，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司分裝，產(chǎn)品批號4222403，分裝批號4222403A，有效期2005年1月7日至2007年12月。以生理鹽水配制成濃度為0.06mg/mL的均勻混懸液備用。
造模試劑Aβ25-35(Amyloid β-Protein Fragment 25-35)，Sigma公司產(chǎn)品，貨號A-4559，批號115K4778。麻醉劑戊巴比妥鈉，北京化學試劑公司，批號020919；將200mg的戊巴比妥鈉溶于20mL的生理鹽水中，配成1％的溶液。
其他藥品和試劑注射用青霉素粉針，華北制藥股份有限公司，批號E0503315，80萬單位/支，有效期至2007年2月，臨用前無菌生理鹽水配成80萬單位/4mL的注射液。5％H2O2(天津市東方化工廠生產(chǎn))取25mL的30％H2O2，加蒸餾水125mL至150mL。
0.2 M磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)配制試劑 質量(g)NaH2PO4·2H2O 23.712Na2HPO4·12H2O 231.984NaCl 64ddH2O 4000mL0.1M PBS溶液(pH7.4)將0.2M PBS溶液(pH7.4)稀釋二倍即得，4℃保存。
4％多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)多聚甲醛160g溶于0.1M PBS溶液2000mL，混合加熱至60℃，冷卻后調pH為7.4，加0.1M PBS至2000mL，4℃保存。
儀器SR-6N腦立體定位儀日本成茂公司(NARISHIGE)生產(chǎn)。STRON6-90型牙科鉆，韓國SAESHIN公司生產(chǎn)。大鼠Morris水迷宮北京新天地科技公司生產(chǎn)。大鼠避暗箱中國醫(yī)學科學院藥物所研制。
動物SD大鼠，雄性，體重240±20g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK(京)2002-0003。
實驗方法Aβ25-35的聚集老化無菌條件下在Aβ25-35玻璃瓶中加入高壓滅菌的雙蒸水50μ L，制成20μg/μL的儲備液，再加入450μL的無菌生理鹽水，配成2μg/μL的工作液。37℃孵育聚集老化4天。
實驗分組將84只大鼠隨機分為7組假手術組、模型組、多奈哌齊陽性藥物(0.6mg/kg)組，草花總黃酮217.5mg/kg體重治療組，草花總黃酮35mg/kg體重治療組，草花總黃酮70mg/kg體重治療組，草花總黃酮140mg/kg體重治療組，每組12只，灌胃給藥(1mL/100g)，假手術組和模型組大鼠灌胃給予與藥物組同等容量的蒸餾水。
模型制備動物戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉(0.5mL/100g)，固定于腦立體定位儀上，縱向切開頭頂部皮膚，分離皮下組織，以5％H2O2適當處理顱骨使骨縫清晰。大鼠側腦室立體定位儀坐標為前囟后1.0mm，矢狀縫旁2.0mm，硬腦膜下4.0mm，以骨鉆打開顱骨后，微量進樣器自腦表面垂直進針進行注射，Aβ濃度2μg/μL，總體積5μL，2min內注射完畢，停針5min，退針1min。注射后粘合皮膚，肌肉注射青霉素預防感染。假手術組側腦室相同坐標位點注射等容量的生理鹽水。
給藥各組動物于手術后第二天開始進行灌胃給藥，假手術組和模型組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥14天，每天給藥一次。2.5Morris水迷宮，動物于給藥第10天開始進行水迷宮訓練，每天訓練兩次，每次每只2min，于給藥第12天進行水迷宮測試。Morris水迷宮主要由一不銹鋼制成的園柱形黑色水池和一可移動位置的平臺組成。預先在水池里注入清水，使水面高出平臺2cm，水溫控制在20±0.5℃，水中加入黑色墨水，成黑水白鼠對比。平臺置于某一象限的中間，大鼠入池位置為站臺所在位置的對象限，于象限邊1/2弧度處頭朝池壁入水，每次訓練2min。水池上空通過一攝像機與監(jiān)視電視和計算機相連接。當設定的訓練時間已到或動物已爬上平臺，計算機停止跟蹤并記錄下游泳軌跡和自動計算出動物在水池中所游過的路程，找到平臺所需的時間(即潛伏期)等指標。若動物在2min之內尚未找到平臺，則將動物拿到平臺上并使它在上面停留20s，若大鼠在2min內找到平臺，記錄自動停止，也讓其在平臺上停留20s(大鼠找到平臺后，記錄自動停止，然后大鼠基本上就停留在臺子上不再跳下來。如果跳下平臺，就將其重新放回臺子。然后用秒表計時20s)，方結束一次訓練。于給藥第12天進行測試。設定實驗時間為60s。
避暗箱于給藥第13天進行避暗箱訓練，24h后進行避暗箱測試。避暗箱是由一個明室和一個暗室組成的裝置。兩個室之間有一個圓形洞口連接。暗室通以40V電壓，并與一記時器相連，記時器可以自動記錄潛伏期時間。將大鼠面部背向洞口放置入明室，同時啟記時器，動物穿過洞口進入暗室受到電擊，即可取出大鼠。24h后正式測驗，記錄每只動物從放入明室至首次進入暗室遇到電擊所需的時間(潛伏期)，并記錄每只動物3min內受到電擊的次數(shù)。
數(shù)據(jù)處理與分析實驗結果以(均值±標準差)表示，各組間結果進行單因素方差分析和均數(shù)間的多重比較分析(α＝0.05)。
實驗結果Morris水迷宮實驗結果由表1所示，造模13天后，模型組大鼠尋找平臺的潛伏期明顯延長，表明Aβ(10μg/只)腦室注射可造成大鼠空間學習記憶障礙。與模型組相比，陽性對照藥多奈哌齊組大鼠尋找平臺潛伏期時間明顯縮短(P＜0.05)，表明本試驗體系的建立是成功的。與模型組大鼠相比，受試品各給藥組大鼠尋找平臺的潛伏期均有所縮短，其中AB-8-270mg/kg及140mg/kg兩個劑量組大鼠尋找平臺潛伏期的縮短有顯著性差異(P＜0.05)，且與陽性對照藥多奈哌齊組動物相比無顯著性差異。
表1.草花總黃酮對Aβ腦室注射所致癡呆大鼠Morris水迷宮空間學習記憶能力的影響

每組n＝12；與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05避暗箱結果由表2所示，與假手術組相比，造模15天后模型組大鼠受到避暗箱內電擊潛伏期有所縮短，3min內受到電擊次數(shù)明顯增多，表明Aβ腦室注射可造成大鼠學習記憶障礙。
與模型組相比，連續(xù)給藥14天后各給藥組大鼠受到避暗箱內電擊的潛伏期均有所延長，3min內受到電擊的次數(shù)均有所減少。多奈哌齊組和AB-8-2(70mg/kg)組大鼠3min內受到電擊的次數(shù)有明顯減少(P＜0.05)。
表2草花總黃酮對Aβ腦室注射所致癡呆大鼠避暗箱學習記憶能力的影響

每組n＝12；與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05結論草花總黃酮在70mg/kg和140mg/kg劑量下連續(xù)給藥14天對Aβ側腦室注射所致大鼠學習記憶障礙有明顯改善作用。
草花總黃酮對基底前腦Meynert核注射IBO致大鼠記憶獲得障礙的影響材料藥品及試劑受試品草花總黃酮，黃色粉末，由中國科學院理化技術研究所教授提供，批號04-1，以蒸餾水配制成濃度分別為14mg/mL，7mg/mL和3.5mg/mL的均勻混懸液備用。
陽性對照藥鹽酸多奈哌齊原料藥，重慶桑田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號20060401。以生理鹽水配制成濃度為0.06mg/mL的均勻混懸液備用。
造模試劑鵝膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBO)1mg包裝，Sigma公司產(chǎn)品，貨號I2765，批號066K3775，將1mg IBO溶于250μL的無菌生理鹽水中，配成4μg/μL溶液備用。
麻醉劑戊巴比妥鈉，北京化學試劑公司，批號020919；將200mg的戊巴比妥鈉溶于20mL的生理鹽水中，配成1％的溶液。
其他藥品和試劑注射用青霉素粉針，華北制藥股份有限公司，批號E0503315，80萬單位/支，有效期至2007年2月，臨用前無菌生理鹽水配成80萬單位/4mL的注射液。5％H2O2(天津市東方化工廠生產(chǎn))，取25mL的30％H2O2，加蒸餾水125mL至150mL。
0.2M磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)配制試劑 質量(g)NaH2PO4·2H2O 23.712Na2HPO4·12H2O231.984NaCl 64ddH2O 4000mL0.1M PBS溶液(pH7.4)將0.2M PBS溶液(pH7.4)稀釋二倍即得，4℃保存。4％多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)多聚甲醛160g溶于0.1MPBS溶液2000mL，混合加熱至60℃，冷卻后調pH為7.4，加0.1M PBS至2000mL，4℃保存。
儀器SR-6N腦立體定位儀日本成茂公司(NARISHIGE)生產(chǎn)。STRONG-90型牙科鉆，韓國SAESHIN公司生產(chǎn)。大鼠Morris水迷宮北京新天地科技公司生產(chǎn)。大鼠避暗箱中國醫(yī)學科學院藥物所研制。
動物SD大鼠，雄性，體重210±10g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK(京)2002-0003。
方法實驗分組將72只大鼠隨機分為6組假手術組，模型組，多奈哌齊陽性藥物(0.6mg/kg)組，草花總黃酮低劑量(35mg/kg)組，草花總黃酮中劑量(70mg/kg)組，草花總黃酮高劑量(140mg/kg)組，每組12只。灌胃給藥(1mL/100g)，假手術組和模型組大鼠灌胃給予與藥物組同等容量的蒸餾水。
模型制備對動物腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(50mg/kg)，固定于腦立體定位儀上，縱向切開頭頂部皮膚，分離皮下組織，以5％H2O2適當處理顱骨使骨縫清晰。大鼠基底前腦Meynert核立體定位儀坐標為前囟后0.9mm，矢狀縫旁2.6mm，硬腦膜下6.9mm，以骨鉆打開顱骨后，微量進樣器自腦表面垂直進針，進行雙側注射，IBO濃度4μg/μL，每側1μL，2min內注射完畢，停針5min，退針1min。注射后粘合皮膚，肌肉注射青霉素預防感染。假手術組基底前腦相同坐標注射等容量的生理鹽水。
給藥各組動物于手術后第二天開始進行灌胃給藥(1mL/100g體重)，假手術和模型對照組灌胃給予等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥14天，每天給藥一次。
Morris水迷宮動物于給藥第10天開始進行水迷宮訓練，每天訓練兩次，每次每只120s，于給藥第12天進行水迷宮測試。
Morris水迷宮主要由一不銹鋼制成的園柱形黑色水池和一可移動位置的平臺組成。預先在水池里注入清水，使水面高出平臺2cm，水溫控制在20±0.5℃，水中加入黑色墨水，成黑水白鼠對比。平臺置于某一象限的中間，大鼠入池位置為站臺所在位置的對象限，于象限邊1/2弧度處頭朝池壁入水，每次訓練120s。水池上空通過一攝像機與監(jiān)視電視和計算機相連接。當設定的訓練時間已到或動物已爬上平臺，計算機停止跟蹤并記錄下游泳軌跡和自動計算出動物在水池中所游過的路程，找到平臺所需的時間(即潛伏期)等指標。若動物在120s之內尚未找到平臺，則將動物拿到平臺上并使它在上面停留20s，若大鼠在120s內找到平臺，記錄自動停止，也讓其在平臺上停留20s，方結束一次訓練。于給藥第12天進行測試。設定實驗時間為60s。
避暗箱于給藥第13天進行避暗箱訓練，24h后進行避暗箱測試。避暗箱是由一個明室和一個暗室組成的裝置。兩個室之間有一個圓形洞口連接。暗室通以40V電壓，并與一記時器相連，記時器可以自動記錄潛伏期時間。將大鼠面部背向洞口放置入明室，同時啟記時器，動物穿過洞口進入暗室受到電擊，即可取出大鼠。24h后正式測驗，記錄每只動物從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間(潛伏期)，并記錄每只動物3min內受到電擊的次數(shù)。
數(shù)據(jù)處理與分析實驗結果以(均值±標準差)表示，各組間結果進行單因素方差分析和均數(shù)間的多重比較分析(α＝0.05)。
結果Morris水迷宮實驗結果由表1所示，造模第13天，模型組大鼠尋找平臺的潛伏期明顯延長，表明IBO(8μg/只)基底前腦Meynert核注射可造成大鼠空間學習記憶障礙。與模型組相比，陽性對照藥多奈哌齊組大鼠尋找平臺潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，表明本試驗體系的建立是成功的。與模型組大鼠相比，受試品各給藥組大鼠尋找平臺的潛伏期均有所縮短，其中AB-8-235mg/kg及140mg/kg兩個劑量組大鼠尋找平臺潛伏期有顯著性差異(P＜0.05)，且與陽性對照藥多奈哌齊組動物相比無顯著性差異。
表1.草花總黃酮對IBO基底前腦Meynert核注射所致癡呆大鼠Morris水迷宮空間學習記憶能力的影響

每組n＝12，*P＜0.05，與假手術組比較；#P＜0.05，與模型組比較避暗箱結果由表2所示，與假手術組相比，造模第15天模型組大鼠受到避暗箱內電擊的潛伏期有所縮短，3min內受到電擊的次數(shù)增多。與模型組相比，連續(xù)給藥14天各給藥組大鼠受到避暗箱內電擊的潛伏期均有所延長，3min內受到電擊的次數(shù)均有所減少，但沒有明顯差異。
表2.草花總黃酮對IBO基底前腦Meynert核注射所致癡呆大鼠避暗箱學習記憶能力的影響

每組n＝12結論草花總黃酮在35mg/kg和140mg/kg劑量下連續(xù)給藥14天對IBO基底前腦Meynert核注射所致大鼠學習記憶障礙有明顯改善作用。
權利要求
1.一種采用溶劑提取或大孔吸附樹脂法或溶劑提取和大孔吸附樹脂組合集成法制備的草花有效部位，其特征在于該有效部位含有50-90％重量的總黃酮成分，制備方法按下列步驟進行a、將草花原藥材加6-10倍量的溶劑水或醇或水與醇的混合物，浸泡提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；b、將濃縮提取物用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇進行萃??；c、將萃取物減壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量為50-90％有效部位；d、或將步驟a的濃縮物過濾并稀釋后通過大孔樹脂，用水或5-10％乙醇洗脫除掉雜質后，再用濃度為15-95％乙醇洗脫，蒸干，得到含有50-90％草花總黃酮的有效部位。
2.根據(jù)權利要求1所述的草花有效部位，其特征在于步驟a的醇為甲醇或乙醇或異丙醇或丁醇，其濃度為45-95％。
3.根據(jù)權利要求1所述的草花有效部位，其特征在于步驟b中所述大孔樹脂是D101型或具有苯乙烯骨架的大孔樹脂。
4.根據(jù)權利要求1所述的草花有效部位，其特征在于將提取有效部位按常規(guī)制藥方法制成膠囊或片劑或口服液或沖劑或注射液或緩釋制劑或控釋制劑；或將有效部位與中、西藥配伍制成膠囊或片劑或口服液或沖劑或注射液或緩釋制劑或控釋制劑。
5.一種草花有效部位的制備方法，其特征在于按下列步驟進行a、將草花原藥材加6-10倍量的溶劑水或醇或水與醇的混合物，其中醇為甲醇或乙醇或異丙醇或丁醇，濃度為15-95％，浸泡提取，合并濾液，濾去藥渣，減壓濃縮至無醇味；b、將濃縮提取物用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇進行萃?。籧、將萃取物減壓蒸干，即可得到草花總黃酮含量為50-90％有效部位；d、或將步驟a的濃縮物過濾并稀釋后通過D101型或具有苯乙烯骨架大孔樹脂，用水或5-10％乙醇洗脫除掉雜質后，再用濃度為15-95％乙醇洗脫，蒸干，得到含量為50-90％草花總黃酮有效部位。
6.一種草花有效部位作為制備預防和治療老年期癡呆的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種草花有效部位及其制備方法和用途，是在中國專利031591949基礎上的進一步研究。本發(fā)明采用溶劑法或大孔吸附樹脂法或溶劑法和大孔吸附樹脂組合集成法制備草花有效部位，該有效部位按常規(guī)制藥方法制成膠囊或片劑或口服液或沖劑或注射液或緩釋制劑或控釋制劑；或將有效部位與中、西藥配伍制成膠囊或片劑或口服液或沖劑或注射液或緩釋制劑或控釋制劑用于治療老年期癡呆的藥物。
文檔編號A61P25/28GK101084946SQ20071012653
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月20日 優(yōu)先權日2007年6月20日
發(fā)明者阿吉艾克拜爾·艾薩, 再帕爾·阿不力孜, 朱海波, 帕爾哈提·克熱木, 吳韜, 熱依木古麗, 趙永昕, 楊義 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所