專利名稱：：由母體妊娠高血壓導(dǎo)致胎兒/新生兒海馬中損傷的預(yù)防的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或改善由于母體妊娠高血壓(GH)而導(dǎo)致哺乳動物胎兒或新生兒中神經(jīng)損傷的方法。所述方法包括對患有GH的懷孕哺乳動物口服給藥萌發(fā)活化破壁靈芝孢子("GLS")。所述神經(jīng)元損傷包括海馬細胞增殖和神經(jīng)元數(shù)量的減少。本發(fā)明進一步涉及一種用于預(yù)防或改善由于母體GH而導(dǎo)致哺乳動物胚胎中海馬缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-la)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)增加表達的方法。
背景技術(shù)：
：妊娠高血壓(GH)是指先前血壓正常的婦女在懷孕二十周之后顯現(xiàn)并在分娩后恢復(fù)正常的高血壓。一種較嚴重的狀況，被稱為先兆子癇，是指在尿中伴隨蛋白的GH。先兆子癇可發(fā)展為子癇，導(dǎo)致母體的發(fā)作。這些懷孕相關(guān)的高血壓障礙可對孕婦及胎兒的各種器官引起損傷。母體并發(fā)癥可包括肺水腫、血栓性并發(fā)癥、腎衰竭以及死亡。在美國，妊娠高血壓障礙占母體死亡率的近百分之十五。長期的后遺癥也可產(chǎn)生。雖然患有慢性高血壓的婦女存在源自頑固性高血壓的顯然性長期風(fēng)險，但是，患有先兆子癇的婦女，盡管產(chǎn)后障礙解除，與不患有先兆子癇的孕婦相比在以后的生命中仍具有增加心血管疾病的風(fēng)險。由于GH而致的胎兒并發(fā)癥包括生長受限、早產(chǎn)和死產(chǎn)。GH也可引起子宮內(nèi)胎兒器官發(fā)育遲緩、產(chǎn)后智力下降以及許多神經(jīng)心理障礙。也有證據(jù)表明，高血壓妊娠中子宮內(nèi)環(huán)境，以涉及胎兒沒能訓(xùn)練完全生長潛能的機理，給予在成年期增加心血管事件的風(fēng)險。靈芝屬于真菌類的多孔菌科。靈芝被廣泛地用于傳統(tǒng)中藥，作為多種.醫(yī)學(xué)病況如肝炎、AIDS、癌癥以及自身免疫疾病的輔助治療。GLS是靈芝的精華，并且含有活性成分，諸如多糖類、甾醇類、油酸、亞油酸、三萜類、神經(jīng)酰胺類以及某些有機離子，它們都擁有強的生物活性。GLS也已被用于治療神經(jīng)學(xué)上的障礙。但是，目前尚未有關(guān)于GLS對GH相關(guān)胎兒損傷影響的報道。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或改善由于母體妊娠高血壓(GH)而導(dǎo)致哺乳動物胎兒或新生兒中神經(jīng)損傷的方法。所述方法包括對患有GH的懷孕雌性給藥有效量的萌發(fā)活化破壁靈芝(G朋o&rma/腦V/Mm)孢子(GLS)。以如下方法制備GLS:(l)將靈芝孢子浸入水、鹽水、營養(yǎng)液或其組合的溶液中，使孢子萌發(fā)；(2)放置經(jīng)萌發(fā)處理的靈芝孢子于相對濕度65-98%和溫度18-48°C的培養(yǎng)箱中，以使萌發(fā)的靈芝孢子被活化；和(3)破壞萌發(fā)活化靈芝孢子的孢壁，以產(chǎn)生破壁GLS。所述的懷孕雌性患有妊娠高血壓。所述的懷孕雌性優(yōu)選是人類?？蛇x擇地，所述懷孕雌性是嚙齒動物。所述GH優(yōu)選為先兆子癇。在動物模型中，所述先兆子癇可能是由N-w-硝基-L-精氨酸曱酯誘導(dǎo)的。所述被誘導(dǎo)的先兆子癇表明與人類中相似的先兆子癇癥習(xí)犬。一種形式的所述神經(jīng)損傷是海馬細胞增殖的減少。另一種形式的所述神經(jīng)損傷是神經(jīng)元數(shù)量的減少。所述神經(jīng)損傷發(fā)生于大腦的海馬區(qū)內(nèi)。GLS優(yōu)選被口服給藥。有效量的GLS優(yōu)選為0.01至20g/kg體重/日之間，并且更優(yōu)選0.1至20g/kg體重/日之間。本發(fā)明進一步提供了一種用于預(yù)防或改善由母體GH而導(dǎo)致哺乳動物胚胎中海馬缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-la)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)增加.表達的方法。所述的方法包括對患有GH的懷孕雌性給藥有效量的萌發(fā)活化破壁靈芝孢子(GLS)。附圖簡要說明圖1是復(fù)合圖，其表示的是以50x放大(在每板右上角的插入物為200x)、自實驗懷孕大鼠生育的30-齡(P-30)大鼠中海馬顆粒下區(qū)(SGZ)的BrdU陽性細胞核(個)的免疫組織化學(xué)染色。板1A:正常對照組；板1B:L-NAME+蒸餾水組；板1C:L-NAME+精氨酸組；板1D:L-NAME+GLS組。圖2是復(fù)合圖，其表示的是應(yīng)用vWF免疫組織化學(xué)染色、100x放大、21-天齡(E21)胚胎中海馬的微血管(卞)。板2A:正常對照組；板2B:L-NAME+蒸餾水組；板2C:L-NAME+精氨酸組；板2D:L-NAME+GLS組。圖3是復(fù)合圖，表示的是P30大鼠中海馬CA1區(qū)的毛細血管的超微結(jié)構(gòu)(卞表示外周血管結(jié)構(gòu)而l表示血管的基底膜)。EC是血管內(nèi)皮細胞；內(nèi)腔表示血管中內(nèi)腔。透射電子顯微鏡12000x。板3A:正常對照組；板3B:L-NAME+蒸餾水組；板3C:L-NAME+靈芝孢子組。毛細血管基底膜變厚(板3B,|),外周結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空泡(板3B,^)而且在L-NAME+蒸餾水組中出現(xiàn)的內(nèi)皮細胞也是空泡的(板3B，個)。圖4是復(fù)合圖，表示的是P30大鼠中海馬CA1、CA2和DG區(qū)的細胞層和神經(jīng)元體。中性紅染色，200x。板1A:正常對照組；板IB:L-NAME+蒸餾水組；板1C:L-NAME+精氨酸組；板ID:L-NAME+GLS組；a:CA1區(qū)；b:CA3區(qū)；c:DG區(qū)。DG:齒狀腦回。CA1-CA3:阿門氏角(Cwm/v4ww7w^)區(qū)域。盡管涉及描述海馬和相鄰皮質(zhì)的術(shù)語缺乏一致性，但是術(shù)語"海馬結(jié)構(gòu)"通常應(yīng)用于齒狀腦回，阿門氏角區(qū)域CA1-CA3(以及CA4，常常稱為門并被認為是齒狀腦回的部分)，和下托。CA1、CA2和CA3區(qū)域組成了海馬本體。圖5A是WesternBlot圖，表示的是在E21和P30海馬組織中HIF-la和VEGF的表達。N-正常對照組；M隱L畫NAME+蒸餾水組；A-L-NAME+精氨酸組；G-L-NAME+GLS。圖5B是復(fù)合圖，表示的是在E21和P30海馬組織中HIF-la和VEGF表達的RT-PCR結(jié)果。N-正常對照組；M-L-NAME+蒸餾水組；A-L-NAME+精氨酸組；G-L-NAME+GLS。發(fā)明的詳細描述本發(fā)明致力于研究由于母體妊娠高血壓(GH)而導(dǎo)致的神經(jīng)損傷和在哺乳動物胎兒和/或新生兒海馬中缺氧誘導(dǎo)因子(HIP-la)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的增加表達，以及萌發(fā)活化破壁靈芝孢子粉(GLS)對于這種損傷的預(yù)防或改善作用。為了便利于母體GH而導(dǎo)致哺乳動物胎兒/新生兒中神經(jīng)損傷的研究，根據(jù)YallampalliC.等，AmJ.ObstetGynecol.，169(5):1316-1320(1993)和HelmbrechtGD等，Am.J.Obstet.Gynecol"175(4):800-805(1996)應(yīng)用先兆子癇的動物模型。所述的動物模型包括了應(yīng)用一氧化氮合成酶(NOS)非選擇性抑制劑，N-o硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)，以在懷孕大鼠中誘導(dǎo)先兆子癇樣綜合癥一高血壓、蛋白尿、子宮內(nèi)生長受限以及腎小球毛細管內(nèi)皮損害。這種模型在產(chǎn)科領(lǐng)域是公認的，以在懷孕的人類中產(chǎn)生類似于先兆子癇的那些癥狀。應(yīng)用L-NAME以誘導(dǎo)先兆子癇樣綜合癥的理論是基于這樣的觀察結(jié)果在患有GH的孕婦中，血液中一氧化氮(NO)的水平顯著性低于正常孕婦中的水平(WangY，等，AmJObstetGynecol.,190(3):817-824(2004))。NO是由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的并且涉及到血管張力、血小板聚集、神經(jīng)傳遞以及免疫活化的調(diào)節(jié)。NO，原來認作EDRF(內(nèi)皮素衍生的松弛因子)，然而，是由含核黃素的酶，一氧化氮合成酶(NOS),對L-精氨酸的胍基氮進行氧化脫氨而合成的。換言之，L-精氨酸是NOS的底物以產(chǎn)生NO。因此，用L-精氨酸類似物一L-NAME代替L-精氨酸阻滯了NO的合成，并且依次較少了懷孕嚙齒動物中的NO產(chǎn)生，這模擬了懷孕人類中的NO較少。如下文中下列的實驗設(shè)計和結(jié)果中所示的，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，母體GH引起胎兒和新生兒中大腦海馬區(qū)的細胞增殖以及神經(jīng)元數(shù)量的減少。也發(fā)現(xiàn)在哺乳動物胚胎中海馬缺氧誘導(dǎo)性因子(HIP-la)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的增加。海馬位于大腦的顳葉中間葉(medialtemporallobe)。它形成邊緣系統(tǒng)的一部分并且參與記憶和空間導(dǎo)航。名稱"海馬"源自它在大腦冠狀部分中彎曲的外形，類似海馬(希臘語/2^;ocgw;ws)。在阿爾茨海默病中，海馬成為遭受損傷的、大腦首要區(qū)域之一。海馬中的損傷包括，但不限于，記憶問題和定向障礙。因此，在胎兒和新生兒大腦海馬上的損傷可導(dǎo)致胎兒和新生兒記憶喪失以及長期學(xué)習(xí)能力的損傷。在所述的本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，為了清晰而采用了特定的術(shù)語。但是本發(fā)明并非限于所選的特定術(shù)語。應(yīng)當(dāng)理解的是，每一個特定元素都包括以相似方式來實現(xiàn)相似目的而實施的全部技術(shù)等同。本發(fā)明的一方面涉及一種用于預(yù)防或改善由于母體GH而導(dǎo)致胎兒/新生兒神經(jīng)損傷的方法。所述方法包括對患有GH的懷孕雌性給藥有效量GLS的步驟。所述懷孕雌性可以是任意的哺乳動物，包括但不限于，人類，寵物如狗和貓，飼養(yǎng)動物如綿羊、山羊、牛和豬，以及實驗室動物如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴子和狒狒。GLS為微溶于水的棕色粉末。生物活性的GLS可通過包括如下步驟的工藝而生產(chǎn)/.勞發(fā)'謬,仔細挑選成熟且完整的靈芝孢子以經(jīng)受浸泡工藝來誘導(dǎo)萌發(fā)。將孢子保持于清澈或蒸餾水、生物鹽水溶液、或者能使靈芝孢子迅速萌發(fā)的其它營養(yǎng)溶液。營養(yǎng)溶液的實例包括椰汁或1-5%麥芽提取物溶液、0.5-25%的靈芝孢子果或靈芝孢絲的提取物、0.1-5%含生物素的培養(yǎng)溶液、0.1-3%含有磷酸二氳鉀和硫酸鎂的培養(yǎng)溶液。溶液的選擇將取決于所需的浸泡時間、待處理的孢子數(shù)量以及其它諸如材料可獲得性等因素?？墒褂靡环N以上的上述萌發(fā)溶液，添加的量是靈芝孢子重量的0.1-5倍。浸泡的時間可根據(jù)水溫而確定，并且通常30分鐘至8小時完成浸泡，水溫為20-43。C。優(yōu)選地，浸泡時間為2-4小時，且水溫為25-35。C。//.;gy么潛^;將靈芝孢子從浸泡溶液中取出，通過使其滴流而消除過量的溶液。然后將該孢子置于恒定溫度和濕度的、通風(fēng)良好的培養(yǎng)箱，以便于完成孢子培養(yǎng)活化。培養(yǎng)的相對濕度通常設(shè)為65-98%,培養(yǎng)溫度設(shè)為18-48。C，并且活化時間持續(xù)從30分鐘至24小時。優(yōu)選地，濕度為85-97%并且溫度為25-35。C。在活化過程中，靈芝孢子的細胞壁被明顯地軟化，這樣更易于滲透孢子的細胞壁。靈芝孢子的活化一般達到95%以上的比率。///^子^變付義^^.'經(jīng)萌發(fā)/活化工序之后，用酶解處理孢子。本工序是在低溫下實現(xiàn)的，并且在此條件下酶的活性得以維持，應(yīng)用工業(yè)上常用的殼多糖酶、纖維素酶或其它酶。當(dāng)孢子外壁喪失彈性并且變脆時，本工序完成。可替代地，實現(xiàn)物理處理以滲透細胞壁，例如微粉化、碾壓、研磨、超高壓微流處理，以及可實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)中常用的其它機械方法，滲透率99%以上。"f媒成'炎承；在低溫下應(yīng)用工業(yè)中常用的標(biāo)準(zhǔn)方法包括凍干或真空干燥等實現(xiàn)干燥。所獲得產(chǎn)物具有水分含量低于4%。經(jīng)干燥后，用水或醇，或者通過薄膜濃縮，提取生物活性物質(zhì)。通過滲析可進一步純化所提取的生物活性物質(zhì)，以確保最終產(chǎn)品中無污染物。最終的產(chǎn)品可制成純化的粉末、提取膏、注射或口服的溶液。關(guān)于生產(chǎn)GLS的更詳細描述可見于美國專利號6,316,002,在此通過引用全文并入作為參考。GLS是從KindwayInternationalLtd./HolistolInternationalLtd.,瑞典和香港，商業(yè)上可以獲得的。有效量的GLS是指在胎兒/新生兒中用于預(yù)防或改善GH相關(guān)神經(jīng)損傷的有用劑量。GLS的毒性和治療功效可通過在細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游锬Ｐ椭袠?biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法來確定，例如確定LD5。(50%種群致死的劑量)和ED50(在50%種群中治療上有效的劑量)。毒性和治療作用之間的劑量比率是治療系數(shù)，并且它可表示為LD5Q/ED5()。從細胞培養(yǎng)檢驗以及動物實驗獲得的數(shù)據(jù)可用于配制一定范圍的人用劑量。通常，適當(dāng)?shù)慕o藥GLS劑量可為，例如，從O.Olg/kg體重/天至20g/kg體重/天的范圍。在一種實施方案中，GLS的有效量為0.1至20g/kg體重/天之間。在另一種實施方式中，GLS的有效量為1至10g/kg體重/天之間。在另一種實施方式中，GLS的有效量為8g/kg體重/天。優(yōu)選GLS為口服給藥。所述的給藥可以是一次用藥，或者間隔的，如每日三次，每日兩次，每日一次，隔日一次，和每周一次。給藥GLS的用藥方案可基于個體的狀況和目標(biāo)需要而調(diào)整。在推注用藥后，也可應(yīng)用連續(xù)輸注。通過適宜的生物檢驗可檢測任何特定劑量的作用。可將GLS與藥學(xué)上可接受的載體一起制成藥學(xué)組合物。這里所用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"是指包括了任意和所有的溶劑、增溶劑、填充劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、堿、緩沖劑、控釋載體、稀釋劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、M介質(zhì)、包衣劑、抗菌或抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等，與藥學(xué)上給藥可相容的。在本領(lǐng)域中，用于藥學(xué)活性物質(zhì)的這種介質(zhì)和試劑是熟知的。除了與活性化合物不相容的任意常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，考慮都可用在組合物中。也可將補充試劑用于組合物中。本發(fā)明的藥學(xué)組合物可配制成與其給藥途徑，例如口服或非胃腸給藥，相容的制劑?？诜M合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可被封閉在明膠膠嚢中或壓縮成片劑。為了口服治療給藥，活性化合物可與固體載體結(jié)合并且以片劑、錠劑或膠嚢劑的形式而應(yīng)用。口服組合物也可應(yīng)用液體載體來制備。作為組合物的一部分，藥學(xué)上相容的粘合劑，和/或輔助材料可包括。片劑、丸劑、膠嚢劑、錠劑等可含有任意下列的成份，或相似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃耆膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如海藻酸、Primogd或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸^:或Stertes;助流劑如膠狀二氧化珪；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸曱酯或橘子調(diào)味劑。適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(當(dāng)水可溶時)或者用于臨時配制無菌可注射溶液或分散劑的分散劑和無菌粉末。對于靜脈給藥，適宜的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在任何情況下，可注射組合物應(yīng)當(dāng)是無菌的并且應(yīng)當(dāng)是達到易于注射程度的流動性。在制造和儲存條件下，它應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的并且必須抗微生物如細菌和真菌污染作用而保存。所述的載體可以是溶劑和分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等等)，以及它們的適宜混合物。例如，通過應(yīng)用包衣劑如卵磷脂，在分散情況下通過維持所需粒徑，以及通過應(yīng)用表面活性劑，可保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。以各種抗菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯曱酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等，可實現(xiàn)預(yù)防微生物的作用。在許多情況下，它可優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，諸如氯化鈉、糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇等)。通過在組合物中包括延長吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠，可取得延長吸收的可注射組合物。通過將在適當(dāng)?shù)娜軇┲兴枇康腉LS與必要時一種或上面列舉的成份的組合相結(jié)合，然后過濾滅菌，可制備無菌可注射溶液。通常，通過將活性化合物結(jié)合至含有堿性分散介質(zhì)以及所需的、來自上面所列舉那些的其它成份的無菌載體，制備分散劑。在用于配制無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，它從先前無菌過濾溶液得到活性成份以及任意添加所要成份的粉末。將口服或非胃腸組合物制成易于給藥和劑量一致性的劑量單元形式是有利的。如這里所用的劑量單元形式包括物理上離散單元，其作為單元劑量適于治療的個體；每個單元含有預(yù)定量的、計算與所需藥學(xué)載體一起產(chǎn)生想要治療作用的活性化合物。本發(fā)明劑量單元形式的規(guī)定受治于且直接取決于活性化合物的獨特性質(zhì)以及要實現(xiàn)的特定治療效果，以及用于個體治療在復(fù)合這種活性化合物領(lǐng)域中的自身限制。藥物組合物可包括在與用藥說明在一起的容器、包裝或分配器中。下面的實例是示例性的，并非限制本發(fā)明的范圍。這里可以進行合理的變化，例如對于適當(dāng)技術(shù)人員而發(fā)生的那些，沒有脫離本發(fā)明的范圍。另外，在描述本發(fā)明中，為了清楚應(yīng)用了特定的術(shù)語。但是本發(fā)明并非想要限制于所選的特定術(shù)語。應(yīng)當(dāng)理解的是，每一個特定元素都包括以相似方式來實現(xiàn)相似目的而運行的全部技術(shù)等同。實^i殳計動參遂一秀參/#秀。在大鼠中，應(yīng)用Yallampalli等[Yallampallietal.,AmJObstetGynecol"1993,169:1316畫1320]的L-NAME(—類NOS抑制劑)方法產(chǎn)生妊娠高血壓(GH)。40只成熟(11-12周齡)SD雌性大鼠，體重200-230g;10只成熟(13-15周齡)SD雄性大鼠，體重250-300g;以雌性雄性為1:2的比率，將大鼠在籠中成對，在第二天，觀察(涂片技術(shù))雌性大鼠陰道分泌物以及那些含有精子的被認為懷孕0天(E0)。將懷孕大鼠分成(1)正常對照組一每日腹腔注射生理鹽水+每日胃喂詞蒸餾水，從懷孕14日至20日(E14-20);(2)L-NAME+蒸餾水組(腹腔注射L-NAME+胃喂飼蒸餾水)；(3)L-NAME+精氨酸組(腹腔注射L-NAME+胃喂飼L-精氨酸32mg/kg/天)和(4))L-NAME+GLS組(腹腔注射L-NAME+胃喂飼GLS8g/kg/天)。兩次注射給予L-NAME,總用藥量為60mg/kg/天。在每次注射兩小時后，懷孕大鼠接受胃喂祠蒸餾水、L-精氨酉臾或GLS。GLS是由KindwayInternationalLtd./HolistolInternationalLtd.提供，許可號GANSPSP04040104。L-精氨酸購自Ameresco公司。組織材料的制備。在E21天，對一些懷孕大鼠進行麻醉，腹腔注射1%戊巴比妥(35mg/kg)。從子宮中取出胚胎。一些被置于冷凍機盤并且從胚胎大腦中取出海馬組織，置于Eppendorf試管并于-80。C保存待檢。將胚胎大腦的其余部分固定于4%多聚曱醛溶液。另一組懷孕大鼠進行正常生產(chǎn)，并喂飼幼鼠且伺養(yǎng)至懷孕30天(P30)。一些幼鼠接受先前的戊巴比妥麻醉并且將它們的海馬組織置于冷凍機盤并保存待檢。在P30組中，其余的大鼠接受如上的戊巴比妥麻醉，將它們的胸腔打開，穿過左心室插入主動脈插管。首先用生理鹽水快速灌注一組幼鼠，然后是4%聚曱醛0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)(pH7.4)。然后，將固定的腦冠進行連續(xù)地冷凍并且以15ium厚度切片。從海馬槽開始切片，每個切片300(am,自每個大腦獲取六個切片，從而收集六套切片。用預(yù)冷的生理鹽水快速灌注另一組的動物，隨后用含有2%戊二醛+2。/。多聚曱醛的0.1mol/LPB(pH7.4)。萃取大腦，固定并置于4。C過夜。在振蕩式切片機中對大腦樣品進行切片，厚度100pm，以1%鋨酸固定，脫水，植入樹脂并進行半薄切片。證實它是CA1區(qū)后，進行超薄切片，然后醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙電子染色，透射電子顯微鏡進行觀測和攝像。將自E21天大鼠胚胎分離到的海馬組織置于培養(yǎng)皿并剪成碎片，加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)并反復(fù)研磨，過濾通過100目篩，將得到的單細胞懸浮液固定于75%酒精、4。C,待檢。檢驗前，將萃取的細胞懸浮液離心，除去上清液，加入100jnLRNase(O.lmg/L),置于37。C、30分鐘，在用生理鹽水沖洗之后，加入碘化丙咬(PI)染色(0.05mg/L，0.03%TritonX-1000.5mL),置于4°C避光反應(yīng)30分鐘，然后#:測。在流式細胞術(shù)中，分析488nm激光應(yīng)用CellFit軟件收集的10,000細胞/樣品細胞周期數(shù)據(jù)，并且為了統(tǒng)計學(xué)處理而進行單向ANOVA檢驗(one-wayANOVAtesting)。///.i瘦jg歡化爭糴逸用11202和正常山羊血清固定海馬組織切片。滴加一抗培養(yǎng)溶液并置于4。C過夜。一抗的類型和濃度包括家兔抗體缺氧誘導(dǎo)性因子-la(HIF-la)(Boshide,1:200),大鼠抗體血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(SantaCruz,1:200),大鼠抗體因子八種相關(guān)抗原(vWF[vonWillebrand's因子])(BeijingZhongshan,工作溶液)。滴力卩PBS沖洗之后，然后加入二抗并進行特定抗原結(jié)合能力(SABC)培養(yǎng)，用DAB進行現(xiàn)影，然后進行蘇木精對染，脫水，澄清并密封。5Wt/赤記.從各個P30組的大鼠中隨機選出五只動物，接受腹腔注射，而且應(yīng)用胸腺嘧，定類似物，5-溴脫氧尿苷(BrdU)(Sigma)標(biāo)記以定位增殖細胞。將BrdU溶于含有0.007NNaOH的生理鹽水中，并且在使用前新配制。將50mg/kg注射至腹腔，并且在灌注前兩小時，大鼠接受一次注射。參考Kuhn等的方法[Kuhnetal.，J.Neurosci,1996,16:2027-2033],進行BrdU免疫組織化學(xué)染色。簡而言之，將組織切片用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次沖洗5分鐘)；在3%11202中室溫培養(yǎng)30分鐘；用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次沖洗5分鐘)；用50。/。曱醛/2XSSC、65。C孵化箱培養(yǎng)2小時；用2XSSC沖洗三次(每次沖洗5分鐘)；用2NHC1、37°C培養(yǎng)30min;用0.1mol/L硼酸鹽(boricate)緩沖液(pH8.0)沖洗三次(每次沖洗5分鐘)；用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次沖洗5分鐘)；用1:50正常山羊血清阻滯30分鐘；用小鼠抗體BrdU單克隆抗體(Sigma,1:400)于4。C培養(yǎng)過夜；用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次沖洗5分鐘)；與1:200生物素標(biāo)記的綿羊抗-小鼠IgG室溫反應(yīng)30分鐘；用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次沖洗5分鐘)；用1:100SABC室溫培養(yǎng)30分鐘；用DAB顯色；用蘇木精對染，然后進行常規(guī)的固定和脫水。多,悉都量夢^^f.檢測源自海馬各個區(qū)域的各種細胞層厚度并獲得神經(jīng)元體計數(shù)。借助低倍顯微鏡，從CA1、CA3和DG區(qū)隨機選擇兩個可見區(qū)域。借助高倍顯微鏡(200x)，測定細胞層厚度并計數(shù)有核的神經(jīng)元體數(shù)目。細胞層厚度或體數(shù)目是兩個可見區(qū)域的平均數(shù)。雄馬,j&^密乂f;應(yīng)用Weidner計數(shù)法以確定微血管標(biāo)準(zhǔn)[Weidneretal.，AmJPathol.1995,147:9-19],其應(yīng)用細胞質(zhì)的陽性vWF染色作為血管內(nèi)皮細胞的指示。檢驗的區(qū)域為在錐體層和分子層上的微血管。借助光顯微鏡(200x),在五個可見區(qū)域內(nèi)計數(shù)微血管數(shù)目。微血管密度為五個區(qū)域的平均數(shù)。漆^份^7/W4勿應(yīng)^"炎.對于每一個動物，在源自齒狀腦回粒細胞層的六個大腦切片中對BrdU陽性細胞數(shù)目進行計數(shù)。才艮據(jù)Kuhn等的方法[Kuhnetal.,JN函sci.1996，16:2027-2033],將顆粒下區(qū)(SGZ)定義為每個顆粒層內(nèi)兩個顆粒細胞寬度的區(qū)域。應(yīng)用自六個大腦切片中每個的一面的海馬SGZ以獲得總的BrdU陽性細胞計數(shù)。/K逆#求-炎合躇鏈^^^對于每一組，收集分離海馬組織的三個樣品，并且根據(jù)Trizol試劑說明書萃取總組織RNA。5|ugRNA在下列條件下經(jīng)受室溫反應(yīng)合成cDNA:70。C5分鐘，42。C60分鐘，94°C5分鐘。HIF-la引物序列為上游引物5'GGCTGGGCAACTACGTCATC3'(SEQIDNO:l)下游引物5'CCATGCACCTTAACATCCCA3'(SEQIDNO:2);VEGF引物序列為上游引物5'AATTGAGACCCTGGTGGACATC3'(SEQIDNO:3);下游引物5'TCTTTCTTTGGTCTGCATTCAC3'(SEQIDNO:4);內(nèi)標(biāo)GAPDH引物序列為上游引物5'GTGCTGAGTATGTCGTGGAGT3'(SEQIDNO:5);下游引物5'GATGGCATGGACTGTGGTCA3'(SEQIDNO:6)。才艮據(jù)下列順序進行PCR反應(yīng)94。C預(yù)變性45秒，60°C復(fù)性1分鐘；72。C延伸1.5分鐘秒；當(dāng)周期完成時，72。C延伸5分鐘然后停止反應(yīng)。然后用2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。Pf，飾/從每組中收集三個樣品的被分離海馬組織用于均化。用10%SDS-PAGE分離20嗎蛋白質(zhì)并且電子方法地轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用無脂奶粉室溫阻滯該膜2小時，然后用小鼠抗-VEGF單克隆抗體(SantaCruz1:200)或者家兔抗-HIF-la多克隆抗體(武漢Boshide,l:200)于4。C培養(yǎng)過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水和吐溫(PBST)沖洗該膜，并且用軛合山羊抗-小鼠IgG(SantaCruz，1:5000，用于小鼠抗-VEGF抗體)或者山羊抗-家兔IgG(SantaCmz,1:5000，用于家兔抗-HIF-la抗體)的辣根過氧化物酶室溫培養(yǎng)2小時。將小鼠抗-GAPDH單克隆抗體(ShanghaiKangcheng,1:10000)標(biāo)記的辣根過氧化物酶與軛合山羊抗-小鼠IgG或者山羊抗-家兔IgG.的辣才艮過氧化物酶一起滴加。然后以PBST沖洗該膜并且用ECL[增強化學(xué)發(fā)光]化學(xué)發(fā)光技術(shù)顯影。W.^#浙借助SPSS10.0統(tǒng)計軟件、應(yīng)用單因素方差分析，對所有的實驗數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計學(xué)處理，而且計算結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。^:M;勿應(yīng)^:錄果表1為四組E21天的大鼠胚胎大腦海馬細胞周期的比較。結(jié)果表明，應(yīng)用L-NAME顯著性降低DNA合成期(S期)海馬細胞的百分數(shù)，并且增加G0/G1期細胞的百分數(shù)。然而，在L-NAME+GS組中S期細胞的數(shù)目是統(tǒng)計學(xué)上不同于L-NAME+DW組的，并且與正常對照組的沒有統(tǒng)計學(xué)上的不同。盡管L-NAME+Arg組中動物與L-NAME+DW組相比也表現(xiàn)為S期細胞增加，但是這種增加不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。然而，L-NAME+Arg組具有最大百分數(shù)的G1/G0期細胞，與正常對照組和L-NAME+靈芝孢子組的那些相比，其為統(tǒng)計學(xué)上顯著的。結(jié)果表明，在E21天大鼠胚胎中應(yīng)用GLS將S期海馬細胞數(shù)目恢復(fù)至接近正常的水平。表1.E21天大鼠胚胎海馬細胞在細胞周期各時期的百分數(shù)(x士sx，％)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>DW:蒸餾水；L-arg:L-精氨酸；GS:靈芝孢子單因素方差分析(單向ANOVA):S期arSd，aWj,drajP〈0.05;arag，dMg尸>0.05G1/G0期bFSe,erakPO,05;bF5h,bF5k,hF5Tc戶>0.05G2/M期craf,crai，crai,fFSi,fFSl,iraii5>0.055^/"#尹記如圖1所示，BrdU陽性細胞主要分布于P30幼鼠的海馬齒狀腦回中。表2表明，與正常對照組相比，L-NAME+DW組和L-NAME+Arg組具有較少的BrdU陽性細胞(也可參見圖1A-1C)。與L-NAME+DW組相比較，L-NAME+GLS組具有增加數(shù)目的BrdU陽性細胞(圖1D),這與正常對照組沒有顯著性不同。這種結(jié)果表明，GLS能夠?qū)rdU陽性細胞計數(shù)恢復(fù)至正常水平。凈馬凝Af^^和超凝潛^^f必.表3中結(jié)果表明，在L-NAME+DW組中，E21天海馬微血管密度明顯地增加(圖2B)。在應(yīng)用GLS之后，微血管密度(圖2D,表4)被降低至正常對照組的水平(圖2A)。盡管微血管密度隨著精氨酸的給予而降低(圖2C,表4),但是減少的數(shù)量沒有應(yīng)用GLS的大。在四組幼鼠中，P30天海馬微血管密度沒有統(tǒng)計學(xué)上不同。但是，與正常對照組相比，隨著L-NAME的給予，在海馬CAl區(qū)毛細管壁超孩i結(jié)構(gòu)上的血管內(nèi)皮細胞中出現(xiàn)空泡(圖3A)(圖3B),所述脈管的管周結(jié)構(gòu)是云狀的且不清楚，而且還有空泡，并且所述脈管的基底膜更厚。然而，在應(yīng)用GLS之后，CA1區(qū)血管內(nèi)皮細胞和血管壁結(jié)構(gòu)更加完整(圖3C)。表3.在P30大鼠中海馬齒狀腦回的BrdU陽性細胞計數(shù)(x土sd).<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>DW:蒸餾水；L-arg:L-精氨酸；GS:靈芝孢子單因素方差分析(單向ANOVA):E21:aFSt,cragP<0.01;aFSe，cFSe，eFSg_P<0.05;aragP>0.05P30:b5f，brai，dKST，drai,歸P>ftft5漆4勿應(yīng)^岸,^都定和#經(jīng)^傳#炎/.在中性紅染色之后，觀察L-NAME+DW組(圖4，板Ba，Bb，和Be)和L-NAME+L-arg組(圖4,板Ca,Cb和Cc)P30大鼠在海馬CAl區(qū)，CA3區(qū)和DG細胞層厚度，并與正常對照組對比(圖4，板Aa,Ab,和Ac)。神經(jīng)元體計數(shù)明顯地減少(表5)。在應(yīng)用GLS之后，CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG細胞層厚度和神經(jīng)元體計數(shù)都達到恢復(fù)性增加(圖4，板Da,Db,和Dc，表5)。結(jié)果表明，在應(yīng)用GLS之后，在海馬神經(jīng)元體計數(shù)方面實現(xiàn)恢復(fù)性增加是可能的，隨著給予精氨酸未觀察到這種作用。表5.P30大鼠中海馬細胞層厚度(x±sd,pm)和神經(jīng)元體計數(shù)(x±sd,num).組別CAl(nm)CA1(誦)CA3(iara)CA3(n—DG(,)正常對照130.01±8.03a41.20±1.35b104.42士7.2ie38.00±3.01d84.06±1.37eL-NAME+DW100.78±3.65s27.60±1.36h79.30i6.69126.60±1.36*59.4l±5.31kL-NAME+L-arg115.23±9.49m31.80±1.15n90.64±6.18°23.00±0.83p64.87±4.42qL-NAME+GS125.60±7.30s38.00±1.58'93.70±9.78u35.20±1.28v75.12±3.81w單因素方差分析(單向ANOVA):CAl(nm):arag，gFSs戶O.05;aram，aFSs，gMni,mFSsP>0.05CA1(num):bF5h，bKSn,b(^h，nrat,hKSnP<0.05;bF汰nFSt尸>0.05CA3(nm):cFSi尸<0.05;cFSo,cFSu,iFSo，iKSu,oFSu,尸>0.05CA3(num):dFSj,dKSp，pFSv/><0.01;dr5V;jKSpP>0.05DG(nm):e離，eSw，e^5Sv，qF5\v尸<0.05;kraqP>0.05舉馬*FEGFW4逸在E21和P30海馬組織中，對HIF-la和VEGFmRNA以及蛋白質(zhì)表達水平進行RT-PCR和Western-Blot檢驗。才t險結(jié)果示于圖5A和5B。對于各組E21海馬內(nèi)HIF-lamRNA及其蛋白質(zhì)表達，在L-NAME+蒸餾水組和L-NAME+精氨酸組中HIF-lamRNA及其蛋白質(zhì)表達水平應(yīng)當(dāng)高于正常對照組中(圖5A和5B)。在應(yīng)用GLS之后，HIF-lamRNA及其蛋白質(zhì)表達未表現(xiàn)明顯的增加。在正常對照組P30海馬中，未檢測到HIF-lamRNA及其蛋白質(zhì)表達。L-NAME+蒸餾水組和L-NAME+精氨酸組都具有可檢測到的HIF-lamRNA以及蛋白質(zhì)表達水平。在應(yīng)用GLS之后，未見HIF-lamRNA及其蛋白質(zhì)表達。同時，在各組中E21和P30海馬組織HIF-la蛋白質(zhì)表達的免疫組織化學(xué)沖企驗與Western-Blot檢驗的結(jié)果是一致的。對于正常對照組，可以檢測到E21海馬中的VEGFmRNA及其蛋白質(zhì)表達；然而，在正常對照組的P30海馬中未能檢測到VEGFmRNA及其蛋白質(zhì)表達(圖5A和5B)。在P30海馬中，在L-NAME+蒸餾水組中仍可以檢測到VEGFmRNA及其蛋白質(zhì)表達。應(yīng)用靈芝孢子之后，在E21海馬中，可以檢測到VEGFmRNA及其蛋白質(zhì)表達，然而在P30海馬中未4全測到VEGFmRNA及其蛋白質(zhì)表達。這種情況類似于正常對照組中VEGFmRNA及其蛋白質(zhì)表達。在各組海馬組織中E21和P30的免疫組織化學(xué)結(jié)果與上述Western-Blot4僉-瞼的那些結(jié)果相類似。離^論本研究證明了，在懷孕雌性中，GH特別是先兆子癇導(dǎo)致胚胎中海馬缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-la)以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達增加，并且這種表達在新生兒中延續(xù)。GLS治療將海馬HIF-la和VEGF表達恢復(fù)至正常水平，并且預(yù)防在海馬細胞增殖和神經(jīng)元數(shù)目方面的減少以及在在海馬組織中異常的發(fā)展。在本說明書中示例及討論的實施方案只是想要教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員本發(fā)明人所知的最佳方式，以制造和使用本發(fā)明。不應(yīng)當(dāng)將本說明書認為是對本發(fā)明保護范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述的教導(dǎo)，對于本發(fā)明的上述實施方案可進行修改或改變，增加或省略技術(shù)特征元素，且未背離本發(fā)明。因此，應(yīng)當(dāng)理解為，在權(quán)利要求及其等同的保護范圍內(nèi)，可實現(xiàn)本發(fā)明，除非特別說明。權(quán)利要求1.萌發(fā)活化破壁靈芝孢子(GLS)用于制備預(yù)防或改善由于懷孕雌性的母體妊娠高血壓而導(dǎo)致的哺乳動物胎兒或新生兒疾病的藥物的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述疾病選自哺乳動物胎兒或新生兒中神經(jīng)損傷、哺乳動物胚胎中海馬缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-la)表達增加、哺乳動物胚胎中海馬血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達增加。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述GLS的制備方法包括以下步驟將靈芝孢子浸泡在溶液中以引起孢子萌發(fā)，所述的溶液選自水、鹽水和營養(yǎng)溶液組成的組；將所萌發(fā)處理的靈芝孢子置于培養(yǎng)箱，以65-98%的相對濕度和18-48°C的溫度來引起已萌發(fā)靈芝孢子活化；和破壞所萌發(fā)活化靈芝孢子的孢壁以產(chǎn)生所述的GLS。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的懷孕雌性是人類。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的懷孕雌性是嚙齒動物。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的妊娠高血壓是先兆子癇。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述的先兆子癇是由N-co-硝基-L-精氨酸曱酯引起的。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的神經(jīng)損傷是指細胞增殖的減少。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的神經(jīng)損傷是指神經(jīng)元數(shù)量的減少。10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述神經(jīng)損傷是在大腦的海馬區(qū)。全文摘要本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或改善哺乳動物胎兒或新生兒中神經(jīng)損傷的方法，所述的損傷是由母體妊娠高血壓(GH)而引起的。該方法包括對患有GH的懷孕哺乳動物口服給藥萌發(fā)活化破壁靈芝孢子(“GLS”)。所述的神經(jīng)損傷包括海馬細胞增殖和神經(jīng)元數(shù)量的減少。本發(fā)明進一步提供了一種用于預(yù)防或改善由于母體GH而導(dǎo)致哺乳動物胚胎中海馬缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1a)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)增加表達的方法。文檔編號A61K36/16GK101204406SQ20071012968公開日2008年6月25日申請日期2007年8月14日優(yōu)先權(quán)日2006年8月14日發(fā)明者張志強,曾園山申請人:偉善國際有限公司