專利名稱：二倍體細(xì)胞乙型腦炎疫苗及純化乙型腦炎疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型腦炎的純化疫苗的制備方法，特別是在人二倍體細(xì)胞上 接種乙腦病毒毒種得到的乙型腦炎純化疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
目前世界上大量生產(chǎn)的乙腦疫苗有三種，第一種是以日本為代表的用感染乙 腦病毒的小白鼠腦組織經(jīng)過研磨、乳化、濃縮、超速離心制備的純化乙腦疫苗； 第二種是中國生產(chǎn)的原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的乙腦滅活疫苗和原代地鼠腎乙腦活 疫苗，這兩種疫苗的細(xì)胞基質(zhì)均來源于普通級動物，無法保證不攜帶外源因子； 第三種是北京生物制品研究所以Vero細(xì)胞為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)的凍干乙腦純化滅活 疫苗，但不能保證細(xì)胞基質(zhì)的致腫瘤和細(xì)胞的DNA。
中國專利2004100581129描述了一種人二倍體細(xì)胞-WI-38乙型腦炎純化疫苗， 該疫苗的制備采用的細(xì)胞營養(yǎng)液由199培養(yǎng)液加入2-10%牛血清配制而成。 無血清培養(yǎng)基(Serum-free Media)被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動物和無脊椎動物 細(xì)胞以制備單克隆抗體、病毒抗原和重組蛋白等。無血清培養(yǎng)基必須能夠滿足細(xì) 胞的一系列營養(yǎng)及生理需求，而通常情況下這些營養(yǎng)及生理需求是由加入到培養(yǎng) 基中的血清來予以提供的。大多數(shù)的無血清產(chǎn)品含有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的轉(zhuǎn)鐵蛋 白和調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質(zhì)如清蛋白、纖連蛋白、胎球蛋 白等，這些蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反 應(yīng)器剪切力，提供細(xì)胞貼壁所需的基質(zhì)，作為脂類和其他生長因子的載體等。 本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)，通過使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞乙腦純化疫苗，可 使過敏反應(yīng)大大降低，同時有利于純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種人二倍體細(xì)胞乙腦純化疫苗的制備方法。 本發(fā)明采用人二倍體細(xì)胞-WI-38來制備乙型腦炎純化疫苗，該疫苗是在人 二倍體細(xì)胞上接種乙腦病毒毒種，經(jīng)分離純化得到的乙型腦炎疫苗。所述乙腦病 毒毒種選自乙腦鼠腦毒種Ps株或SA14-14-2株。本發(fā)明的疫苗是凍干注射劑或
水針劑。
本發(fā)明的疫苗的制備方法，包括以下步驟
(1) 、人用二倍體細(xì)胞的復(fù)蘇；
(2) 、人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增；
(3) 、在人用二倍體細(xì)胞上接種乙腦病毒毒種；
(4) 、收獲病毒液；
(5) 、病毒液的滅活；
(6) 、澄清超濾；
(7) 、純化；
(8) 、稀釋分裝。
所述人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增是在細(xì)胞營養(yǎng)液中進(jìn)行的，細(xì)胞營養(yǎng)液由無 血清培養(yǎng)液組成?？梢匝a(bǔ)充適量的抗生素。所述人二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增是在轉(zhuǎn) 瓶內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)方式為微載體培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)或細(xì)胞袋培養(yǎng)。
在本發(fā)明的乙腦純化疫苗的制備工藝中，細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是無血清培
養(yǎng)基，采用純化超濾純化初步純化，蔗糖密度梯度離心法和S印harose 4FF凝膠 過濾層析進(jìn)行更純提純。測試結(jié)果表明，經(jīng)過本發(fā)明的三步提純后，可使疫苗總 蛋白含量減少約99%以上，疫苗免疫效果大大提高，副反應(yīng)大大降低，加入氫氧 化鋁佐劑后使疫苗的效價提高20%，穩(wěn)定性同時大大提高，接種時減緩病毒釋放 的速度，保持良好的抗體水平。通過純化疫苗加入佐劑能增加疫苗的持久性，疫 苗能夠持久刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。
本工藝提供的人二倍體乙型腦炎純化疫苗，是指在人二倍體細(xì)胞上接種乙腦 病毒毒種得到的乙型腦炎純化疫苗。本工藝具體的制備方法包括以下步驟
(1) 、人二倍體細(xì)胞的復(fù)蘇；
(2) 人二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增；
(3) 、在人二倍體細(xì)胞上接種乙腦病毒毒種；
(4) 、收獲病毒；
(5) 、滅活病毒制成粗疫苗；
(6) 澄清過濾；
(7) 、超濾純化；
(8) 、蔗糖密度梯度離心；(或DEAE-SepharoseFF陰離子交換)
(9) 、 S印harose4FF柱層析純化；
(10) 、佐劑吸附加保護(hù)劑人血白蛋白(或不加佐劑吸附)
(11) 、稀釋分裝。
本工藝使用的人二倍體細(xì)胞種來源于中國疾病預(yù)防控制中心，首先建立細(xì)人 二倍體細(xì)胞種子庫和人二倍體細(xì)胞工作庫，并對細(xì)胞庫細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)的檢定。在 制備疫苗之前，需先進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和擴(kuò)增，以達(dá)到生產(chǎn)批量的需要?？?使用無血清培養(yǎng)基補(bǔ)充適量的抗生素配制而成的細(xì)胞營養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為 PH7, 0-7. 6在37±0. 5°C溫度下進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。
各種用于制備疫苗的哺乳動物細(xì)胞均為附著依賴性細(xì)胞，細(xì)胞在一定的載體 上生長，本工藝中細(xì)胞的培養(yǎng)方式為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，包括微載體培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、細(xì) 胞袋培養(yǎng)。
為防止細(xì)菌污染，在配制細(xì)胞營養(yǎng)液的同時可加入適量的卡那霉素或慶大霉素。
培養(yǎng)過程中，細(xì)胞分種率根據(jù)生產(chǎn)批量的需要確定， 一般可以是l: 2-1: 4 當(dāng)細(xì)胞長成致密單層后，即可接種乙腦病毒，細(xì)胞維持液中最好加入
0.4-0.5。/。(w/w)的人血白蛋白，同時調(diào)整PH7.2-7.8，培養(yǎng)溫度32-37。C，并可加 入適量的氨基酸和抗生素，可供使用的無血清培養(yǎng)液選自 UltraCULTURETM培養(yǎng)基(通用無血清培養(yǎng)基)
12-725F UltraCULTURE MEDIUM (Serum-free general purpose medium) 500 ml 988.80
PC-1TM培養(yǎng)基(通用無血清培養(yǎng)基)
77232 PC-1 Complete Serum-Free Medium 2x500ml 2， 206. 26
77230 PC-l Complete Serum-Free Medium (powder plus supplement) 10 L
12, 566. 00
344022 PC-1 Supplement (50X) 10 ml 875.50 UltraMEM Reduced Serum培養(yǎng)基(通用無血清培養(yǎng)基)
12-745F UltraMEM Reduced Serum Medium (Protein-free basal medium without L-glutamine) 500 ml 449. 08
12-743F UltraMEM Reduced Serum Medium (Low-protein medium containing L-glutamine & ITES) 500 ml 519.12 X-VIVOTM無血清培養(yǎng)基
04-380Y X-VIVOTM 10(with Gentamycin and phenol red) 1 liter 1386.38 04-380Q X-VIVOTM lO(with Gentamycin and phenol red) 1 liter 1386.38 08-022A X-VIVOTM 10(with Gentamycin) 4 liter 6241.80
04-743Q X-VIVOTM 10(without Gentamycin or phenol red) 1 liter 1948.76 04-418Y X-VIVOTM 15 (with Gentamycin) 1 liter 1643.88
04-418Q X—VIVOTM 15 (with Gentamycin and phenol red) 1 liter 1602.68 08-055B X-VIVOTM 15 (with Gentamycin) 10 liter 16020.62 04-744Q X-VIVOTM 15 (without Gentamycin & phenol red) 1 liter 1831.34
04-448Q X-VIVOTM 20 (with Gentamycin and phenol red) 1 liter 1643.88
然后在已經(jīng)生長成致密單層的人二倍體細(xì)胞上接種乙腦病毒毒種 MOI0. 1-0. 00001及上述細(xì)胞維持液，培養(yǎng)72小時左右，即可收獲病毒。
本工藝在人二倍體細(xì)胞上接種的乙腦病毒為在傳代的人二倍體乙腦病毒種， 有實驗結(jié)果顯示，乙腦病毒在人二倍體細(xì)胞上能夠很好地生長繁殖，在人二倍體 細(xì)胞傳代乙腦病毒IO代以內(nèi)很穩(wěn)定，并且制備人二倍體細(xì)胞乙腦疫苗方面，10 代以內(nèi)的細(xì)胞傳代毒種的免疫原性沒有明顯改變，而io代以后的毒種的免疫原 性則有明顯的下降，也就是說，制備疫苗最好選用10代以內(nèi)的傳代毒種，10代 以后的毒種不宜用于制備純化疫苗。至于毒種則優(yōu)選乙腦鼠毒種P3株在人用二 倍體細(xì)胞的傳代毒種。
乙腦病毒在人二倍體細(xì)胞上的生長繁殖可維持較長時間，因此病毒的收獲可 采取多次收取的方式，最好是第3-4天收獲一次，對收獲的病毒液及時測定病毒 滴度，要求每批所收獲病毒液病毒滴度均應(yīng)在107LD50/ml以上，因為只有高滴 度的病毒液才能保證疫苗的高效力。
收獲的病毒液用甲醛溶液或e -丙內(nèi)酯滅活病毒得到的是粗疫苗。滅活后的粗疫苗需要進(jìn)行濃縮提純制備成純疫苗制品，本工藝選用 Sepharose中空纖維純化超濾的方法對得到的粗疫苗進(jìn)行濃縮， 一般是用截留10 萬-30萬分子量的超濾器濃縮疫苗，濃縮至20倍以上，然后純化疫苗。
以人用二倍體細(xì)胞制備生物制品安全性的關(guān)鍵是雜蛋白的含量。疫苗的總蛋 白量必須小于15ug/ml。有關(guān)疫苗的純化方法包括化學(xué)法和物理方法等可以有多 種，經(jīng)反復(fù)試驗和研究，本工藝提出純化方法超濾純化、超離純化和S印harose 4FF柱層析純化。
超濾純化疫苗即把疫苗超濾濃縮到一定倍數(shù)，然后加入適量的PBS沖洗，再 深縮到原倍數(shù)，再加入適量的PBS沖洗如此反復(fù)5-6次，雜蛋白可以去除93%以 上，再經(jīng)過蔗糖密度梯度離心法參考石慧穎1998年發(fā)表的大規(guī)模區(qū)帶離心純化 的方法純化Vero細(xì)胞乙腦疫苗的方法，用36%和45% (W/V)蔗糖溶液作密度梯 度，23000rpm超速離心4小時后,經(jīng)過對紫外吸收峰的抗原含量，蛋白濃度的分 析，確定病毒抗原所在位置。然后再經(jīng)過S印harose4FF純化，而凝膠過濾層析 是層析技術(shù)中最簡單，條件最溫和，對保持生物大分子的活性最有利的方法，適 合分離分子量懸殊的物質(zhì)，乙腦病毒的分子量在400萬以上，與疫苗中的雜蛋白 分子量相差較大，故使用凝膠柱層析可以非常方便有效地去除疫苗中殘留的小分 子雜質(zhì)，該凝膠過濾柱可以是S印harose 4FF柱或其他凝膠，而檢測結(jié)果表明， 經(jīng)三歩層析柱純化后，疫苗總蛋白含量減少約99%以上，而且比規(guī)程所要求的含 量更低。純化疫苗制成成品(即水針劑型)，加入保護(hù)劑人血白蛋和氫氧化鋁佐 劑。用人二倍體細(xì)胞作為疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)，并且以人二倍體細(xì)胞的傳代毒種代替 現(xiàn)有的鼠腦組織毒種，通過相應(yīng)的工藝方法生產(chǎn)制備出高質(zhì)量的乙腦疫苗。用本 工藝制備的乙型腦炎純化疫苗中不含鼠腦組織，純度高，免疫效果大大提高，使 用安全性高，并能實現(xiàn)乙腦疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
本工藝制備的疫苗經(jīng)提純后抗原活性明顯提高，雜蛋白減少99%以上，疫苗 的純度大大提高。
具體實施方式
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以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。 實施例1
二倍體細(xì)胞來自中國疾病預(yù)防控制中心，使用38-50代，細(xì)胞營養(yǎng)液為無血
清培養(yǎng)基中加入25IU/ml慶大霉素或25IU/ml卡那霉素，并調(diào)整PH到7.2,用 3L轉(zhuǎn)瓶37"C培養(yǎng)成致密單層后按照1: 2分種率擴(kuò)增，擴(kuò)增到生產(chǎn)批量時，經(jīng)過 4天左右，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層，棄去細(xì)胞營養(yǎng)液，接種二倍體細(xì)胞乙腦病毒， 使用乙腦鼠腦毒種P:,株在二倍體細(xì)胞上傳代的第二代工作毒種(Pw)，毒種濃度 M0I0. 05，細(xì)胞維持液為含0, 4-0. 5M(W/W)人白蛋白的199培養(yǎng)液，PH7, 6， 35。C下 培養(yǎng)，24小時后換以新鮮細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)2天，開始收獲病毒，每3-4天 收獲一次，共收5次，每批病毒液均取樣進(jìn)行病毒滴定和無菌試驗，要求收獲病 毒液的病毒滴度達(dá)到107LD50/ml以上;合并病毒液加入甲醛溶液或P-丙內(nèi)酉旨(終 濃度1/2000)置于26土rc， 8天滅活病毒，得到粗疫苗，用截留30萬分子量的 超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗。
超濾純化的濃縮疫苗蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾柱S印harose 4FF， 經(jīng)三步純化，得到純化疫苗，加入人血蛋白保護(hù)劑和氫氧化鋁佐劑制成純化疫苗 成品，分裝，制成乙型腦炎純化疫苗為水針劑型5ml或其他規(guī)格。
檢定疫苗效力達(dá)到了中國乙腦疫苗參考品和日本乙腦疫苗參考品要求，其 他各項檢定均合中華人民共和國藥典標(biāo)準(zhǔn)2005版生物制品規(guī)程的疫苗要求。 實施例2
二倍體細(xì)胞來自中國疾病預(yù)防控制中心，使用38-50代，細(xì)胞營養(yǎng)液為無血 清培養(yǎng)基中加入25IU/ml慶大霉素和25IU/ml卡那霉素，并調(diào)整PH到7. 2，用 3L轉(zhuǎn)瓶37nc培養(yǎng)成致密單層后按照l: 2分種率擴(kuò)增，擴(kuò)增到生產(chǎn)批量時，經(jīng)過 4天左右，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層，棄去細(xì)胞營養(yǎng)液，用PH7. 2的Earl's液沖洗細(xì) 胞面，接種二倍體細(xì)胞乙腦病毒，使用乙腦鼠腦毒種AS14-14-2株在二倍體細(xì)胞 上傳代的第二代工作毒種(P:,-2)，毒種濃度MOI0.05,細(xì)胞維持液為含 0. 4-0. 5%(\￥/\0人白蛋白的199培養(yǎng)液，PH7. 6， 350C下培養(yǎng)，24小時后換以新鮮 細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)2天，開始收獲病毒，每3-4天收獲一次，共收5次，每批 病毒液均取樣進(jìn)行病毒滴定和無菌試驗，要求收獲病毒液的病毒滴度達(dá)到 107LD50/ml以上；合并病毒液加入甲醛溶液或e-丙內(nèi)酯(終濃度1/2000)置于 26土1"C， 8天滅活病毒，得到粗疫苗，用截留30萬分子量的超濾器濃縮成20 倍濃縮疫苗。
超濾純化的濃縮疫苗過蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾柱S印harose 4FF，
經(jīng)三步純化，得到純化疫苗，加入人血蛋白保護(hù)劑和氫氧化鋁佐劑制成純化疫苗 半成品，分裝，制成乙型腦炎純化疫苗為水針劑型2ml或其他規(guī)格。
檢定疫苗效力達(dá)到了中國乙腦疫苗參考品和閂本乙腦疫苗參考品要求，其他 各項檢定均合中華人民共和國藥典標(biāo)準(zhǔn)2005版生物制品規(guī)程的疫苗要求。
實施例3
用權(quán)利要求1方法制備的乙腦滅活疫苗經(jīng)實驗(包括給12名4-6歲兒童注 射，未接種過乙腦疫苗者，接種2針乙腦滅活疫苗，兩針間隔7 — 10天。)證明 中和抗體陽轉(zhuǎn)率為91.7%，無副反應(yīng)發(fā)生。
實施例4
用權(quán)利要求1方法制備的乙腦滅活疫苗經(jīng)實驗給58名4-6歲兒童注射，未 接種過乙腦疫苗者，接種2針乙腦滅活疫苗，兩針間隔7 — 10天，過敏反應(yīng)為O
而用2004100581129專利描述的方法制備的乙型腦炎純化疫苗(注該疫苗 的制備采用的細(xì)胞營養(yǎng)液由199培養(yǎng)液加入2-10%牛血清配制而成)給45名兒 童注射，有兩名兒童出現(xiàn)紅腫。
權(quán)利要求
1、一種人用二倍體細(xì)胞乙型腦炎純化疫苗的制備方法，包括(1)、人用二倍體細(xì)胞的復(fù)蘇；(2)、人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增；(3)、在人用二倍體細(xì)胞上接種乙腦病毒毒種；(4)、收獲病毒液；(5)、病毒液的滅活；(6)、澄清超濾；(7)、純化；(8)、稀釋分裝步驟，其特征在于，其中步驟(2)所述人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增是在細(xì)胞反應(yīng)罐中進(jìn)行，培養(yǎng)方式為微載體培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)或細(xì)胞袋培養(yǎng)，采用無血清培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為PH7.0-7.6，溫度在37±0.5℃。
2、 權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基是通用無血清培養(yǎng) 基。
3、 權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基含有抗生素慶大霉 素和卡那霉素。
4、 權(quán)利要求l的制備方法，其特征在于，其中培養(yǎng)條件PH為7.2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種二倍體細(xì)胞乙型腦炎疫苗及純化乙型腦炎疫苗的制備方法，該方法使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞乙腦純化疫苗，可使過敏反應(yīng)大大降低，同時有利于純化。
文檔編號A61K39/12GK101352569SQ200710129799
公開日2009年1月28日 申請日期2007年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者棟 崔 申請人:棟 崔