專利名稱：：丹酚酸a在預(yù)防和\或治療糖尿病及并發(fā)癥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及丹酚酸A在制備防治糖尿病高血糖癥，糖尿病心血管并發(fā)癥，糖尿病腎病，糖尿病末梢神經(jīng)病變，末梢循環(huán)障礙(血管病、糖尿病性壞疽、足潰瘍)，肥胖癥，高脂血癥，促進(jìn)傷口愈合(各種創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、皮膚糜爛、褥瘡、植皮、放射所致的皮膚、粘膜損傷)藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：糖尿病是一種以血液中葡萄糖濃度增高為特征的代謝性疾病群。引起血糖增高的病理生理機(jī)制是胰島素分泌缺陷及胰島素作用缺陷。明顯血糖增高時(shí)可出現(xiàn)多尿、多飲、體重減輕，有時(shí)尚可伴多食及視力模糊。糖尿病的急性酮癥酸中毒及非酮癥高滲綜合征是可危及生命的并發(fā)癥。糖尿病患者長(zhǎng)期血糖增高可致各器官組織損害，引起功能不全以致功能衰竭。在糖尿病的慢性并發(fā)癥中，主要表現(xiàn)為腎功能衰竭、周圍神經(jīng)病變引起活動(dòng)障礙及足病變、自主神經(jīng)病變(可出現(xiàn)胃腸道、泌尿生殖及心血管等系統(tǒng)的表現(xiàn))，視網(wǎng)膜病變可導(dǎo)致視力喪失，糖尿病也可導(dǎo)致或促進(jìn)脈粥樣硬化性心血管、周圍血管、腦血管病的發(fā)生和發(fā)展，而且與高血壓、脂代謝異常密切相關(guān)。糖尿病導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量將降低，壽限將縮短，病死率增高。丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)為唇形科鼠尾草屬植物的干燥根。具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩之功效。丹參是一重要的傳統(tǒng)中藥，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為丹參有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效。近來(lái)對(duì)丹參的作用研究主要集中在改善心、肝、肺、腦等臟器的缺血再灌注損傷；對(duì)肝細(xì)胞的損傷；肝纖維化、肝硬變、肝癌的作用；調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；抗感染和抗腫瘤等方面，而對(duì)丹參及其成分在防治糖尿病及其并發(fā)癥方面，主要通過其活血化瘀作用，降低血粘度，改善血液循環(huán)，對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的直接治療作用尚沒有報(bào)道。丹參作為臨床上常用的一種傳統(tǒng)藥物，其活性成分越來(lái)越引起醫(yī)學(xué)^f究者的重視，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所首先從丹參中發(fā)現(xiàn)了多種丹酚酸，其中丹酚酸A是重要的一種水溶性成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，丹參中丹酚酸類成分的抗心肌缺血缺氧的活性比丹參素和原兒茶醛更強(qiáng)，其中丹酚酸A是目前已知的最強(qiáng)的抗氧化化合物之一，并且還具有改善記憶、抑制血小板聚集、降低抗癌藥阿霉素毒性等作用。抗肝損傷、肝纖維化作用，防治動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心肌損傷作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，抗腫瘤作用、改善記憶功能障礙、防治白內(nèi)障、抑制血小板功能等作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種新的藥物。即丹酚酸A在制備預(yù)防和\或治療糖尿病相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的糖尿病是2型糖尿病。所述的糖尿病相關(guān)疾病選自糖尿病高血糖癥、糖尿病血管病變、糖尿病腎病、糖尿病末梢循環(huán)功能障礙、糖尿病外周神經(jīng)病變、糖尿病合并高脂血癥血脂。所述的末梢循環(huán)障礙包括血管病、糖尿病性壞疽、足潰瘍。丹酚酸A在制備預(yù)防和\或治療高脂血癥藥物中的應(yīng)用。丹酚酸A在制備促進(jìn)機(jī)體ATP生成藥物中的應(yīng)用。丹酚酸A在制備促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。所述的傷口的引起原因包括創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、皮膚糜爛、褥瘡、植皮、放射所致的皮膚、粘膜損傷。丹酚酸A在制備預(yù)防和\或治療肥胖癥的藥物中的應(yīng)用。丹酚酸A在制備降低正常哺乳動(dòng)物體重的藥物中的應(yīng)用。為了完成本發(fā)明之目的，可采用如下技術(shù)方案本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的1、丹酚酸A降糖、降低體重作用的研究(1)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)正常小鼠血糖及體重的影響，結(jié)果顯示丹酚酸A具有降低正常動(dòng)物血糖及體重作用。(2)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響，結(jié)果顯示丹酚酸A具有降低糖尿病大鼠血糖的作用。(3)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)人Bel-7401細(xì)胞系葡萄糖吸收的影響，結(jié)果顯示丹酚酸A能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和利用。上述方法共同證明了丹酚酸A是具有降低正常和糖尿病大鼠血糖的作用，同時(shí)能夠降低哺乳動(dòng)物體重的藥物。2、丹酚酸A防治糖尿病慢性心血管并發(fā)癥的研究(1)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠離體主動(dòng)脈舒張和收縮反應(yīng)性的影響。(2)檢測(cè)丹酚酸A糖尿病大鼠血管反應(yīng)性(缺血組織充血程度和速度)的影響，反應(yīng)糖尿病大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞功能。3、丹酚酸A防治糖尿病性腎病的研究(1)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠尿液中NAG含量影響及干預(yù)作用(2)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠血肌酐、尿素氮含量的變化及干預(yù)作用(3)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠腎臟指數(shù)的變化的影響(腎臟重/體重)。4、丹酚酸A防治糖尿病性慢性末梢循環(huán)障礙的研究(1)采用激光多普勒檢測(cè)丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠足底血流灌注量的變化及丹酚酸A的干預(yù)作用。5、丹酚酸A防治糖尿病性慢性外周神經(jīng)病變的研究(1)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)糖尿病性大鼠痛域的變化及干預(yù)作用(2)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)肌肉信號(hào)傳導(dǎo)速度的變化及干預(yù)作用6、丹酚酸A促進(jìn)細(xì)胞ATP生成的研究(1)檢測(cè)丹酚酸A促進(jìn)細(xì)胞ATP生成作用。(2)檢測(cè)丹酚酸A對(duì)線粒體功能的促進(jìn)作用。7、丹酚酸A降血脂作用研究(1)檢測(cè)丹酚酸A降低高脂血癥大鼠血脂水平的作用。(2)檢測(cè)丹酚酸A降低糖尿病合并高脂血癥大鼠血脂水平的作用。總而言之，本發(fā)明顯示丹酚酸A可降低正常和糖尿病動(dòng)物血糖，促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)糖的吸收及利用，改善糖尿病性大血管病變、改善糖尿病性腎病、改善糖尿病性外周神經(jīng)病變、改善糖尿病性末梢循環(huán)障礙，同時(shí)具有促進(jìn)機(jī)體能量物質(zhì)ATP的生成，并能夠降低血脂、減輕哺乳動(dòng)物體重的作用。即丹酚酸A通過促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，增加細(xì)胞ATP的生成，促進(jìn)細(xì)胞糖的利用，降低動(dòng)物血糖水平，適用于糖尿病性性高血糖癥，慢性心血管并發(fā)癥，糖尿病性腎病，糖尿病性外周神經(jīng)障礙，糖尿病性末梢循環(huán)障礙，高脂血癥及肥胖癥的治療。本發(fā)明因此還涉及以本發(fā)明化合物作為活性成份的藥物組合物。該藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備?？赏ㄟ^將本發(fā)明化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動(dòng)物使用的任何劑型。本發(fā)明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量％。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將本發(fā)明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤(rùn)劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯垸酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤(rùn)滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆?；蛭⑼?，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。為將本發(fā)明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、pH調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-e-環(huán)糊精等；pH調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的個(gè)體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍為0.001-150mg/Kg體重，優(yōu)選為0.l-100mg/Kg體重，更優(yōu)選為1-60rag/Kg體重，最優(yōu)選為2-30mg/Kg體重。上述劑量可以一個(gè)劑量單位或分成幾個(gè)劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。定義salA為丹酚酸A圖1.藥物對(duì)正常小鼠體重的影響。Normal,正常對(duì)照組；Metformin,二甲雙胍l'50mg/kg組；salAH,丹酚酸A10mg/kg組；salAM，丹酚酸A5mg/kg組，salAL,丹酚酸Almg/kg組；weight:動(dòng)物體重以(g)計(jì)。藥物對(duì)正常小鼠體重的影響，其中以丹酚酸Almg/kg給藥組作用最強(qiáng)，其作用稍強(qiáng)于二甲雙胍150mg/kg給藥組，而丹酚酸A高劑量組作用稍弱。圖2.:丹酚酸A對(duì)正常小鼠血糖的影響。Normal,正常對(duì)照組；Metformin,二甲雙胍150mg/kg;salAH，丹酚酸A10mg/kg;salAM，丹酚酸A5mg/kg,salAL,丹酚酸Almg/kg。末次給藥15h，禁食14h后血糖測(cè)定結(jié)果，丹酚酸Almg/kg給藥低劑量組對(duì)正常小鼠降糖作用持續(xù)的時(shí)間較為長(zhǎng)久，其作用強(qiáng)于二甲雙胍150mg/kg組，丹酚酸A其余劑量組降糖作用不明顯。圖3:丹酚酸A對(duì)正常小鼠血糖的影響。禁食16h，給藥2h后血糖測(cè)定結(jié)果，各給藥組均有降低小鼠血糖的作用，其中以丹酚酸A(10mg/kg)高劑量組作用最強(qiáng)。圖4.:丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠正常進(jìn)食，禁食8小時(shí)及0GTT血糖的影響。糖尿病大鼠模型組、正常組、丹酚酸高、低劑量組不同時(shí)間點(diǎn)血糖測(cè)定結(jié)果。圖5:丹酚酸A對(duì)Bel-7401細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖消耗的影響。圖6:丹酚酸A對(duì)Bel-7401細(xì)胞葡萄糖吸收過程細(xì)胞數(shù)量的影響。圖7.糖尿病大鼠末梢循環(huán)舒張反應(yīng)性的變化及丹酚酸A的干預(yù)作用。圖8.糖尿病大鼠尿NAG排除率與肌酐的比值變化及丹酚酸A的干預(yù)作用。圖9.糖尿病大鼠末梢循環(huán)血流灌注量的變化及丹酚酸A的干預(yù)作用。圖10.糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)速度的變化及丹酚酸A的改善作用。圖ll.糖尿病大鼠足底痛域的變化及丹酚酸A的改善作用。圖12.SalA對(duì)hy926細(xì)胞ATP生成的影響。圖13.salA對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞ATP生成的影響。圖14.salA對(duì)心、腦、肝中線粒體ATP生成的影響。具體實(shí)施方式一、丹酚酸A降低血糖作用實(shí)施例l.丹酚酸A對(duì)正常小鼠血糖的影響方法將50只小鼠隨機(jī)分為5組，體重17-20g，全營(yíng)養(yǎng)飼料喂食，不限食水。正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予二甲雙胍150mg/kg,其余三組分別給予丹酚酸A水溶液10mg/kg，3mg/kg，lmg/kg。連續(xù)6天給藥，第6天(禁食14h)斷尾取血一次(20ul血液加入20ul生理鹽水稀釋后取上清)，然后給藥，2h(禁食16h)后摘眼球取血，常規(guī)分離血清，按血糖測(cè)定試劑盒(己糖激酶法，中生北控生物科技股份有限公司)說明以測(cè)定小鼠血糖含量。結(jié)果二甲雙胍和丹酚酸A給藥組均能降低正常小鼠的體重，其中以丹酚酸Almg/kg給藥組作用最強(qiáng)，其作用稍強(qiáng)于二甲雙胍150mg/kg給藥組，而丹酚酸A高劑量組作用稍弱。圖1末次給藥15h，禁食14h后血糖測(cè)定結(jié)果，丹酚酸Almg/kg低劑量給藥組對(duì)正常小鼠降糖作用持續(xù)的時(shí)間較為長(zhǎng)久，其作用強(qiáng)于二甲雙胍150mg/kg組。圖2禁食16h，給藥2h后血糖測(cè)定結(jié)果顯示，各給藥組均有降低小鼠血糖的作用，其中以丹酚酸A(10mg/kg)高劑量組作用最強(qiáng)，其作用隨劑量增加而增強(qiáng)。所有丹酚酸A組血糖降低水平均大于二甲雙胍150mg/kg組。結(jié)果提示丹酚酸A的短時(shí)間降糖效果(2h)隨劑量增加而增加，但是長(zhǎng)時(shí)間的維持作用則以低劑量組為明顯，提示丹酚酸A還存在其他作用機(jī)制。圖3實(shí)施例2.丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響方法SD大鼠腹腔注射鏈脲佐霉素30mg/kg，分兩次注射，間隔時(shí)間為一周，然后采用羅氏血糖測(cè)定儀測(cè)血糖，血糖值高于11.5作為糖尿病大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物分組正常組、模型組、丹酚酸A高劑量5mg/kg組、低劑量lmg/kg。每組7只。丹酚酸A腹腔注射，連續(xù)給藥6天。期間喂正常全營(yíng)養(yǎng)飲食。5天以后測(cè)定動(dòng)物進(jìn)食狀態(tài)下血糖值，第6天禁食8h，測(cè)定基礎(chǔ)血糖值作為零時(shí)血樣，而后腹腔注射給藥，于給藥后60min各實(shí)驗(yàn)組灌胃葡萄糖2g/kg(2ml)，并于給葡萄糖后30、60、120min，180min斷尾取血。4000rpm離心10min。常規(guī)分離血清，按血糖測(cè)定試劑盒(己糖激酶法，中生北控生物科技股份有限公司)說明以測(cè)定小鼠血糖結(jié)果丹酚酸Almg/kg能降低正常進(jìn)食和空腹糖尿病大鼠血糖值，同時(shí)也能降低OGTT90min血糖值；丹酚酸A5mg/kg能降低OGTT90min時(shí)血糖，上述結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。lmg/kg劑量其余時(shí)間點(diǎn)也有降低血糖作用，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯。圖4實(shí)施例3.丹酚酸A對(duì)人肝癌細(xì)胞系Bel-7401葡萄糖吸收的影響方法Bd-7401細(xì)胞常規(guī)10。/。FBS1640培養(yǎng)。胰酶消化，3X103細(xì)胞/孔常規(guī)種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，16h后細(xì)胞貼壁完全后，換用不同濃度丹酚酸A(終濃度10—5M-l(r9M)的無(wú)酚紅無(wú)血清1640培養(yǎng)基，胰島素(終濃度0.04U/ml)對(duì)照組處理相同。72h后測(cè)定上清液中葡萄糖濃度，同時(shí)SRB法檢測(cè)細(xì)胞含量。加入藥物72h后檢測(cè)上清液中葡萄糖含量，SRB法檢測(cè)細(xì)胞的量，結(jié)果salA10—6M-10—8M劑量組均可促進(jìn)人肝癌細(xì)胞系Bel-7401細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，其中salAl(T6M組促進(jìn)葡萄糖吸收作用大于終濃度0.04U/ml胰島素。因?yàn)閟alA10—SM組對(duì)細(xì)胞具有損傷作用，促吸收作用不明顯。圖5圖6二、丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠血管并發(fā)癥的干預(yù)作用實(shí)施例4.(1)糖尿病大鼠主動(dòng)脈收縮與舒張反應(yīng)性的變化及丹酚酸A的干預(yù)作用方法SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，從中隨機(jī)抽取12只作為正常對(duì)照組(NC組)，其余作為糖尿病組(DM組)。正常對(duì)照組喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，糖尿病組喂養(yǎng)高糖高脂飼料。喂養(yǎng)4周后糖尿病組空腹18-24小時(shí)腹腔注射小劑量鏈霉佐菌素(STZ)30mg/kg(用前以PH4.4的0.1mo1/L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液配成0.75。/。的濃度)，正常對(duì)照組僅注射檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液。l周后再測(cè)血糖。根據(jù)血糖水平，可以再繼續(xù)注射2-3次，每次間隔1周。選擇空腹血糖大于10mmol/L糖尿病大鼠，隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(DC組)、糖尿病二甲雙胍治療組(150mg/kg)，糖尿病卡托普利治療組(20mg/kg),丹酚酸A治療組(分高10mg/kg、中3mg/kg、低劑量組lmg/kg)。藥物溶于蒸餾水中灌胃，每日一次。連續(xù)給藥3個(gè)月。末次給藥后動(dòng)物禁食8-12h，處死，取近端胸主動(dòng)脈切成3mm寬的環(huán)，掛于含K-H緩沖液(NaC1113.8mmol/L，NaHC0320mmol/L,KC14.7mmol/L,KH2P041.2廳ol/L，CaC122.5mmol/L,glucose5.5mmol/L，pH為7.4)浴槽中的三角環(huán)內(nèi)，控制基礎(chǔ)張力1.2克，穩(wěn)定約40分鐘，保持37°C，緩沖液通以95%02+5%C02混合氣體，期間每20分鐘換一次K-H緩沖液。穩(wěn)定lh后，給予2次60mMKCl收縮，加入去甲腎上腺素，終濃度為1X10-6mol/L，觀察收縮效應(yīng)。然后加入乙酰膽堿終濃度為10-5mol/L，觀察舒張效應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>N=10，平均值士SD采用LSDone-wayANOVA進(jìn)《亍統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P<0.051.**P<0.01.結(jié)果可見，糖尿病模型動(dòng)物在造模3月左右對(duì)KC1，去甲腎上腺素的收縮反應(yīng)性減弱，對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)性也減弱，而丹酚酸A低中劑量組對(duì)此反應(yīng)具有改善作用，其中丹酚酸A中劑量組對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)性的改善具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例5.阻斷后反應(yīng)性充血方法糖尿病大鼠造模和具體分組方法見實(shí)施例4，采用彈力帶將大鼠后肢扎緊，將激光多普勒血流檢測(cè)儀(PFLDPM單元，瑞典PERIMED公司)激光探頭放置在大鼠腳掌部位，待血流灌注量降低到0值時(shí)，持續(xù)3-5min，然后突然剪斷彈力帶，觀察血流灌注量到達(dá)峰值時(shí)斜率、與基線的百分比變化、上升時(shí)間、斜率和到達(dá)峰值額度時(shí)間。結(jié)果如圖7結(jié)果顯示丹酚酸A對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能具有保護(hù)作用，可改善阻斷后反應(yīng)性充血。三、丹酚酸A防治糖尿病性腎病的研究實(shí)施例6.丹酚酸A對(duì)糖尿病大鼠尿液中NAG/肌酐的影響N-乙酰-卩-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)廣泛存在于各種組織器官、體液、紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板中，是溶酶體中的一種酸性水解酶。NAG是腎小管損傷的標(biāo)記物，尿NAG活性升高是腎臟損害的敏感性指標(biāo)。NAG活性可用于腎小管間質(zhì)性腎炎、尿路感染、糖尿病腎病綜合癥、高血壓腎病、腎移植后的排異反應(yīng)和腎病綜合癥的早期診斷。NAG活性的升高均早于其他相應(yīng)指標(biāo)，有利于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。本測(cè)定方法的原理是底物在NAG作用下水解，釋放出游離的對(duì)硝基酚。加入堿性溶液停止反應(yīng)，并使對(duì)硝基酚顯色。在400nm處測(cè)吸光度，可計(jì)算酶活力單位。肌酐采用堿性苦味酸測(cè)定法，測(cè)定時(shí)尿液50倍稀釋。糖尿病大鼠造模和分組方法見實(shí)施例4，NAG，肌酐測(cè)試試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所，結(jié)果如圖8與模型組相比，丹酚酸A及卡托普利組均能降低尿中NAG的量，其中丹酚酸A低劑量組(lmg/kg)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例7.，丹酚酸A糖尿病大鼠血清中肌酐、尿素氮含量的影響糖尿病大鼠造模，分組及給藥方法參見實(shí)施例4，肌酐，尿素氮試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。表2丹酚酸A糖尿病大鼠血清中肌酐、尿素氮含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>N=10,平均值土SD采用LSDone-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P<0.051.**P<0.01.結(jié)果可見丹酚酸A可降低慢性糖尿病大鼠血肌酐水平，對(duì)糖尿病腎病可能具有保護(hù)作用。四、丹酚酸A防治糖尿病性慢性末梢循環(huán)障礙的研究實(shí)施例8.丹酚酸A防治糖尿病性慢性末梢循環(huán)障礙的研究方法糖尿病大鼠造模，分組及給藥方法參見實(shí)施例4，糖尿病大鼠給藥第80天，烏拉坦麻醉，采用激光多普勒血流檢測(cè)儀(PFLDPM單元，瑞典PERIMED公司)檢測(cè)大鼠足底部血流的變化。結(jié)果可見，丹酚酸A各組均對(duì)糖尿病大鼠末梢循環(huán)的血流具有改善作用。圖9五、丹酚酸A防治糖尿病性慢性外周神經(jīng)病變的研究實(shí)施例9.(1)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)-肌肉傳導(dǎo)速度的變化及丹酚酸A的千預(yù)作用方法糖尿病大鼠造模，分組及給藥方法參見實(shí)施例4，糖尿病大鼠給藥第80天時(shí)，各組動(dòng)物烏拉坦腹腔麻醉，俯臥固定。刺激電極為雙針電極，75%酒精消毒后插入坐骨神經(jīng)窩處坐骨神經(jīng)干附近，記錄電極為雙針電極，75%酒精消毒后插入腓腸肌肌腹，兩電極相距約30毫米(mm)。設(shè)備采用BL-420E+型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，刺激信號(hào)選擇l毫伏(mv)，0.015毫秒(ms)，單刺激，掃描速度為0.01秒(s)，lOkHz濾波，誘導(dǎo)信號(hào)放大50倍，計(jì)算神經(jīng)肌肉動(dòng)作電位潛伏期，傳導(dǎo)速度計(jì)算公式為MNCV-刺激電極到記錄電極的距離(m)/潛伏期(ms)如圖10實(shí)施例10.糖尿病大鼠足底痛域感覺的變化及丹酚酸A的干預(yù)作用方法糖尿病大鼠造模，分組及給藥方法參見實(shí)施例4，給藥第60天，將大鼠足底部一固定部位置于光電痛域檢測(cè)器檢測(cè)孔處，固定刺激強(qiáng)度，給予熱刺激，觀察大鼠足部移開的時(shí)間。結(jié)果如下；丹酚酸A對(duì)糖尿病性大鼠的痛覺神經(jīng)功能具有改善作用，提高痛覺靈敏性。圖ll六、丹酚酸A促進(jìn)細(xì)胞ATP生成的研究實(shí)施例ll.丹酚酸A對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞ATP生成的影響1)salA對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞ATP生成作用的測(cè)定SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞P1代，(低糖DMEM/F12培養(yǎng)基，20。/。FBS培養(yǎng))細(xì)胞種植24小時(shí)后，去血清，無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)基洗一遍，再加入不同濃度的salA與細(xì)胞孵育2h，、ATP酶檢測(cè)。2)salA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926細(xì)胞ATP生成作用的測(cè)定:hy926細(xì)胞，低糖DMEM培養(yǎng)15%FBS。接種到2塊96孔板中。細(xì)胞統(tǒng)一棄上清，無(wú)血清低糖DMEM洗一遍，再加入無(wú)血清低糖DMEM配制的salA至終濃度，分別作用相應(yīng)時(shí)間，ATP酶法檢測(cè)ATP含量。3)salA對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞ATP生成作用的測(cè)定低糖DMEM培養(yǎng)15%FBS。接種到96孔板中。細(xì)胞統(tǒng)一棄上清，無(wú)血清低糖DMEM洗一遍，再加入無(wú)血清低糖DMEM配制的salA至終濃度，分別作用相應(yīng)時(shí)間，ATP酶法檢測(cè)ATP含量。ATP檢測(cè)方法CellTiter-GloTMLuminescentCellViabilityAssay,美國(guó)Promega公司，該方法是基于螢光細(xì)胞活性檢測(cè)的方法，是根據(jù)定量測(cè)定所存在的ATP數(shù)量來(lái)確定培養(yǎng)物中活性細(xì)胞數(shù)目的一種均質(zhì)的高靈敏方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A可促進(jìn)多種細(xì)胞ATP的生成。包括乳鼠心肌細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926細(xì)胞、大鼠主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞、大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞系Bel-7401細(xì)胞等。結(jié)果可見，salA10-5M-10-uM10min即可明顯增加EA.hy926細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，作用至12小時(shí)減弱。5min時(shí)則作用不明顯。SalA增加ATP產(chǎn)生的作用與濃度成正比。圖12SalA10-5M-10-9M呈濃度依賴性增加SD乳鼠心肌細(xì)胞的產(chǎn)生，其中10-5M-10-7M在實(shí)驗(yàn)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖13SalA對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞ATP生成作用的測(cè)定，salAl(T5M-l(T6MsalA對(duì)細(xì)胞V^TP生成作用最明顯。圖略。實(shí)施例12.丹酚酸A促進(jìn)心、肝、腦線粒體功能的研究方法常規(guī)提取250g正常SD大鼠心肌、肝臟、大腦線粒體，與線粒體底物，ADP。加入等體積CellTiter-GIoTMLuminescentCellViabilityAssay共同孵育10min，檢測(cè)ATP生成的速度，結(jié)果可見。丹酚酸A可促進(jìn)線粒體ATP的產(chǎn)生。圖14七、丹酚酸A降血脂作用研究實(shí)施例13.檢測(cè)丹酚酸A降低高脂血癥大鼠血脂水平的作用。實(shí)驗(yàn)方法雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為六組，每組12只?？瞻讓?duì)照組、高脂血癥模型組、辛伐他汀(Simvastatin,3.5mg/kg)對(duì)照組、血脂康(Xuezhikang)對(duì)照組、受試藥品高、中、低劑量組。除空白對(duì)照組大鼠喂養(yǎng)普通詞料以外，其它各組大鼠都給予高脂飼料喂養(yǎng)30天。辛伐他汀對(duì)照組、血脂康對(duì)照組灌胃口服，丹酚酸A各給藥組腹腔注射，連續(xù)給藥15天時(shí)，麻醉大鼠，眼眶取血，靜置，離心(4000轉(zhuǎn)/分)10min，取出血清，放于-40。C冰箱備用。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定血清中CHO、TG、LDL-C、HDL-C的含量，以便觀察受試藥品在高脂飼料致大鼠高脂血癥模型的降血脂作用?？偰懝檀荚噭┖?，甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒均購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑有限公司。表3:藥物對(duì)血脂的影響，給藥15d后結(jié)果，單位mg/dl檢測(cè)指標(biāo)正常對(duì)照模型對(duì)照辛伐他汀血脂康丹酚酸低0.5mg/kg丹酚酸中1.5mg/kg丹酚酸高5mg/kgTG176±40178±58165±35140±38148±79170±55175±59CHO319±92**869±98737±92705±95318±88**354±80**463±91**LDL275土93"793±卯663±87634±248264±84**293±77**400±88**HDL32±10**73±3079±3368±1690±2497±36106±44*N=12，平均值士SD采用LSDone-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P<0.05，P<0.01.結(jié)果可見，丹酚酸A高中低劑量組均可降低血清中膽固醇、低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白膽固醇的水平。也具有降低血清中甘油三酯水平的趨勢(shì)。實(shí)施例14.檢測(cè)丹酚酸A降低糖尿病合并高脂血癥大鼠血脂水平的作用。方法SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，從中隨機(jī)抽取12只作為正常對(duì)照組(NC組)，其余作為糖尿病組(DM組)。正常對(duì)照組喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，糖尿病組喂養(yǎng)高糖高脂飼料。喂養(yǎng)4周后糖尿病組空腹18-24小時(shí)腹腔注射小劑量鏈脈佐菌素(STZ)30mg/kg。l周后再測(cè)血糖。選擇空腹血糖大于10mmol/L糖尿病大鼠模型。把糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(DC組)、糖尿病二甲雙胍治療組(150mg/kg)，糖尿病卡托普利治療組(20mg/kg)，丹酚酸A治療組(分高10mg/kg、中3mg/kg、低劑量組lmg/kg)。藥物溶于蒸餾水中灌胃，每日一次。連續(xù)給藥3個(gè)月，給藥期間給予高脂飲食，80天后股動(dòng)脈取血離心取血清，-20'C儲(chǔ)存?zhèn)錂z?？偰懝檀荚噭┖校视腿ピ噭┖?、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒均購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑有限公司。表4糖尿病合并高脂血癥大鼠血脂水平變化及丹酚酸A的干預(yù)作用正常模型二甲雙胍卡托普利S低1mg/kgS中3mg/kgS高10mg/kgCHO(mmol/L)1.75±0.51**27.8±7.2323.1±8.5118.8±8.92*18.5±9.54*17.3±10.4*27.7±9.07TG(mmol/L)1.61±0.577.48±2.967.16±4.256.9±3.244.27±3.17*6.35±3.467.8±3.86LDL(mmol/L)1.3土0.4**21.3±5.517.1±5.812.2±7.3**13.4±8.3*12.5±7.1**20.2±6.5HDL(mmol/L)0.54±0.250.39±0.230.32±0.270.51±0.460.4U0.300.44±0.200.34±0.20N40，平均值士SD采用LSDone-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ZP0.05，**P<0.01.權(quán)利要求1.丹酚酸A在制備預(yù)防和\或治療糖尿病相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述的糖尿病是2型糖尿病。3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的糖尿病相關(guān)疾病選自糖尿病高血糖癥、糖尿病血管病變、糖尿病腎病、糖尿病末梢循環(huán)功能障礙、糖尿病外周神經(jīng)病變、糖尿病合并高脂血癥血脂。4.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，所述的末梢循環(huán)障礙包括血管病、糖尿病性壞疽、足潰瘍o5.丹酚酸A在制備預(yù)防和X或治療高脂血癥藥物中的應(yīng)用。6.丹酚酸A在制備促進(jìn)機(jī)體ATP生成藥物中的應(yīng)用。7.丹酚酸A在制備促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，所述的傷口的引起原因選自創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、皮膚糜爛、褥瘡、植皮、放射所致的皮膚、粘膜損傷。9.丹酚酸A在制備預(yù)防和\或治療肥胖癥或降低正常哺乳動(dòng)物體重的藥物中的應(yīng)用。10.—種藥物組合物，其特征在于，含有藥物有效劑量的丹酚酸A，及藥用載體。全文摘要本發(fā)明公開了了丹酚酸A能夠降低動(dòng)物血糖，促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖吸收，改善糖尿病高血糖癥，防治糖尿病心血管并發(fā)癥，防治糖尿病腎病，防治糖尿病末梢循環(huán)障礙，防治糖尿病外周神經(jīng)病變，以及降低血脂，降低哺乳動(dòng)物體重，增加細(xì)胞能量物質(zhì)ATP的產(chǎn)生從而促進(jìn)傷口愈合和代謝功能。說明丹酚酸A能用于防治糖尿病高血糖癥，糖尿病心血管并發(fā)癥，糖尿病腎病，糖尿病末梢神經(jīng)病變，末梢循環(huán)障礙(血管病、糖尿病性壞疽、足潰瘍)，肥胖癥，高脂血癥，促進(jìn)傷口愈合(各種創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、皮膚糜爛、褥瘡、植皮、放射所致的皮膚、粘膜損傷)。文檔編號(hào)A61P25/00GK101347422SQ20071013032公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2007年7月17日優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日發(fā)明者杜冠華,楊秀穎,珂王申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;北京科萊博醫(yī)藥開發(fā)有限責(zé)任公司