專利名稱：：一種重組復(fù)制缺陷型病毒、含有該病毒的藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種重組復(fù)制缺陷型病毒、含有該病毒的藥物組合物及其應(yīng)用，特別是含人融合基因LFA3-Fc的復(fù)制缺陷型病毒、以及抗銀屑病的藥物組合物。技術(shù)背景銀屑病是一種常見(jiàn)的復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，其以角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管形成作為組織病理三要素。此外，銀屑病還是一種具有遺傳相關(guān)性的免疫性疾病。在與銀屑病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的眾多因素當(dāng)中，免疫性因素是首要因素，其中尤以T細(xì)胞(胸腺依賴性淋巴細(xì)胞)的激活最為相關(guān)，該T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的主要組分，其細(xì)胞表面有大量002受體表達(dá)，可舉出的實(shí)例有004+0045110+和CD8+CD45RO+等。根據(jù)美國(guó)銀屑病協(xié)會(huì)的報(bào)道，誘發(fā)銀屑病的T細(xì)胞的激活必須滿足兩個(gè)條件第一，抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresentingcell,APC，可舉出的實(shí)例有巨噬細(xì)胞，Langerhans細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等)必須要向T細(xì)胞呈遞一種能被該細(xì)胞表面受體識(shí)別且匹配的抗原成分(但這些抗原的具體成分尚未能夠闡明)；第二，結(jié)合在一起的APC和T細(xì)胞必須在一個(gè)或多個(gè)刺激通道的作用下，T細(xì)胞才能被激活。一旦T細(xì)胞被激活，它們就會(huì)釋放出大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于位于表皮最外層的角質(zhì)生成細(xì)胞，促使角質(zhì)生成細(xì)胞分裂速度不斷加快，這種現(xiàn)象被稱為"過(guò)度增殖"。T細(xì)胞被激活后還可以激發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中包括輔助T細(xì)胞的激活以及發(fā)生皮膚內(nèi)聚集現(xiàn)象。這最終使得皮損處出現(xiàn)大量的APC，而這些APC又反過(guò)來(lái)進(jìn)一步激活了更多的T細(xì)胞，由此造成惡性循環(huán)。LFA3即淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原3(Lymphocytefunction-associatedantigen-3,LFA-3;又名CD58)。APC表面的LFA3分子與T細(xì)胞的CD2的結(jié)合就是所述共刺激信號(hào)中的一種。這種LFA3與CD2的結(jié)合不僅激活了T細(xì)胞，還進(jìn)一步促進(jìn)一些細(xì)胞因子(如Y-干擾素)的分泌，而銀屑病的發(fā)生與Y-干擾素的過(guò)度分泌也是密切相關(guān)的。由此可以看出一種有效的銀屑病治療藥物是必須能夠阻斷這一惡性循環(huán)的藥物。目前，很多生物制藥公司也都釆用在循環(huán)開(kāi)始之前就阻斷這一過(guò)程的生物藥(LFA3-Fc)來(lái)治療銀屑病。換言之，就是該LFA3-Fc可直接干擾T細(xì)胞的激活。所述LFA3-Fc是將人的LFA3胞外可溶部分與人IgGl的Fc片段融合而形成的新分子。該LFA3-Fc是一種雙功能分子，其LFA3部分可與T細(xì)胞表面的CD2受體特異結(jié)合，抑制T細(xì)胞的激活，改變炎癥反應(yīng)進(jìn)程；其IgGl的Fc片段可與NK細(xì)胞表面的CD16(Fcy受體III)結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，最終減少和清除有記憶效應(yīng)的T細(xì)胞。由于銀屑病患者皮損處存在的大量被激活的T細(xì)胞上的LFA3/CD2共刺激通道被LFA3-Fc阻斷，從而抑制了T細(xì)胞的作用，達(dá)到緩解和治愈銀屑病的目的。但是，由于LFA3-Fc臨床使用劑量高(每周一次肌肉注射15mg或靜脈注射7.5mg，12周為一個(gè)療程)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinesehamsterovary，CHO)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量較低和難以規(guī)?；a(chǎn)，使得目前的LFA3-Fc很難滿足臨床的需要。本發(fā)明采用基因治療方案——將LFA3-Fc基因?qū)胂俨《荆瑯?gòu)建重組腺病毒(Ad-LF)，從而在體內(nèi)使LFA3-Fc持續(xù)表達(dá)。采用本發(fā)明的方法可克服體外表達(dá)蛋白產(chǎn)量低、表達(dá)及純化過(guò)程繁瑣、重組蛋白半衰期短的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)可以長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)目的蛋白，同時(shí)還可以減少給藥次數(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明第一方面涉及一種復(fù)制缺陷型病毒，該復(fù)制缺陷型腺病毒包含有啟動(dòng)子控制下的人融合基因LFA3-Fc，該人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分與人IgG的Fc片段融合形成的。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，關(guān)于病毒載體，必須使用復(fù)制缺陷型病毒，例如復(fù)制缺陷型腺病毒、復(fù)制缺陷型單純皰疹病毒和復(fù)制缺陷型新城疫病毒。本發(fā)明優(yōu)選使用復(fù)制缺陷型病毒的原因在于，這種病毒載體不能在除包裝細(xì)胞系(293、911、PERC6等)以外的細(xì)胞中復(fù)制增殖，其共同特點(diǎn)是缺失了病毒基因組中某些復(fù)制增殖所必需的基因。其中，本發(fā)明優(yōu)選使用第一代5型腺病毒或第二代、第三代5型腺病毒。本發(fā)明的第二方面涉及一種含有本發(fā)明第一方面的復(fù)制缺陷型病毒的宿主細(xì)胞。例如可用本發(fā)明的重組復(fù)制缺陷型病毒直接轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，例如293細(xì)胞，也可以用帶有融合基因LFA3-Fc的克隆載體與脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。關(guān)于宿主細(xì)胞，可用于實(shí)施本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌、酵母、或者是動(dòng)物細(xì)胞。此外，所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選是真核細(xì)胞。更進(jìn)一步的，所述的宿主細(xì)胞是293細(xì)胞。本發(fā)明之所以采用293細(xì)胞是因?yàn)樵摷?xì)胞株轉(zhuǎn)染了腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞，重組的復(fù)制缺陷型腺病毒可在此細(xì)胞中復(fù)制及包裝；并且三種大規(guī)模培養(yǎng)方式(貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無(wú)血清懸浮培養(yǎng))均可用于293細(xì)胞的培養(yǎng)。本發(fā)明第三方面提供一種抗銀屑病的藥物組合物，由下列成分組成a.—種重組復(fù)制缺陷型病毒，該復(fù)制缺陷型病毒包含有啟動(dòng)子控制下的人融合基因LFA3-Fc，該人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分與人IgG的Fc片段融合形成的；和b.藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明的第四方面，提供了一種抗銀屑病的藥物組合物的制備方法。為了制備抗銀屑病的藥物組合物，應(yīng)提供一種復(fù)制缺陷型病毒和藥學(xué)上可接受的輔料，其中，所述的復(fù)制缺陷型病毒包含有啟動(dòng)子控制下的人融合基因LFA3-Fc，該人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分與人IgG的Fc片段融合形成的；以及將所述復(fù)制缺陷型病毒和所述藥學(xué)上可接受的輔料混合。本發(fā)明抗銀屑病的藥物組合物優(yōu)選為液體制劑形式，更優(yōu)選為注射劑。可用一般用于配制病毒制劑的液體載體，例如純凈水，生理鹽水，葡萄糖溶液等，作為所述藥學(xué)上可接受的輔料。對(duì)于注射液，應(yīng)該采用無(wú)菌無(wú)熱源的液體載體。本發(fā)明的藥物組合物一般應(yīng)低溫保存，例如保存在-2(TC溫度下。根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)崿F(xiàn)含有所述重組腺病毒的宿主細(xì)胞分泌表達(dá)高活性(能感染包括肺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等多種細(xì)胞類型)的人重組LFA3-Fc多肽。試驗(yàn)證明，在體外，這些分泌表達(dá)的人重組LFA3-Fc多肽可以有效地抑制淋巴細(xì)胞的增殖。同時(shí)還證明，由本發(fā)明重組腺病毒制備成的抗銀屑病注射劑，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠使機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)高水平的人LFA3-Fc并保持完整的生物活性，能有效治療銀屑病。本發(fā)明還提供一種治療銀屑病的方法，該方法包括給患者施用有效量的本發(fā)明的重組復(fù)制缺陷型病毒粒子。對(duì)于作為本發(fā)明優(yōu)選的藥物組合物形式的注射劑，可以采用肌肉注射、靜脈注射的方式給藥，給藥劑量可以根據(jù)一些已知的因素，諸如銀屑病病情嚴(yán)重程度，病人體重，性別、年齡、給藥方式等由醫(yī)師容易地加以確定。例如可以一般可以在3xl()9-3xl0"范圍內(nèi)，優(yōu)選在3><101()-3><1013范圍內(nèi)變動(dòng)。本發(fā)明的抗銀屑病注射劑可以彌補(bǔ)直接蛋白輸注的藥物體內(nèi)穩(wěn)定性差等缺陷，能增大給藥時(shí)間的間隔、大大減少給藥量、減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)并提高患者的生活質(zhì)量。本發(fā)明的詳細(xì)描述對(duì)于所用的人融合基因LFA3-Fc，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中可得到的融合LFA3-Fc，也可以按照如下程序自行制備a.合成下列PCR引物，分別擴(kuò)增人LFA3的胞外基因序列和人IgGl的Fc片段的基因序列Pl(SEQIDNo.2):5'CTCAAGCTTGCTAGCATGGTTGCTGGGAGCGACGC3'P2(SEQIDNo.3):5'ACGCGTCGACATAAAGAAAGAACTTCATGG3'P3(SEQIDNo.4):5'ACGCGTCGACAAAACTCACACATGCC3'P4(SEQIDNo.5):5'CGGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGG3"b.將人LFA3的胞外段的基因序列構(gòu)建入克隆載體；c.將人IgGl的Fc片段的基因序列構(gòu)建入克隆載體得到LFA3-Fc融合基因。上述過(guò)程的一個(gè)具體例子包括，合成序列SEQIDNO.2和SEQIDN0.3的PCR引物(具有酶切位點(diǎn)序列)，以PCR方法擴(kuò)增人LFA3胞外段cDNA;將片段插入克隆載體pUC18構(gòu)建成pUC18-L;合成序列SEQIDN0.4和SEQIDNO.5的PCR引物(具有酶切位點(diǎn)序列)，以RT-PCR方法從人淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增人IgGl的Fc片段的cDNA;再將Fc片段的cDNA插入pUC18-L，構(gòu)建成其中含有人LFA3-Fc融合基因的pUC18-LF。此時(shí)得到的人LFA3-Fc融合基因具有如SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。上述過(guò)程所使用的克隆載體為重組DNA技術(shù)中最常用的載體，例如有質(zhì)粒、噬菌體X，柯斯質(zhì)粒和噬菌體M13，并且這些載體的受體細(xì)胞都是大腸桿菌。對(duì)于本發(fā)明中所使用的克隆載體沒(méi)有特別限定，只要其能夠在大腸桿菌中自主復(fù)制、能連同所帶的外源DNA—起復(fù)制、以及易于同細(xì)菌DNA分開(kāi)并加以純化即可。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的克隆載體為pUC18。然后，將克隆到的人融合基因LFA3-Fc構(gòu)建入穿梭載體，再與包含病毒基因組的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，篩選出本發(fā)明的重組復(fù)制缺陷型病毒pAd-LF。關(guān)于宿主細(xì)胞，可用于實(shí)施本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌、酵母、或者是動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選所述的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。更進(jìn)一步的，所述的宿主細(xì)胞是293細(xì)胞。本發(fā)明之所以采用293細(xì)胞是因?yàn)樵摷?xì)胞株易于轉(zhuǎn)染，并且三種大規(guī)模培養(yǎng)方式(貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無(wú)血清懸浮培養(yǎng))均可用于293細(xì)胞的培養(yǎng)。關(guān)于共轉(zhuǎn)化的方法可分為兩類，一類是直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，例如基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中以基因槍轉(zhuǎn)化法為代表；另一類是生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。在本發(fā)明中，對(duì)于共轉(zhuǎn)化的方法沒(méi)有特別的限定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以采用電穿孔的方法。將感染的宿主細(xì)胞培養(yǎng)后，通過(guò)離心分離得到所述的復(fù)制缺陷型病毒。通過(guò)將該復(fù)制缺陷型病毒與例如無(wú)菌注射用水混合并調(diào)節(jié)pH值便得到本發(fā)明第三方面的抗銀屑病組合物的注射液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每毫升該注射劑含有3xl0義3x1013病毒粒子(VP)的病毒顆粒。本發(fā)明第四方面提供一種制備抗銀屑病藥物組合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式，提供了一種制備注射劑的方法，包括以下步驟a.在無(wú)菌條件下取注射用水，按每毫升3xl01Q-3xl013VP加入復(fù)制缺陷型病毒；b.在無(wú)菌條件下將步驟a所述原料混合均勻，調(diào)節(jié)pH值至7.5-8.5;c.將步驟b產(chǎn)物無(wú)菌過(guò)濾后分裝成注射劑。圖1是重組腺病毒(Ad-LF)的構(gòu)建流程圖。圖2是PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖電泳圖譜。其中M為lkb+lOObpDNA梯帶(GBICO)，1為PCR產(chǎn)物。圖3是RT-PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖電泳圖譜。其中M為lOObpDNA梯帶(GBICO)，1為RT-PCR產(chǎn)物。圖4是pAd-LF的酶切鑒定結(jié)果(PacI)的1%瓊脂糖電泳圖譜。其中M為lkbDNA梯帶(GIBCO);1為篩選出的單克隆的編號(hào)。圖5是PCR擴(kuò)增鑒定重組腺病毒(PL1+PL2)的1%瓊脂糖電泳圖譜。其中M為100bpDNA梯帶(GBICO)，C為陽(yáng)性對(duì)照(pAd-LF)，l-6分別表示l-6號(hào)空斑。圖6是PCR擴(kuò)增鑒定重組腺病毒(PE1+PE2)的1%瓊脂糖電泳圖譜。其中M為100bpDNA梯帶(GBICO)，C為陽(yáng)性對(duì)照(pAd-LF)，l-6分別表示l-6號(hào)空斑。圖7是Hela細(xì)胞的WesternBlot鑒定結(jié)果，其中R為還原條件，NR為非還原條件，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)采用RainbowMarker(GEHsdthcarc)o圖8是病毒感染上清液對(duì)混合淋巴細(xì)胞增殖的抑制實(shí)驗(yàn)，其中，Ad-Null為空載腺病毒的感染上清液，Ad-LF為重組腺病毒Ad-LF的感染上清液。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1人LFA3基因的制備本實(shí)施例用PCR方法從模板質(zhì)粒pORF5-LFA-3(購(gòu)自Invivogen公司)擴(kuò)增出人LFA3胞外段(aa.1-120)cDNA片段。根據(jù)人LFA3基因序列設(shè)計(jì)并合成PCR引物，為了能將PCR產(chǎn)物直接插入克隆載體-pUC18(購(gòu)自Invitrogen公司)并與其后的IgG1Fc片段融合，在5'引物中設(shè)計(jì)入HindIII和NheI酶切位點(diǎn)，3'引物中設(shè)計(jì)入Sall酶切位點(diǎn)，引物序列如下Pl(SEQIDN0.2):5'CTCAAGCTTGCTAGCATGGTTGCTGGGAGCGACGC3"P2(SEQIDNO.3):5'ACGCGTCGACATAAAGAAAGAACTTCATGG3'PCR條件如下PCR反應(yīng)混合物在94'C變性5分鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)94'C變性30秒；55"C退火30秒；72T延伸30秒。反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。然后72X:再延伸12分鐘。反應(yīng)完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的380bp左右的DNA片段(見(jiàn)圖2)。構(gòu)建入pUC18，得到pUC18-L，測(cè)序結(jié)果表明所得到重組質(zhì)粒中的目的基因與發(fā)表的人LFA3胞外段序列完全一致。實(shí)施例2人LFA3-Fc融合基因的制備本實(shí)施例用RT-PCR方法從人淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出人IgGlFc(aa.247-473)的cDNA片段。根據(jù)人IgGl基因序列設(shè)計(jì)并合成RT-PCR引物，為了能將PCR產(chǎn)物插入LFA3片段后，發(fā)明人在5'引物中設(shè)計(jì)入SalI位點(diǎn)，在3'引物中設(shè)計(jì)入BamHI位點(diǎn)，引物序列如下P3(SEQIDN0.4):5'ACGCGTCGACAAAACTCACACATGCC3'P4(SEQIDN0.5):5'CGGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGG3'RT-PCR條件如下RT-PCR反應(yīng)混合物在5CTC變性30分鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)94'C變性30秒；50"C退火30秒；68r延伸1分鐘。反應(yīng)IO個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)94。C變性30秒；52'C退火30秒；68'C延伸1分鐘。反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。然后68"C再延伸7分鐘。反應(yīng)完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的720bp左右的DNA片段(見(jiàn)圖3)。構(gòu)建入pUC18-L，得到pUC18-LF，測(cè)序表明所得到重組質(zhì)粒中的目的基因與預(yù)計(jì)的人LFA3胞外段序列(aa.l-120)與人IgGlFc(aa.247-473)融合基因的序列完全一致。實(shí)施例3重組腺病毒Ad-LF的構(gòu)建及篩選先將克隆到的人LFA3-Fc融合基因構(gòu)建入pAdenoVator-CMV5穿梭載體，再與包含腺病毒基因組的質(zhì)粒pAdenoVatorAElE3共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，篩選重組子，再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，篩選重組腺病毒。1、將克隆到的人LFA3-Fc融合基因構(gòu)建入pAdenoVator-CMV5穿梭載體后，再與包含腺病毒基因組(E1，E3缺失)的環(huán)狀質(zhì)粒pAdenoVatorAElE3(購(gòu)自Qbiogene公司)用常規(guī)的電穿孔方法共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183(購(gòu)自Qbiogene公司)，篩選重組子-pAd-LF，進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明篩選到了重組位點(diǎn)位于復(fù)制子和右臂之間的重組子pAd-LF(見(jiàn)圖4)，可切出大小為4.5kb的片段。2、使用常規(guī)共轉(zhuǎn)染方法將線性化的重組質(zhì)粒pAd-LF與脂質(zhì)體Lipofectamine(購(gòu)自Invitrogen公司)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)，篩選重組腺病毒Ad-LF。14天后，孵育的培養(yǎng)皿共出現(xiàn)6個(gè)空斑，分別提取每個(gè)空斑進(jìn)行擴(kuò)增。3、抽提腺病毒DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增人LFA3-FcDNA片段鑒定是否為重組腺病毒，同時(shí)鑒定腺病毒特征性的E2B區(qū)片段。擴(kuò)增人LFA3-FcDNA片段的引物為5'引物P1:5'CTCAAGCTTGCTAGCATGGTTGCTGGGAGCGACGC3'3'引物P4:5'CGGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGG擴(kuò)增腺病毒特異的E2B區(qū)的引物為5，引物PE1:5'TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG3'3'引物PE2:5'CATCTGAACTCAAAGGGTGG3'經(jīng)鑒定，挑取的空斑均插入人LFA3-FcDNA片段(1060bp左右的條帶，見(jiàn)圖5);挑取的空斑均擴(kuò)增出腺病毒E2B陽(yáng)性條帶(860bp左右，見(jiàn)圖6)。4、用篩選到的病毒感染Hda細(xì)胞，取培養(yǎng)上清用常規(guī)ELISA方法鑒定LFA3-Fc融合蛋白的表達(dá)情況，表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1。表1各空斑LFA3-Fc融合蛋白的表達(dá)情況Ad-LF空斑LFA3-Fc融合蛋白表達(dá)情況(A450)腦(xl)10(xl0)l(xlOO)1#2.04051.54350.16352#2.20851.62150.17353#1.60651.28950.12154#1.98751.12350.11755#2.01151.52150.15456#2.13451.67450,1475從測(cè)定結(jié)果看來(lái)，6個(gè)空斑均能表達(dá)融合蛋白LFA3-Fc，2#空斑表達(dá)最高。我們選擇表達(dá)最高的空斑Ad-LF-2#，命名為Ad-LF。實(shí)施例4重組腺病毒的擴(kuò)增和純化將Ad-LF病毒種子液逐級(jí)擴(kuò)增，最終感染5><106個(gè)293細(xì)胞，培養(yǎng)4872小時(shí)直至出現(xiàn)完全細(xì)胞病變(cytopathiceffect,CPE)，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀重懸于100ml含5%FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基，-20。C/37。C反復(fù)凍融三次，離心去細(xì)胞碎片，上清即為病毒裂解液，備用。采用常規(guī)兩步氯化銫(CsCl)密度梯度超離心法純化Ad-LF，第一步采用不連續(xù)CsCl梯度去除大部分的細(xì)胞碎片以及缺陷的病毒顆粒(即不具備感染活性的病毒顆粒)，第二步采用連續(xù)CsCl密度梯度徹底將具備感染活性的病毒顆粒與缺陷的病毒顆粒區(qū)分開(kāi)，最后再通過(guò)透析脫鹽，去除CsCl，得到重組人LFA3-Fc腺病毒-Ad-LF。實(shí)施例5重組腺病毒Ad-LF對(duì)不同細(xì)胞的感染活性及WesternBlot鑒定我們將Ad-LF以不同的MOI值(multiplicityofinfection,感染復(fù)數(shù))感染不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人肺癌細(xì)胞株A549、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，分別用ELISA和WesternBlot方法檢測(cè)人LFA3-Fc融合蛋白的表達(dá)情況。分別將人肺癌細(xì)胞株A549、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(購(gòu)自ATCC公司)接種于6孔板，將實(shí)施例4所得的重組腺病毒Ad-LF以不同的MOI值0、5、10、50進(jìn)行感染，培養(yǎng)48小時(shí)后，取上清液用試劑盒(購(gòu)自Chemicon公司)檢測(cè)LFA3-Fc的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)表2。表2不同細(xì)胞感染不同量的Ad-LF的表達(dá)情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)果表明，重組腺病毒Ad-LF能感染包括肺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌在內(nèi)的多種細(xì)胞類型，表達(dá)并分泌人LFA3-Fc融合蛋白，說(shuō)明Ad-LF具有較廣譜的感染范圍及較高的表達(dá)活性。同時(shí)以兔抗人LFA3抗體(1:500)(購(gòu)自Chemicon公司)為一抗、羊抗兔IgG-HRP(購(gòu)自DAKO公司)為二抗(1:3000)，用常規(guī)WesternBlot法進(jìn)一步鑒定Hela細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物是否與預(yù)計(jì)的相同。結(jié)果見(jiàn)圖7，結(jié)果表明Hela細(xì)胞特異地表達(dá)人LFA3-Fc融合蛋白，分別用還原和非還原條件電泳，還原條件得到雜交條帶與預(yù)計(jì)的一致(60kDa左右)，非還原條件的雜交條帶為二聚體形式(119kDa左右)，均很彌散，呈現(xiàn)典型的糖蛋白電泳圖譜。實(shí)施例6重組腺病毒Ad-LF抑制淋巴細(xì)胞增殖的活性測(cè)定在體外，我們通過(guò)混合淋巴細(xì)胞增殖的抑制試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)重組腺病毒Ad-LF表達(dá)的融合蛋白的活性。首先，Ad-LF感染Hela細(xì)胞(MOhl0)制備病毒感染上清液，備用。淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離的人淋巴細(xì)胞分為兩組，一組用RPMI1640洗滌兩次，重懸于含10%FBS的RPMI1640中，得到終濃度為3xl06/ml的細(xì)胞懸液，作為反應(yīng)細(xì)胞(respondercells);另一組用2000rads-射線處理得到終濃度為3xl06/ml的細(xì)胞液，作為刺激細(xì)胞(stimulatorcells)。反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞按1:1的比例加入圓底96孔板(1.5xl0V孔細(xì)胞)，每孔加入50m1病毒感染上清液(等二倍稀釋)，置于37°〇，5。/。C02孵箱孵育5天。第五天，每孔加入1pCi的&標(biāo)記的胸腺嘧啶，孵育15小時(shí)后，用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，用液閃測(cè)定儀測(cè)定每孔相對(duì)放射性(以CPM表示)。結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明LFA3-Fc融合蛋白濃度與淋巴細(xì)胞增殖的抑制之間存在劑量依從性，在l:4稀釋濃度時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞細(xì)胞的抑制達(dá)到50%;而空載腺病毒Ad-Null感染上清則無(wú)抑制效應(yīng)。這說(shuō)明了Ad-LF表達(dá)的LFA3-Fc融合蛋白在體外的確可以顯著地抑制淋巴細(xì)胞的增殖。實(shí)施例7重組腺病毒Ad-LF注射劑的制備在無(wú)菌條件下取500ml注射用水，加入實(shí)施例4所得的重組腺病毒Ad-LF(3xl010-3xl013VP)、Tris0.484g、MgCl20.076、蔗糖16g，混合均勻，再加注射用水至總體積1000ml，同時(shí)用HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0。無(wú)菌過(guò)濾后分裝成lml/支的重組腺病毒Ad-LF注射齊U，于-2(TC保存。綜上，由本發(fā)明中的人LFA3-Fc融合基因構(gòu)建的重組腺病毒Ad-LF能感染多種類型的細(xì)胞，并大量穩(wěn)定地分泌表達(dá)高活性的重組人LFA3-Fc多肽。由本發(fā)明的重組腺病毒制備的抗銀屑病注射劑，能使機(jī)體持續(xù)高水平的表達(dá)具有完整生物活性的重組人LFA3-Fc多肽。這彌補(bǔ)了蛋白輸注人LFA3-Fc藥物體內(nèi)穩(wěn)定性差、有效濃度持續(xù)時(shí)間十分短暫的局限，能大大減少給藥量、降低用藥成本、減輕患者負(fù)擔(dān)，同時(shí)還提高了患者的生活質(zhì)量，具有很好的市場(chǎng)前景。以上的較優(yōu)的具體實(shí)施方式是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的舉例說(shuō)明，但并非對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種變型或改進(jìn)，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的精神及所附上的權(quán)利要求書(shū)定義的范圍之內(nèi)。序列表〈110>〈120〉一種重組復(fù)制缺陷型病毒、含有該病毒的藥物組合物及其應(yīng)用〈130〉F卜070270-59<160>7〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1044<212>隨〈213〉重組人LFA3-Fc融合基因<400>1atggttgctgggagcgacgcggggcgggccC3CtgCtttggtttcatc3gctgtttttccgtaactttccatgtaccaagcaatgtgcctgat3a3gttgcagsactggaaasttctgaagttt3ttt3g3C3CtgtgtC3ggt3gCCtCgatg3gtatg3aatggaatcgccaaat3ttg3caaa3ctcscacstgcccaccgtgccc3ttCCtcttCCCCCC33a3CCC33gg3C3CCtgCgtggtggtgg3Cgtg3gCC3Cg33g3CggCgtgg3ggtgC3t33tgCC3Sg3C333gcgtgtggtcagcgtcctcscCgtCCtgC3Ctgcaaggtctccaac3a3gccctcccsgccctgggggtcctcagcgtggtctgcctgctg60caacaaatatatggtgttgtgtatgggaat120ttaaaagaggtcctatggaaaaaacaaaag180ttcagagctttctcatcttttaaaastagg240actatctacaacttaacatcatcagatgaa300actgataccatgaagttctttctttatgtc360gcacctgaactcctgggaggaccatcagtc420ctcstgatctcccggscccctgsggtC3ca480CCtg3ggtC33gttC33Ctggt3Cgtgg3C540ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac600caggactggctgaatggcaaggsgtacasg660cccatcgagaaaaccatctccassgccaaa720司有物力躍明懷東磊光太為凱勇立仁紹亞紅波琦莞..........東韓何陽(yáng)楊張鐘聞李何唐gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaag780aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag840tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc900gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg960aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc1020ctctccctgtctccgggtaaatga1044<210>2<211>35〈212〉瞧〈213〉引物1(P1)〈400>2ctcaagcttgctagcatggttgctgggagcgacgc35<210>3〈211〉30〈212〉陽(yáng)〈213〉引物2(P2)〈400>3acgcgtcgacataaagaaagaacttcatgg30<210>4<211>26〈212>DNA<213>引物3(P3)<400>4acgcgtcgacaaasctcacacatgcc26〈210〉5<211>27〈212〉瞧〈213〉引物4(P4)〈400>5cgggatcctcatttacccggagacagg27<210>6〈211>20〈212〉DNA<213>引物PE1<400>6tcgtttctcagcagctgttg20<210>7<211>20<212>DNA〈213>引物PE2〈400>7catctgaactcaaagggtgg20權(quán)利要求1.一種重組復(fù)制缺陷型病毒，其特征在于該復(fù)制缺陷型病毒包含有啟動(dòng)子控制下的人融合基因LFA3-Fc。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)制缺陷型病毒，其特征在于，所述的人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分與人IgG的Fc片段融合形成的。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)制缺陷型病毒，其特征在于，所述的人融合基因LFA3-Fc的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的復(fù)制缺陷型病毒，其特征在于所述復(fù)制缺陷型病毒是復(fù)制缺陷型腺病毒、復(fù)制缺陷型單純皰疹病毒或復(fù)制缺陷型新城疫病毒中的任何一種。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)制缺陷型病毒，其特征在于，所述的復(fù)制缺陷型病毒為5型腺病毒。6.—種含有權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述復(fù)制缺陷型病毒的宿主細(xì)胞。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為293細(xì)胞。8.—種權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的重組復(fù)制缺陷型病毒的制備方法，該方法包括將人融合基因LFA3-Fc插入復(fù)制缺陷型病毒基因組中并置于啟動(dòng)子控制下的步驟。9.一種藥物組合物，其特征在于由權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的復(fù)制缺陷型病毒和藥學(xué)上可接受的輔料構(gòu)成。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物為注射液，每毫升注射液含有3xl0夂3x1013病毒粒子。11.權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的復(fù)制缺陷型病毒用于制備抗銀屑病的藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組復(fù)制缺陷型病毒，該復(fù)制缺陷型病毒包含有啟動(dòng)子控制下的人融合基因LFA3-Fc，其中該人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分與人IgG的Fc片段融合形成的。本發(fā)明還涉及一種抗銀屑病的藥物組合物，該藥物組合物由所述的復(fù)制缺陷型病毒和藥學(xué)上可接受的輔料組成。根據(jù)本發(fā)明方法制成的抗銀屑病藥物組合物注射劑可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)目的蛋白，因而可以減少給藥次數(shù)。文檔編號(hào)A61P17/00GK101113459SQ200710130548公開(kāi)日2008年1月30日申請(qǐng)日期2007年7月16日優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日發(fā)明者凱何,波何,琦唐,張仁懷,李紅光,楊立明,鐘紹東,聞亞磊,勇陽(yáng),韓為躍申請(qǐng)人:東莞太力生物工程有限公司