專利名稱：：粒-巨細胞集落刺激因子基因修飾的異基因腫瘤細胞疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及粒-巨細胞集落刺激因子(以下稱GM-CSF)基因修飾的異基因腫瘤細胞系及其在制備腫瘤疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展，我們欣喜地注意到腫瘤疫苗已經(jīng)走到了腫瘤治療的前沿，并給廣大患者帶來了希望。應(yīng)用自身的滅活的腫瘤細胞作為抗原來治療胂瘤己有上百年歷史，但一直療效不佳。近幾年來將自身的滅活的腫瘤細胞聯(lián)合細胞因子進行治療取得較大進展，大致的方法是將患者自體腫瘤細胞通過基因載體轉(zhuǎn)移細胞因子，成為可分泌細胞因子的腫瘤細胞，再將其經(jīng)致死劑量的放射線照射后皮內(nèi)或皮下注射，成為腫瘤疫苗。由于這些疫苗，通過基因轉(zhuǎn)染使胂瘤細胞能夠表達某些細胞因子或共刺激分子，使得腫瘤細胞的免疫原性獲得了大幅度的提高。其中又以轉(zhuǎn)染GM-CSF基因效果更好，通過GM-CSF轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞，使其表達GM-CSF蛋白，在注射局部形成GM-CSF高濃度區(qū)域，從而使注射局部的抗原提呈細胞的功能大幅度增強。鑒于目前大多數(shù)人類肺瘤細胞抗原類型仍未得到明確的鑒定，用全腫瘤細胞作為疫苗的有效組分仍不失簡單有效。自身腫瘤細胞作為疫苗已用于臨床試驗，但在大規(guī)模的臨床使用中，存在著幾個問題自體腫瘤疫苗需要利用患者的腫瘤組織制備，病例選擇和治療次數(shù)受到取材的限制，而且花費較高；原代腫瘤細胞在體外培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染等操作方面，存在較大困難；不同患者來源的肺瘤細胞在遺傳性狀、基因轉(zhuǎn)染效率等方面存在較大差異，難以質(zhì)控等等，這些因素限制了其廣泛使用。應(yīng)用已建^^的腫瘤細胞系具有獨特的優(yōu)勢①能夠以較小的成本，克服自體/異體腫瘤細胞取材難的問題；②其體外培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染等方面的技術(shù)趨于成熟，可以提供表達穩(wěn)定的抗原；③經(jīng)治療基因轉(zhuǎn)染的胂瘤細胞系，其治療因子分泌量穩(wěn)定，易于質(zhì)控，因此更適合于開發(fā)及廣泛應(yīng)用。到目前為止，有關(guān)應(yīng)用GM-CSF基因轉(zhuǎn)染異基因腫瘤細胞系制備瘤苗及其機制研究及腫瘤疫苗與放化療結(jié)合治療肺癌的報道在國內(nèi)外尚未見報道，本發(fā)明人進行了這方面的研究，證明其在肺瘤主動免疫方面的有效性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面提供了一種GM-CSF基因修飾的異基因腫瘤細胞系。本發(fā)明GM-CSF基因修飾的異基因腫瘤細胞系。其中所述腫瘤細胞系為肺癌細胞系LA795或A549、乳腺癌細胞系MCF-7、胃癌細胞系803、結(jié)腸癌細胞系HCT-8或卯巢癌細胞系SKOV3;其中GM-CSF是通過真核表達載體pIRES-EGFP轉(zhuǎn)染到所述腫瘤細胞系中的；其中GM-CSF是通過病毒載體轉(zhuǎn)染到所述肺瘤細胞系中的；其中病毒載體為腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。疫苗組合物，其含有上述任一項的轉(zhuǎn)基因腫瘤細胞系和任選的可藥用載體。上述疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療肺瘤的藥物中的用途。可用的腫瘤細胞系可以選自肺癌細胞系LA795或A549、乳腺癌細胞系MCF-7、胃癌細胞系803、結(jié)腸癌細胞系HCT-8或卵巢癌細胞系SKOV3等等。本發(fā)明主要是利用GM-CSF基因修飾的同種異體腫瘤疫苗(即腫瘤細胞系)作為治療手段，因此比較有意義的是來源于人的腫瘤細胞系。GM-CSF基因表達載體轉(zhuǎn)染人腫瘤細胞系，同樣可以整合到基因組DNA并穩(wěn)定表達該細胞因子(如后面提供的GM-CSF基因克隆、轉(zhuǎn)染及篩選的實驗方法)。在該種疫苗的治療效杲評價方面，由于應(yīng)用于臨床治療的時間較短，僅能就免疫反應(yīng)進行監(jiān)測(如DTH、注射部位的反應(yīng)等)，而療效觀察還在進行中。因此，試驗周期短的動物實驗就提供了評價異體疫苗效果的一種方法，我們構(gòu)建了GM-CSF基因修飾的小鼠肺癌細胞系LA795疫苗，而同時以另外一種小鼠肺癌細胞系LLC接種小鼠構(gòu)建動物模型，從而模擬人的異體疫苗的情況，來評價該疫苗的治療效果。實驗中利用動物實驗探討的主要問題—是否可以應(yīng)用同種異體腫瘤疫苗作為治療，所以采用一種小鼠細胞系LLC接種后，用LA795制備疫苗，檢驗其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)以及抑制腫瘤生長的作用，因此動物實驗的意義并不是檢驗LA795疫苗的作用，而是探討異體疫苗是否可以應(yīng)用以及治療的效果。GM-CSF可以通過真核表達栽體或病毒載體轉(zhuǎn)染到所迷月中瘤細胞系中。例如，包括但不限于真核表達載體pIRES-EGFP、腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。本發(fā)明另一方面也提供了疫苗組合物，其含有前述的腫瘤細胞系，并壬選地含有可藥用載體。其中腫瘤細胞系的合適的量為1x107/次；可藥用載體的實例如目前在國內(nèi)已用于臨床的Ad-P53(即腺病毒載體攜帶的野生型P53基因)，其載體的使用劑量為1-2x1012VP/周，共4周(PengZ.CurrentstatusofgendicineinChina:recombinanthumanAd-p53agentfortreatmentofcancers.HumGeneTher2005;16:1016-1027);所述疫苗組合物用量需依據(jù)預(yù)防和/或治療的目的、疾病種類以及患者具體情況如年齡、性別、病史、體重等酌情使用，通常劑量范圍為1x106-1xio8(其中，全細胞型胂瘤疫苗的劑量以轉(zhuǎn)染并照射處理的腫廇細胞數(shù)來計算)；所述組合物可以配制成注射液；給藥方式為真皮內(nèi)注射；用藥頻率一般每周一次，共5次。本發(fā)明又一方面還提供了所述轉(zhuǎn)基因腫瘤細胞系或疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的用途。附圖的簡短說明圖1.腫瘤疫苗的制備流程圖。圖2.檢測腫瘤疫苗的安全性及有效性的動物實驗流程圖。圖3.GM-CSF擴增、測序、克隆的電泳圖。顯示了GM-CSF擴增、測序和克隆的結(jié)果。圖3a為RT-PCR獲得GM-CSF的cDNA電泳圖，而圖3b為PCR獲得GM-CSF的DNA序列擴增產(chǎn)物電泳圖；圖3c為連接有GM-CSF目的片段的pIRES2-EGFP質(zhì)粒酶切鑒定圖；圖3d為GM-CSF-pMD18-T質(zhì)粒雙酶切片段的測序結(jié)果。圖4.免疫小鼠的生存期。圖5.免疫小鼠血清學(xué)細胞因子的變化。圖5a,5b，5c分別顯示了IL-4、IFN-y、IFN-P的水平變化。各圖中，1為GM-CSF分泌性LA795瘤苗接種組；2為GM-CSF分泌性LLC瘤苗接種組；3為LA795瘤苗接種組；4為LLC瘤苗接種組；5為PBS對照組。圖6.免疫小鼠脾細胞的殺傷實驗。圖6a顯示了未經(jīng)分選脾細胞對作為抗原的Lewis肺癌細胞系的殺傷率；圖6b顯示了分選的CD8+陽性脾細胞對所述抗原的殺傷率。各圖中，1為GM-CSF分泌性LA795瘤苗接種組；2為GM-CSF分泌性LLC瘤苗接種組；3為LA795瘤苗接種組；4為LLC瘤苗接種組；5為PBS對照組。圖7.免疫小鼠ELISOPT實驗結(jié)果。圖8.免疫小鼠的接種部位免疫組化照片。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的i兌明，而并不旨在以任何方式限制本發(fā)明。實施例1:GM-CSF基因的克隆1.1GM-CSF基因的擴增首先，取于-80。C凍存的人脾組織100mg，如Sambrook等《分子克隆實驗室指南》，第二版1989F,M.Ausubel等編輯的《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗》(CurrentProtocolsInMolecularBiology)(1987)所述進行組織總RNA提取。然后，以此為模板，設(shè)計引物進行RT-PCR實驗。在GenBank檢索人GMCSF基因編碼序列，確定擴增區(qū)域。GM-CSF基因編碼序列CDS(33-467，gi:27437029)。利用01ig6軟件進行引物設(shè)計外上游引物Pl5，GGCTAAAGTTCTCTGGAGGATGTG3'(SEQIDNO:1)外下游引物P25，CTCATCTGGCCGGTCTCACTC3，(SEQIDNO:2)內(nèi)上游引物P35,GAATTCATGTGGCTGCAGAGCCTG3'(SEQIDNO:3)內(nèi)下游引物P45，GGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC3'(SEQIDNO:4)PCR擴增引物由大連寶生物^^司合成，其中P3攜帶5aw/ZI酶切位點P4攜帶Eco/H酶切位點，PCR擴增產(chǎn)物的長度為447bp。配制如下反應(yīng)體系，置于PE-9600型PCR儀中，72。C5min，然后立即置于冰上。01igo-(dT)15primer(500ng/ml)1pitotalRNAsample1jxgSterilewater補足到10pi在反應(yīng)體系中加入以下試劑，置于PCR儀中，42°Clh。廣M-MLVRT(200,1^dNTP(10mM)5^15xReactionBuffer5(xlRNaseinhibitor(25一)0.7piDEPC處理水3.3nl接下來，利用巢式PCR擴增目的片段。第一次PCR擴增按照50|J體系配置PCR反應(yīng)液〖10xbuffer(含Mg2+)5jil■P4)Lll外上游引物(P1)l)Lll外下游引物(P2)1piH2036.75piExTaq聚合酶0.25fil"反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2^1將上述各組分混合均勻，按照如下反應(yīng)條件進行PCR擴增預(yù)變性94°C3分鐘、變性94°C40秒、退火60°C1分鐘、延伸72°C1分鐘，經(jīng)過30個循環(huán)后再72。C10分鐘。第二次PCR擴增按照50^il體系配置PCR反應(yīng)液10xPCRbuffer(含Mg2+)5jxldNTP4fxl內(nèi)上游引物(P3)2|il內(nèi)下游引物(P4)2|idH2033.75}xlExTaq聚合酶0.25^1模板(一擴產(chǎn)物)3jal將上述各組分混合均勻進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件預(yù)變性94°C3分鐘、變性94。C40秒、退火62°C1分鐘、延伸72°C1分鐘，經(jīng)過30個循環(huán)后再72°CIO分鐘。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取在符合目的基因大小處有明顯條帶的PCR產(chǎn)物進行純化以及下一步的實驗。以P1為引物，以總RNA為沖莫板，進行RT時獲得GM-CSF的cDNA電泳圖見圖3a，而以P3和P4為引物，進行PCR擴增時獲得GM-CSF的DNA序列擴增產(chǎn)物電泳圖見圖3b。1.2擴增的GM-CSF基因的驗證將前述純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(Promega)用T4DAN連接酶于4匸過夜連接。取重組質(zhì)粒，；通過電轉(zhuǎn)化或氯化鈣法對感受態(tài)菌抹DH5ot(曰本TaKaRa公司)進行轉(zhuǎn)化。借助于藍白斑鑒定篩選含重組質(zhì)粒的載體。挑取白色菌落，接種，37。C搖床250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒，I+5a/w//I雙酶切，然后進行電泳鑒定，并送寶生物公司進行測序驗證，GM-CSF-pMDl8-T質(zhì)粒雙酶切片段的測序結(jié)果見圖3d。1.3GM-CSF基因的克隆即表達栽體的構(gòu)建含GM-CSF的目的質(zhì)粒經(jīng)擴增提取后，利用限制性內(nèi)切酶五co尺I+5fiW2//I切割，與經(jīng)同樣雙酶切的真核表達載體pIRES-EGFP(購自Invitrogen)以大約4:l的摩爾比利用T4DNA連接酶于4°C過夜連接，反應(yīng)體系如下10xT4Ligationbuffer2卩l(xiāng)T4ligase2pl目的基因片l爻8|ilpIRES2-EGFP載體片段8pl同前文所述，取連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5a,篩選重組質(zhì)粒，酶切電泳鑒定，連接有GM-CSF目的片段的pIRES2-EGFP質(zhì)粒酶切鑒定如圖3c所示。為構(gòu)建病毒表達載體，以類似方法切割購自Clontech公司AdEasy腺病毒栽體系統(tǒng)或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX,后續(xù)的連接和回收步驟同上，所得重組載體同樣可用于重復(fù)實施以下各實驗。載體為常用載體。實施例2:GM-CSF基因修飾的異基因腫瘤細胞系的制備將狀態(tài)良好的腫瘤細胞以1.5x106/孔接種于35mm六孔板中，以2ml含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液37°C、5%C02、培養(yǎng)1824h，使轉(zhuǎn)染當(dāng)日細胞達到9095%互相接觸。對每個轉(zhuǎn)染孔，按如下方法準(zhǔn)備脂質(zhì)體復(fù)合物DNA稀釋液制備將來自實施例1的DNA4嗎溶于250piOpti-MEMI無抗生素、無血清培養(yǎng)基中，輕柔混勻；脂質(zhì)體稀釋液制備使用前輕柔混勻LipofectamineTM2000，取10pi用Opti-MEMI無抗生素、無血清培養(yǎng)基稀釋至250iil，輕柔混勻。室溫孵育5min后，將脂質(zhì)體稀釋液與DNA稀釋液混合在一起，室溫孵育20min以形成DNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物。將這500piDNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入到一個含培養(yǎng)基和細胞的孔中，輕晃培養(yǎng)板以使其混勻。5%(302的37。C溫箱中孵育6小時。棄去培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，加入完全培養(yǎng)基孵育。謬遂襲膝G418篩選抗性克隆的篩選將轉(zhuǎn)染細胞進行傳代，生長24h后，更換為選擇性培養(yǎng)基(5%小牛血清并含有600ug/mlG418)繼續(xù)培養(yǎng)。間隔23d換液一次，待對照細胞全部死亡時，已基本得到G418抗性LA795細胞的克隆，挑取單個細胞的克隆繼續(xù)進行篩選擴增，即為G418抗性的LA795細胞?？剐钥寺〉蔫b定從基因和蛋白水平檢測GM-CSF的表達?；蛩降臋z測用SDS/蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提的方法制備細胞基因組DNA,PCR方法擴增GM-CSF基因。結(jié)果可見GM-CSF基因的表達。蛋白水平的檢測ELISA方法檢測GM-CSF基因分泌，收獲細胞培養(yǎng)上清液，ELISA方法測定106細胞24h內(nèi)的GM-CSF分泌量，結(jié)果GM-CSF分泌/106/24h>400ng。ELISA實驗方法除空白孔外每孔加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品100ju1,37°C孵箱孵育90min。洗板，加入生物素化抗體工作液(100ju1/孔)，37°C孵箱孵育60min。洗板，加入酶結(jié)合物工作液(100n1/孔),37°C孵箱孵育30mm。洗板，加入顯色劑100jul/孔，避光，37°C孵育10-25mm。加入終止液100p1/孑L,混勻，5min內(nèi)以酶標(biāo)儀測量OD450值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品中GM-CSF的濃度。依據(jù)本實施例中的方法，分別成功篩選到GM-CSF基因修飾的肺癌細胞系A(chǔ)549、乳腺癌細胞系MCF-7、胃癌細胞系803、結(jié)腸癌細胞系HCT-8或卵巢癌細胞系SKOV3。上述的A549為人肺癌細胞系，接種正常動物;漠型不能形成移植瘤，而接種棵鼠雖可成瘤，但棵鼠為免疫缺陷型，接種疫苗后不能產(chǎn)生正常的免疫反應(yīng)，此為腫瘤疫苗的動物實驗中難以解決的問題。在此，可以補充GM-CSF基因修飾異體腫瘤細胞疫苗接種人體的情況。GM-CSF基因修飾異體胂瘤細胞疫苗接種后，患者注射部位不同程度的紅腫等炎癥反應(yīng)，紅腫硬結(jié)的直徑可達2-3cm，周圍發(fā)紅的區(qū)域直徑可達10-30cm;未出現(xiàn)發(fā)熱、流感樣癥狀及其他不良反應(yīng)。注射部位皮膚行病理檢測，可見大量淋巴細胞等單個核細胞在腺體、血管等周圍浸潤；免疫組化染色可見CD3+和CD8+細胞較多。并且治療后患者DTH反應(yīng)為陽性(DTH是目前檢測體內(nèi)侍異性免疫反應(yīng)的常^1方法)。實施例3:小鼠腫瘤疫苗的制備和接種實驗小鼠為清潔級近交系C57BL/6(H-2Kb,雌性)，8-12周齡，體重18-22g，購自北京維通利華動物中心。以接種LewisLungCancer(LLC)的C57小鼠作為動物模型，如實施例2所苗。接種疫苗的步驟在無菌條件下，取細胞系腫瘤疫苗(小鼠GM-CSF基因修飾LA795細胞疫苗)0.1ml(107)懸液，注射與小鼠左后肢內(nèi)側(cè)皮下，不需麻醉，每7天重復(fù)1次，共3次。對照小鼠注射相同體積的PBS、未經(jīng)GM-CSF基因修飾的LLC或LA795瘤苗。分別按照如下實施例4-8的操作評估各項療效指標(biāo)。實施例4:腫瘤疫苗接種小鼠的成瘤時間、腫瘤體積及生存時間治療開始后，由專人用游標(biāo)卡尺每3天測量腫瘤的最大徑(A)和垂直徑(B),根據(jù)公式1/6兀AB2計算腫瘤體積(A〉B),并記錄小鼠的成瘤時間和生存期。有關(guān)小鼠生存期結(jié)果參見圖4，各組小鼠在給予三次瘤苗接種后第7天給予腫瘤接種，劑量為lx107，接種后觀察接種后的存活時間，相對于PBS對照組，單純LA795和LLC接種組的小鼠荷瘤存活時間并無明顯延長(P>0.05)，而GM-CSF分泌性的自體或同種異體腫瘤疫苗組的荷瘤存活時間卻明顯被延長(P<0.01)。通過這種預(yù)防接種，發(fā)現(xiàn)與PBS對照組以及單純LA795和LLC接種組相比，經(jīng)GM-CSF基因修飾的LLC和LA795瘤苗接種后，成瘤時間明顯推遲，腫瘤生長延緩，主要體現(xiàn)在接種后出現(xiàn)可測量腫瘤的時間推遲，并且同期相比的腫瘤體積小于對照組。同成瘤時間相似的是，GM-CSF分泌性的lLC(自體)瘤苗接種組的生存期有長于LA795(同種異體)瘤苗接種組的趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。從以上結(jié)果可以看出，GM-CSF基因修飾的異基因瘤苗能夠有效地誘導(dǎo)抗腫瘤免疫活性，抑制腫瘤的生長，延長生存期。實施例5:小鼠血清學(xué)細胞因子的變化各組小鼠分別于腫瘤疫苗接種前、每次接種瘤苗前及最后一次接種瘤苗后7天，處死小鼠3只，各經(jīng)眼球取血約0.6-1ml,用于血清學(xué)指標(biāo)檢測，利用ELISA法檢測小鼠血清IFN-Y、IL-4:的分泌水平。簡言之，監(jiān)測小鼠疫苗接種前后血清IFN-y、IL-4分泌水平的變化。以上細胞因子檢測ELISA試劑盒購自Bender公司(Austrian)。在預(yù)先包纟皮抗體的96孔板加入標(biāo)準(zhǔn)品和實驗樣品(每孔100ul)，37。C孵育90min;棄去液體并用WashingBuffer洗板5次，加入生物素標(biāo)記抗體，將育60mm;洗才反，加入HRP孵育30min;洗才反，加入顯色液孵育10min;加終止液(2NHC1)終止反應(yīng)，于450nm檢測吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中相應(yīng)細胞因子的濃度。結(jié)果見圖5a-5b,圖中，1為GM-CSF分泌性LA795瘤苗接種組，2為GM-CSF分泌性LLC瘤苗4矣種組，3為LA795瘤苗4姿種組，4為LLC瘤苗4妄種組，5為PBS對照組?？梢姼鹘M中隨腫瘤疫苗的注射，其血清IL-4水平并無明顯變化(P〉0.05)，各組之間的血清IL-4水平也無顯著性差異(P>0.05)?？梢姼鹘M中隨腫瘤疫苗的注射，其血清IFN-y水平變化明顯(P>0.05);IFN-y水平尤以第3次注射后增高明顯(其中自體瘤苗組比同種異體組的IFN-y高，但無顯著性差異)；其中GM-CSF分泌性自體和同種異體瘤苗組的IFN-y水平隨注射次數(shù)的增加變化明顯，遠高于其他各組(PO.01)，而無GM-CSF分泌性的自體或同種異體瘤苗組的IFN-7水平的升高遠不及有GM-CSF的分泌組明顯；PBS對照組IFN-y水平注射前后無明顯變化。從以上結(jié)果可以看出，GM-CSF基因修飾的異基因瘤苗與自體瘤苗一樣能夠有效地誘導(dǎo)血清Thl類細胞因子的升高。Thl升高的意義CD4+的輔助性T細胞即Th細胞，而Th細胞又可向Thl和Th2兩個方向分化，Thl類細胞主要分泌IFN卞IL-2等細胞因子，而Th2類細胞則分泌IL-4，IL-10等。腫瘤患者體內(nèi)大多出現(xiàn)Th2偏移，在形成腫瘤導(dǎo)致的免疫抑制當(dāng)中具有重要的作用。i^過免疫治療調(diào)節(jié)該現(xiàn)象，使其Thl方向漂移，即本研究中檢測到的Thl類細胞因子升高，而Th2類細胞因子無顯著變化，這種Thl漂移的現(xiàn)象有利于誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)。實施例6:免疫小鼠脾細胞的殺傷實驗V、^々v^^^^敘敏Jg岸W為、有預(yù)防組各組小鼠分別于肺瘤疫苗接種前、每次接種瘤苗前及最后一次接種瘤苗后7天，處死小鼠3只，各取脾細胞制備成勻漿，利用流式細胞儀(BDPharmingen)通過流式細胞術(shù)檢測各細胞亞群的分布CD4-FITC/CD3-PE、CD8-FITC/CD3-PE、CD4-FITC/CD25-PE。表1.各組、鼠流式細胞檢測的淋巴細胞亞群比例(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>然后使用LDH法檢測瘤苗接種后小鼠脾細胞對腫瘤細胞的殺傷活性(Program):以Lewis肺癌細胞系作為抗原進行重復(fù)刺激，觀察效應(yīng)細胞對抗原的殺傷比率(圖6a)。進而對脾細胞進行CD8+陽性分選，以此CD8+細胞作為效應(yīng)細胞對含有特異性抗原的腫瘤細胞進行殺傷實驗(圖6b)。圖中，1為GM-CSF分泌性LA795瘤苗接種組，2為GM-CSF分泌性LLC瘤苗接種組，3為LA795瘤苗接種組，4為LLC瘤苗4矣種組，5為PBS對照組?？梢姼鹘M中隨腫瘤疫苗的注射，其脾細胞(效應(yīng)細胞)對抗原的殺傷能力不斷增強(PO.01),尤以第3次免疫后的增強最為明顯(PO.01);其中GM-CSF分泌性自體和同種異體瘤苗組的效應(yīng)細胞的殺傷特定抗原的能力增加明顯，遠高于其他各組(P<0.01);而無GM-CSF分泌性的自體或同種異體瘤苗組的效應(yīng)細胞的殺傷能力的升高遠不及有GM-CSF的分泌組明顯；PBS對照組注射前后無明顯變化；經(jīng)CD8+分選后各組的效應(yīng)細胞的殺傷實驗亦證實腫瘤疫苗可以有效誘導(dǎo)抗原特異性的CD8+CTL細胞，對相應(yīng)靶細胞產(chǎn)生特異性殺傷作用。從以上結(jié)果可以看出，GM-CSF基因修飾的異基因瘤苗同自體瘤苗一樣能夠有效地刺激機體淋巴細胞特別是CD8+CTL細胞對"自體，，腫瘤細胞的殺傷活性。實施例7:免疫小鼠的ELISOPT實驗結(jié)果免疫斑點實驗(ELISOPT)檢測脾細胞活化，即分泌IFN-y的細胞數(shù)量(BDBioscience)。簡言之，應(yīng)用ELISPOT方法檢測小鼠脾淋巴細胞經(jīng)LLC肺癌抗原刺激后的活化。ELISPOT的實驗步驟('針對LA795瘤苗的動物實驗)每孔加入50pLMagiCoatingBuffer稀釋好的包被抗體，4。C過夜。傾倒包^^皮液，用PBS洗滌3次，在滅菌的吸水紙上扣千。加入200pL稀釋好的封閉液，37°C封閉lh后，傾倒封閉液。接種細胞(100pL/wel1)，實驗組1x106細胞/well,同時加入刺激物即抗原(本實驗中為放射滅活后的LLC細胞)；背景負對照孔加入lOO^L的Lympho-SpotTM無血清培養(yǎng)基；正對照孔1x104細胞/well同時加入10pLPHA(終濃度l-4ug/mL)。37°C培養(yǎng)18-24h，傾倒孔內(nèi)的細胞及培養(yǎng)基。每孔加入20(HiL水冷的去離子水，水浴10min。每孔用20(HiLPBS洗滌10次，在吸水紙上扣千。每孔加入100pL稀釋好的生物素標(biāo)記檢測杭體，37°C賻育lh。每孔用200^LPBS洗滌5次，在吸水紙上扣干。每孔加入lOOpL酶標(biāo)親和素工作液，37。C孵育1小時。每孔用200pLPBS洗滌5次，在吸水紙上扣干。每孔加入100pL的AEC顯色液，室溫避光靜置15-45min,待斑點形成到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上拍干之后取下保護層，在通風(fēng)處室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干。將ELISPOT板置于BiosysBioreader4000PRO自動讀板儀內(nèi)分析。治療組小鼠在免疫接種前和第3次免疫接種后7天，分別處死小鼠，取脾進行ELISPOT實驗。加入抗原LLC肺癌細胞后，可見小鼠效應(yīng)細胞被特異性抗原活化在預(yù)防組各組小鼠中免疫后活化細胞數(shù)量明顯增加(PO.Ol)，免t后GM-CSF分泌性瘤苗組的活化明顯高于其他組(PO.01)。從以上結(jié)果可以看出，GM-CSF基因修飾的異基因瘤苗同自體瘤苗一樣能夠有效地刺激脾淋巴細胞對"自體"腫瘤細胞抗原的活化，即可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對"自體"腫瘤細胞的特異性免疫反應(yīng)。實施例8:免疫小鼠接種部位淋巴細胞浸潤情況以常規(guī)HE染色及免疫組化染色，簡言之，以免疫組化法檢測疫苗接種部位的淋巴細胞浸潤情況。HE染色切片在二甲苯中脫蠟5~10分鐘。移入二甲苯和純酒精(l:1)混合液中5分鐘左右。依次放入100%、95%、85%、70%酒精，各級分別為2-5分鐘，最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液。蘇木精染液染色5~15分鐘。水洗玻片上多余染液，0.5~1%鹽酸酒精(70%酒精配制)分色片刻。鏡檢控制，直至細胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約10秒鐘。流水沖洗1530分鐘；或者在碳酸鋰飽和液中短時間堿化或藍化，即細胞核呈藍色，蒸餾水短洗。0.1-0.5%伊紅染液染色1~5分鐘。依次經(jīng)70%、85%、95%、100%酒精脫水，各級為23分鐘。二甲苯透明(二次)，共約IO分鐘。封片。免疫組化組織切片脫蠟、水化后，PBS洗2~3次各5分鐘。滴加3%H202，室溫靜置10分鐘；PBS洗2~3次各5分鐘?？乖迯?fù)，PBS洗。滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。滴加I抗50|^1，室溫靜置1小時或者4°C過夜或者37。C1小時。PBS洗3次各5分鐘；滴加II抗40-50^1,室溫靜置，或37。C1小時(1I抗中可加入0.05。/o的tween-20)。PBS洗3次各5分鐘；DAB顯色5~10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。PBS或自來水沖洗10分鐘；蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；自來水沖洗1015分鐘。脫水、透明、刮片、鏡檢。接種部位免疫組化照片見圖8,通過比較可知，GM-CSF基因修飾自體或異體腫瘤疫苗注射部位可見明顯的CD8+T細胞浸潤，而對照組未見淋巴細胞浸潤現(xiàn)象。從以上結(jié)果可以看出，GM-CSF基因修飾的異基因瘤苗同自體瘤苗一樣能夠有效地誘導(dǎo)CD8+T細胞的趨化和浸潤，即刺激局部的CTL細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。序列表<110>天津腫瘤醫(yī)院<120>GM-CSF基因修飾的異基因腫瘤細胞疫苗<130>tj002<160〉4<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>24<212〉DNA<213>人工<220〉<221〉血isc一feature<223>外上游引物P1<400〉1ggctaaagttctct,ggaggatgtg24<210>2<211>21<212>DNA<213>人工<220><221>misc—feature<223〉外下游引物P2<400>2ctcatctggccggtctcact,c21<210〉3<211>24<212>DNA<213>人工<220〉<221〉misc—feature<223>內(nèi)上游引物P3<400>3gaatt,catgt.ggct,gcagagcctg24〈210>4<211>24〈212>DNA<213〉人工〈220><221>inisc—feature<223〉內(nèi)下游引物P4<400>4gga.t,cctcactcctggactggctc2權(quán)利要求1.一種GM-CSF基因修飾的異基因腫瘤細胞系。2.權(quán)利要求1的腫瘤細胞系，其中所述腫瘤細胞系為肺癌細胞系LA795或A549、乳腺癌細胞系MCF-7、胃癌細胞系803、結(jié)腸癌細胞系HCT-8或卵巢癌細胞系SKOV3。3.權(quán)利要求1或2的腫瘤細胞系，其中GM-CSF是通過真核表達載體pIRES-EGFP轉(zhuǎn)染到所述腫瘤細胞系中的。4.權(quán)利要求1或2的腫瘤細胞系，其中GM-CSF是通過病毒載體轉(zhuǎn)染到所述腫瘤細胞系中的。5.權(quán)利要求4的腫瘤細胞系，其中病毒載體為腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。6.疫苗組合物，其含有權(quán)利要求1-5中任一項的轉(zhuǎn)基因腫瘤細胞系和任選的可藥用載體。7.權(quán)利要求1-5中任一項的腫瘤細胞系或者權(quán)利要求6中的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療肺瘤的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及GM-CSF基因修飾的異基因腫瘤細胞系及其在制備腫瘤疫苗中的用途。本發(fā)明公開了GM-CSF基因修飾的異基因腫瘤細胞系及其在制備腫瘤疫苗中的用途。文檔編號A61P35/00GK101353645SQ20071013079公開日2009年1月28日申請日期2007年7月26日優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日發(fā)明者任秀寶,慧李,郝希山申請人:天津市腫瘤醫(yī)院