專利名稱：：聚乙二醇修飾的抑肽酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化學(xué)修飾的抑肽酶及其制備方法和用途，具體地說涉及一種聚乙二醇修飾的抑肽酶及其制備方法，還包括其在止血和抗炎中的用途。
背景技術(shù)：
：抑肽酶(aprotinin)是從牛肺中提取的一種堿性多肽，為非特異性蛋白酶抑制劑，能抑制多種含有絲氨酸活性中心的蛋白酶。抑肽酶由58個(gè)氨基酸組成，其氨基酸組成為RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA。大量臨床研究表明大劑量抑肽酶可明顯減少體外循環(huán)術(shù)后出血，臨床主要用于防治各種纖維蛋白溶解所致的急性出血及各種休克，急性胰腺炎及胰腺壞死。近年來廣泛應(yīng)用于各種手術(shù)、如體外循環(huán)心臟直視手術(shù)、癌癥手術(shù)、骨科手術(shù)、剖宮產(chǎn)術(shù)、鼻內(nèi)窺鏡術(shù)等，以減少術(shù)中、術(shù)后出血。但是在使用過程中也發(fā)現(xiàn)這些藥物具有蛋白質(zhì)藥物所共有的缺點(diǎn)，如具有免疫原性，半衰期短等。特別是免疫原性問題，已成為抑肽酶廣泛應(yīng)用的最大障礙。資料顯示0.7%的患者首次接觸既可發(fā)生過敏反應(yīng)，再次使用者過敏反應(yīng)發(fā)生率增至10%。為此，發(fā)明人試圖采用蛋白質(zhì)修飾技術(shù)對(duì)抑肽酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以降低或消除抑肽酶的免疫原性，從而改善該類藥物的藥效，降低毒性。目前，在對(duì)蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行化學(xué)修飾的研究領(lǐng)域中，應(yīng)用最多，成功率最高的是聚乙二醇(PEG)修飾技術(shù)。用于修飾蛋白質(zhì)藥物的PEG有很多種，典型的修飾反應(yīng)列舉如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>1)SPA-PEG或SBA-PEG所參與的反應(yīng)；2)帶a-支鏈的SPA-PEG或SBA-PEG所參與的反應(yīng)(C:幾種活化的PEG修飾蛋白質(zhì)巰基的反應(yīng)■O1.)mPEG—N+SH-RmPEG—NO—S-ROOII2.)ro:PEG——S—CH-CH2+SH-RO如omPEG—S—CH2CH2SOO■3.)mPEG—NHCCTjI+SR-ROtlmPEG—NHCCH，S-R4,)mPEG—S-S-1)為PEG-馬來酰亞胺；2)為PEG-乙烯基砜；3)為PEG-碘乙酰胺;4)為PEG-鄰-吡啶-二硫醚。修飾研究中大多數(shù)是將多肽分子中的氨基作為修飾位點(diǎn)。為克服抑肽酶作為藥物使用所存在的不足，采用聚乙二醇修飾技術(shù)對(duì)抑肽酶的氨基進(jìn)行修飾，以獲得聚乙二醇修飾的抑肽酶，作為止血藥物和抗炎藥物在臨床上應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)制備抑肽酶存在免疫原性，半衰期短等缺陷，采用蛋白質(zhì)修飾技術(shù)以降低其免疫原性，延長(zhǎng)其半衰期，從而改善該蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)特性，以提高其耐受性和減少給藥次數(shù)，更好地滿足抑肽酶在臨床應(yīng)用方面的需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特征在于，抑肽酶的氨基上連接有聚乙二醇或其衍生物鏈。所述的抑肽酶(aprotinin)包括從牛肺或牛的胰腺中提取的或用基因工程手段制備的重組抑肽酶，該抑肽酶的氨基酸組成序列為[R]PDFCLEPPYTGPC[K]ARIIRYFYNA[K]AGLCQTFVYGGCRA[K]RNNF[K]SAEDCMRTCGGA;分子式為C284H432N84079S7;分子量為6511.44。所述的抑肽酶的氨基，具體而言就是指抑肽酶組成中N-末端的a-氨基和賴氨酸的s-氨基，可能的修飾位點(diǎn)為5個(gè)(見上述序列中的[]中的氨基酸)。每個(gè)抑肽酶分子上可以接15條聚乙二醇的長(zhǎng)鏈，優(yōu)選每個(gè)抑肽酶分子上連接一條聚乙二醇長(zhǎng)鏈。所述的聚乙二醇長(zhǎng)鏈可以為直鏈聚乙二醇也可以為支鏈聚乙二醇，優(yōu)選直鏈聚乙二醇；聚乙二醇長(zhǎng)鏈的分子量通常在2000200000之間，優(yōu)選的分子量在3000-30000之間。優(yōu)選的的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結(jié)構(gòu)m陽PEG-Y-NH畫R其中PEG代表聚乙二醇長(zhǎng)鏈，其可以是直鏈聚乙二醇長(zhǎng)鏈，也可以是帶有支鏈的聚乙二醇長(zhǎng)鏈，優(yōu)選直鏈聚乙二醇；該長(zhǎng)鏈的分子量通常在2000~200000之間，優(yōu)選的分子量在3000~30000之間；其中m代表d~C4的低級(jí)烷氧基，該低級(jí)烷氧基用于保證每個(gè)聚乙二醇長(zhǎng)鏈上僅修飾一個(gè)抑肽酶分子，也即單聚乙二醇修飾抑肽酶，m優(yōu)選甲氧基；其中Y代表聚乙二醇長(zhǎng)鏈和抑肽酶的連接基團(tuán)，是聚乙二醇或其衍生物在修飾后留下的殘基；其中R代表少了一個(gè)氨基的抑肽酶分子。聚乙二醇修飾的抑肽酶的制備方法包括將活化的聚乙二醇或其衍生物與抑肽酶進(jìn)行反應(yīng)，然后將聚乙二醇修飾的抑肽酶從反應(yīng)混合物中分離，得到藥用純度的聚乙二醇修飾的抑肽酶。所述的活化的聚乙二醇或其衍生物是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的，例如描述于RobertMJ等，先進(jìn)的藥物傳遞評(píng)論(AdvancedDrugDiliveryReviews)(2002;54:459-476)。其中聚乙二醇或其衍生物包括但不限于單甲氧基聚乙二醇、單甲氧基聚乙二醇羧酸衍生物、單甲氧基聚乙二醇酯類衍生物、單甲氧基聚乙二醇二氯三嗪衍生物、單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇對(duì)硝基苯碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇碳酰咪唑、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇羧酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、戊酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、已酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、庚酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇戊醛、單甲氧基聚乙二醇已醛、單甲氧基聚乙二醇庚醛、或單甲氧基聚乙二醇丙醛和單甲氧基聚乙二醇乙醛通過酸水解形成的乙縮醛水合物，也可以在這些種類的修飾劑的結(jié)構(gòu)中引入葡萄糖及其類似物、賴氨酸及其類似物等分子的結(jié)構(gòu)，以形成新的活化的聚乙二醇修飾劑等等。優(yōu)選地，使用甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、戊酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、已酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、庚酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇戊醛、單甲氧基聚乙二醇已醛或單甲氧基聚乙二醇庚醛。更優(yōu)選的使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛(使用醛進(jìn)行修飾時(shí)需在反應(yīng)液中加入硼氫化鈉)，這些修飾劑可采用美國(guó)NektarTherapeutics公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。更優(yōu)選地，所述聚乙二醇修飾的抑肽酶具有如下通式結(jié)構(gòu)m-PEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中m代表dC4的低級(jí)烷氧基，優(yōu)選甲氧基；其中PEG代表聚乙二醇長(zhǎng)鏈，其可以是直鏈聚乙二醇長(zhǎng)鏈，也可以是帶有支鏈的聚乙二醇長(zhǎng)鏈，優(yōu)選直鏈聚乙二醇；該長(zhǎng)鏈的分子量通常在2000-200000之間，優(yōu)選的分子量在300030000之間；n=0~6，優(yōu)選『2或3;oT為c或CH2;R為去除一個(gè)氨基(NH2)的抑肽酶分子。o當(dāng)T為i'時(shí)為一種修飾方法，具體為IImPEG-O(CH2)nC_NH—R當(dāng)T為CH2時(shí)為另一種修飾方法，具體為m-PEG-0-(CH2)n-CH2-NH-R本發(fā)明還提供聚乙二醇修飾抑肽酶的制備方法，包括如下步驟在抑肽酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值在4.5-9.5，優(yōu)選6.57.5;然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應(yīng)溫度為4~40°C，優(yōu)選20~30°C;反應(yīng)時(shí)間，當(dāng)T為c時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為5"20分鐘，當(dāng)T為CH2時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為0.5到48小時(shí)；反應(yīng)中活化的聚乙二醇或其衍生物與抑肽酶的摩爾比為0.1~100，優(yōu)選15，將反應(yīng)混合液采用本領(lǐng)域所公知的離子交換層析技術(shù)。離子交換層析采用陽離子交換層析，流動(dòng)相為含NaCl的磷酸鹽緩沖液，即可得聚乙二醇修飾的抑肽酶。制備反應(yīng)按下式進(jìn)行m-PEG-0-(CH2)n-D+R-NH2-mPEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中m代表C廣C4的低級(jí)垸氧基，優(yōu)選甲氧基；其中PEG代表聚乙二醇長(zhǎng)鏈，其可以是直鏈聚乙二醇長(zhǎng)鏈，也可以是帶有支鏈的聚乙二醇長(zhǎng)鏈，優(yōu)選直鏈聚乙二醇；該長(zhǎng)鏈的分子量通常在2000200000之間，優(yōu)選的分子量在300030000之間；當(dāng)D為0時(shí)，T為c;當(dāng)D為—CH時(shí)，T為CHyR為去除一個(gè)氨基(NH2)的抑肽酶分子。離子交換層析采用陽離子交換層析進(jìn)行分離，所使用陽離子交換層析介質(zhì)為本領(lǐng)域所公知的各種層析介質(zhì)，根據(jù)其骨架的不同可分為聚苯乙烯型、纖維素型、葡聚糖型、瓊脂糖型、球狀纖維素型等，如SSepharose系列、CMSepharose系列、CMSephacel系列、SPSephadex系列、CMSephadex系列、SOURCES系列等，其中優(yōu)選使用SOURCE30S作為層析介質(zhì)進(jìn)行分離；陽離子層析的柱D為o或—。其中R-NH2為抑肽酶;n=0~6，優(yōu)選11=2或3;體積為1600ml，流速為0.550ml/min;用起始緩沖液平衡2~8倍柱體積；上樣量為2200ml;先用15倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+1.0mol/LNaCl緩沖液(B)，B體積百分含量從0100X，洗脫20倍柱體積。起始緩沖液可使用乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、磷酸二氫鈉-氫氧化鈉緩沖液、Tris-HCl緩沖液、巴比妥-鹽酸緩沖液、硼砂緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液等，這些緩沖液的pH可從3.09.0，其中最優(yōu)地使用pH為58的Tris-HCl緩沖液。收集各洗脫組份，用SDS-PAGE和反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行分析，合并聚乙二醇修飾的抑肽酶。本發(fā)明還提供聚乙二醇修飾的抑肽酶在制備高效低毒的止血藥物和抗炎藥物的臨床應(yīng)用，其中可以按照公知技術(shù)制備成為注射液或凍干粉針給藥。令人吃驚的是，本發(fā)明的聚乙二醇修飾的抑肽酶能顯著提高抑肽酶的比活力，同時(shí)它比未修飾的抑肽酶有較低的免疫原性和更好的穩(wěn)定性，動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明它比未修飾的抑肽酶有更好的止血效果，因此作為藥物它比未修飾的抑肽酶有更大的優(yōu)越性。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的抑肽酶的制備方法，簡(jiǎn)單易行。圖1聚乙二醇修飾抑肽酶的HPLC分析圖譜圖2聚乙二醇修飾抑肽酶的SDS-PAGE圖(譜圖中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2為聚乙二醇修飾抑肽酶)圖3聚乙二醇修飾抑肽酶的MALDI-TOF-MS分析圖譜具體實(shí)施例方式實(shí)施例1丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)修飾的抑肽酶反應(yīng)溫度的選擇取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為7.0，再加入mPEG-SPA-5000固體4.0mg，溶解，混勻，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后分別置于4。C、10°C、25。C和37。C反應(yīng)30min后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，其中25。C的修飾率最高，具體數(shù)據(jù)見表一。表一不同溫度對(duì)抑肽酶修飾率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>反應(yīng)時(shí)間的選擇取l.Omg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為7.0，再加入mPEG-SPA-5000固體4.0mg，溶解，混勻，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后于25t:分別反應(yīng)5、15、30、60、120min后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，其中30min后的修飾率沒有明顯提高，具體數(shù)據(jù)見表二。表二不同時(shí)間對(duì)抑肽酶修飾率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩爾比的選擇取10.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為7.0，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后分別加入1.2、2.3、5.8和11.5mgmPEG-SPA-5000(相當(dāng)于mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩爾比分別為1:1，1:2，1:5，h10)，溶解，混勻，反應(yīng)30min后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，當(dāng)mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩爾比在2時(shí)修飾率已達(dá)到最高，進(jìn)一步增加mPEG-SPA-5000的量修飾率也沒有明顯地增加，具體數(shù)據(jù)見表三。表三不同摩爾比對(duì)抑肽酶修飾率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例2聚乙二醇修飾抑肽酶的分離純化與鑒定取1.0mg/ml的抑肽酶溶液10ml，加約5ml的磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為7.0，再加入mPEG-SPA-5000固體16mg，溶解，混勻，于25。C反應(yīng)30min，加入3g甘氨酸固體終止反應(yīng)。取上述反應(yīng)液，對(duì)0.05mol/L，pH6.0的Tris-HCl緩沖液透析，用截流分子量為3000的超濾膜濃縮至5ml，上柱分離。色譜條件如下層析介質(zhì)SOURCE30S柱體積5ml流速3.0ml/min柱平衡用0.05mol/L，pH6.0的Tris-HCl(起始緩沖液)平衡5倍柱體積上樣量5ml洗脫先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+1.0mol/LNaCl緩沖液(B)，B從0100%，洗脫20倍CV收集3.0ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行跟蹤分析，合并聚乙二醇修飾的抑肽酶。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修飾的抑肽酶的純度在98%以上，見附圖l，具有較高的純度。SDS-PAGE測(cè)定表明聚乙二醇修飾的抑肽酶在電泳圖上為單一條帶，經(jīng)計(jì)算表觀分子量為14373，見附圖2。聚乙二醇修飾的抑肽酶經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，測(cè)得其分子量為11539.29，見附圖3。抑肽酶的分子量為6511.44，二者分子量相差約5000，同時(shí)在11540.29(M+l峰)附近有一系列峰，相鄰兩峰的分子量相差44，具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征，證實(shí)得到的聚乙二醇抑肽酶的單修飾產(chǎn)物。實(shí)施例3抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶生物效價(jià)測(cè)定(方法參見中國(guó)藥典2005年二部抑肽酶)按照藥典中抑肽酶的效價(jià)測(cè)定方法，測(cè)定抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶的效價(jià)，然后計(jì)算樣品的比活力(U/mg)。效價(jià)測(cè)定表明聚乙二醇修飾的抑肽酶不但比活力沒有降低，而且還升高了近l倍，具體結(jié)果見表四。表四抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶生物效價(jià)測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例4抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶止血作用比較按照Ga'borVeres等公布的抑肽酶對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物止血作用的影響的試驗(yàn)方法，以beagle犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行開胸手術(shù)試驗(yàn)，方法參見Ga'borVeres，Tama'sRadovitsHolgerSchultz等，EuropeanJournalofCardio-thoracicSurgery,2007;32(2):340-345。24只beagle犬被分成3組，每組8只，雌雄各半，分為陰性對(duì)照組(生理鹽水)、聚乙二醇修飾抑肽酶和抑肽酶組。抑肽酶和聚乙二醇修飾抑肽酶組在手術(shù)前每只犬按1.57單位/kg靜脈給藥，手術(shù)過程中用泵循環(huán)給藥，劑量為1.57U/kg，速率為111.1U/h，循環(huán)時(shí)間為卯min。試驗(yàn)結(jié)果表明抑肽酶和聚乙二醇修飾抑肽酶均能顯著降低因開胸手術(shù)引起的出血量(p<0.05)。具體結(jié)果見表五表五抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶止血作用比較結(jié)果纟1￥—出血量(n^T"5"血減少Q(mào))SSSJiir180±63抑肽酶93±3548.3%聚乙二醇修飾抑肽酶68士2462.2%這些結(jié)果表明聚乙二醇修飾的抑肽酶在體內(nèi)不但保留了抑肽酶止血的生理作用，而且在同等劑量下還能提高止血效果。因此，預(yù)期在人體內(nèi)聚乙二醇修飾的抑肽酶會(huì)有更好的止血作用效果。實(shí)施例5聚乙二醇修飾的抑肽酶對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫原性的研究以家兔作為制備抗血清的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用福氏佐劑免疫法，并分別以抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶作為抗原，劑量均為6U/kg/次，每周1次，共5次。分別以抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶作為抗原，用雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定它們各自抗血清的效價(jià)，測(cè)定結(jié)果為抑肽酶組抗血清的效價(jià)為h16;聚乙二醇修飾的抑肽酶組抗血清的效價(jià)測(cè)不出。分別以抑肽酶和聚乙二醇修飾的抑肽酶作為抗原，然后用抑肽酶組的抗血清作為第一抗體，再以辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG作為第二抗體，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定它們各自的免疫原性，測(cè)定結(jié)果為抑肽酶組為陽性，聚乙二醇修飾的抑肽酶組為陰性。以上結(jié)果表明同抑肽酶比較，聚乙二醇修飾的抑肽酶的免疫原性顯著降低，這樣更有利用作為治療藥物進(jìn)行使用。實(shí)施例6用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SPA-20000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SPA-30000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯60000(mPEG-SPA-60000)代替實(shí)施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實(shí)施例中1-5相似的結(jié)果。實(shí)施例7用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SBA-5000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SBA-20000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SBA-30000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯60000(mPEG-SBA-60000)代替實(shí)施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了實(shí)施例中1-5相似的結(jié)果。實(shí)施例8甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)修飾的抑肽酶反應(yīng)溫度的選擇取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-ALD-5000固體4.0mg，溶解，混勻，再加0.164ml的lmol/LNaBH4，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后分別置于4°C、10°C、25。C和37。C反應(yīng)16h后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些溫度下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，其中25。C的修飾率最高，具體數(shù)據(jù)見表六。表六不同溫度mPEG-ALD-5000對(duì)抑肽酶修飾率的影響<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>反應(yīng)時(shí)間的選擇取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-ALD-5000固體4.0mg，溶解，混勻，再加0.164ml的lmol/LNaBH4，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后于25。C分別反應(yīng)0.5、1.0、8.0、16.0、24.0h后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，其中16h后的修飾率沒有明顯提高，具體數(shù)據(jù)見表七。表七不同時(shí)間mPEG-ALD-5000對(duì)抑肽酶修飾率的影響<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩爾比的選擇取10.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5，各取0.3ml置于4支帶塞試管中，然后分別加入1.2、2.3、5.8、11.5mgmPEG-ALD-5000(相當(dāng)于mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩爾比在1.010.0)，溶解，混勻，再分別加0.041ml的lmol/LNaBH4反應(yīng)16.0h后終止反應(yīng)。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明在這些條件下都能得到聚乙二醇修飾的抑肽酶，當(dāng)mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩爾比在2.0時(shí)修飾率已達(dá)到最高，進(jìn)一步增加mPEG-ALD-5000的量修飾率也沒有明顯地增加，具體數(shù)據(jù)見表八。表八不同摩爾比的mPEG-ALD-5000對(duì)抑肽酶修飾率的影響<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>聚乙二醇修飾抑肽酶(醛修飾)的分離純化與鑒定取1.0mg/ml的抑肽酶溶液10ml,加5ml磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為7.0，再加入mPEG-ALD-5000固體16.0mg，溶解，混勻，再加0.328ml的lmol/LNaBH4，反應(yīng)16h后，加入3g甘氨酸固體終止反應(yīng)。然后按照實(shí)施例2中的方法進(jìn)行聚乙二醇修飾抑肽酶的分離純化與鑒定。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修飾的抑肽酶的純度在98%以上，具有較高的純度。測(cè)定表明該聚乙二醇修飾的抑肽酶在電泳圖上為單一條帶，經(jīng)計(jì)算表觀分子量為14588。實(shí)施例11聚乙二醇修飾抑肽酶(醛修飾)的特性研究按照實(shí)施例3~6中的方法進(jìn)行mPEG-ALD-5000修飾抑肽酶生物活性、穩(wěn)定性、對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血栓形成的影響和免疫原性的研究，結(jié)果見表九。表九聚乙二醇修飾抑肽酶(醛修飾)的特性研究結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例12用甲氧基聚乙二醇丙醛2000(mPEG-ALD-2000)、甲氧基聚乙二醇氧基聚乙二醇丙醛10000(mPEG-ALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丙醛20000(mPEG-ALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丙醛30000(mPEG-ALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丙醛60000(mPEG-ALD-60000)代替實(shí)施例9中的mPEG-ALD-5000，得到了實(shí)施例中9-ll相似的結(jié)果。實(shí)施例13用甲氧基聚乙二醇丁醛2000(mPEG-ButyrALD-2000)、甲氧基聚乙二醇丁醛5000(mPEG-ButyrALD-5000)、甲氧基聚乙二醇聚乙二醇丁醛10000(mPEG-ButyrALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丁醛20000(mPEG-ButyrALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丁醛30000(mPEG-ButyrALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丁醛60000(mPEG-ButyrALD-60000)代替實(shí)施例1中的實(shí)施例9中的mPEG-ALD-5000，得到了實(shí)施例中9-11相似的結(jié)果。權(quán)利要求1.一種聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特征在于抑肽酶的氨基上連接有聚乙二醇或其衍生物鏈。2.權(quán)利要求l所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特征在于每個(gè)抑肽酶分子上連接一條聚乙二醇長(zhǎng)鏈。3.權(quán)利要求2的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結(jié)構(gòu)m-PEG-Y-NH-R，其中m代表dC4的低級(jí)烷氧基，PEG代表聚乙二醇長(zhǎng)鏈，Y代表聚乙二醇長(zhǎng)鏈和抑肽酶的連接基團(tuán)，R代表少了一個(gè)氨基的抑肽酶分子。4.權(quán)利要求3的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結(jié)構(gòu)m-PEG-0-(CH2)n-T-NH-R，其中m代表dC4的低級(jí)烷氧基，PEG代表聚乙o二醇長(zhǎng)鏈，n=0~6，T為^或CH2，R代表少了一個(gè)氨基的抑肽酶分子。5.權(quán)利要求4所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.權(quán)利要求4所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其具有如下的通式結(jié)構(gòu)m-PEG-0-(CH2)n-CH2-NH-R。7.權(quán)利要求4-6所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特征在于11=2或3。8.權(quán)利要求1-6所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特征在于聚乙二醇長(zhǎng)鏈的分子量在2000200000之間。9.權(quán)利要求8所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特征在于聚乙二醇長(zhǎng)鏈的分子量在3000~30000之間。10.權(quán)利要求3-6所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其特征在于m為甲氧基。11.一種聚乙二醇修飾的抑肽酶的制備方法，其特征在于制備反應(yīng)按下式進(jìn)行<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中m代表dC4的低級(jí)烷氧基；其中PEG代表聚乙二醇長(zhǎng)鏈；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>;其中R-NH2為抑肽酶；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>當(dāng)D為O時(shí)，T為^;當(dāng)D為一CH時(shí)，T為CH2;R為去除一個(gè)氨基(NH2)的抑肽酶分子；反應(yīng)步驟如下在抑肽酶溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值在4.5-9.5;然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反應(yīng)溫度為44(TC;反應(yīng)時(shí)間，o當(dāng)T為i'時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為5120分鐘，當(dāng)T為CH2時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為0.5到48小時(shí)；反應(yīng)中活化的聚乙二醇或其衍生物與抑肽酶的摩爾比為0.1100;將反應(yīng)混合液采用離子交換層析技術(shù)，離子交換層析采用陽離子交換層析，流動(dòng)相為含NaCl的磷酸鹽緩沖液，即可得聚乙二醇修飾的抑肽酶。12.權(quán)利要求1-6所述的聚乙二醇修飾的抑肽酶，其在制備高效低毒的止血藥物或抗炎藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種聚乙二醇修飾的抑肽酶及其制備方法，其特征在于，抑肽酶的氨基上連接有聚乙二醇或其衍生物鏈。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的抑肽酶能夠提高抑肽酶的比活力，同時(shí)它顯著地降低了抑肽酶的免疫原性并提高了抑肽酶的穩(wěn)定性，從而改善了抑肽酶的藥物動(dòng)力學(xué)特性，提高了耐受性并減少了給藥次數(shù)。文檔編號(hào)A61P29/00GK101412995SQ20071013332公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2007年10月17日優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日發(fā)明者軍馮,呂達(dá)娜,張喜全,張來芳,鵬朱,娟潘,偉趙,珍趙申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院;江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司