專利名稱：：神經(jīng)營養(yǎng)因子的制作方法神經(jīng)營養(yǎng)因子本申請是申請?zhí)?9808289.9、申請日為1999年7月5日、發(fā)明名稱為"神經(jīng)營養(yǎng)因子"的發(fā)明專利申請的分案申請。
背景技術：
：本發(fā)明涉及神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的核酸和特異性結合神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗體。
背景技術：
：神經(jīng)營養(yǎng)因子是天然蛋白質，它可促使神經(jīng)元細胞和組織的存活，維持其表型分化，防止其退化并增強其活性。神經(jīng)營養(yǎng)因子分離自神經(jīng)組織和由神經(jīng)系統(tǒng)支配的非-神經(jīng)組織，并被分為功能和結構相關的組，也稱家族，超家族或亞族。神經(jīng)營養(yǎng)因子超家族包括成纖維細胞生長因子，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和轉化生長因子-P(TGF-P)超家族?？筛鶕?jù)其物理結構，與其復合受體的相互作用及其對多種類型神經(jīng)細胞的影響來區(qū)分各種神經(jīng)營養(yǎng)因子。被分在TGF-P超家族(Massague等，TrendsinCellBiology,1994，4172-178)的是得自膠質細胞系的神經(jīng)營養(yǎng)因子配體("GDNF，，；WO93/06116,列入本文作為參考)，其包括GDNF，persephin("PSP，，；Milbrandt等，神經(jīng)元，199820245-253，列入本文作為參考)和neurturin("NTN";WO97/08196,列入本文作為參考)。GDNF亞族的配體都能通過RET受體酪氨酸激酶誘導信號傳遞。GDNF亞族的這三種配體對神經(jīng)營養(yǎng)受體家族，GFR受體的相對親和性有所不同。鑒于神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)元組織的影響，仍需要鑒定和表征其它神經(jīng)營養(yǎng)因子以用于診斷和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。發(fā)明筒述本發(fā)明涉及新的神經(jīng)營養(yǎng)因子，本文稱之為"neublastin",或"NBN"。neublastin屬于GDNF亞族的成員，因為它與其它GDNF配體共享同源性區(qū)域(見下文表3和4),并能與RET相互作用(例見Airaksinen等,Mol.Cell.Neuroscience,199913313-325)，neublastin是新的，獨特的神經(jīng)營養(yǎng)因子。與其它GDNF配體不同的是，neublastin表現(xiàn)出與GFRa3-RET受體復合物的高親和性，而且，其氨基酸序列中具有獨特的亞區(qū)。本文所用"neublastin多肽"是具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的多肽(如實施例6，7，8和9所述)，其包括具有與人"neublastin"多肽的同源性至少為70%的氨基酸序列的多肽及其變體和衍生物，所述人"neublastin"多肽示于SEQIDNO:2的AA-95-AA105,SEQIDNO:2的AArAA^,SEQIDNO:4的AA-97-AA140，SEQIDNO:4的AA_41-AA140(pro)，SEQIDNO:4的AA纊AA"o,SEQIDNO:9的AA,AA14o("野生型"prepro),SEQIDNO:9的AA.41-AA140(pro),SEQIDNO:5的AArAAmo(成熟的140AA),SEQIDNO:6的AA纊AAu6(成熟的116AA),SEQIDNO:7的AArAAn3(成熟的113AA),SEQIDNO:IO的AArAAwo(成熟的140AA),SEQIDNO:ll的AArAA^6(成熟的116AA),SEQIDNO:12的AArAAu3(成熟的113AA)。另外，本發(fā)明還包括具有與鼠"neublastin"多肽的同源性至少為70%的氨基酸序列的多肽，所述鼠"neublastin"多肽示于SEQIDNO:16的AArAA224。上文所鑒定的neublastin多肽的C-末端序列優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA72-AAk)5(即SEQIDNO:9的AAKn-AA"o)所示的氨基酸序列，更優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA"-AA^(即SEQIDNO:9的AA76-AA柳)所示的氨基酸序列，或SEQIDNO:16的AA191-AA224所示的氨基酸序列。另外，優(yōu)選neublastin多肽保留7個保守的Cys殘基，所述殘基是GDNF家族和TGF-(3超家族所特有的殘基。優(yōu)選neublastin多肽具有與上述序列和SEQIDNO:16的AArAA224的同源性大于85%,最優(yōu)選大于95%的氨基酸序列，上述序列即為SEQIDNO:2的AA_95-AA105，SEQIDNO:2的AA廣AAk)s，SEQIDNO:4的AA_97-AA14o,SEQIDNO:4的AA_41-AA140，SEQIDNO:4的AArAA攝，SEQIDNO:9的AA刷-AAwo("野生型，，prepro)，SEQIDNO:9的AA_41-AA14o(pro),SEQIDNO:5的AArAAwo(成熟的140AA),SEQIDNO:6的AArAAn6(成熟的116AA),SEQIDNO:7的AArAAn3(成熟的113AA),SEQIDNO:IO的AArAA糊(成熟的140AA),SEQIDNO:ll的AArAAu6(成熟的116AA),SEQIDNO:12的AArAAu3(成熟的U3AA)。本文所用"neublastin核酸"是編碼neublastin多肽的多核普酸。因此，分離的neublastin核酸是具有核香酸密碼子開放閱讀框的多核苷酸分子，當其暴露于翻譯所需的適當組分中時可編碼neublastin多肽。本發(fā)明的neublastin核酸可以是RNA或DNA，例如基因組DNA，或與neublastinmRNA互補和/或由其轉錄的DNA("cDNA")。因此，本發(fā)明的neublastin核酸還包括在高度嚴緊的雜交條件下與編碼neublastin多肽的多核苷酸特異性雜交的多核苷酸分子。本發(fā)明還涉及核酸引物或其片段，所述引物可用于鑒定，分離和擴增編碼neublastin多肽的多核苷酸。在本發(fā)明的某些實施方案中，某些引物是neublastin-特異性的探針，所述探針可用于與neublastin核酸雜交，而不與編碼GDNF家族其它成員的核酸雜交。"特異的"，"特異性"或"特異地"指的是能與neublastin核酸雜交，而不能與非-neublastin核酸雜交，包括不能與編碼GDNF配體(例如GDNF，pers印hin和neurturin)的獨特核酸雜交。在另一個實施方案中，通過具有互補核酸序列，或闡明它能在高度嚴緊的雜交條件下與編碼neublastin的多核苷酸特異性雜交，而將本發(fā)明的neublastin核酸鑒定為與編碼neublastin多肽的多核苷酸互補的核酸。特定的neublastin核酸包括但不限于本文所示的核酸序列和SEQIDNO:l，SEQIDNO:3，SEQIDNO:8，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:29和SEQIDNO:30以及引物SEQIDNO:17-28，31和32所示的核酸序列。本發(fā)明的neublastin核酸還包括neublastin核酸獨特的亞區(qū)域或片段，包括但不限于圖8所示的核酸片段?？墒褂帽景l(fā)明的neublastin核酸表達neublastin多肽，例如通過體外表達neublastin多肽，或通過給動物施用neublastin核酸以在體內表達。neublastin核酸可包含在諸如表達載體或克隆載體的核酸載體中。neublastin核酸可以，但不是必須作為核酸載體的一部分被維持，復制，轉移或表達?？蓪⒑衝eublastin多核苷酸序列的重組表達栽體導入細胞和/或在所述細胞中維持。neublastin載體的宿主細胞可以是原核細胞?；蛘撸蓪eublastin核酸導入真核細胞，例如含有適當元件的真核細胞，所述元件負責在翻譯后將多肽加工成成熟的蛋白質和/或負責將多肽分泌至細胞的胞外環(huán)境中。本發(fā)明還涉及neublastin類神經(jīng)營養(yǎng)因子"neublastin"。neublastin可以是多肽的形式，也可以是兩個或多個neublastin多肽的多聚體，例如neublastin二聚體。neublastin多肽通過本領域技術人員公知的分子間結構連鍵連接成多聚體，所述連鍵包括但不限于半胱氨酸-半胱氨酸相互作用，sulfhydryl鍵和非-共價相互作用。特定neublastin多肽包括但不限于本文所公開的氨基酸序列和SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:IO，SEQIDNO:ll，SEQIDNO:12和SEQIDNO:16所示的氨基酸序列。本發(fā)明的neublastin多肽可用于治療神經(jīng)元缺陷，包括但不限于受損害的神經(jīng)元和受外傷的神經(jīng)元。受外傷的外周神經(jīng)包括但不限于髓神經(jīng)或脊髓神經(jīng)。neublastin多肽可用于治療神經(jīng)變性疾病，例如大腦局部缺血性神經(jīng)元損傷；神經(jīng)病，例如外周神經(jīng)病，阿爾茨海默氏病，亨廷頓氏病，帕金森氏病，肌萎縮性側索硬化(ALS)。neublastin多肽還可用于治療記憶減退，例如與癡呆有關的記憶減退。附圖簡述圖1是與3￥-標記的neublastincDNA雜交的2個Northern印跡的照片，照片中比較了neublastin基因在多種成人組織類型(A系列)和多個成人腦區(qū)(B系列)中的相對表達水平。圖2是與"P-標記的neublastincDNA雜交的Northern印跡照片，照片中比較了neublastincDNA在未經(jīng)轉染的細胞系HiB5，經(jīng)neublastincDNA轉染的細胞系和經(jīng)GDNF-cDNA轉染的細胞系中的表達量。圖3是與neublastin-特異性抗體Ab-2(左印跡；A序列)或與neublastin-特異性抗體Ab-l(右印跡；B序列)雜交的2個Western印跡的照片，照片中比較了neublastin蛋白在未經(jīng)轉染的HiB5細胞(泳道l)和經(jīng)neublastincDNA穩(wěn)定轉染的HiB5細胞系(泳道2)中的表達水平。圖4圖示了neublastin在無血清培養(yǎng)基中對經(jīng)培養(yǎng)的大鼠胚胎神經(jīng)元，多巴胺能神經(jīng)元，前側中腦神經(jīng)元的存活，和對膽堿能顱神經(jīng)運動神經(jīng)元的ChAT活性的影響。尤其是，圖4A闡明了重組GDNF對ChAT活性(dpm/小時)之影響的劑量-反應曲線。圖4B使用經(jīng)稀釋的得自生產(chǎn)neublastin或生產(chǎn)GDNF之細胞的條件培養(yǎng)基闡明了ChAT活性(dpm/小時)。圖4C闡明了每孔中的酪氨酸羥化酶免疫反應細胞的數(shù)目。圖5闡明了HiB5pUbilzNBN22細胞分泌的neublastin對與HiB5pUbilzNBN22細胞(neublastin)或HiB5細胞(對照)共培養(yǎng)的豬胚胎多巴胺能前側中腦神經(jīng)元之切片培養(yǎng)物的功能和存活的影響。圖5A和圖5B分別闡明了于DIV12[多巴胺(pmol/ml)-第12天和DIV多巴胺(pmol/ml)-第21天釋放至培養(yǎng)基中的多巴胺。圖5C闡明了于DIV21切片培養(yǎng)物中的酪氨酸羥化酶免疫反應細胞的數(shù)目TH-ir細胞/培養(yǎng)物。圖6闡明了由慢病毒產(chǎn)生的neublastin在體內對黑質多巴胺神經(jīng)元的影響。圖7圖示了neublastin基因的基因組結構，包括可用于鑒定全長neublastin基因的核酸引物及其相對于編碼neublastin的基因組序列(即基因)的空間定向。圖8闡明了用于鑒定編碼人neublastin多肽之cDNA克隆的neublastin特異性引物，該引物能與編碼neublastin多肽的核酸雜交，但不能與編碼其它已知的GDNF家族成員(即GDNF，persephin和neurturin)的核酸雜交。圖9闡明了與已知神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，本發(fā)明的多肽對得自不同發(fā)育階段的經(jīng)解離的大鼠側根神經(jīng)節(jié)細胞培養(yǎng)物的神經(jīng)營養(yǎng)活性[O:對照實驗(缺乏因子)；1:存在GDNF;2:存在neurturin;3:存在本發(fā)明的neublastin;E12:胚胎第12天；E16:胚胎第16天；P0:出生的當天；P7:出生后第7天；P15:出生后15天。圖10顯示了CHO細胞系的neublastin生產(chǎn)情況。圖11比較了neublastin和GDNF與GFRa-l和GFRa-3受體的結合。圖12是Western印跡照片，顯示出R30抗-欣抗體和R31抗-肽抗體與neublastin的結合。圖13是凝膠照片，顯示出通過親和結合于RETL3-Ig來提取neublastin。圖14是pET19b-Neublastin的質粒圖譜以及Neublastin合成基因的序列。圖15是pMJB164-HisNeublastin的質粒圖譜以及HisNeublastin合成基因的序列。發(fā)明詳述申請人已鑒定出編碼新的神經(jīng)營養(yǎng)因子(本文稱之為"neublastin"或"NBN")的核酸。neublastin屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子的轉化生長因子-P(TGF-P)超家族，并且是其中得自膠質細胞系的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)亞類的成員。編碼neublastin的cDNA最初是按下述筌定的。使用TBLASTNl.4.11算法規(guī)則(Atschul等，核酸研究，1997，253389-3402),對人persephin(GenBank登記號AF040962)表示懷疑，首先在2個人細菌人工染色體(BAC)的高通量基因組序列(HGTS)中鑒定出290bp的片段，這2個BAC的GenBank登記號為AC005038和AC005051。AC005038由約l卯，000bp的5個非順序序列重疊群組成，AC005051由約132，000bp的12個非順序序列重疊群組成。經(jīng)證實，在2個BAC克隆中鑒定的290bp片段具有與神經(jīng)營養(yǎng)因子，人persephin的cDNA編碼區(qū)同源但不相同的區(qū)域。由該2卯bp序列合成2個Neublastin-特異性PCR引物(上鏈引物[SEQIDNO:17和下鏈引物[SEQIDNO:18j)。篩選人胎腦cDNA文庫，最初的篩選包括使用2個PCR引物[SEQIDNO:17和18，基于96孔PCR篩選cDNA文庫"主平板"，所述主平板由含有約5，000個克隆/孔的500,000個cDNA克隆組成。對人胎腦cDNA文庫"次平板"進行第二次基于PCR的篩選，所述"次平板"每孔含有約5，000個克隆的大腸桿菌甘油原種。在基于PCR篩選主平板和次平板時鑒定出102bp的片段[SEQIDNO:13]，選擇陽性cDNA克隆(具有102bp片段)，鋪于2個含有LB/抗生素的平板，培養(yǎng)過夜。從這些平板中總共選擇出96個細菌菌落，將它們各自置于新的96孔PCR板的孔中，每個孔中含有兩種PCR引物[SEQIDNO:17和18和必需的PCR擴增試劑。然后進行PCR擴增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳分析96個獨立的PCR反應。然后鑒定具有含102bp片段之克隆的陽性菌落。由含有102bp片段的陽性菌落得到質粒DNA并測序。隨后的測序分析揭示出861bp的全長cDNA[SEQIDNO:8]的存在。在SEQIDNO:8中鑒定的663bp開放閱讀框(ORF)或編碼區(qū)(CDS)編碼前-多肽原(稱為"前-Neublastin原")，其示于SEQIDNO:9。根據(jù)SEQIDNO:9，鑒定出3個Neublastin多肽變體，這些變體包括(i)本文稱之為NBN140的140AA多肽，其具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列；(ii)本文稱之為NBN116的116AA多肽，其具有SEQIDNO:ll所示的氨基酸序列；和(iii)本文稱之為NBN113的113AA多肽，其具有SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。含有782bp5'非翻譯DNA,663bp編碼DNA和447bp3'非翻譯DNA(總共為1992bp)的完整cDNA序列已被呈送至GenBank，登記號為AF120274。按下述鑒定基因組中的Neublastin編碼序列為了克隆基因組中的neublastin編碼序列，制備了另一套引物，具體包括1號引物對[有義=SEQIDNO:23,反義=SEQIDNO:24和2號引物對[有義=SEQIDNO:25，反義-SEQIDNO:26。使用2號引物對，通過PCR由人基因組DNA制品擴增887bpDNA片段，并克隆至pCRII載體(Invitrogen),然后轉化至大腸桿菌。對所得質粒進行測序，推測出861bp的推定cDNA序列(編碼在本文中被稱為neublastin的蛋白質)(如SEQIDNO:3所示)。類似地，使用1號引物對，通過對人基因組DNA進行PCR而得到870bp的DNA片段。在此片段中發(fā)現(xiàn)了位于開放閱讀框(ORF)3，末端的42bp區(qū)域，相對于887bp序列而言，該區(qū)域是額外的。通過將neublastin基因與其它神經(jīng)營養(yǎng)因子的核酸序列相比較，并作圖外顯子-內含子邊界序列即可推測出該基因的基因組結構。此分析闡明neublastin基因具有至少兩個被70bp內含子分開的外顯子。另外，使用此序列篩選GenBank中的neublastinEST序列。鑒定出3個這樣的序列，它們的GenBank登記號為AA844072,AA931637和AA533512,這表明neublastin核酸被轉錄成mRNA。將所得的完整cDNA序列(AF120274)和GenBank登記號為AC005038和AC005051的基因組序列相比較，結果表明neublastin基因由至少5個被4個內含子分開的外顯子(包括3個編碼外顯子)組成(例見圖8)?？傊怙@子具有全長Neublastin多肽的推測氨基酸序列。還應說明的是，我們發(fā)現(xiàn)887bp的片段含有完整的neublastin原編碼區(qū)。推測的cDNA[SEQIDNO:3含有編碼neublastin原的開放閱讀框(ORF)(181個氨基酸殘基)，其顯示出與3個已知的人蛋白質-Persephin，Neurturin和GDNF的同源'逸。本發(fā)明的neublastin核酸另一方面，本發(fā)明提供了能表達本發(fā)明多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括DNA，cDNA和RNA序列以及反義序列，并包括天然的，合成的和經(jīng)人為改造的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸還包括因遺傳密碼所致的簡并序列，但該序列仍編碼neublastin多肽。本文所定義的術語"多核苷酸"指的是長度至少為IO個堿基，優(yōu)選長度至少為15個堿基的核苷酸聚合物形式。"分離的多核苷酸"指的是不與兩個編碼序列緊鄰的多核苷酸，而在分離得到該多核苷酸之生物體的天然基因組中，該多核苷酸與上述兩個編碼序列(一個在5，端，一個在3，端)緊鄰。因此，該術語包括重組DNA，它可摻入表達載體，自我復制的質粒或病毒，或原核生物或真核生物的基因組DNA中，它也可以是獨立的分子，例如不依賴于其它序列的cDNA。本發(fā)明的多核苷酸還包括等位基因變體和"突變的多核苷酸"，其具有的核苷酸序列與本文所提供的核苷酸序列在一個或多個核苷酸位置處有所不同。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸具有的核酸(DNA)序列能在如下文詳述的至少中度，中度/高度，或高度嚴緊的條件下，與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列，或SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞序列雜交。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸具有的核酸(DNA)序列與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列，或SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列至少70%,優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%同源。在最優(yōu)選的實施方案中，多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的DNA序列，SEQIDNO:3所示的DNA序列，SEQIDNO:8所示的DNA序列，或SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供了新的引物和DNA序列，它們可用于鑒定，分離和擴增編碼neublastin多肽或其片段的neublastin多核苷酸。所述引物包括SEQIDNO:17-28和31-32所示的多核苷酸。另外，本發(fā)明還提供了由這些引物產(chǎn)生的neublastinDNA序列，包括SEQIDNO:13和14所示的序列。另外，本發(fā)明還提供了得自基因組DNA中的3，或5，非翻譯區(qū)域("UTR")的DNA序列，該序列側翼于neublastin外顯子；該序列可用于鑒定，分離和擴增編碼neublastin多肽或其片段的neublastin多核苷酸。本發(fā)明的3'UTR序列包括下列序列SEQIDNO:l的核苷酸721-865,SEQIDNO:3的核普酸718-861,SEQIDNO:8的核苷酸718-861,SEQIDNO:15的核苷酸1647-2136，和得自(即包含于)上述序列中的長度為10至25個核苷酸的鄰接序列(可用作引物)。本發(fā)明的5'UTR序列包括下列序列SEQIDNO:l的核苷酸1-10，SEQIDNO:8的核苷酸1-57,SEQIDNO:15的核苷酸1-974,和得自(即包含于)上述序列中的長度為10至25個核苷酸的鄰接序列(可用作引物)。優(yōu)選通過克隆方法得到本發(fā)明的多核苷酸，所述方法例見"最新分子生物學方法"[JohnWiley&Sons公司。在優(yōu)選的實施方案中，可由人腦的人基因組DNA或cDNA文庫克隆多核苷酸，或者在所述文庫的基礎上產(chǎn)生多核苷酸。DNA序列的同源性可將上文所提及的DNA序列同源性測定為兩個序列之間的同一性程度，示出第一個序列與第二個序列的差異。利用本領域已知的計算機程序可適當?shù)販y定同源性，所述程序包括例如GCG程序包中提供的GAP[Needleman，S.B和WimschC.D.，分子生物學雜志1970，48:443-453。使用具有下列設置的GAP進行DNA序列比較GAP產(chǎn)生罰分為5.0，GAP延伸罰分為0.3,上文所提及的類似DNA序列編碼區(qū)與SEQIDNO:l所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQIDNO:3所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQIDNO:8所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQIDNO:15所示DNA序列的CDS(編碼)部分的同一性程度優(yōu)選至少為70%,更優(yōu)選至少為80%，更優(yōu)選至少為90%，更優(yōu)選至少為95%。術語"序列同一性"指的是在特定的比較區(qū)域內，兩個多核苦酸序列在核苷酸-緊接著-核苷酸的基礎上的相同程度。術語"序列同一性的百分比"是通過下列方法計算的，即比較兩個在比較區(qū)域內排列得最令人滿意的序列，測定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如A，T，C，G，U或I)的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較區(qū)域內的位置總數(shù)(即窗口大小)，將結果乘以100即產(chǎn)生序列同一性的百分比。本文所用術語"基本上相同"表示多核苷酸序列的特征，其中，多核苷酸含有的序列在比較區(qū)域內與參照序列相比具有至少80%的序列同一性，優(yōu)選為至少85%的同一性，經(jīng)常為90至95%的序列同一性，更通常為至少99%的序列同一性。雜交方法
技術領域：
：本發(fā)明的多核苷酸所具有的核酸序列能在如下文詳述的至少中度，中度/高度，或高度嚴緊的條件下，與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，或SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列，或SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列，或其互補鏈，或其亞序列雜交。測定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間的雜交的適當實驗條件包括預先在5xSSC[氯化鈉/檸檬酸鈉；參見Sambrook等；分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約1989中將含有待雜交的DNA片段或RNA的濾膜浸泡10分鐘，在5xSSC，5xDenhardt，s溶液[參見Sambrook等，文獻同上l,0.5%SDS和100ng/ml變性的經(jīng)超聲處理的鮭精DNA[參見Sambrook等，文獻同上中預雜交濾膜，接著于約45X:,在含有10ng/ml探針的相同溶液中雜交12小時，所述探針為隨機-引發(fā)的[FeinbergAP&VogelsteinB;分析生物化學，1983，132,6-13，并經(jīng)32p-dCTP-標記(比活〉1x1()9cpin/ng)的探針。然后在溫度至少為60t:(中度嚴緊條件)，優(yōu)選至少為65*€(中度/高度嚴緊條件)，更優(yōu)選至少為70TC(高度嚴緊條件)，甚至更優(yōu)選至少為75"C(很高的嚴緊條件)時，在O.lxSSC，0.5%SDS中將濾膜洗滌2次，時間長達30分鐘。使用X-射線膠片可檢測到在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子?？寺〉亩嗪塑账嵊绕涫?，本發(fā)明的分離的多核苷酸可以為克隆的多核苷酸。本文所定義的術語"克隆的多核苷酸"指的是根據(jù)基因工程領域最新使用的標準克隆方法克隆的多核苷酸或DNA序列，所述克隆方法可以將DNA區(qū)段，尤其是cDNA，即通過酶的作用由RNA產(chǎn)生的cDNA從其天然位置移位至不同位點，在所述位點處，該DNA區(qū)段可以再生。通過任何適當?shù)耐緩蕉伎梢酝瓿煽寺?，包括例如逆轉錄酶技術，PCR技術等，以及切下和分離所需的DNA區(qū)段。本發(fā)明的克隆的多核苷酸也可被稱為"DNA構建體"或"分離的DNA序列"，尤其可以是互補DNA(cDNA)。生物來源本發(fā)明的分離的多核苷酸可以得自任何適當?shù)膩碓础Ｔ趦?yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸克隆自下列cDNA文庫，或在這些文庫的基礎上產(chǎn)生，所述文庫包括得自下列的cDNA文庫，例如胎兒或成人腦，尤其是前腦，后腦，皮質，紋狀體，扁桃體，小腦，尾狀核，胼胝體，海馬，丘腦核，丘腦下核，溴核，豆狀核,黑質，側根神經(jīng)節(jié)，三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)，腸系膜上動脈或丘腦；脊髓；心臟；胎盤；肺；肝臟；骨骼??；腎臟；胰腺；腸；眼；視網(wǎng)膜；牙髓；毛嚢；前列腺；垂體；或氣管?？缮藤彽亩喾N人和非人組織的cDNA文庫得自例如Stratagene和Clontech?？赏ㄟ^標準方法，例如工作實施例中所述的那些方法得到本發(fā)明的分離的多核苷酸。本發(fā)明的neublastin多肽如上文所述，本文所用"neublastin多肽"是具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的多肽(如實施例6，7，8和9所述)，其包括具有與"neublastin"多肽的同源性至少為70%的氨基酸序列的多肽及其變體和衍生物，所述"neublastin"多肽示于SEQIDNO:2的AA_95-AA105，SEQIDNO:2的AA廣AAk)s,SEQIDNO:4的AA_97-AA14o，SEQIDNO:4的AA41-AA140,SEQIDNO:4的AArAA^o,SEQIDNO:9的AA—8o-AAm。("野生型"prepro)，SEQIDNO:9的AA-41-AA140(pro)，SEQIDNO:5的AArAA柳(成熟的140AA),SEQIDNO:6的AA纊AAu6(成熟的116AA),SEQIDNO:7的AA纊AAm(成熟的113AA),SEQIDNO:IO的AArAAwo(成熟的140AA),SEQIDNO:11的AA^AAn6(成熟的116AA),SEQIDNO:12的AA^AAn3(成熟的113AA),SEQIDNO:16的AA1-AA224(鼠prepro)。上文所鑒定的neublastin多肽的C-末端序列優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA"-AAk)5(即SEQIDNO:9的AAw7-AA劇)所示的氨基酸序列，更優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA41-AA衡(即SEQIDNO:9的AA76-AA柳)所示的氨基酸序列。另外，優(yōu)選neublastin多肽保留7個保守的Cys殘基，所述殘基是GDNF家族和TGF-P超家族所特有的殘基。優(yōu)選neublastin多肽具有與上述序列的同源性大于85%，最優(yōu)選大于95%的氨基酸序列，上述序列即為SEQIDNO:2的AA_95-AA105，SEQIDNO:2的AAi-AA105,SEQIDNO:4的AA_97-AA140,SEQIDNO:4的AA-41-AA14o，SEQIDNO:4的AArAA柳，SEQIDNO:9的AA—80-AA劇("野生型"prepro)，SEQIDNO:9的AA_41-AA140(pro)，SEQIDNO:5的AA廣AAwo(成熟的140AA),SEQIDNO:6的AA廣AAu6(成熟的116AA),SEQIDNO:7的AArAAu3(成熟的113AA)，SEQIDNO:IO的AArAA娟(成熟的140AA),SEQIDNO:11的AA纊AAu6(成熟的116AA),SEQIDNO:12的AArAA加(成熟的113AA),SEQIDNO:16的AArAA224(鼠prepro)，具有上文所筌定的neublastin多肽之C-末端序列的上述任一多肽優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA72-AA105(^pSEQIDNO:9的AAw7-AAwo)所示的氨基酸序列，更優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA化AAk)5(即SEQIDNO:9的AA76-AA南)或SEQIDNO:16的AA191-AA224所示的氨基酸序列。另外，本發(fā)明包括具有與鼠"neublastin"多肽的同源性至少為70%的氨基酸序列的多肽，所述鼠"neublastin"多肽示于SEQIDNO:16的AA1畫AA224。在一個實施方案中，本發(fā)明優(yōu)選的多肽為neublastin的前序列原(分別示于SEQIDNO:2，4，9和16)，序列原(分別示于SEQIDNO:2的AA-75-AA1()5，或SEQIDNO:4和9的AA—4rAA"o)和成熟序列(示于SEQIDNO:5，6，7，10，11或12,優(yōu)選為SEQIDNO:IO，11，12)。本發(fā)明的多肽包括變體多肽。在本發(fā)明的上下文中，術語"變體多肽"指的是多肽(或蛋白質)具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10,SEQIDNO:11，SEQIDNO:12或SEQIDNO:16所示的序列在一個或多個氨基酸位置處有所不同。這種變體多肽包括上文所述的經(jīng)修飾多肽，以及保守取代，剪接變體，同種型，得自其它物種的同系物和多態(tài)性。本文所定義的術語"保守取代"表示某個氨基酸殘基被另一個生物特性相似的殘基所取代。例如，人們希望保守的氨基酸取代僅對生物活性有很小的影響或沒有影響，當保守取代占多肽或蛋白質殘基總數(shù)的10%以下時，更希望如此。保守的氨基酸取代優(yōu)選為低于5%的多肽或蛋白質中的變化，最優(yōu)選為低于2%的多肽或蛋白質中的變化(例如當根據(jù)NBN113進行計算時，最優(yōu)選的保守取代為野生型成熟氨基酸序列中少于3個的氨基酸取代)。在特別優(yōu)選的實施方案中，成熟序列中僅有單個氨基酸取代，其中被取代的和取代的氨基酸都是非-環(huán)形的。其它特別保守的取代例子包括用一個諸如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲辟u氨酸的疏水殘基取代另一個疏水殘基，或用一個極性殘基取代另一個極性殘基，如用精氨酸取代賴氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺等。術語保守取代也包括使用經(jīng)取代的氨基酸殘基取代未經(jīng)取代的親代氨基酸殘基，只要針對經(jīng)取代多肽而產(chǎn)生的抗體也能與未經(jīng)取代的多肽發(fā)生免疫反應即可。修飾該原始氨基酸序列可產(chǎn)生活性與未經(jīng)修飾的相應多肽基本上相同的蛋白質，因此，可認為該蛋白質是親代蛋白質的功能類似物。所述修飾可以是有意的，例如通過定點誘變，或者可以自發(fā)產(chǎn)生，所述修飾包括剪接變體，同種型，得自其它物種的同系物和多態(tài)性。本發(fā)明還包括上述功能類似物。此外，修飾原始氨基酸序列可產(chǎn)生未保留親代蛋白質之生物活性的蛋白質，包括顯性失活形式等。顯性失活蛋白質通過結合，或要不然螯合通常與多肽發(fā)生功能性相互作用的調節(jié)劑(如上游或下游組分)來干擾野生型蛋白質。本發(fā)明也包括這種顯性失活形式。"信號肽"是肽序列，它可使新合成的與信號肽結合的多肽定位于內質網(wǎng)(ER)以進行進一步的翻譯后加工和分布。對neublastin而言，本文所用"異源信號肽"指的是非人neublastin信號肽，一般指的是一些除neublastin之外的哺乳動物蛋白質的信號肽。熟練技術人員會認為可使用人neublastinDNA序列(cDNA或基因組DNA)，或使用因沉默密碼子變化或產(chǎn)生保守氨基酸取代的密碼子變化而與人neublastinDNA有所不同的序列對經(jīng)培養(yǎng)的人細胞進行基因修飾，以使所述細胞能過量表達和分泌酶。本發(fā)明的多肽還包括嵌合多肽或可裂解的融合多肽，所迷融合多肽中的另一種多肽與多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合即可產(chǎn)生嵌合多肽。產(chǎn)生嵌合多肽的技術是標準技術。所述技術通常需要以一定的方式連接序列以使兩個序列位于相同的閱讀框中，并且，融合多肽的表達處于相同啟動子和終止子的控制之下。本發(fā)明的多肽還包括全長neublastin分子的截短形式。在該截短分子中，一個或多個氨基酸從N末端或C末端，優(yōu)選從N末端缺失。氨基酸序列同源性候選多肽與本發(fā)明的neublastin多肽的同源性程度被測定為兩個氨基酸序列之間的同一性程度。高水平的序列同一性表示第一個序列很可能得自第二個序列。通過計算機分析可測定同源性，所述程序例如但不限于ClustalX計算機序列對比程序[ThompsonJD，GibsonTJ，PlewniakF，JeanmouginF，&HigginsDG:ClustalXwindows界面借助于質量分析工具進行多個序列對比的靈活策略；核酸研究，1997，25(24):4876-82，本文建議了其缺省參數(shù)值。使用該程序，由本發(fā)明的類似DNA序列所編碼多肽的成熟部分與本文SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:ll，SEQIDNO:12或SEQIDNO:16所示氨基酸序列的同一性程度至少為卯％，更優(yōu)選至少為95%,最優(yōu)選至少為98%。根據(jù)同源性的檢測結果，證實屬于TGF-(3超家族的本發(fā)明多肽與GDNF亞族相關，但本發(fā)明的多肽是該亞族中的一個與眾不同的成員。生物活性多肽可以任何生物活性形式提供本發(fā)明的多肽，包括前-蛋白質原，蛋白質原，成熟蛋白質，糖基化蛋白質，磷酸化蛋白質或任何其它經(jīng)翻譯后修飾的蛋白質。本發(fā)明的多肽尤其可以是N-糖基化多肽，優(yōu)選該多肽在序列表所示的N-殘基處糖基化。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列，在第122位具有糖基化的天冬酰胺殘基；SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，在第122位具有糖基化的天冬酰胺殘基；SEQIDNO:ll所示的氨基酸序列，在第98位具有糖基化的天冬酰胺殘基；或SEQIDNO:12所示的氨基酸序列，在第95位具有糖基化的天冬酰胺殘基。本發(fā)明還包括neublastin融合蛋白，例如Ig-融合蛋白，例見美國專利5，434，131(列入本文作為參考)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:2所示序列至少約85%，優(yōu)選至少約90%，更優(yōu)選至少約98%，最優(yōu)選至少約99%同源之氨基酸序列的多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:4所示序列至少約90%,優(yōu)選至少約95%,更優(yōu)選至少約98%,最優(yōu)選至少約99%同源之氨基酸序列的多肽。在第三個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:5所示序列至少約90%,更優(yōu)選至少約95%,最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第四個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:6所示序列至少約卯％,更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第五個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:7所示序列至少約90%,更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的neublastin多肽包括等位基因變體，例如SEQIDNO:5-7的多肽氨基酸序列，其中Xaa表示Asn或Thr，Yaa表示Ala或Pro。在第六個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:9所示序列至少約卯％，更優(yōu)選至少約95%,最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第七個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:10所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:10所示序列至少約90%,更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第八個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:ll所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:ll所示序列至少約90%,更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第九個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:12所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:12所示序列至少約90%,更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第十個實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:16所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:16所示序列至少約90%，更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽，所述多肽是鼠源前-neublastin原。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽具有GDNF亞族指紋，即表3中的下劃線氨基酸殘基。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了由下述多核苷酸序列編碼的多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴緊的條件下與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞-序列雜交。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列至少70%同源。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列所編碼。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴緊的條件下與SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞-序列雜交。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列至少70%同源。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列所編碼。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴緊的條件下與SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞-序列雜交。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列至少70%同源。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列所編碼。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴緊的條件下與SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列，其互補鏈，或其亞-序列雜交。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列至少70%同源。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列所編碼。生物來源本發(fā)明的多肽可分離自哺乳動物細胞，優(yōu)選分離自人細胞或鼠源細胞。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽可分離自人的心臟組織，人骨骼肌，人胰腺，人腦組織，尤其可分離自尾狀核或丘腦，或者可得自哺乳動物源的DNA，這一點將在下文詳細討論。神經(jīng)營養(yǎng)活性本發(fā)明的neublastin多肽可用于緩和神經(jīng)或神經(jīng)元細胞的代謝，生長，分化或存活。特別是，neublastin多肽可用于治療或緩解活動物，例如人的失調或疾病，所述失調或疾病對神經(jīng)營養(yǎng)劑的活性有反應。下文將更詳細地描述這種治療和方法?？贵w可使用本發(fā)明的neublastin多肽或多肽片段產(chǎn)生neublastin-特異性抗體。本文所用"neublastin-特異性抗體"是抗體，例如多克隆抗體或單克隆抗體，所述抗體能與neublastin多肽或多肽片段發(fā)生免疫反應，或者與neublastin多肽的表位特異性結合。多克隆和單克隆抗體的制備是本領域眾所周知的。尤其是，可按以下文獻所述得到多克隆抗體例如Green等"產(chǎn)生多克隆的抗血清"，免疫化學方法(Manson編);Humana出版社，1992，pl-5;Coligan等"在兔，大鼠，小鼠和倉鼠中產(chǎn)生多克隆抗血清"，最新免疫學方法，1992,第2.4.1節(jié)；EdHarlow和DavidLane(編)"抗體實驗室手冊"，冷泉港實驗室出版社，1988;這些方法都列入本文作為參考。尤其是，可按以下文獻所述得到單克隆抗體Kohler&Milstein，自然，1975，256:495;Coligan等，最新免疫學方法,1992，第2.5.1-2.6.7節(jié)；和Harlow等，"抗體實驗室手冊"，冷泉港實驗室出版社，1988，p726;這些方法都列入本文作為參考。簡單地說，可通過下述方法得到單克隆抗體，即用含有抗原的組合物注射例如小鼠，通過取出血清樣品證實抗體的產(chǎn)生，取出脾臟，得到B淋巴細胞，使B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對抗原之抗體的陽性克隆，從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。可通過多種已成熟建立的技術從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體，所述技術包括用A蛋白Sepharose進行親和層析，大小排阻層析和離子交換層析，例見Coligan等，最新免疫學方法，1992,第2.7.1-2.7.12節(jié)和第2.9.1-2.9.3節(jié)；和Barnes等"免疫球蛋白G(IgG)的純化"，分子生物學方法;Humana出版社，1992，Vol.10,p79-104。任選通過與基質結合并從基質上洗脫下來以進一步純化多克隆或單克隆抗體，所述基質上結合有產(chǎn)生抗體的多肽。使用含有所需小肽(作為免疫抗原)的完整多肽或片段可制備出與本發(fā)明的neublastin多肽結合的抗體。通過重組DNA技術或通過化學合成可得到用于免疫動物的多肽，任選將所述多肽與載體蛋白綴合。常用的與肽化學偶聯(lián)的載體蛋白包括匙孔嘁血藍蛋白(KLH),甲狀腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)和破傷風類毒素。然后可使用偶聯(lián)的肽免疫動物，所述動物尤其可以是小鼠，大鼠，倉鼠或兔。在一個實施方案中，可使用下列肽產(chǎn)生抗體肽1:CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQIDNO:9的氨基酸108-124);或肽2:ALRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的氨基酸93-107)。實施例10中描述了使用這些多肽產(chǎn)生抗體的方法。我們還針對下列肽產(chǎn)生了兔多克隆抗體肽R27:GPGSRARAAGARGC(SEQIDNO:9的氨基酸30-43);肽R28:LGHRSDELVRFRFC(SEQIDNO:9的氨基酸57-70);肽R29:CRRARSPHDLSL(SEQIDNO:9的氨基酸74-85);肽R30:LRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的氨基酸94-107);肽R31:STWRTVDRLSATAC(SEQIDNO:9的氨基酸123-136)。在該組肽中，只有相對靠近于C末端的肽R30和R31才能識別Western印跡上的在還原條件下變性的蛋白質。如下文所詳述，我們還鑒定了其它得自成熟蛋白質的neublastin-衍生肽，根據(jù)已知的GDNF結構(Eigenbrot和Gerber，Nat.Struct.Bio，..19974435-438)，推測它們是暴露于表面的環(huán)，因此可用于產(chǎn)生抗體區(qū)域1:CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC(SEQIDNO:9的AA43-70);區(qū)域2:CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的AA74-107);區(qū)域3:CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC(SEQIDNO:9的AA108-136)。在本發(fā)明的另一方面，與neublastin或neublastin-衍生肽特異性結合的抗體可用于檢測多種介質中所述neublastin神經(jīng)營養(yǎng)因子的存在，尤其可用于診斷與本發(fā)明的neublastin分子相關的病癥或疾病。包括ELISA,RIA和FACS的多種檢測方法是本領域已知的。本發(fā)明的抗體也可用于阻斷神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，尤其可以是中和抗體。產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法如下文所詳述，在允許產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞含有編碼本發(fā)明neublastin多肽的DNA序列，接著從培養(yǎng)基中回收多肽。當為了產(chǎn)生neublastin多肽需要對細胞進行基因修飾時，可通過常規(guī)方法或通過基因激活修飾細胞。根據(jù)常規(guī)方法，可將含有neublastincDNA或基因組DNA序列的DNA分子包含在表達構建體中，并通過標準方法轉染至細胞中，所述轉染方法包括但不限于脂質體-,Polybrene-或DEAE葡聚糖-介導的轉染，電穿孔，磷酸鉤沉淀，微量注射或速度驅動的微粒轟擊("biolistics")?；蛘?，也可使用通過病毒載體傳遞DNA的系統(tǒng)。已知可用于基因轉移的病毒包括腺病毒，腺-相關病毒，慢病毒，皰夢病毒，腮腺炎病毒，脊髓灰質炎病毒，逆轉錄病毒，新培斯病毒和痘苗病毒，如金絲雀痘病毒，以及昆蟲細胞(尤其是SfP9昆蟲細胞)的桿狀病毒感染?；蛘撸墒褂没蚣せ?"GA")法修飾細胞，所述方法描述于例如美國專利5，733，761和5，750，376(皆列入本文作為參考)。因此，本文所用術語"經(jīng)基因修飾的細胞"包括在導入DNA分子之后能表達特定基因產(chǎn)物的細胞，所述DNA分子編碼所述基因產(chǎn)物和/或控制該基因產(chǎn)物編碼序列之表達的調節(jié)元件。可通過基因靶向導入DNA分子，使DNA分子摻入特定的基因組位點。重組表達載體在本發(fā)明的另一方面，提供了含有本發(fā)明的多核苷酸的重組表達載體。本發(fā)明的重組表達載體可以是任何適當?shù)恼婧吮磉_載體。優(yōu)選的重組表達載體是含有遍在蛋白啟動子的載體pTEJ-8(JohansenTE，SchoellerMS,TolstoyS，SchwartzT;F冊SLe化1990267289-294),及其衍生物，例如pUbilZ。優(yōu)選的商購真核表達載體是例如含有病毒啟動子的載體pcDNA-3(可得自Invitrogen)。另一個優(yōu)選的表達載體使用SV40早期啟動子和腺病毒主要晚期啟動子(衍生自質粒pAD2(3;Norton和Coffin,分子細胞生物學，1985，5，281)。本發(fā)明還提供了原核表達載體和合成基因(syngene),所述合成基因的密碼子經(jīng)最優(yōu)化后適于原核表達。用較低的GC含量和偏好的細菌(例如大腸桿菌)密碼子構建合成基因。將合成基因克隆至兩個載體，pET19b和pMJB164(pET19b的衍生物)。pET19b的構建示于圖14。在此構建體中，編碼neublastin成熟結構域的序列直接與起始甲硫氨酸融合。pMJB164的構建示于圖15。生產(chǎn)細胞在本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)細胞，所述細胞經(jīng)基因操作后含有本發(fā)明的分離的多核苷酸序列，和/或本發(fā)明的重組表達載體。特別是，可對本發(fā)明的細胞進行基因操作以瞬時或穩(wěn)定表達，過量表達或共表達本發(fā)明的多肽。產(chǎn)生瞬時和穩(wěn)定表達的方法是本領域已知的?？蓪⒈景l(fā)明的多核苷酸插入表達載體，例如質粒，病毒或其它表達載體，所述多核苷酸與表達控制序列以特定的連接方式可操作相連，從而使編碼序列能在與表達控制序列相容的條件下進行表達。適當?shù)谋磉_控制序列包括啟動子，增強子，轉錄終止子，起始密碼子，內含子的剪接信號和終止密碼子，它們都維持于本發(fā)明的多核苷酸的正確讀碼框內，從而能適當翻譯mRNA。表達控制序列還包括其它組分，例如前導序列和融合配對物序列。啟動子尤其可以是組成型或誘導型啟動子。當克隆至細菌系統(tǒng)時，可使用誘導型啟動子，例如噬菌體人的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜合啟動子)。當克隆至哺乳動物系統(tǒng)時，可使用得自哺乳動物細胞基因組的啟動子，例如遍在蛋白啟動子，TK啟動子，或金屬硫蛋白啟動子，或得自哺乳動物病毒的啟動子，例如逆轉錄病毒長的末端重復，腺病毒晚期啟動子或痘苗病毒7.5K啟動子。也可使用通過重組DNA或合成技術得到的啟動子以提供本發(fā)明多核苷酸的轉錄。適當?shù)谋磉_載體一般含有表達起點，啟動子以及能用表型選擇轉化細胞的特定基因，所述載體包括在細菌中表達的基于T7的表達載體[Rosenberg等，基因，1987，56，125，在哺乳動物細胞中表達的pTEJ-8，pUbilZ，pcDNA-3和pMSXND表達栽體[Lee和Nathans,生物化學雜志，19882633521，在昆蟲細胞中表達的衍生自桿狀病毒的載體，和卵母細胞表達載體PTLN[LorenzC，PuschM&JentschTJ:具有新特性的異多亞基CLC氯通道；Proc.Natl.Acad.Sci.USA19969313362-13366〗。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的細胞是真核細胞，例如哺乳動物細胞，如人細胞，卵母細胞或酵母細胞。本發(fā)明的細胞包括但不限于人胚腎(HEK)細胞，例如HEK293細胞，BHK21細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，Xenopuslaevis卵母細胞(XLO)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的細胞是真菌細胞，例如絲狀真菌細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，細胞是昆蟲細胞，最優(yōu)選為Sf9細胞。本發(fā)明另一個優(yōu)選的哺乳動物細胞是PC12，HiB5，RN33b細胞系和人神經(jīng)祖細胞。最優(yōu)選的是人細胞。原代或繼代細胞的例子包括成纖維細胞，上皮細胞(包括乳房和腸上皮細胞)，內皮細胞，血液的組成成分(包括淋巴細胞和骨髓細胞)，膠質細胞，肝細胞，角質形成細胞，肌細胞，神經(jīng)細胞或這些細胞類型的前體細胞。用于本發(fā)明方法的無限增殖化人細胞系的例子包括但不限于Bowes黑素瘤細胞(ATCC登記號為CRL9607)，Daudi細胞(ATCC登記號為CCL213)，HeLa細胞和HeLa細胞的衍生物(ATCC登記號為CCL2,CCL2.1和CCL2.2),HL-60細胞(ATCC登記號為CCL240)，HT-1080細胞(ATCC登記號為CCL121),Jurkat細胞(ATCC登記號為TIB152)，KB癌細胞(ATCC登記號為CCL17)，K-562白血病細胞(ATCC登記號為CCL243)，MCF-7乳腺癌細胞(ATCC登記號為BTH22),MOLT-4細胞(ATCC登記號為1582),Namalwa細胞(ATCC登記號為CRL1432),Raji細胞(ATCC登記號為CCL86),RPMI8226細胞(ATCC登記號為CCL155)，U-937細胞(ATCC登記號為CRL1593),WI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC登記號為CLL75.1)和2780AD卵巢癌細胞(VanderBlick等，癌癥研究，1988，48，5927-5932)，以及通過融合人細胞和另一物種的細胞而產(chǎn)生的異雜交瘤細胞。也可使用繼代人成纖維細胞系，如WI-38(ATCC登記號為CCL75)和MRC-5(ATCC登記號為CCL171)。當本發(fā)明的細胞是真核細胞時，本發(fā)明的異源多核苷酸的摻入可特別地通過以下方法來實現(xiàn)，即感染(利用病毒載體)，轉染(利用質粒載體)，使用磷酸釣沉淀，微量注射，電穿孔，脂轉染法，或其它本領域已知的物理-化學方法。在更優(yōu)選的實施方案中，可將本發(fā)明的分離的多核苷酸序列和/或本發(fā)明的重組表達載體轉染至哺乳動物宿主細胞，神經(jīng)祖細胞，星形細胞，T-細胞，造血干細胞，非-分裂細胞，或腦內皮細胞，所述細胞含有至少一種能介導細胞無限增殖化和/或轉化的DNA分子。通過導入調節(jié)元件，尤其是導入啟動子可以激活宿主細胞中的內源性基因，所述啟動子能導致編碼本發(fā)明之neublastin多肽的內源性基因的轉錄。藥物組合物在本發(fā)明的另一方面，提供了新的藥物組合物，其含有治療有效量的本發(fā)明多肽。為了用于治療，可以任何方便的形式施用本發(fā)明的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽與一種或多種佐劑，賦形劑，載體和/或稀釋劑混合于藥物組合物中，本領域技術人員使用本領域已知的常規(guī)方法即可制備藥物組合物。這種藥物組合物可含有本發(fā)明的多肽或其抗體?？梢詥为毷┯迷摻M合物，也可與一種或多種其它藥劑，藥物或激素一起施用該組合物?？赏ㄟ^任何適當?shù)耐緩绞┯帽景l(fā)明的藥物組合物，包括但不限于口服，靜脈內，肌內，動脈間，髓內，鞘內，室內，經(jīng)皮，皮下，腹膜內，鼻內，anteral，局部，舌下或直腸給藥，頰內，陰道內，眶內，腦內，顱內，脊柱內，室內，池內，嚢內，肺內，經(jīng)粘膜，或經(jīng)由吸入。肺內傳遞方法，裝置和藥物制品描述于例如美國專利5,785,049,5，780，019和5,775,320(皆列入本文作為參考)?？赏ㄟ^周期性注射藥物制品的巨丸劑進行給藥；也可通過靜脈內或腹膜內途徑更連續(xù)地給藥，所述藥物得自外部(例如IV袋)或內部(例如生物可腐蝕的植入物，生物人工器官，或植入的neublastin生產(chǎn)細胞集落)藥物庫。例見美國專利4，407，957，5,798,113和5，800，828(皆列入本文作為參考)。肺內傳遞方法和裝置描述于例如美國專利5,654,007，5，780，014和5，814，607(皆列入本文作為參考)。尤其是，使用任何適當?shù)膫鬟f方式都可施用本發(fā)明的neublastin,所述方式包括(a)泵(例見藥物治療年鑒,27:912(1993);癌癥,41:1270(1993);遮癥研究，44:1698(1984),列入本文作為參考)，(b)微嚢化(例見美國專利4,352,883;4，353，888和5,084,350,列入本文作為參考)，(c)持續(xù)釋放的聚合植入物(例見Sabel,美國專利4,883,666，列入本文作為參考)，(d)巨嚢化(例見美國專利5,284,761，5，158，881，4,976,859和4，968，733和公開的PCT專利申請W092/19195,WO95/05452,皆列入本文作為參考)，(e)移植至CNS的棵露的或未嚢化的細胞移植物(例見美國專利5，082，670和5，618，531，皆列入本文作為參考)，(f)皮下，靜脈內，動脈內，肌內注射或注射至其它適當?shù)奈稽c；和(g)以膠嚢，液體，片劑，丸劑或延長釋放的制劑口服給藥。在本發(fā)明的一個實施方案中，直接將neublastin傳遞至CNS，優(yōu)選傳遞至腦室，腦實質，鞘內間隙或其它適當?shù)腃NS位置，最優(yōu)選傳遞至鞘內。在另一個優(yōu)選的實施方案中，我們希望通過皮下注射，靜脈內給藥或靜脈內灌注全身性傳遞給藥。其它有用的非腸道傳遞系統(tǒng)包括乙烯-乙烯基醋酸酯共聚物顆粒，滲透泵，可植入的灌注系統(tǒng)，泵傳遞，膠嚢化細胞傳遞，脂質體傳遞，針頭-傳遞的注射，無針頭注射，噴霧器，煙霧劑，電穿孔和經(jīng)皮貼片。有關配制和給藥技術的其它詳情可參見Remington's藥物科學(Maack出版公司，Easton，PA)的最新版本。每天以一個或幾個劑量施用活性成分。本發(fā)明所希望的適當劑量為每次給藥0.5ngneublastin/kg體重至約50pg/kg,每天給藥約1.0ng/kg至約100^g/kg。neublastin藥物組合物應該提供局部濃度為約5ng/ml腦脊髓液("CSF，，)至25ng/mlCSF的神經(jīng)營養(yǎng)因子。當然，應當根據(jù)年齡，體重和接受治療的個體的身體狀況以及給藥途徑，劑量形式和制度，所需結果小心地調整給藥的劑量，醫(yī)生應當可以確定精確的劑量。在其它實施方案中，可使用下文"治療方法"一節(jié)中所述的細胞系和載體，通過基因傳遞施用本發(fā)明的neublastin多肽。為了產(chǎn)生這種治療性的細胞系，可將本發(fā)明的多核苷酸插入表達載體，例如質粒，病毒或其它表達載體，所述多核苷酸與表達控制序列以特定的連接方式可操作相連，從而使編碼序列能在與表達控制序列相容的條件下進行表達。適當?shù)谋磉_控制序列包括啟動子，增強子，轉錄終止子，起始密碼子，內含子的剪接信號和終止密碼子，它們都維持于本發(fā)明的多核苷酸的正確讀碼框內，從而能適當翻譯mRNA。表達控制序列還包括其它組分，例如前導序列和融合配對物序列。啟動子尤其可以是組成型或誘導型啟動子。組成型啟動子可以是合成的，病毒的或得自哺乳動物細胞基因組的啟動子，例如人遍在蛋白啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，治療性的細胞系是表達本發(fā)明多肽的人無限增殖化神經(jīng)細胞系。為了進行植入，我們希望植入約105至101Q個細胞，更優(yōu)選植入106至約108個細胞。治療方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及多核苷酸和蛋白質，多肽，肽片段或由它們產(chǎn)生的衍生物，以及針對所述蛋白質，肽或衍生物的抗體，本發(fā)明可用于治療或緩解活動物體，包括人的失調或疾病，所述失調或疾病對神經(jīng)營養(yǎng)劑的活性有反應?？山?jīng)由例如注射入，植入或食入的藥物組合物，直接使用本發(fā)明的多肽來治療對neublastin多肽有所反應的病理過程?？墒褂帽景l(fā)明的多核苷酸，包括其互補序列來表達本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)因子。通過表達本發(fā)明的這種蛋白質，肽或衍生物的細胞系，或通過編碼本發(fā)明的這種蛋白質，肽或衍生物的病毒載體，或通過表達這種蛋白質，肽或衍生物的宿主細胞可實現(xiàn)這一目的?？稍谥委煹陌袇^(qū)域施用這些細胞，載體和組合物以影響對neublastin多肽有所反應的疾病過程。適當?shù)谋磉_載體可衍生自慢病毒，逆轉錄病毒，腺病毒，皰奢病毒或痘苗病毒，或衍生自多種由細菌產(chǎn)生的質粒，可在體內使用這些表達載體將核苷酸序列傳遞至整個生物體或靶器官，組織或細胞群體。其它方法包括但不限于脂質體轉染，電穿孔，用含有核或其它定位信號的載體肽轉染，和經(jīng)由緩釋系統(tǒng)進行基因傳遞。在本發(fā)明的另一方面，可使用與neublastin基因或其部分互補的"反義"核苷酸序列抑制或增強neublastin表達。本發(fā)明的另一方面涉及治療或緩解活動物體，包括人的失調或疾病的方法，所述失調或疾病對神經(jīng)營養(yǎng)劑的活性有反應。失調或疾病尤其可以是由創(chuàng)傷，外科手術，局部缺血，感染，代謝疾病，營養(yǎng)缺陷，惡性胂瘤或毒性劑和遺傳或自發(fā)過程導致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。損傷尤其可發(fā)生在感覺神經(jīng)元或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，包括側根神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元或下列任何組織中的神經(jīng)元膝狀，巖部和結節(jié)狀神經(jīng)節(jié)；第VIII根顱神經(jīng)的耳前庭復合體；三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)之上下頜葉的腹外側極；和中腦三叉神經(jīng)核。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，疾病或失調是涉及受損和受傷的神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病，例如外周神經(jīng)，髓質和/或脊髓的外傷性損害，大腦局部缺血性神經(jīng)元損害，神經(jīng)病(尤其是外周神經(jīng)病)，外周神經(jīng)創(chuàng)傷或外傷，局部缺血性中風，急性腦損傷，急性脊髓損傷，神經(jīng)系統(tǒng)胂瘤，多發(fā)性硬化，暴露于神經(jīng)毒素，代謝疾病(例如糖尿病或腎功能異常)和由感染因子導致的損傷，神經(jīng)變性失調，包括早老性癡呆，杭廷頓氏病，帕金森氏病，Parkinson-Plus綜合征，進行性核上麻痹(Steele-Richardson-Olszewski綜合征)，橄欖體腦橋小腦萎縮(OPCA),Shy-Drager綜合征(多系統(tǒng)萎縮)，Guamanian帕金森氏綜合征癡呆復征，肌萎縮性側硬化，或任何其它先天的或神經(jīng)變性疾病，和與癡呆相關聯(lián)的記憶損傷。在優(yōu)選的實施方案中，我們希望治療感覺和/或自主系統(tǒng)的神經(jīng)元。在另一個優(yōu)選的實施方案中，我們希望治療運動神經(jīng)元疾病，例如肌萎縮性側硬化("ALS，，)和脊柱肌萎縮。在另一個優(yōu)選的實施方案中，我們希望使用本發(fā)明的neublastin分子增強外傷后的神經(jīng)恢復。在一個實施方案中，我們希望使用神經(jīng)引導通道，該通道具有含neublastin多肽的基質。這種神經(jīng)引導通道公開于例如美國專利5，834，029(列入本文作為參考)。在優(yōu)選的實施方案中，可使用本發(fā)明的多肽和核酸(和含有它們的藥物組合物)治療外周神經(jīng)病。在外周神經(jīng)病中，有望用本發(fā)明的分子進行治療的是外傷-誘導的神經(jīng)病，例如由物理損傷或疾病狀態(tài)，對腦的物理損傷，對脊髓的物理損傷，與腦損傷相關的中風和與神經(jīng)變性相關的神經(jīng)失調所致的神經(jīng)病。我們還希望治療由化學治療誘導的神經(jīng)病(例如由諸如紅豆杉醇或順式鉑氨的化學治療劑的傳遞所導致的神經(jīng)病)；毒素-誘導的神經(jīng)病，藥物-誘導的神經(jīng)病，維生素-缺乏-誘導的神經(jīng)??；自發(fā)性的神經(jīng)病和糖尿病性神經(jīng)病，例見美國專利5，496，804和5，916，555(皆列入本文作為參考)。我們還希望使用本發(fā)明的neublastin核苷酸和多肽治療非-神經(jīng)病，單-多重神經(jīng)病和多-神經(jīng)病，包括軸索和脫髓鞘神經(jīng)病。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽和核酸(和含有它們的藥物組合物)可用于治療多種眼病，包括受斑變性，色素性視網(wǎng)膜炎，青光眼和類似疾病困擾的患者的視網(wǎng)膜光受體損失。本發(fā)明的另一個目的是提供預防與上述疾病和失調相關聯(lián)的變性變化的方法，所述方法包括將人載體或細胞植入哺乳動物的腦，所述載體或細胞能產(chǎn)生neublastin的生物活性形式或neublastin前體，即易于通過哺乳動物體轉變?yōu)閚eublastin的生物活性形式的分子，或者，另外可將分泌neublastin的細胞包裹于例如半透膜內?？稍隗w外培養(yǎng)細胞以用于移植至或植入哺乳動物(包括人)的腦。在優(yōu)選的實施方案中，可使用例如國際專利申請W098/32869中所述的表達栽體，將編碼本發(fā)明多肽的基因轉染至適當?shù)募毎?，例如無限增殖化的大鼠神經(jīng)干細胞系，如HiB5和RN33b，或轉染至人無限增殖化的神經(jīng)祖細胞系，再將所得的細胞系植入活體(包括人)的腦中，以在CNS中分泌本發(fā)明的治療性多肽。診斷和篩選方法可使用neublastin核酸測定個體是否因neublastin基因缺損，如neublastin等位基因的缺損而先傾向于患有神經(jīng)失調癥，所述缺損是通過例如基因遺傳，異常胚胎發(fā)育，或獲得性DNA損傷而獲得的。所述分析包括例如檢測neublastin基因內的缺損或點突變，或檢測具有特異性限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的基因缺損誘因的遺傳性，通過使患者的核酸樣品與neublastin基因特異性的核酸探針雜交來檢測是否存在正常的neublastin基因，并且測定探針與核酸雜交的能力?？商貏e地將neublastin核酸用作雜交探針。可使用這種雜交分析檢測，預測，診斷或監(jiān)測與編碼neublastin蛋白之mRNA的異常水平相關的病癥，失調或疾病。可將neublastin核酸當作neublastin神經(jīng)營養(yǎng)因子-依賴型生理過程的"標記"。這些過程包括但不限于"正常的"生理過程(如神經(jīng)元功能)和病理過程(如神經(jīng)變性疾病)。neublastin蛋白和/或編碼neublastin的mRNA水平異常(即升高或降低)的特定患者亞群的鑒定導致新的疾病分類。本文所定義的"異常水平"指的是經(jīng)定量或定性方法測定，上述水平相對于對照樣品或未患病的個體而言有所增加或降低。也可使用本發(fā)明的neublastin核酸和多肽篩選和鑒定neublastin類似物，包括neublastin的小分子模擬物。在一個經(jīng)深思熟慮的實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定候選化合物的方法，所述化合物可誘導neublastin-介導的生物學作用，所述方法包括以下步驟提供受試細胞，當其與neublastin接觸時可被誘導表達可測的產(chǎn)物，將細胞暴露于候選化合物，并檢測可測產(chǎn)物?？蓽y產(chǎn)物的表達是候選化合物能誘導neublastin-介導的生物學作用的標志。此外，本發(fā)明的neublastin核酸和多肽可用于DNA芯片或蛋白質芯片，或用于計算機程序以鑒定相關的新基因序列和由其編碼的蛋白質，包括等位基因變體和單核苷酸多態(tài)性("SNP")。所述方法描述于例如美國專利5,795,716;5,754,524;5,733,729;5,800,992;5,445,934;5，525，464(皆列入本文作為參考)。實施例實施例1:分離neublastin核酸的方法方法1:快速篩選人胎腦cDNA中的neublastin基因通過與人persephin的同源性，在兩個提交至GenBank的高通量基因組序列(HGTS)(登記號為AC005038和AC005051)中鑒定出290bp片段。由290bp片段的核酸序列合成兩個neublastin特異性引物。neublastin上鏈引物("NBNmt.sence，，)具有序列5，-CCTGGCCAGCCTACTGGG-3，[SEQIDNO:17。neublastin下鏈引物("NBNint.anUsence")具有序列5，-AAGGAGACCGCTTCGTAGCG-3'[SEQIDNO:18。用這些引物進行96孔PCR反應。96孔主平板含有500，000個cDNA克隆的質粒DNA，每孔上樣約5000個克隆。96孔次平板使用的是大腸桿菌DH10B甘油原種，每孔含有50個克隆。使用聚合酶鏈反應("PCR")技術通過3輪擴增鑒定出neublastin核酸；擴增增加了樣品中的核酸拷貝數(shù)。主平板篩選使用上述96-孔PCR篩選技術，用基因-特異性引物篩選人胎腦cDNA主平板以分離人neublastincDNA。從主平板的相應孔中得到30納克(30ng)人胎腦cDNA(6ng/|nl;OrigeneTechnologies),將其置于總體積為25^1的溶液中，所述溶液含有下列試劑0.2mM上述兩種基因-特異性引物(即NBNint.sence和NBNint.antisence),lx標準的PCR緩沖液(BufferV,AdvancedBiotechnologies,UK),0.2mMdNTP(Amersham畫Pharmacia)，0.1MGC國Melt(CIontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/nI;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用下列方案和條件進行PCR熱循環(huán)反應。起初使DNA于94X:變性3分鐘，然后按下述進行35輪循環(huán)94X:變性l分鐘，55^C退火l分鐘，72C第一次延伸90秒；72C最終延伸5分鐘。使用含有溴化乙錠染料的2%瓊脂糖凝膠經(jīng)凝膠電泳分析96個獨立的PCR反應產(chǎn)物。由一個孔中得到的102bp陽性PCR產(chǎn)物對應于獨特的96孔次平板102bp核酸片段具有下列序列[SEQIDNO:135'-CCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGC丁GCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTT-3'次平板篩選將1^1得自相應次平板孔的甘油原種置于總體積為25[il的溶液中，經(jīng)PCR-介導的擴增篩選96孔人胎腦次平板，所述溶液含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，lx標準的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK)，0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia),0.1MGC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/pl;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用的PCR熱循環(huán)條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應，鑒定出給出102bpPCR片段的陽性孔。菌落PCR:用Luria肉湯(LB)將1ml得自陽性次平板孔的甘油原種稀釋100倍，然后將1ml和10ml上述稀釋液鋪于2個含有Luria肉湯(LB)和100i!g/ml羧節(jié)青霉素的獨立瓊脂平板上，于30t:將LB平板保溫過夜。從這些平板中挑選出96個菌落，置于新的96孔PCR板的孔中，每孔的終體積為25nl，其中含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，lx標準的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK)，0.2mMdNTP(Amersham隱Pharmacia),0.1MGC畫Mdt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/nl;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用的PCR熱循環(huán)條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應，隨后鑒定出含有102bp片段的陽性菌落。對由該陽性菌落制備的質粒DNA進行測序，顯示出861bp的全長cDNA[SEQIDNO:8。該cDNA編碼前-neublastin原[SEQIDNO:9。使用BigDye⑧終止循環(huán)測序試劑盒(PEAppliedBiosystems,USA)進行自動化的DNA測序。在ABIPrism377(PEAppliedBiosystems，USA)上電泳測序凝膠。方法2:從人腦中克隆neublastincDNA:通過聯(lián)合使用RACE(快速擴增cDNA末端)，上文所述的neublastin-特異性引物NBNint.sence和NBNint.antisence,以及載體-特異性或銜接子-特異性引物，例如通過使用MarathoncDNA擴增試劑盒(ClontechLaboratories,USA,Cat.No.K1802-l)，可實施擴增全長neublastincDNA或cDNA片段的另一種方法。使用整個人腦Marathon-ReadycDNA(ClontechLaboratories,USA,Cat.No.7400-1)擴增全長neublastincDNA。擴增所用的引物包括neublastin上鏈引物5，-ATGGAACTTGGACTTGG-3，[SEQIDNO:19("NBNext.sence")，和neublastin下鏈引物5，-TCCATCACCCACCGGC-3，[SEQIDNO:20("NBNext.antisence"),以及包含在Marathon-ReadycDNA中的銜接子引物AP1。也可使用另一種上鏈引物，5，-CTAGGAGCCCATGCCC-3，[SEQIDNO:28。也可使用另一種下鏈引物5，-GAGCGAGCCCTCAGCC-3，[SEQIDNO:33。類似地，也可使用另一種下鏈引物SEQIDNO:24和26。方法3:從人腦中克隆neublastincDNA:克隆neublastincDNA的另一種方法是通過用本文所述的一種或多種neublastin探針篩選成人或胎兒的腦文庫(如圖1所例舉)。這些文庫包括Xgtll人腦(CloiitechLaboratories,USA,Cat.No.HL3002b);或Xgtll人胎腦(ClontechLaboratories,USA,CatNo.HL3002b)。方法4:快速篩選小鼠胎cDNA中的neublastin基因按下述方法進行快速篩選neublastin基因的方案。96孔主平板含有500,000個cDNA克隆的質粒DNA,每孔上樣約5000個克隆。96孔次平板使用的是大腸桿菌甘油原種，每孔含有50個克隆。進行3輪PCR-介導的擴增以鑒定出感興趣的基因(即neublastin)。主平板篩選使用基因-特異性引物，通過96-孔PCR篩選小鼠胎cDNA主平板以分離小鼠neublastincDNA。合成下列兩個引物(l)neublastinC2引物(NBNintsence)5，-GGCCACCGCTCCGACGAG-3，[SEQIDNO:21；和(2)neublastinC2as引物(NBNint.antisence):5，-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3，SEQIDNO:22。通過使用這兩個基因-特異性引物，鑒定出220bp的陽性PCR產(chǎn)物。220bp核酸具有下列序列[SEQIDNO:145'-GGCCACCGCTCCGACGAGCTGATACGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCGTGCCGCCGAGCACGCTCCCAGCACGATCTCAGTCTGGCCAGCCTACTGGGCGCTGGGGCCCTACGGTCGCCTCCCGGGTCCCGGCCGATCAGCCAGCCCTGCTGCCGGCCCACTCGCTATGAGGCCGTCTCCTTCATGGACGTGAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCC-3'然后按下列方法進行96孔PCR反應。從主平板的相應孔中得到30納克小鼠胎腦cDNA(6ng/nl;OrigeneTechnologies),將其置于總體積為25^tl的溶液中，所述溶液含有下列試劑0.2mM上述兩種基因-特異性引物(即C2引物(NBNint.sence)和neublastinC2as引物(NBNmt.antisence))，1x標準的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK),0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia),0.1MGC隱Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/i^l;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用下列PCR熱循環(huán)條件起初使DNA于94t:變性3分鐘，然后按下述進行35輪循環(huán)94X:變性l分鐘，55"C退火1分鐘，72X:延伸90秒；72X:最終延伸5分鐘。在含有溴化乙錠染料的2%瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應。由一個孔中得到的220bp陽性PCR產(chǎn)物對應于獨特的96孔次平板。在含有溴化乙錠染料的2%瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應。鑒定出的220bp陽性PCR產(chǎn)物對應于96孔次平板特有的孔。次平板篩選將1^1得自相應次平板孔的甘油原種置于最終總體積為25fil的溶液中，經(jīng)PCR-介導的擴增篩選96孔小鼠胎次平板，所述溶液含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，lx標準的pCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK)，0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia)，0.1MGC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/pl;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用的PCR熱循環(huán)條件與上文所述的主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2。/。瓊脂糖凝膠上分析96個獨立的PCR反應，鑒定出產(chǎn)生220bp片段的陽性孔。菌落PCR:用Luria肉湯(LB)將lml得自陽性次平板孔的甘油原種稀釋100倍，然后將lml和10ml上述稀釋液鋪于2個含有100嗎/ml羧芐青霉素的獨立LB平板上，于30t:保溫過夜?？偣卜蛛x出96個菌落，將這些菌落轉移至96孔PCR板的孔中，每孔的終體積為25nl，其中含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，lx標準的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK)，0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia)，0.1MGC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/fil;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用的PCR熱循環(huán)條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳分析96個獨立的PCR反應，通過220bp片段的存在鑒定出陽性菌落。由該陽性菌落制備質粒DNA,使用具有AmpliTaqDNA聚合酶的BigDye⑧終止循環(huán)測序試劑盒對克隆進行自動化的DNA測序。在ABIPrism377(PEAppliedBiosystems，USA)上電泳測序凝膠。所得克隆序列顯示出2136bp的全長cDNA[SEQIDNO:15。此cDNA包括具有SEQIDNO:16所示的推測氨基酸序列的開放閱讀框，其編碼小鼠前-neublastin原多欣。實施例2:克隆基因組neublastin如上文所討論，申請人在兩個登錄至GenBank的人BAC克隆(登記號為AC005038和AC005051)中鑒定出290bp的核酸片段，該片段具有與persephin和pers印hin的側翼序列同源的區(qū)域。申請人使用上文所述的861bp推測序列設計出其它引物，目的是使用LasergeneSoftware(DNAStar公司)克隆出編碼其它neublastin核酸的核酸。通過對基因組DNA進行PCR反應，使用兩對引物克隆neublastin基因。這兩對引物如下。l號引物對5，CCAAgCCCACCTgggTgCCCTCTTTCTCC3，(有義)[SEQIDNO:23j5，CATCACCCACcggCAggggCCTCTCag3，(反義)[SEQIDNO:24。2號引物對5'gAgCCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgAggACA3，(有義)[SEQIDNO:255，CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC3，(反義)[SEQIDNO:26。使用1號引物對，由購自ClontechLaboratories(Cat.No.6550-1)的人基因組DNA制品擴增887bpDNA片段。PCR方案使用具有緩沖液1的ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim)進行PCR?？傮w積為50nl的PCR反應混合物中添加有5。/o二甲基亞砜(DMSO)和17.5pmol各種dNTP。熱循環(huán)反應為94"C預-變性2分鐘，接著進行35輪94"C10秒和1分鐘的兩-步循環(huán)。通過于68X:保溫5分鐘終止熱循環(huán)。在PTC-225DNAEngineTetrad熱循環(huán)儀(MJResearch,MA)中進行熱循環(huán)。通過在2%瓊脂糖(FMC)上進行凝膠電泳來分析PCR產(chǎn)物，然后進行照相。將用l號引物對擴增自人基因組DNA的887bp片段克隆至pCRII載體(Invitrogen)，并轉化至XL1-Blue感受態(tài)大腸桿菌細胞(Stratagene)。所得質粒被稱為neublastin-2，使用熱測序酶(AmershamPharmaciaBiotech)對該質粒測序。通過在ALFExpress自動測序儀(Amer-shamPharmaciaBiotech)上電泳來分析測序產(chǎn)物。對用第二對引物(上述1號引物對)PCR擴增人基因組DNA得到的片段進行測序，顯示出位于開放閱讀框3'引物末端的額外的42bp區(qū)域。通過將此全長序列與其它神經(jīng)營養(yǎng)因子的核酸序列相比較，以及使用尋找基因的軟件程序作圖外顯子-內含子邊界序列來分析此全長序列，所述程序可使用Netgene和GeneMark軟件(Brunak等，分子生物學雜志，1991，22049-65;Borodovsky等，核酸研究，1995，23，3554-62)鑒定適當?shù)募艚咏宇^和具有高編碼潛力的區(qū)域。通過得自上述快速篩選的cDNA進一步證實外顯子-內含子邊界序列。如圖7所示，所得neublastin基因具有兩個被70bp內含子分開的外顯子?？傊?，外顯子具有全長Neublastin多肽的推測氨基酸序列。推測的cDNA[SEQIDNO:3含有編碼238個氨基酸殘基[SEQIDNO:4的開放閱讀框(ORF)。Neublastin-2克隆含有neublastin原的完整編碼序列。由此基因編碼的氨基酸序列顯示出與3個蛋白質，presephin，neublastin和GDNF具有高同源性。實施例3:表達neublastin核酸使用下述技術檢測嚙齒類動物和人的神經(jīng)和非-神經(jīng)組織，以及多個發(fā)育不成熟和成年階段的neublastinRNA表達。使用RT-PCR檢測NeublastinRNA表達的方法根據(jù)SEQIDNO:l所筌定的neublastinDNA序列，合成了下列引物(l)neublastinC2引物5，-GGCCACCGCTCCGACGAG-3，[SEQIDNO:21；和(2)neublastinC2as引物5，-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3，[SEQIDNO:22。使用該套引物由成人和胎兒全腦mRNART-PCR擴增DNA片段，通過此反應產(chǎn)生的DNA片段中有一個為220bp。鑒定該220bpDNA片段，結果表明成人和胎兒腦組織中表達了neublastin基因。使用這些引物從基因組DNA中也擴增到220bpDNA片段。通過Northern印跡雜交檢測NeublastinRNA表達的方法具有成人組織的polyA+RNA的Northern印跡購自廠商(ClontechLaboratories,USA)，并用34-標記的neublastincDNA作探針與其雜交。根據(jù)上文實施例1所述的方法制備經(jīng)標記的neublastincDNA。制備探針按照廠商的說明，使用RediprimeII標記試劑盒(Amersham;Cat.No.RPN1633)標記neublastin核酸DNA片段(SEQIDNO:8的核苷酸296-819)以用作雜交探針。筒單地說，用10mMTE緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.0，ImMEDTA)稀釋DNA樣品至濃度為2.5-25ng/45nl。然后在開水浴中將樣品加熱至95-100X^達5分鐘，將其置于冰上放5分鐘以快速冷卻樣品，簡單離心使內容物沉至反應管底部，從而使DNA變性。在反應管中加入上述所有變性的DNA以及5^1Redivue[32pdCTP(AmershamPharmaciaBiotechLtd),該反應管中還同時含有dATP，dGTP，dTTP的緩沖溶液，干燥的穩(wěn)定化形式的無外切核酸酶的Klenow酶和隨機引物。通過用移液管上下抽吸2次，用移液管攪動溶液以混合溶液，于37t:將反應混合物保溫10分鐘。通過加入5nl0.2MEDTA終止標記反應。為了用作雜交探針，通過將DNA樣品加熱至95-100r達5分鐘，然后將其置于水上放5分鐘以快速冷卻DNA樣品，從而使經(jīng)標記的DNA變性為單鏈。離心試管，充分混合其內容物。最后，使用NucleotideRemoval試劑盒(Qiagen)純化單鏈DNA探針。雜交技術制備的Northern印跡購自廠商("多組織Northern印跡"，ClontechLaboratories,USA，Cat.No.7760-1和7769-1),根據(jù)廠商說明，使用上文所制備的neublastin"P-標記的探針與所述印跡雜交。為了進行雜交，使用了ExpressHyb溶液(ClontechLaboratories,USA)和濃度約為3ng/ml的經(jīng)標記探針。將ExpressHyb溶液加熱至，然后攪拌以溶解任何沉淀物。根據(jù)廠商說明，于68E,在Hybaid雜交烘箱中的至少5mlExpressHyb溶液中將每個Northern印跡膜(10xl0cm)預-雜交30分鐘。于95-1001放置2分鐘使neublastin32P-標記的探針變性，然后在水上快速冷卻。在5ml新鮮的ExpressHyb中加入14^1經(jīng)標記的探針并徹底混合。預-雜交中所用的ExpressHyb溶液被5ml均勻分布于印跡膜的含有經(jīng)標記探針的新鮮ExpressHyb溶液所替代。于68t:，在Hybaid雜交烘箱中將印跡保溫1小時。保溫后，在低嚴緊度(含有0.05V。SDS的2xSSC緩沖液，室溫)下將印跡沖洗和洗滌幾次，接著在高嚴緊度(含有0.1%SDS的O.lxSSC，50匸)[20xSSC是0.3MNaCl/0,3M檸檬酸鈉，pH7.0下洗滌。于-，使用增感屏將印跡暴露于HyperfilmMP(AmershamPharmaciaBiotechLtd.)。Northern印跡雜交實驗的結果示于圖1。圖1A(左)和圖1B(右)是按實施例3所述與"P-標記的neublastincDNA探針雜交的polyA+RNANorthern印跡。標記物表示大小為1.35千堿基對("kb")，2.4kb，4.4kb,7.5kb和9.5kb的多核苷酸。用提取自多種成人組織的mRNA制備圖1A的膜。由Northern印跡雜交分析的結果，申請人得出結論很多成人組織中都表達neublastinmRNA。在心臟，骨骼肌和胰腺中檢測到最高水平的neublastin表達。用提取自成人腦的多個區(qū)域的RNA制備圖IB的膜。在成人腦中，尾狀核和丘腦中的表達水平最高。在腦中，約5kb的mRNA轉錄物是主要表達的neublastinmRNA形式。使用原位雜交檢測組織中的neublastinRNA表達的方法使用以下技術，用neublastin反義探針測定動物組織，例如嚙齒動物組織中的neublastinRNA表達。在小鼠中的表達制備組織樣品在懷孕第13.5或18.5天，通過頸脫位處死懷孕小鼠(B&KUniversal,Stockholm,Sweden)。在無菌條件下解剖，取出胚胎，立即浸入含有4。/o低聚甲醛("PFA")的0.1M磷酸鹽緩沖液(PB)中達24至30小時，然后從PFA中取出并儲存于PBS中。通過將組織浸入30%蔗糖溶液，然后在TissueTech(O.C.T.Compound,SakuraFinetekUSA,Torrance,CA)中包埋該組織即可制備出切片用的組織。在低溫恒溫器上切下6個冠狀或矢狀切片(各為12nm)系列，并融化固定在帶正電的玻片上。在實施與胚胎階段相同的方案之后，固定新生兒的頭/腦(Pl，P7)，解剖成年腦組織，立即在干冰中凍干，無需包埋即可在低溫恒溫器上進行切片。制備neublastinRiboprobe:按下述制備反義neublastinRNA探4十(下文稱之為neublastinriboprobe)。將小鼠neublastincDNA序列的核苷酸1109-1863[SEQIDNO:15j亞克隆至BlueScript載體(Stratagene)。使用EcoRI限制性內切核酸酶將所得質粒切對成線性DNA。根據(jù)廠商(BoehringerMaimheim)說明，使用T3RNA聚合酶和地高辛配基("DIG")RNA標記試劑盒體外轉錄EcoRIDNA片段。雜交在4。/oPFA中將低溫恒溫器切片固定10分鐘，用10mg/ml蛋白酶K處理5分鐘，依次分別用70%和95%乙醇脫水5和2分鐘，然后風干。將含有l(wèi)ng/mlDIG-標記探針的雜交緩沖液(50。/。去離子化的甲酰胺，50%葡聚糖硫酸酯溶液中的10%,1%Denhardt溶液，250ng/ml酵母tRNA，0.3MNaCl，20mMTris國HCl(pH8)，5mMEDTA，lOmMNaP04，1%十二烷基肌氨酸鈉)加熱至達2分鐘，并應用于切片上，然后用石蠟膜覆蓋切片，于55t:保溫16至18小時。第二天，于55C在高嚴緊度(含有50%甲酰胺的2xSSC)下洗滌切片30分鐘，然后用RNA酶緩沖液洗滌，并于37C與20ng/mlRNA酶A保溫30分鐘。為了檢測DIG-標記的探針，在封閉溶液(含有0.1%吐溫-20和10%熱-滅活的山羊血清的PBS)中將切片預保溫1小時，然后于4r與按1:5000稀釋的堿性磷酸酶-偶聯(lián)的抗-DIG抗體(BoehringerMannheim)保溫過夜。第二天，用含有0.1%吐溫-20的PBS將每個切片洗滌4次，每次2小時，然后用NTMT緩沖液(100mMNaCl，100mMTris-HCl(pH9.5)，50mMMgCl2，0.1%吐溫-20)洗滌2次，每次10分鐘。然后在含有0.5mg/mllevamisole的BM-紫色底物中將切片保溫48小時。通過用PBS洗滌以終止顏色反應，風干切片，用具有DPX的封套(KEBO-lab，Sweden)覆蓋切片。原位雜交反應的結果示于表1。表l:在小鼠中表達neublastin<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如表1所示，在第13.5天胚胎期("E13.5")，脊髓和后腦中表達了neublastin，前腦中僅有微弱表達。在發(fā)育中的視網(wǎng)膜和感覺神經(jīng)節(jié)(側根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)(V))中也檢測到neublastin表達。除神經(jīng)系統(tǒng)外，在腎，肺和腸中發(fā)現(xiàn)了微弱信號，這表明這些組織中也表達neublastin。在第18.5天胚胎期("E18.5"),三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)(V)中的neublastin表達最為顯著，也在視網(wǎng)膜，紋狀體和皮質中檢測到neublastin表達。另外，還在牙髓中觀察到表達。參照表1，在皮質，紋狀體和三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)(V)中，由E18.5時間點至出生后第1和7天，neublastin的表達逐步增加。皮質外層的neublastin表達比皮質內層更加顯著。在P7天，有表達的結構與Pl天的相同，但另外還在海馬，尤其是齒狀回和小腦中發(fā)現(xiàn)了neublastin表達。在成年的鼠腦中，neublastin在齒狀回中大量表達，而在受試的其它組織中僅檢測到很低或不可測水平的neublastin表達。在大鼠中表達下列實驗描述了大鼠組織與堿性磷酸酶-標記的寡脫氧核苷酸neublastin反義探針的雜交。制備組織樣品用戊巴比妥麻醉之后，由懷孕的Wistar大鼠(MollegaardBreeding,Denmark)得到大鼠胚胎(E14)。通過斷頭殺死出生后的大鼠(P0，P7，成年)。立即將解剖的腦和整個頭浸入冷的0.9%NaCl中，新鮮冷凍并在低溫恒溫器上切片成20nm(冠狀或矢狀切片，10個系列)。原位雜交使用反義堿性磷酸酶(AP)綴合的寡脫氧核苷酸探針(5'-NCAGGTGGTCCGTGGGGGGCGCCAAGACCGG-3，[SE()IDNO:27]，Oligo.No.l64675，DNATechnology,Denmark)雜交兩個切片系列。所述探針與SEQIDNO:15所示小鼠neublastincDNA的堿基1140至1169互補。在雜交之前，室溫風干切片，加熱至55C10分鐘，然后于4"C用96%乙醇處理過夜。然后風干切片，于39C在雜交介質(5.0pmol探針/ml)中保溫過夜(Finsen等，神經(jīng)科學，1992，47，105-113;West等，J.Comp.Neurol，1996，370，11-22)。雜交后的處理包括于用1xSSC(0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉)沖洗4次，每次30分鐘，接著在室溫下用Tris-HCl，pH9.5沖洗3次，每次10分鐘，然后使用AP顯色劑。AP顯色劑即用即制，其含有氮藍四唑(NBT，Sigma)，5-溴，4-氯，3-丐l哚磷酸(BCIP，Sigma)和Tris畫HCl-MgCl2緩沖液，pH9.5(Finsen等，神經(jīng)科學，1992，47，105-113)。室溫下，在黑暗中進行AP顯色48小時。通過用蒸餾水沖洗切片來終止顏色反應。在梯度丙酮中使切片脫水，用二甲笨-笨酚木溜油(AUchem，UK)使其軟化，用二甲笨清洗，并使用Eukitt(Bie&Berntsen,Denmark)覆蓋一層封套。對照反應包括(l)在雜交前用RNA酶A(50pg/ml，Pharmacia,Sweden)預-處理切片；(2)用過量100倍的未經(jīng)標記的探針與切片雜交；和(3)僅用雜交緩沖液與切片雜交。雜交反應的結果示于表2。表2:在大鼠中表達neublastin<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>在第14天胚胎期(E14),neublastin在大鼠胚胎的前腦，后腦和脊髓中微弱表達。在眼(視網(wǎng)膜)，側根神經(jīng)節(jié)，三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)(V)和腎，肺，心臟，肝臟和腸中也檢測到neublastinmRNA。在新生(P0)大鼠中，皮質和紋狀體中的neublastin表達顯著。在嗅球和海馬中也檢測到neublastin表達。在7天齡(P7)大鼠中，皮質，紋狀體，嗅球和小腦表達了neublastin。在海馬中發(fā)現(xiàn)了顯著的信號。在成年大鼠中，在腦的大多數(shù)區(qū)域檢測到^艮低或不可測的neublastin表達水平。在丘腦核中檢測到微弱信號，在海馬中檢測到顯著的neublastin表達。實施例4:neublastin多肽在SEQIDNO:8中鑒定的開放閱讀框或編碼區(qū)(CDS)編碼前-多肽原(稱為"前neublastin原")。由此開放閱讀框推測的氨基酸序列示于SEQIDNO:9，鑒定了3個neublastin多肽變體，這些變體包括(i)本文稱為NBN140的多肽，其具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列；(ii)本文稱為NBN116的多肽，其具有SEQIDNO:ll所示的氨基酸序列；和(Hi)本文稱為NBN113的多肽，其具有SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。類似地，根據(jù)SEQIDNO:3中鑒定的編碼區(qū)(CDS)編碼具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的前-多肽原，鑒定了3個neublastin變體，這些變體包括(i)具有SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽；(ii)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽；和(iii)具有SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽。根據(jù)基于ClustalW(1.75)的多序列對比，將SEQIDNO:9與GDNF，pers印hin和neurturin的氨基酸序列相比較。對比結果示于表3。表3:neublastin與persephin，neurturin和GDNF的氨基酸序列比較Neurturin-full--------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGLI^SHRLGPANeublastinMELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPPPeirsephin—full--------■------------------------------------------------GDNF—HUMAN-ful1-----MKLWDWAVCLVLLHTASAFPIjPAGKRPPEAPAEDRSIjGRRRAPFALSSDSNeurturin-ful1LVPIiHRLPRTLDAR工ARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRRNeublastinVIiASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGPersephin-full-MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTHRPLGDNF一HUMAN-ful1NMPEDYPDQFDDVMDF工QATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGNeurturin-ful1RARARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGfACEA-AARVYDLGLRRNeublastinSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRR-ARSPHDIjSLASPerSephin-ful1ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAE^GLGYASEEKVIFRYCAGSCPRGARTQHGLALARGDNF一HUMAN-fullRRGQRGKNRGCVLTA工HIJJVTDjU5IiGYETKEELIFRYCSGSCDA-AETTYDK工LKNNeurturin-fullIiRQRKRLRRE---RVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHEI*SAR￡CACV-NeublastinLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYE-AVSFMDVMSTWRTVDRLSATACGCLGPersephin-fullLQGQGRAHGG--------PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQLSAAACGCGGGDNF一HUMAN-ful1LSRNRRLVSD----KVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNiiVYHILRKHSAKRCGC工—*表示具有單個完全保守殘基的位置；:表示下列"強(strong)"組之一是完全保守的-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，F(xiàn)YW;.表示下列"較弱(weaker)"組之一是完全保守的-CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，VLIM，HFY。由表3所示的氨基酸序列對比可以看出neublastin有7個保守的半胱氨酸殘基，它們位于TGF-P超家族保守的位置處。在一個實施方案中，優(yōu)選的neublastin多肽含有(7個)保守的半胱氨酸，在SEQIDNO:2中，保守位置為第8，35，39，72，73，101和103位，而在SEQIDNO:4和9中，保守位置為第43，70，74，107,108，136和138。已知這7個保守的半胱氨酸殘基在TGF-P超家族形成3個單體內二硫鍵(例如，在SEQIDNO:2中為半胱氨酸殘基8-73，35-101和39-103之間的二疏鍵，而在SEQIDNO:4和9中為半胱氨酸殘基43-108，70-136和74-138之間的二硫鍵)和l個單體間二硫鍵(在SEQIDNO:2中為半胱氨酸殘基72-72之間的二硫鍵，而在SEQIDNO:4和9中為半胱氨酸殘基107-107之間的二硫鍵)，它們與延伸的j3鏈區(qū)域一起構成了TGF-P超家族保守的結構基元，例見Daopin等，蛋白質，1993，17，176-192。根據(jù)此序列對比，表明neublastin是神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF亞族的成員(LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC,表3中下劃線的GDNF亞族指紋)。計算neublastin與GDNF家族其它成員的同源性，結果示于下表4。表4:neublastin多肽與GDNF家族其它成員的同源性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>GDNF=得自膠質細胞系的神經(jīng)營養(yǎng)因子NTN=NeurturinPSP=PersephinIHA=抑制素-aTF-P2=轉化生長因子-卩2強同源性表明下列"強(strong)"組之一是保守的STA，NEQK，NHQK,NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，F(xiàn)YW。實施例5:生產(chǎn)neublastin如下文所述，我們在真核和原核細胞中生產(chǎn)出neublastin。表達載體將編碼neublastin的全長cDNA插入真核表達載體pUbilZ。該載體是通過將人UbC啟動子克隆至pcDNA3.1/Zeo的經(jīng)修飾形式而產(chǎn)生的。未經(jīng)修飾的pcDNA3.1/Zeo可以商購(Invitrogen)。經(jīng)修飾的pcDNA3.1/Zeo比原始載體小，因為除去了氨千青霉素基因(第3933至5015位)和第2838至3134位的序列。在pcDNA3.1/Zeo的經(jīng)修飾形式中，CMV啟動子被得自pTEJ-8的UbC啟動子(Johansen等，F(xiàn)EBSLett,1990，267，289-294)取代，產(chǎn)生pUbilZ。哺乳動物細胞表達然后用含有neublastin編碼序列的pUbilZ載體轉染哺乳動物細胞系HiB5，該細胞系是無限增殖化的大鼠神經(jīng)細胞系(Renfranz等，細胞，1991，66，713-729)。已建立了幾抹能穩(wěn)定表達neublastin(通過RT-PCR測定)的HiB5細胞系。在一個這樣的穩(wěn)定細胞系中，通過在Northern印跡上使總RNA與"P-標記的neublastin探針雜交，證實了HiB5pUbilzNBN22的表達。這些研究的結果示于圖2。然后將HiB5pUbilzNBN22用作neublastin的來源以研究neublastin的神經(jīng)營養(yǎng)活性。圖2顯示了HiB5pUbilzNBN22克隆中的neublastincDNA表達(即按上文所述用本發(fā)明的"P-標記的neublastincDNA與Northern印跡雜交)。通過分別從未經(jīng)轉染的HiB5細胞，HiB5pUbilzNBN22細胞和HiB5pUbilzGDNF14中提取總RNA來制備印跡。如印跡上所示，28S和18SrRNA帶的位置分別相當于4.1kb和1.9kb。如圖3所示，針對neublastin-書f生多肽產(chǎn)生的抗體還識別HiB5pUbilzNBN22克隆而不是未經(jīng)轉染的HiB5細胞的條件培養(yǎng)基中約13kD的蛋白質(參見實施例6)。經(jīng)測定，未經(jīng)修飾(即未經(jīng)翻譯后修飾)的neublastin多肽NBN140[SEQIDNO:IO，NBN116[SEQIDNO:ll和NBN113[SEQIDNO:12的推測分子量分別為14.7kD,12.4kD和12.1kD。方法在0.8%甲醛瓊脂糖凝膠上電泳得自未經(jīng)轉染的HiB5細胞和HiB5pUbilzNBN22克隆的總RNA(10[ig)，將其印跡至尼龍膜(Duralone，Stratagene)上，從而制備出Northern印跡。按實施例3所述，使印跡與1.3kb^P-標記的探針雜交并洗滌，所述探針是通過隨機標記覆蓋SEQIDNO:8和得自neublastincDNA之5，UTR和3，UTR的另一些核苷酸而制備的。于-80t:，使用增感屏將印跡暴露于HyperfilmMP(Amersham)。在添加有N2補充物(LifeTechnologies;Cat.No.17502-048)的無血清培養(yǎng)基中將得自HiB5pUbilzNBN22或未經(jīng)轉染的HiB5細胞的條件培養(yǎng)基保溫過夜，濃縮該條件培養(yǎng)基，在15%聚丙烯酰胺凝膠(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.80-1262-01)上進行分離。將蛋白質轉移至PVDF-膜(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.RPN-303F)上，用含有0.1°/。吐溫20和5%脫脂奶的PBS封閉非-特異性蛋白質-結合位點。將膜與多克隆的neublastin抗體(l:1000)保溫過夜，接著與抗-兔IgG第二抗體(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.NA934)(l:2000)保溫，所述第二抗體上綴合有辣根過氧化物酶。根據(jù)廠商說明(Amersham),使用增強的化學發(fā)光(ECL)(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.RPN2109)或ECL+(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.RPN2132)觀察免疫染色。這些實驗的結果示于圖3。圖3A和3B顯示了經(jīng)轉染的HiB5細胞中的neublastin蛋白表達。按上文所述濃縮得自未經(jīng)轉染的HiB5細胞泳道II,或被neublastincDNA穩(wěn)定轉染的HiB5克隆[泳道2的過夜培養(yǎng)基。然后使用實施例10中所述的兩個特異于neublastin的不同多克隆抗體Ab-l和Ab-2，經(jīng)Western印跡分析培養(yǎng)基。在源自經(jīng)轉染細胞的培養(yǎng)基中，這兩種抗體都能識別分子量約為15kDa的蛋白質，而在未經(jīng)轉染的HiB5細胞中未發(fā)現(xiàn)這種蛋白質。也可將編碼neublastin的克隆cDNA插入其它真核表達載體，例如真核表達栽體TEJ-8(Johansen等，F(xiàn)EBSLett.19卯，267，289-294)或pcDNA-3(Invitrogen),將所得表達質粒轉染至下述任一種哺乳動物細胞系，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，HEK293,COS,PC12或RN33b細胞系或人神經(jīng)干細胞系。使用表達neublastin的穩(wěn)定細胞系產(chǎn)生neublastin蛋白。在CHO細胞中表達構建質粒pJC070.14為了在中國倉鼠卵巢細胞中表達NeublastincDNA，將編碼人前Neublastin原形式的cDNA片段插入哺乳動物表達載體pEAG347以產(chǎn)生質粒pJC070.14。pEAG347含有串聯(lián)的SV40早期和腺病毒主要晚期啟動子(衍生自質粒pAD2p;Norton和Coffin，分子細胞生物學，1985,5,281),唯一的Notl克隆位點，緊接著的是SV40晚期轉錄終止子和polyA信號(得自質粒pCMVp;MacGregor和Caskey，核酸研究，1989，17，2365)。另外，pEAG347含有源自pUC19的質粒骨架和源自pSV2dhfr的dhfr供MTX選擇和在經(jīng)轉染的CHO細胞中擴增。分兩步產(chǎn)生質粒pJC070.14。首先，用寡核苷酸KD2-8245，AAGGAAAAAAGCGGCCGCCATGGAACTTGGACTTGGAGG3，[SEQIDNO:31，KD2-8255，TTTTTTCCTTGGCGGCCGCTCAGCCCAGGCAGCCGCAGG3，[SEQIDNO:32和PFU聚合酶，經(jīng)聚合酶鏈反應從質粒pUbilZ-NBN中分離出編碼人前Neublastin原形式的片段。將該片段克隆至pPCR-ScriptAmpSK(+)的Srf-l位點以產(chǎn)生質粒pJC069。在第二步中，對質粒pJC069進行部分Not-I消化，產(chǎn)生685bp片段(含有neublastin基因)，將其克隆至質粒pEAG347的Not-I位點,產(chǎn)生質粒pJC070.14。質粒pJC070.14中的neublastin基因轉錄受腺病毒主要晚期啟動子的控制。產(chǎn)生表達neublastin的CHO細胞系通過用限制性內切核酸酶Mlu-I消化使200微克pJC070.14線性化。用笨盼:氯仿:異戊醇(25:24:1)提取DNA,并用乙醇沉淀。將線性化的DNA重新懸浮于20mMHepespH7.05，137mMNaCl，5mMKC1，0.7mMNa2HP04，6mM葡萄糖(HEBS)中，通過電穿孔(280V和960pF)導入4E7CHOdukxBl(dhfr)細胞(p23)。電穿孔之后，將細胞返回添加有100/。胎牛血清(FBS)的a十經(jīng)改良的Eagle氏培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)2天。然后用胰蛋白酶消化細胞，重新鋪于100mm平亞(IOO，OOO個細胞/m)內的a-MEM(缺乏核糖和脫氧核糖核苷)中培養(yǎng)5天，所述培養(yǎng)基中添加有10%經(jīng)透析的FBS。隨后，以100,000個細胞/100mm平皿的密度使細胞分開，并在200nM氨甲蝶呤中選擇。挑選抗性集落，刮至6孔培養(yǎng)板；使用下文所述的專用于neublastin的試驗篩選得自各個克隆的條件培養(yǎng)基。將neublastin表達水平最高的12個克隆刮至T162培養(yǎng)瓶中，隨后再進行分析。如圖10所示，CHO細胞系產(chǎn)生25至50ng/mlneublastin。neublastin的三元復合物試驗我們使用Sanicola等(ProcNatlAcadSciUSA1997946238)所述的三元復合物試驗的經(jīng)改良形式分析CHO細胞系培養(yǎng)物的上清液中是否存在neublastin。在此試驗中，可評價GDNF-樣分子介導RET之胞外結構域與多個共同-受體，GFRal,GFRa2和GFRa3之間的結合的能力。RET的可溶性形式和共同受體以融合蛋白的形式產(chǎn)生。已有人描述了大鼠RET之胞外結構域和胎盤堿性磷酸酶(RET-AP)之間的融合蛋白，以及大鼠GFRal(W09744356;1997年11月27日，列入本文作為參考)的胞外結構域和人IgGl(rGFRal-Ig)之Fc結構域之間的融合蛋白(Sanicola等，ProcNatlAcadSciUSA1997946238)。為了產(chǎn)生鼠GFRct3之胞外結構域和人IgGl(mGFRa3-Ig)之Fc結構域之間的融合蛋白，將編碼鼠RETL3之氨基酸1-359的DNA片段與含有人IgGl之Fc結構域的片段連接，克隆至表達載體pEAG347以產(chǎn)生質粒pGJ144。將質粒pGJ144轉染至中國倉鼠卵巢細胞(CHO),產(chǎn)生能生產(chǎn)融合蛋白的穩(wěn)定細胞系，使用標準方法在A蛋白S印harose免疫親和柱上純化該融合蛋白。筒而言之，如果GDNF-樣分子能在此試驗中介導共同受體與RET的結合，那么，RET-AP融合蛋白可保留在平板上，使用堿性磷酸酶的化學發(fā)光底物可測定保留量。用含有l(wèi)ug/ml特異于人Fc的山羊抗體的50mM碳酸氫鹽/碳酸鹽，pH9,6將DynexMicrolite國lELISA板(DynexTechnologies)包被16小時。將ELISA板清空，加入300fU含有1%I-block(Tropix)的TBS/0.5%吐溫-20(TBST)放置1小時。用TBST洗滌3次之后，在孔中加入10(^1用條件培養(yǎng)基稀釋過的lpg/mlrGFRal-Ig或mGFRa3-Ig,所迷條件培養(yǎng)基得自表達RET-AP融合基因的293EBNA細胞。然后在豎行孔的上孔中加入100nl得自CHOneublastin克隆的條件培養(yǎng)基，每排孔往下進行2倍連續(xù)稀釋，室溫下保溫1.5小時。然后用TBST將ELISA板洗滌3次，用200mMTrispH9.8，10mMMgCl2(CSPD緩沖液)洗滌2次。然后用含有425nMCSPD(Tropix)和lmg/mlSapphire化學發(fā)光增強劑(Tropix)的CSPD緩沖液替代洗滌溶液，室溫下保溫30分鐘。使用Dynatech發(fā)光計測定化學發(fā)光輸出量。在最初的實驗中，我們研究了CHO細胞系所產(chǎn)生的neublastin是否能介導GFRal或GFRa3與RET之胞外結構域的結合。如圖11所示，當包括mGFRa3-Ig融合蛋白時，得自CHO細胞克隆#53的條件培養(yǎng)基在三元復合物試驗中產(chǎn)生了強烈信號，但是，當包括rGFRal-Ig融合蛋白時未觀察到信號，這表明neublastin與GFRa3而不是GFRal結合。這一行為將neublastin與GDNF清楚地區(qū)分開來；如圖11所示，GDNF結合GFRal而不是GFRa3。當檢測得自胎盤CHO細胞系的條件培養(yǎng)基或純粹的培養(yǎng)基時，用任一種共同受體融合蛋白都未觀察到信號。為了定量CHO細胞系中的neublastin表達水平，使用rGFRal-Ig和濃度始于lng/ml的GDNF繪制標準曲線。然后使用該標準曲線計算不同CHO細胞系的neublastin濃度；由5個CHO細胞系產(chǎn)生的水平示于圖10。由于這一估計的根據(jù)是未經(jīng)測試的假設，即GDNF和GFRal之間的結合親和性類似于neublastin和GFRa3之間的結合親和性，因此這些水平僅是大致的數(shù)值。分析得自CHO細胞系上清液的neublastin為了進一步分析由CHO細胞系產(chǎn)生的neublastin,使用GFRa3-Ig融合蛋白從培養(yǎng)基中提取蛋白質，并通過用針對neublastin肽的多克隆抗體進行Western印跡以分析這些蛋白質。在第一個實驗中，用結合于Sepharose珠上的mGFRa3-Ig提取neublastin。使用廠商(Pharmacia公司)建議的條件使mGFRct3-Ig與Sepharose珠結合。在1.0ml得自陰性對照CHO細胞系或得自生產(chǎn)neublastin的CHO細胞系#16的條件培養(yǎng)基樣品中加入lOOplmGFRcc3-Ig-Sepharose。在搖動的平臺上將懸浮液保溫2小時。離心各懸浮液，除去上清液，然后用1.0ml10mMHEPES，lOOmMNaCl，pH7.5洗滌3次。將各樹脂重新懸浮于lOOpl2x還原樣品緩沖液中，加熱至100t:達5分鐘。將20nl樣品緩沖液上清液和10pl分子量標準(FMC)上樣于10-20%SDS-PAGE預制凝膠(OwlScientific)的各孔中。以40mA的恒電流電泳凝膠72分鐘。為了進行Western印跡分析，在HoferScientific裝置中，在10mMCAPS,10%甲醇，0.05%SDS，pH11.2的緩沖液系統(tǒng)內將蛋白質電印跡至硝酸纖維素濾膜(Schleicher和Schuell)(400mA恒電流，45分鐘)。轉移之后，從盒中取出硝酸纖維素濾膜，通過用含有0.1%PonceauS的1%醋酸溶液染色60秒以用肉眼觀察分子量標記。將膜切成兩節(jié)，通過在蒸餾水中輕輕攪動以除去過量的染料。4K,用含有2%脫脂奶的TBS將膜封閉過夜。將兩片膜各與兩個經(jīng)親和純化的抗-neublastin肽抗體(R30和R31)保溫，所述抗體的濃度為1.(Hig/ml，并且溶于含2%脫脂奶的TBS中。用TBS-吐溫將膜洗滌3次，每次10分鐘，然后與經(jīng)1:5000稀釋的山羊抗-兔IgG-HRP綴合物(Biorad)保溫30分鐘。用TBS-吐溫將膜洗滌3次，每次IO分鐘，用ECL底物(Amersham)顯色。如圖12所示，相對于用上述兩種抗體在提取自陰性對照細胞系的蛋白質中所觀察到的帶(泳道1和3)而言，在提取自生產(chǎn)neublastin的CHO細胞系的蛋白質中檢測到特異性的帶(泳道2和4)。較低的帶的分子量約為13kD，可能表示neublastin的成熟結構域，該結構域是在裂解原-結構域之后產(chǎn)生的。所述裂解可以在前neublastin原蛋白的3個Arg-—(如-RXXR;-)殘基中的任一個之后發(fā)生，從而分別產(chǎn)生SEQIDNO:IO，11或12所示的140AA,116AA或113AA形式。經(jīng)測定，未經(jīng)修飾(即未經(jīng)翻譯后修飾)的neublastin多肽NB固O[SEQIDNO:IO，NBN116[SEQIDNO:ll和NBN113[SEQIDNO:12的推測分子量分別為14.7kD，12.4kD和12.1kD。需要進一步的分析以證實這些帶的結構以及其它neublastin特異性帶。在第二個實驗中，用ELISA板所捕獲的hGFRcc3-Ig提取neublastin.為了產(chǎn)生人GFRa3(W097/44356;1997年11月27日，列入本文作為參考)的胞外結構域和人IgGl(hGFRa3-Ig)之Fc結構域之間的融合蛋白，將編碼人GFRct3之氨基酸1-364的DNA片段與含有人IgGl之Fc結構域的片段連接，克隆至表達載體CH269(Sanicola等，ProcNatlAcadSciUSA1997946238)。由此質粒編碼的融合蛋白在293-Epstein-Barr病毒所編碼的核抗原(EBNA)細胞中瞬時表達，使用標準方法在A蛋白S印harose免疫親和柱上純化該融合蛋白。4X:,用含有25mg/ml山羊抗人IgG(Fcy片段特異性的；JacksonImmunulogics)的PBS(300ml/孔)將96孔培養(yǎng)板的6個孔包被過夜。室溫下，用400ml含1%BSA的PBS將孔封閉1小時。用PBST(PBS+0.05。/o吐溫20)洗滌3次，在每孔中加入300mlhGFRa3-Ig(10mg/ml，溶于含0.1%BSA的PBS中)。室溫下將培養(yǎng)板保溫1小時，輕輕振蕩(每分鐘振蕩200下)以進行最大程度的結合。然后清空孔，用PBST再洗滌3次。在3個孔中各自加入250ml得自陰性對照CHO細胞系或得自生產(chǎn)neublastin的CHO細胞系#25的條件培養(yǎng)基。室溫下將培養(yǎng)板保溫3小時，輕輕振蕩(每分鐘振蕩300下)，用PBST將孔再洗滌2次。在第一個孔中加入25ml非-還原性的Laemli上樣緩沖液，將培養(yǎng)板快速振蕩5分鐘以洗脫結合的蛋白質(每分鐘振蕩1300下)。將內容物轉移至下一個孔中，重復上述方法以洗脫第二和第三個孔中結合的蛋白質。加入b-巰基乙醇(終濃度為5%)之后，將樣品煮沸5分鐘，在10-20%聚丙蟑酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分析樣品。為了進行Western印跡，將蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜上。用含有5%脫脂奶的PBST封閉和探測膜，并用PBST洗滌膜。與針對兩個neublastin肽產(chǎn)生的多克隆抗體(R30和R31)(lug/ml)反應，接著與HRP-綴合的山羊抗兔抗體(BioRad)反應之后，通過電化學發(fā)光檢測neublastin。如圖13所示，在提取自生產(chǎn)neublastin的CHO細胞系的蛋白質中檢測到5條neublastin特異性帶(泳道2)。較下方的兩條帶與在圖12中所觀察到的帶非常相似；較下方的帶可能也表示neublastin的成熟結構域，該結構域是在裂解原-結構域之后產(chǎn)生的。隨后，對圖13中的帶進行分析(數(shù)據(jù)未顯示)，結果表明用PGNaseF使約為18kD的帶去糖基化后，該帶的大小等同于圖13凝膠中最下方的那條帶。這表明哺乳動物細胞中可產(chǎn)生糖基化形式的neublastin蛋白。在大腸桿菌中表達neublastin為了在大腸桿菌中表達neublastin基因，用較低的GC含量和偏好的大腸桿菌密碼子構建合成基因。將合成基因克隆至兩個載體pET19b和pMJB164(pET19b的衍生物)。pET19b的構建示于圖14。在此構建體中，編碼neublastin之成熟結構域(NBN113)的序列直接與起始甲硫氨酸融合。pMJB164的構建示于圖15。在此構建體中，neublastin的成熟結構域與被腸激酶裂解位點分開的組氨酸標記(即10個組氨酸)融合。組氨酸標記的前面是起始甲硫氨酸。編碼圖14中的neublastin的核苷酸序列TCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGII出GTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCACGTTC丁CCGCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG[SEQIDNO:29〗編碼圖15中的his-標記的neublastin的核苷酸序列ACGACGACAAGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGGAGGAGCACGTCGTTCCGACGMCTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG[SEQIDNO:30]實施例6:neublastin對大鼠胚胎多巴胺能神經(jīng)元的存活和ChAT活性的影響在此實驗系列中，評估了得自上文所述的生產(chǎn)neublastin的HiB5pUbilzNBN22細胞的條件培養(yǎng)基所發(fā)揮的作用。制備培養(yǎng)物:在冷的Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)中，解剖得到大鼠E14胚胎的前側中腦或脊髓。于37C在含有經(jīng)無菌過濾的0.1%胰蛋白酶(Worthington)和0.05%DNA酶(Sigma)的HBSS中將組織塊保溫20分鐘。然后用HBSS+0.05%DNA酶將組織塊沖洗4次，使用lml自動移液管解離。將懸浮液以600rpm離心5分鐘，將沉淀物重新懸浮于血清條件培養(yǎng)基(SCM;含10%胎牛血清的DMEM)中。通過臺盼藍染料排除法評估細胞總數(shù)，以100,000個細胞/cm2的密度鋪于用聚-L-賴氨酸包被的8孔槽載玻片(Nunc)上，評估多巴胺能神經(jīng)元的存活；或者以200,000個細胞/112的密度鋪于48孔培養(yǎng)板(Nunc)上以測定ChAT活性。于37"C,在SCM中，在5%C02/95%02和95%濕度的氛圍下將細胞保溫24至48小時，然后用添加有神經(jīng)營養(yǎng)因子的無血清培養(yǎng)基(SFM)更換原培養(yǎng)基。將評估多巴胺能神經(jīng)元存活所用的細胞在SFM+營養(yǎng)因子中放置5天，然后用4%PFA固定5分鐘，通過免疫組化染色酪氨酸羥化酶。將測定ChAT活性的細胞在SFM中放置3天，然后用HBSS+0.1%TritonX-lOO裂解，立即在干水中冷凍直至測定ChAT活性。加入營養(yǎng)因子由未經(jīng)轉染的HiB5對照或生產(chǎn)neublastin(HiB5pUbilzNBN22)或GDNF(HiB5pUbilzGDNF畫L17)的HiB5收集條件培養(yǎng)基。通過對收集自細胞的條件培養(yǎng)基進行GDNF-ELISA測定，證實HiB5pUbilzNBN22產(chǎn)生約20ng的GDNF/24小時/105個細胞。將各個細胞系與DMEM+1%FCS保溫過夜，取出上清液，儲存于-20r待用。當加入細胞中時，用SFM將上清液稀釋50倍。用扭85對照上清液(1:50)+純化的重組大鼠GDNF(0.03-10ng/ml)處理各個孔。這些實驗的結果示于圖4。如上文實施例5.1所述，圖4A-4C顯示出HiB5pUbilzNBN22細胞分泌的neublastin在無血清培養(yǎng)基中對經(jīng)培養(yǎng)的大鼠胚胎神經(jīng)元，多巴胺能神經(jīng)元，前側中腦神經(jīng)元存活的影響和對膽堿能顱神經(jīng)運動神經(jīng)元中的ChAT活性的影響。圖4A闡明了重組GDNF對ChAT活性(dpm/小時)之影響的劑量-反應曲線，所述活性是于DIV5在無血清培養(yǎng)物中測定的，所述培養(yǎng)物最初是由E14前側中腦建立的[即HiB5;GDNF0.03ng/ml;GDNFO.lng/ml;GDNF0.3ng/ml;GDNFlng/ml;GDNF10ng/ml;GDNF100ng/ml。圖4B闡明了于DIV5在無血清培養(yǎng)物中測定的ChAT活性(dpm/小時)，所述培養(yǎng)物最初是由E14前側中腦建立的。如圖中所示，加入了經(jīng)稀釋的得自生產(chǎn)neublastin的HiB5pUbilzNBN22細胞(neublastin)或生產(chǎn)GDNF的HiB5GDNF-L17(GDNFL-17)細胞的條件培養(yǎng)基[即neublastin1:10;neublastin1:50;GDNFL-171:50。圖4C闡明了于DIV7在無血清培養(yǎng)物中測定的每孔中的酪氨酸羥化酶免疫反應細胞的數(shù)目[TH+細胞數(shù)目/孔，所述培養(yǎng)物最初是由E14前側中腦建立的。如圖中所示，加入了經(jīng)稀釋的得自未經(jīng)轉染的HiB5條件培養(yǎng)基，或多種濃度的重組GDNF[即HiB51:10;HiB51:40;GDNFO.lng/ml;GDNFlOng/ml;GDNF100ng/ml和neublastin1:40。與相同和較低稀釋度(I:IO和l:40)的對照(未經(jīng)轉染的)HiB5細胞相比，按1:40稀釋的得自經(jīng)neublastin轉染的HiB5細胞的條件培養(yǎng)基能顯著增加每孔中的TH免疫反應細胞數(shù)目(例見圖4B)。TH-免疫反應細胞的增加與GDNF濃度最大(10ng/ml)時觀察到的增加差不多。這表明分泌至培養(yǎng)基中的neublastin對得自大鼠胚胎前側中腦的多巴胺能神經(jīng)元群體的存活有影響。相反，與經(jīng)轉染的HiB5細胞分泌的GDNF不同的是，得自經(jīng)neublastin轉染的HiB5細胞的條件培養(yǎng)基對相同培養(yǎng)物中的另一個神經(jīng)元群體，即膽堿能神經(jīng)元沒有影響(例見圖4A)。實施例7:neublastin對豬胚胎多巴胺能前側中腦神經(jīng)元的薄切片培養(yǎng)物存活的影響在此實驗中，研究了共培養(yǎng)的生產(chǎn)neublastin的HiB5pUbilzNBN22細胞對豬胚胎前側中腦之薄切片培養(yǎng)物的影響。制備培養(yǎng)物:在無菌條件下由豬胚胎(E28;n-12)分離前側中腦(VM),切成400pm的薄切片，置于冷的含葡萄糖(6.5mg/ml)的Gey氏平衡鹽溶液(GIBCO)。通過界面培養(yǎng)法培養(yǎng)組織切片，所述方法最初是由Stoppini等[L.Stoppini，P.A.Buchs，D.Muller，神經(jīng)矛+學方法雜志,1991，37，173-182發(fā)展起來的。簡單地說，將組織切片置于半透膜(MilHpore，0.3jim;對應于一個VM，每張膜上放8個切片)上，將膜插入6孔板(Costar)中的含血清培養(yǎng)基(GibcoBRL)中。每孔含有l(wèi)ml培養(yǎng)基(50%Optimem，25%馬血清,25%Hank氏平衡鹽溶液(都得自GIBCO)),其中添加有終濃度為25mM的D-葡萄糖。第0天，在每個組織切片上接種7000個經(jīng)轉染的ffiBSpUbilzNBN22(neublastin)或7000個未經(jīng)轉染的HiB5細胞(對照)。首先在33C的溫箱中共培養(yǎng)48小時，使得因具有溫度敏感型癌基因而無限增殖化的HiB5細胞得以增殖，然后轉移至37X:的溫箱使HiB5細胞分化。每周換2次培養(yǎng)基。在任何階段都不使用抗有絲分裂劑和抗生素。通過HPLC測定多巴胺:在體外第12和21天，收集培養(yǎng)基，使用具有電化學檢測的HPLC分析多巴胺(W.N.Slooth，J.B.P.Gramsbergen，神經(jīng)矛+學方法雜志，1995，60，141-49)。組織處理和免疫組化:在第21天，在含4%低聚甲搭的磷酸鹽緩沖液中將培養(yǎng)物固定60分鐘。在20%蔗糖溶液中脫水24小時，冷凍，在低溫恒溫器上切下20pm的切片(4個系列)，將切片置于包被有明膠的顯微鏡載玻片上。對一個切片系列中的酪氨酸羥化酶(TH)進行免疫染色。簡單地說，用含有1%TritonX-100的0.05MTris-緩沖鹽水(TBS，pH7.4)將切片洗滌3x15分鐘，并與含有10。/。胎牛血清(FBS，LifeTedmologies)的TBS保溫30分鐘。然后于4"C將組織與用含10%FBS的TBS稀釋600倍的小鼠抗TH單克隆抗體(BoehringerMannheim)保溫24小時。用含1%TritonX-100的TBS洗滌3x15分鐘之后，將切片與用含10%FBS的TBS稀釋200倍的生物素化抗小鼠IgG抗體(Amersham)保溫60分鐘。然后用含1%TritonX-100的TBS洗滌切片(3xl5分鐘)，并與用含10%FBS的TBS稀釋200倍的鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(Dako)保溫60分鐘。用TBS洗滌(3xl5分鐘)之后，通過用含有0.05%3，3-二氨基聯(lián)笨胺(Sigma)和0.01%H202的TBS處理以觀察結合的抗體。最后，用乙醇使切片脫水，用二甲笨清洗切片，并在Eukitt中覆蓋封套。細胞計數(shù)和形態(tài)測量分析:使用亮視野顯微鏡(Olympus)對免疫反應性的TH-ir神經(jīng)元進行定量測定。僅計數(shù)顯示出強染色的，且細胞結構保持完好，細胞核清晰可辨的細胞。使用x20倍的物鏡對每4個培養(yǎng)物切片進行細胞計數(shù)，以此為基礎進行估計。根據(jù)Abercrombie，s公式(M.Abercrombie，Anat.Rec.194694239-47),使用TH畫ir神經(jīng)元的核平均直徑(6.6士0.2nm，n-30)校正兩次計數(shù)的細胞數(shù)目。使用神經(jīng)元示蹤系統(tǒng)(Neurolucida，Micro-BrightField公司)估計核的大小。這些實驗的結果示于圖5。圖5A-5C闡明了HiB5pUbilzNBN22細胞分泌的neublastin對與HiB5pUbilzNBN22細胞(neublastin)或HiB5細胞(對照)共培養(yǎng)的豬胚胎多巴胺能前側中腦神經(jīng)元之切片培養(yǎng)物的功能和存活的影響。圖5A和圖5B分別闡明了于DIV1多巴胺(pmol/ml)-第12天和DIV21[多巴胺(pmol/ml)-第21天釋放至培養(yǎng)基中的多巴胺。圖5C闡明了于DIV21,每個切片培養(yǎng)物中的酪氨酸羥化酶免疫反應細胞的數(shù)目[TH-ir細胞/培養(yǎng)物。在第12天，HPLC分析表明得自HiB5-neublastin共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基所含有的多巴胺比得自HiB5-C共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的多巴胺多84%(圖5A)。在第21天，差異是78%(圖5B)，細胞計數(shù)表明HiB5-neublastin共培養(yǎng)物含有的酪氨酸羥化酶免疫反應神經(jīng)元比HiB5-C共培養(yǎng)物的多66。/。(p〈0.05)(圖5C)。這表明HiB5pUbilzNBN22克隆分泌的neublastin對豬胚胎多巴胺能神經(jīng)元的存活具有潛在的影響。實施例8:無血清培養(yǎng)基中側根神經(jīng)節(jié)細胞的存活本實施例顯示出neublastin多肽與已知神經(jīng)營養(yǎng)因子相比較的神經(jīng)營養(yǎng)活性。通過頸脫位處死懷孕的雌性小鼠，按下述處理胚胎以進行培養(yǎng)。使用經(jīng)電解削尖的鵪針頭，由所示階段的C57/B16小鼠(MollegaardBreeding,Denmark)解剖得到側根神經(jīng)節(jié)。于37C將胚胎神經(jīng)節(jié)與含有0.05%胰蛋白酶(Gibco/BRL)的無鉤和鎂的Hanks平衡鹽溶液保溫5分鐘。用膠原酶/分散酶(lmg/ml)將神經(jīng)節(jié)處理30至45分鐘，然后用胰蛋白酶/DNA酶(0.25Q/。)處理15分鐘。除去胰蛋白酶溶液之后，用10ml含有10%熱滅活馬血清的DMEM將神經(jīng)節(jié)洗滌1次，用經(jīng)燒邊處理的Pasteur移液管將神經(jīng)節(jié)輕輕揭碎以得到單細胞懸浮液。將細胞鋪于預先用聚鳥氨酸(0.5mg/ml，過夜)和層粘連蛋白(20mg/ml，4小時；Gibco/BRL)包被的24孔培養(yǎng)板(Nunc)上，于37°C,在潮濕的5%C02溫箱內的確定培養(yǎng)基中保溫神經(jīng)元，所述培養(yǎng)基由添加有2mM谷氨跣胺，0.35%牛血清白蛋白，60ng/ml孕酮，16mg/ml腐胺，400ng/mlL-甲狀腺素，38ng/ml硒酸鈉，340ng/ml三碘代-甲狀腺原氨酸，60mg/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的HamsF14組成。保溫48小時之后，在相差光學顯微鏡下，因神經(jīng)元的兩極形態(tài)而能清楚地識別該神經(jīng)元。通過在第48小時時計數(shù)孔中的神經(jīng)元來評估神經(jīng)元在缺乏或存在營養(yǎng)因子(在接種神經(jīng)元之前加入培養(yǎng)基中，濃度為10ng/ml)時的存活百分比，或在得自生產(chǎn)neublastin的HiB5pUbilzNBN22細胞的條件培養(yǎng)基中的存活百分比。這些實驗的結果示于圖9，其中O表示對照實驗(缺乏營養(yǎng)因子)；1表示存在GDNF時的實驗；2表示存在Neurturin時的實驗；3表示存在本發(fā)明的Neublastin時的實驗；E12表示對分離自12天-胚胎的DRG細胞所進行實驗的數(shù)據(jù)；E16表示對分離自16天-胚胎的DRG細胞所進行實驗的數(shù)據(jù)；P0表示對分離自出生當天的DRG細胞所進行實驗的數(shù)據(jù)；P7表示對分離自出生后7天的DRG細胞所進行實驗的數(shù)據(jù)；和P15表示對分離自出生后15天的DRG細胞所進行實驗的數(shù)據(jù)。這些結果清楚地表明本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)因子顯示出相當于或甚至優(yōu)于已知神經(jīng)營養(yǎng)因子的活性。實施例9:neublastin對黑質多巴胺神經(jīng)元的體內影響為了檢測neublastin是否能夠保護成熟黑質多巴胺(DA)神經(jīng)元免受6-羥基多巴胺誘導的降解，我們利用了患帕金森氏病的大鼠模型(Sauer和Oertel，神經(jīng)科學，1994，59，401-415)以及neublastin的慢病毒基因轉移。慢病毒的產(chǎn)生:為了產(chǎn)生編碼neublastin的慢病毒轉移栽體pHR，-neublastin,將得自neublastincDNA的1331bpBamHI片斷亞克隆至pSL301(Invitrogen)的BamHI/Bglll位點。從此構建體上切下1519bp的BamHI/Xho1片斷，連接至pHR，的BamHI/XhoI位點，所述pHR，攜有土撥鼠肝炎病毒翻譯后片斷(ZuffereyR，DonelloJE，TronoD，HopeTJ:土撥鼠肝炎病毒轉錄后的調節(jié)元件能增強由逆轉錄病毒載體傳遞的轉基因的表達；病毒學雜志，199973(4):2886-2892)。為了產(chǎn)生pHR-GDNF，將得自pUbilz-GDNF的701bpBamHI/XhoI片斷連接至pHR，的BamHI/XhoI位點。Zufferey等人描述了慢病毒載體的產(chǎn)生(ZuffereyR，NagyD，ManddRJ，NaldiniL，TronoD:多重減毒的慢病毒載體能在體內進行有效的基因傳遞；Nat.Biotechnol，1997，15(9)871-875)。簡單地說，用轉移構建體和輔助質粒pR8.91和pMDG共同轉染293T細胞。在轉染后48和72小時收集釋放至培養(yǎng)基中的毒粒。為了濃縮病毒，以141000g將培養(yǎng)基離心1.5小時，并將沉淀物溶解于DMEM中。通過GFP熒光，測定出283T細胞中的攜有綠色熒光蛋白(GFP)基因的對照的滴度為1()S個轉化單位(TU)/ml。使用RNA狹線印跡技術(vonSchwedlerU，SongJ，AikenC，TronoD:Vif對感染細胞中的人I型免疫缺損病毒原病毒DNA合成至關重要，病毒學雜志，1993，67(8)4945-4955)測定病毒顆粒的滴度。在GDNF上清液和neuWastin上清液中，病毒顆粒比GFP上清液中的少10倍。外科手術方案:所有涉及動物的工作都按照Lund大學實驗室動物使用倫理委員會所制訂的細則執(zhí)行?？偣彩褂?1只剛成年的雌性Sprague-Dawley大鼠(B&KUniversal,Stockholm,Sweden),在12小時光照黑暗周期中圈養(yǎng)這些大鼠，圈養(yǎng)過程中不給大鼠進食和喂水。在損害前3周，根據(jù)Sauer和Oertel(Sauer和Oertel,神經(jīng)科學，1994，59，401-415)所述進行逆行標記和6-OHDA損害。簡單地說，在Equithesin麻醉(0.3ml/100g)下，給大鼠兩側注射0.2^12%逆行示蹤Fluoro-Gold(FG;Fluorochrome公司，Englewood，CO)溶液(溶解于0.9%NaCl中)。使用2^1Hamilton注射器在以下坐標處進行注射AP=+0.5mm;ML-離前囟門士3.4mm;DV-離硬腦膜-5.0mm，切齒線被設置于0.0mm。另外，在抽出針頭之前，以0.05pl/min的速度再注射5分鐘。在FG注射之后14天，動物總共接受5個慢病毒載體沉積物(lp1/沉積物)，所述載體攜有綠色熒光蛋白(GFP)，neublastin或GDNF的基因。在下列坐標處，沿著兩條針道將4個沉積物注射至紋狀體AP-十1.0mm，ML=-2.6mm，DV尸-5.0mm，DV2=-4.5mm和AP=0.0mm，ML=-3.7mm，DV產(chǎn)-5.0mm，DV2=-4.5mm。在AP=-5.2mm，ML=-2.0mm，DV尸-6.3mm處將沉積物注射至黑質上。切齒線被設置于-2.3mm。逆行標記21天之后，和注射慢病毒7天之后，重新麻醉動物，用lOfUHamilton注射器將單個沉積物，即20嗎6-OHDA(Sigma;計算為游離堿基并溶解于3^1冰冷的添加有0.02%抗壞血酸的鹽水中)注射至與FG沉積物位置相同的右紋狀體。注射速率為lnl/min，在抽出針頭之前再保留3分鐘。組織處理:在注射6-OHDA之后21天，用水合氯搭深度麻醉動物，經(jīng)賁門灌流鹽水(pH7.4;室溫)達l分鐘，接著灌流200ml水冷的甲醛溶液(含4%低聚甲醛的O.IM磷酸鹽緩沖液，pH7.4)。解剖取腦，在相同的固定劑中固定3至4小時，然后轉移至25。/。蔗糖/0.1M磷酸鹽緩沖液中放置48小時。在水冷的切片機上切下穿過紋狀體和黑質(SN)的5個40nm切片系列。定量評估SN中的多巴胺能神經(jīng)元:如前人所述(Sauer和Oertel，神經(jīng)科學，1994，59，401-415),通過不透光的觀察儀評估SN雙致密層中經(jīng)FG標記的神經(jīng)元數(shù)目。簡單地說，使用了3個連串切片，這些切片集中于輔助視束的中間末端核水平線周圍(MTN;Paxinos和Watson(1997)圖片-5.3)，以40倍的放大倍數(shù)計數(shù)MTN側向的所有經(jīng)標記/染色的神經(jīng)元(11=6-7/組)。如果FG-標記的神經(jīng)元在波長為330nm的表面照射下能發(fā)出明亮的熒光，顯示出神經(jīng)元分布圖并延伸至少一個神經(jīng)過程，即將這些神經(jīng)元包括在內。在接受攜有GFP之慢病毒注射的動物的受損害的一側，F(xiàn)G-陽性黑質神經(jīng)元的數(shù)目降低為完好的一側的18%。相反，用慢病毒-neublastin注射的動物顯示出對FG-陽性黑質神經(jīng)元數(shù)目近乎完全的保護(89%)。這與用慢病毒-GDNF處理的動物同樣有效，其中87%逆行標記的神經(jīng)元保留在受損的一側。這表明neublastin對受損的成年黑質多巴胺神經(jīng)元而言是強有力的存活因子，并且象GDNF—樣有效。圖6闡明了慢病毒產(chǎn)生的neublastin對黑質多巴胺神經(jīng)元的體內影響。用Flurogold(FG)逆行標記雌性SpragueDawley大鼠的SN雙致密層中的神經(jīng)元，3周后用6-羥基多巴胺(6-OHDA)單次注射右紋狀體。在注射6-OHDA之前l(fā)周，如圖所示，使動物接受表達neublastin[neublastin],GDNF[GDNF或綠色熒光蛋白[GFP]的慢病毒載體注射。注射6-OHDA21天之后，測定紋狀體兩側經(jīng)FG標記的神經(jīng)元數(shù)目。圖中顯示出3組動物紋狀體的損害(右)側對完好(左)側中經(jīng)FG標記的神經(jīng)元的百分比[o/。FG損害/完好I。實施例10:產(chǎn)生抗體為了制備抗neublastin的抗體，以3周為間隔，用肽1:CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQIDNO:9的氨基酸108-124)或肽2:ALRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的氨基酸93-107)免疫2只兔子，所述肽與載體蛋白綴合。在第0，3，6和10周用每種肽免疫2只兔子，在第7和11周收集血液。經(jīng)由肽親和柱親和純化第二次采的血液。根據(jù)肽的不同，將抗體稱為Ab-l和Ab-2。Western印跡在含有N2添加物(GIBCO)的無血清培養(yǎng)基中將2xl06個被neublastincDNA穩(wěn)定轉染的HiB5細胞(HiB5pUbilzNBN22)或未經(jīng)轉染的HiB5細胞保溫過夜。在具有5kDa截留膜(Millipore，Bedford,MA)的小濃縮器上濃縮培養(yǎng)基，在濃縮的樣品中加入5xLaemmli樣品緩沖液，加熱至95*C5分鐘，在15%丙烯酰胺凝膠上通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，并轉移至PVDF-膜。用含有5%脫脂奶和0.1%吐溫-20的PBS封閉殘留的蛋白質-結合位點。將膜與neublastin抗體(l:1000)保溫過夜，接著與同辣根過氧化物酶綴合的抗兔或抗小鼠IgG第二抗體(1:2000)保溫。根據(jù)廠商(Amersham)說明，使用增強的化學發(fā)光Plus(ECL+)觀察免疫染色。這些實驗的結果示于圖3和實施例5。使用標準技術，我們還針對下列肽產(chǎn)生了兔多克隆抗體肽R27:GPGSRARAAGARGC(SEQIDNO:9的氨基酸30-43);肽R28:LGHRSDELVRFRFC(SEQIDNO:9的氨基酸57-70);肽R29:CRRARSPHDLSL(SEQIDNO:9的氨基酸74-85);肽R30:LRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的氨基酸94-107);和肽R31:STWRTVDRLSATAC(SEQIDNO:9的氨基酸123-136)。在該組肽中，只有相對靠近于C末端的肽R30和R31才能識別Western印跡上的在還原條件下變性的蛋白質。序列表<160>:3<170>Patent工nVer.2.0<210>1<211>865<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>CDS<222>(120)…(719)<220><221>5'UTR<222>(1)..(119)<220><221>3'UTR<222>(721)..(865)<220><221>sig一敗<222>(120).,(179)<220><221>mat—肽<222>(40i)..(719)<220><221>misc—結構<222>(66lT..(663)<223>CARBOHYB:在Asn87處的糖基化天冬酰胺<220><221>misc一結構<222><426丁..(623)<223>DISULFID-Cys8-Cys73二硫橋<220><221>misc_結構<222>(507丁..(707><223>DISULFID:Cys35-CyslOl二疏橋<220><221>misc一結構<222>(519丁-.(713><223>DISULFID:Cys39-Cys103二硫橋<220><221>misc一結構<222>(616丁-.(619)<223>DISULF工D:Cys72-Cys72鏈間二好u橋<400>1ctaggagcccatgcccggcctgatctcagcccgaggacagcccctccttgaggtccttcc60tccccaagcccacctgggtgccctctttctccctgaggctccacttggtctctccgcgc1193tgcctMetPro一95gccAlactgLieutgg"TrpcccPro—903CCThrctgLeugccAlagetAlactggetIjeuAla—85ctgctgLeuLeuageSer*age一80167gtcgcaValAlaGlugccAlatecSer—75ctgLeuggcGlytecgcgAlacccPro—70cgcageArgSercctgccProAlacccPro—65cgcArg215gaaggcGluGlycccProccgPro一60cctProgtcValctgLeugcgAlatecSer一55cccProgccggcAlaGlycacctgHisIjeu—50ccgProgggGly263ggacgcacggcccgctggtgcagtggaagagcceggeggccgcgccgcGlyArgThrAlaArgTrpCysSerGlyArgAlaArgArgProArgArg一45-40-35311sgeLC3CArgHis一30ttcPhetegSe:rgccAlacgcgccAla-25cccProgccAlagccAlatgca_ccCysThr一20ccc&tcPro工letgcCystct359tecccgegggtccgcgcggcgeggctggggggcegggcagcgcgctegSerProArgValArgAlaAlaArgLeuGlyGlyArgAlaAlaArgSer-15-10-5-l1407ggcagegggggcgcggggtgccgcctgcgctegcagctggtgccggtgGlySerGlyGlyAlaGlyCysArgLeuArgSerGinLeuValProVal51015455cgcgcgArgAlaetc]Leu20ggcGlyctgLeuggcGlycaicHiscgcArg25tecAspgagctgGluLeugtgcgtValArg30ttcPhecgcArg503ttctgcPheCys35accThrggcGlytecSertgcCysccgPro40cgcArgAlacgcArgtctccaSerParo45cacgacHisAspetcLeuageSer551ctggccageetactgggcgccggggccctgcgaccgcccccgggctecLeuAlaSerLeuLeuGlyAlaGlyAlaLeuArgProProProGiySer50556065599eggcccArgProgtcValageGin70cccProtgcCystgccgaCysArgcccPro75acgcgcThrArgtacgaa_TyrGluAla80gtcVal647tecttcSerPhe3tgMetAsp85gtcVal貼cAsnageacctggThrTrp90ArgsecgtgThrValgaccgcAspArg95etctecSer695gccaccgcctgcggctgcctgggctgagggctcgctccagggctttgcagactgAlaThrAlaCysGlyCysLeuGly100105749gacccttaccggtggctcttcctgcctgggaccctcccgcagagtcccactagccsgcgg809cctcagccagggacgaaggcctcaaagctgagaggcccctgccggtgggtgatgga865<210>2<211>200<212>PRT<213>Homo<400>2MetProAla一95sapi6nsLieuValAlaGluAlaTrpPro-90Sear]Leu-75ThrLeuAlaGlySerAlaAlaLeuAlaLeu-85ProArgSerPro—70LeuSerSer—80AlaProArg—65GluGlyProProProVal一60GlyArgThrAla-45ArgHisPheSer-30SerProArgVal-15GlySerGlyGly5ArgAlaLeuGly20PheCysThrGly35LeuAlaSerLeu50ArgProValSerArgTrpAlaArgArgAla-IOAlaGlyLeuGlySerCyslieuGly55GinPro70SerPheMetAspValAsn85AlaThrA3La100CysGlyCysLieuAlaSer-55CysSerGly-40AlaProAla-25AlaArgLieuCysArgLeu10HisArgSer25ProArgAla40AlaGlyAlaCysCysArgSerThrTrp90LeuGly105ProAlaGlyHisLeuProGly—50ArgAlaArgArg-35AlaCysThrPro-20GlyGlyArgAlaArgSerGinLeuAspGluIjeuVal30ArgSerProHis45LeuArgProProProThrArgTyr75ProArgA;rg工leCysSerAlsArgSerProVslPheArgVal15AspProGlyLeuSerSer*65GluAlaVal80ArgThrValAspArgLeuSer95<210>3<211>8^1<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>CDS<222>(7)…(717)<220><221>'5'UTR<222>(1)-.(6)<220><221>3'UTR<222>(718)-(861)<220><221>sig—.肚<222>(7)..(174)<220><221>mat—肽<222>(298)-(717)<220><221>mat一肽<222>(370).-(717)<220><221>mat—肽<222>(37)..(717)<220><221>misc一結構<222>(661).,(663)<223>CARBOHYD:在Asn122處的糖基化天冬就胺<220><221>misc—結構<222>(424亍..(621)<223>D工SULFID:Cys43-Cysl08二疏橋<220><221>misc—結構<222>(505]".,(705)<223>D工SUIjFID:Cys70-Cys136二硫橋<220><221>ndsc一結構<222>(517丁..(711)<223>DISDLFID:Cys74-Cysl38二硫橋<220><221>misc一結構<222>(616)..(618)<223>DISULFID:Cysl07-Cysl07鏈間二硫橋<400>3gagcccatgcccggcctgateteagcccgaggacagcccetccttgag48MetProGlyLeulieSerAlaArgGlyGinProLeuLeuGlu—95—90—85gtcValcttLeucctProcccPro一80ca^GingccAlaescHisctgLeuggtGly一75gccAlaetctttPheetcLeucctPro—70gagGlugetAla96CC3ProcttLeuggtGly—65etcLeutecSerAlaGincctPro—60gccAlactgtggTrpcccProa_ccThr一55ctgLeugccAlagetAla144ctgLeugetAla一50ctgLeuctgSerageSergtcVal—45gcaAlagagGlugccAlatecSe;rctgLeu一40GlytecSe:rgcgAlacccPro192cgcArg一35agecctProgccAlaccccgcArg一30GluGlycccProccgProcctPro—25gtcValctgLeugcgAlateccccPi:o—20240gccggccacctgccggggggacgcacggcccgctggtgcagtggaagaAlaGlyHisLeuProGlyGlyArgThrAlaArgTrpCysSerGlyArg—15-10-5288gccAlaeggArgeggArgccgProccgProccgProca_gGincctP:ro5tcteggArgcccProgcgAlacccPro10ccgProccgProcctPro336AlacccPro15ProtctgetAlacttIjeucccPro20cgcArggggGlyggcGlycgcArgAla25gcgAlaeggArggetAlagggGly384ggcccgggcaaccgcgetegggcagcgggggcgeggggctgccgcctgGlyProGlyAsnArgAlaArgAlaAlaGlyAlaArgGlyCysArgLeu30354045432cgcArgtcgSe;rGinctgVal50ccgProgtgValcgcArggcgAlaetcLeu55ggcGlyctgLeuggcGlyHiscgcArg60tecSer480gacgagctggtgcgtttccgcttctgcageggctectgccgccgcgcgAspGluLeuValArgPheArgPheCysSerGlySerCysArgArgAla657075528cgcArgtctPro80C3CHisgacAspetcLeuagectgLeu85gccAlaageSearCt3LeuctgLeuggcGly90gccAlagggGlygccAla576ctgLeucgaArg95ccgProcccProccgProggcGlytecSer100eggArgcccProgtcValageSerc的Gin105cccProtgcCystgcCysArg624cccPro110ThrcgcArgt5CTyrgasGlugcgAla115gtcValtecSerttcPheatgMetgacAsp120gtcVal站cAsnaccThrtggTrp125672Arga_ccThrgtgValAspcgcArg130etcLeutecSergccAlaAsncccPro135tgcCysggcG^ytgcCysctgLeuggcGly140717tgagggctcgctccagggctttgcagactggacccttaccggtggctcttcctgcctggg777accctcccgcagagtcccactagccagcggcctcagccagggacgaaggcctcaaagctg837agaggcccctgccggtgggtgatg861<210>4.<211>237<212>PUT<213>Homo<鋼>4MetProProPro-80GlyLeu—65Gly一95I<eiilieGinAlaHisSerAlaGinLeuLeuSerProAlaP:roSerVal-45ArgGlu一30HisLeuProGlyGly-15ArgProProProGinProSerAlaGlyAsiiArgLieuPro20AlaArg35GinLeuValProVal50LeuVal65ProHis80ArgAspProProProArgTyrValAspGluArg130PheArgLieuSe:rGlySer綱AlaVal115LeuSerSerAlaArgGlyGinProLeuLeuGluValLeu-90-85LeuGlyAlaLeuPheLeuProGluAlaProLeu-75-70ProAlaLeuTrpProThrLeuAlaAlaLeuAla-60-55-50AlaGluAlaSerLeuGlySerAlaProArgSer-40-35GlyProProProValLeuAlaSerProAlaGly-25，-20ArgThrAlaArgTrpCysSerGlyArgAlaArg-10-5ProSerArgProAlaProProProProAlaPro51015ArgGlyGlyArgAlaAlaArgAlaGlyGlyPro2530AlaAlaGlyAlaArgGlyCysArgLeuArgSer4045ArgAlaLeuGlyLeuGlyHisArgSerAspGlu5560PheCysSerGlySerCysArgArgAlaArgSer7075LeuAlaSerLeuLeuGlyAlaGlyAlaLeuArg859095ArgProValSerGinProCysCysArgProTly:105110SerPheMetAspValAsnSerThrTrpArgThx120125AlaAsnProCysGlyCysLeuGly135140<210><211><212》<213><220><223>140PRTHomosapiens其中134位上的Xaa表示Asn或Thr,135位上的Yaa表示Ala或Pro<400>5ProProSerAlaAsnArgProGinProSer5LeuProArgGly20AlaArgAlaAla35Val65HisArgAspProProTyrAspGluArg130ArgGlyGlyProAlaProProPro10ArgAlaAla25Ala40LeuValProValArgAla50Lieu55ArgIjeuPlieArgPheCys70lieuSerLeuAla85GlySerAxgPro100AlaValSerPhe115GlySerGlySerSe;rLeuLieuValSerGin105GlyGlyCysGly90ProMetAspValAsn120ArgAlaCysArgHisArg60ArgArg75AlaGlyCysCysSerTharProAlaProPro15GlyGlyProGly30LeuArgSerGin45SerAspGluLeiiAlaArgSerPro80AlaLeuArgPro95ArgP:roThrArg110TrpArgThrVal125LeuSerAlaXaaYaaCysGlyCys135LeuGly140<210>6<211>116<212=>PRT<213>Homosapiens<220><223>其中no位上的Xaa表示Asn或This111位上的Yaa表示Ala或Pro<400>6AlaAlaArgAlaGlyGlyGlyAlaAlaAlaGlyAla15ArgGlyCysArg20LieuArgSerGinLeu25ValProValArgAla30LeuGlylieuGlyHis35ArgSerAspGluArgCysSerGlySer65Cys50ArgArgAlaArgGlyAlaGlyCysSerProHisAspLeuSerLeuAlaSerLeu5560AlaLieu70GinProCysArgPro85ValAsnSerThrTrpArg100GlyCysLieuGly115ArgProProProGlySer75ThrArgTyxGluAlaVal90ThrValAspArgLeuSer105ArgProValSer80SerPheMetAsp95AlaXaaYaaCys110<210>7<.211>113<212>PRT<213>Homo<220><223>其中108位上的Yaa表示Ala或Pro<400>7AlaGlyGlyProGlyAsnArgAlaArgAlaAlaGlyAlaArgGlyCys151015ArgLeuArgSerGinLeuValProValArgAlaLeuGlyLeuGlyHis202530ArgSerAspGluLeuValArgPheArgPheCysSerGlySerCysArg354045ArgAlaArgSerProHisAspLeuSerLeuAlaSerLeuLeuGlyAla505560GlyAlaLeuArgProProProGlySerArgProValSerGinProCys65707580CysArgProThrArgTyrGluAlaValSerPheMetAspValAsnSer859095ThrTrpArgThrValAspArgLeuSerAlaXaaYaaCysGlyCysLeu100105110Gly<210>8<211>861<212>DMA<213>Homosapiens<220><221>CDS<222>(58)..(717)<220><221>5"UTR<222>(1)..(57)<220><221>3'UTR<222>(718)—(861)<220><221>sig_肽<222>(58)..(174)<220><221>mat—肽<222>(298)-(*717)<220><221>mat_肽<222>(370)…卩17)<220><221>mat—欣<222>(37;)..(717)<220><221>ndsc一結構<222>(661)…(663)<223>CARBOHYD:在Asn122處的糖基化天冬酰胺<220><221>misc一結構<222>(424)..(621)<223>D工SULF工D:Gly43-Gly108二疏橋<220><221>misc一結構<222>(505)…(705)<223>D工SULF工D:Gly70-Gly136二硫橋<220><221>roisc一結構<222>(517)--(711)<223>D工SULFID:Gly74-Gly138二疏橋<220><221>misc_'結構<222>(616)…(618)<223>DISULFID:Glyl07-Gly107鏈間二硫橋<墨>8aggagggtgggggaacagctcaacaatggctgatgggcgctcctggtgttga仁agag57atggaacttggacttggaggcetctccacgctgtcccactgcccctgg105MetGluLeuGlyLeuGlyGlyLeuSerThrLeuSerHisCysProTrp一80-75—70—65cct的gProArgeggcagArgGincctPro一60gecAlactgLeutggTrpcccPro￡LCCThr一55ctggecAlagetAlactggetLeuAla—50ctgLieu153ctgL<euageagegtcSerVal—45gcaAlagagGlugecAlatecctgLeu—40GlytecgcgAlacccProcgcageArgSer一35一cctPro201gecAlacccProcgcgaaArgGlu一30ggcGlycccProccgProcctPro一25gtcValctgLeugcgAlatecSercccPro一2DgecggcAlaGlyca_cHis249ctgccggggggacgcacggeccgctggtgcagtggaagageceggeggLeuProGlyGlyArgThrAlaArgTrpCysSerGlyArgAlaArgArg—15—10-5-l297ccgP:roccgProccgcagProGincctProtctSereggArgcccProgcgAlacccPlTO10ccgProccgProcctProgcaAlacccPro15CC3Pro345tctgetcttccccgcgggggccgcgcggcgegggetgggggcccgggcSerAlaLeuProArgGlyGlyArgAlaAlaArgAlaGlyGlyProGly202530393agecgcgetegggcagcgggggcgeggggctgccgcctgcgctegcagSerArgAlaArgAlaAlaGlyAlaArgGlyCysArgLeuArgSerGin354045441ctgLieugtgVal50ccggtgProValcgcArggcgAlaetcLeu55GlyctgLeuggcGlyescHiscgcArg60tecgacAspgagGluctgLieu489gtgcgtttccgcttctgcageggctectgccgccgcgcgcgctctccaValArgPheArgPheCysSerGlySerCysArgArgAlaArgSerPro65707580537escHisgacAspetcagectgLeu85gecAlaageSerCt3LeuctgIjeuggcGly90gecAlagggGlygecAlactgLieucgaArg95ccgP;ro585cccProccgProggctecGlySer100eggArgcccProgtcValageSercagGin105cccProtgcCystgcCyscgaArgcccPro110ThrcgcArg633tacgaagcggtctecttcatggacgtca3cageacctggagaaccgtgTyrGluAlaValSerPheMetAspValAsnSerThrTrpArgThrVal115120125681gacAspcgcArg130etctecIjeuSergecAlasecThrgecAla135tgcCysggcGlytgcCysctgIjeuggcGly140tgagggctcg727ctccagggctttgcagactggacccttaccggtggctcttagagtcccactagecageggcctcagccagggacgaaggcaccggtgggtgatgcctgcctgggaccctcccgc787ctcaaagctgagaggcccct847861<210>9<211>220<212>PRT<213>liomosapiens<400>9MetGluLeuGlyLeuGlyGly-80-75ProArgArgGinProAlaLeu-60LeuSerSerValAlaGluAla-45AlaProArgGluGlyProPro-30LeuProGlyGlyArgThrAla-15-IOProProProGinProSerArgSerAlaLeuProArgGlyGly20SerArgAlaArgAlaAlaGly35LeuValProValArgAlaLeu5055ValArgPheArgPheCysSer6570HisAspLeuSerLeuAlaSer85ProProGlySerArgProVal100TyrGluAlaValSerPheMet115AspArgLeuSerAlaThrAla130135LeuSerThrLeuSerHisCysProTrp一70—65TrpProThrLeuAlaAla一55IjeuAlaLeu一50SerLeuGlySerAlaProArgSerPro—40—35ProValLeuAlaSerPro—25—20AlaGlyHisArgTrpCysSerGlyArgAlaArgArgProAlaPi:oProProPro10ArgAlaAlaArgAlaGly25AlaArgGlyCysArgLeu4045GlyL*euGlyHisArgSer60GlySerCysArgArgAla75LeuLeuGlyAlaGlyAla90SerGinProCysCysArg105AspValAsnSerThrTrp120125CysGlyCysLeuGly140AlaPro15ProGly30ProGlyArgSerGinAspArgGluIjeuSerPro80LeuArgPro95Pro110ThrArgArgThrVal<210>10<211>140<212>PRT<213>Homosapiens<220><221>CARBOHYD<222>(122)<223>糖基化天冬酰胺<400>10ProProProGinProSerArgProAlaProProP;roProAlaProPro1.51015SerAlaLeuProArgGlyGlyArgAlaAlaArgAlaGlyGlyProGly202530SerArgAlaArgAlaAlaGlyAlaArgGlyCysArgLeuArgSerGin354045LeuValProValArgAlaLeuGlyLeuGlyHisArgSerAspGluLeu505560ValArgPheArgPheCysSerGlySerCysArgArgAlaArgSerPro65707580HisAspLeuSerLeuAlaSerLeuLeuGlyAlaGlyAlaLeuArgPro859095ProProGlySerArgProValSea:100TyrGluAlaValSer'PheMetAsp115120AspArgLeuSerAlaThrAlaCys130135GinProCysCysArgProThrArg105110ValAsnSerThrTrpArgThrVal.125GlyCysLeuGly140<210>11<211>116<212>PRT<213>Homosapiens<220><221>CARBOHYD<222>(98)<223>糖基化天冬酰胺<糊>11AlaAlaArgAlaGlyGlyProGlySerArgAlaArgAlaAlaGlyAla151015ArgGlyCysArgLeuArgSerGinLeuValProValArgAlaLeuGly202530LeuGlyHisArgSerAspGluLeuValArgPheArgPheCysSerGly354045SerCysArgArgAlaArgSerProHisAspLeuSerLeuAlaSerLeu505560LeuGlyAlaGlyAlaLeuArgProProProGlySerArgProValSer65707580GinProCysValAsnSerGlyCysLeu115CysArgProThrArgTyrGluAlaValSerPheMetAsp859095ThrTrpArgThrValAspArgLeuSerAlaThrAlaCys100105110Gly<210>12<211>113<212>PRT<213>Homosapiens<220><221>CARBOHYD<222>(95)<223>糖基化天冬酰胺<糊>12AlaGlyGlyProGly15ArgLeuArgArgSei:Asp35ArgAlsArg50GlyAlaLeu65CysArgP:roThrTrpArg1015SerGinLeuValProValArgAlaLeuGlyLeuGlyHis202530GluLeuValArgPheArgPheCysSerGlySerCysArg4045SerProHisAspLeuSerL/euAlaSer*LeuLeuGlyAla5560ArgProProProGlySerArgProValSerGinProCys707580ThrArgTyrGluAlaValSerPheMetAspValAsnSer859095ThrValAspArgLeuSerAlaThrAlaCysGlyCysLeu100105110'Gly<210>13<211>102<212>DNA<213>Homo<400>13cctggccagcctactgggcgccggggccctgcgaccgcccccgggctcccggcccgtcag60ccagccctgctgccgacccacgcgctacgaagcggtctcctt102<210>14<211>220<212>DMA<213>Murinaegen.sp.<綱>14ggccaccgctccgacgagctgatacgtttccgcttctgcagcggctcgtgccgccgagca60cgctcccagcacgatctcagtctggccagcctactgggcgctggggccctacggtcgcct120cccgggtcccggccgatcagccagccctgctgccggcccactcgctatgaggccgtctcc180ttcatggacgtgaacagcacctggagaaccgtggaccgcc220<210>15<211>2136<212>DNA<213>Murinaegen.sp.<220><221>CDS<222>(975)..(1646)<400>15gcggccgcgaattcggcacgagggcgtctcgctgcagcccgcgatctctactctgcctcc60tggggtcttctccaaatgtctsgcccccacctsgagggscctagcctagccageggggae120cggatccggagggtggagcggccaggtgagccctgsia^ggtggggcggggegggggeget180ctgggccccaccccgggatctggtgacgccggggctggaatttgacaccggaeggeggeg240ggcaggaggctgctgaggga仁ggagttgggctcggcccccagatgcggcccgcgggctct300gccagcaacaagtccctcgggccccagccctcgctgcgactggggcttggagccctgcac360ccaagggcacagaccggctgccaaggccccscttttasctaaaagaggcgctgccaggtg420ggcatgatccacttgsgcttcccsigcsctggtcccaggag480sggcgcctsgsaggacacggaccaggacccctttggtstggagtgaacgctga_gceitgga540gtggaaggaatsctttctcceLEiccsccctggtaccttcagccctgaagta600gggtcttaga3gscagg3ccacagctgtgtgagtctcccccctgaggcct660tagacgatctctgagctcagctgagctttgtttgcccatctggaigaieLgtgagecattg^t720tgaccttgtggcatcgcgaaggaacaggtcctgccaagcacctaacacag3gagcaaggt780tctccatcgcagctaccgctgctgagttgactctagctactccascctcctgggtcgett840cgagagsictggagtggaaggaggaatscccctsax:tcatctttcagtttg900caagctgccgcaggaagagggtggggaaacgggtccacgaaggcttctgatgggagcttcS60tggagccgaasgctatggaactgggacttgcagagMetGluLeuGlyLeuAlaGlucctactgcattgtecProThrAlaLeuSer10101510.cactgcetceggcctaggtggcagteagcctggtggccaaccetaget1058HisCysLeuArgProArgTrpGinSerAlaTrpTrpProThrLeuAla152025gttValCt￡LLeu30gccAlactgageSertgcCys35gtcValseaGlugetAlatecSer40ctgIjeugacAspProMet1106tecSer45ArgSercccProgccAlagetAla50cgcArggacAspggtGlycccProSer55ProgtcValttgLieugcgAlacccPro601154cccacgAspca_cHisctg65cctProgggGlyggaGlyC3CHisactThr70gcgAlaca_tHisttgtgcCysSer75Glu1202aga3CCThrctgLieu80cccProccgProcctProGintctSer85cctProca_gGincccProgcaAlacccPro90ccgProccgPro1250cctProggtGlycccPro95gcgAlaetcLeucagGintctSercctPro100cccProgetAlagcgAlaetcLeucgcArg105gggGlyAlacgcArg1298gcgAlagcgAla110cgtArgAlaggaGlysecThreggArg115a_gcSerageSercgcArgAlaeggArg120secThrThrgatAspAla1346cgc125GlytgcCyscgcArgctgLeucgcArg130tegSercagGinctgLeugtgValccgPro135gtgValageSergcgAlaetcLeuggcGly1401394LeuGlyca_cHisSertecSer145gacAspg印GluctglieuliecgtArg150ttccgcArgttctgcCysage155ggcGly1442tegSertgcCyscgcArgcgaArg160AlacgctecSerGinca_cHis165gatAspetcLeuagtSerctgLieugccAla1701490ctgIj€UGlygetAla175gggGlygccAlaCt3LeueggArgtegSer180cctProcccProgggGlytecSeregg185ccgProa_tc工leSer1538GincccPro190tgcCystgcCyseggArgcccProactThr195cgcArgTyrGlugccAlagtcVal200tecSerttcPhe3tgMetgacAsp1586gtgVal205a_gcSer5LCCThrtggArg210a^ccThrgtgValgacAspca_cHisetc215tecSergccAlaactThrgccAlatgcCys2201634ggcGlytgtCysctgLeuggcGlytgaggatgatctatctccaagcctttgcscactagaccca1686tgtgttgccctacctggaacagctccaccgggcctcactaaccaggagcctcsactceLgc1746ggctgeagagctcsggccccaggccggtgagtgacagacgtegteggcat1806gacagscagagtgaaagatgtcggsaccsctgaccaacagtcccsagttgttcatggatc1866ccagctctac3gacagg3gaaacctcagctcctct的geigaatccagaaa1926tggccctctgtcctggggaatgaattttgaagagatstatatacatatat1986cgcgttgctggaccagcctgtgctga在accagtcccgtgttcSLCttgtggaagecgaage2046cctatttsttstttctsaatt3ttt3ttt5L(itttga站aaaa3cggcc33gtcggcctcc2106ctttagtgagggttaatttgtgatcccggg<210>16<211>224<212>PRT<213>Murinaegen.sp.2136<400>16MetGlu1ProArgLeuSei*AlaAla50LeuPro65LeiiGlyTrpGin20CysVal35ArgAspGlyGlyProProProGinLeuAlaGlu5SerAlaTrpThrGluAlaGlyProSer55HisThrAla70SerProGin85LeuGinGlyThr30euArg130SexAsp145AlaLeuArgProTrpArg210ArgSer180ThrArg195ThrVal<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列ProTrpSer40ProHisProSerPro100ArgSer115SerGinGluLeuProAlaAlaLeuAlaArgSerGinSer*ArgAlaLeuValPro135工leArgPhe150HisAspLeu165ProProGlyTyrGluAlaAspHisLeu215Arg120ValArgSerVal200ThrAlaLeuSerHisCysLeuArg.1015ProThrLeuAlaValLieuAlaLeu2530LeuAspProMetSerArgSerPro45ValLeuAlaProProThrAspHis60LeuCysSerGluArgTh:rIjeuArg7580AlaProProProProGlyProAla9095ArgGlyAlaArgAlaAlaArgAla105110ThrThrAspAlaArgGlyCysArg125SerAlaLeaGlyLeuGlyHisSer140PheCysSerGlySerCysArgArg155160LeuAlaSerLeuLeuGlyAlaGly170175ArgProlieSerGinProCysCys185190SerPheMetAspValAsnSerThr205AlaThrAlaCysGlyCysLeuGly220<220><223>人工序列的描迷PCR引物<400>17cctggccagcctactggg<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>18aaggagaccgcttcgtagcg<210>19<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<綱>19atggaacttggacttgg<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>20tccatcacccsccggc<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>21ggccaccgctccgacgag<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>22ggcggtccacggttctccag<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>23ccaagcccacctgggtgccctctttctcc<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>24catcacccaccggcaggggcctctcag<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>25gagcccatgcccggcctgatctcagcccgaggaca<210>26<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<糊>26ccctggctgaggccgctggctagtgggactctgc<210>27<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述雜交<400>27ncaggtggtccgtggggggcgccaagaccgg31.<210>28<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>28ctaggagcccatgccc16<210>29<211>351<212>DNA<213>Homosapiens<400>29atggctggaggaccgggatctcgtgctcgtgcagcaggagceicgtggct:gtcgtctgcgt60tctcaactagtgccggtgcgtgcactcggactgggacaccgttccgacgaactagtacgt120tttcgtttttgttcsggatcttgtcgtcgtgcacgttctccgcatgatctatctctagcs180tctctsct的gagccggagc3ct貼gaccgccgccgggatctagacctgt240tgttgtagaccga^gca_gta_tctttcatggacgtaaactcta_ca_tgg3ga_300accgtagatagsctatctgcaaccgcatgtggctgtctagg351<210>30<211>414<212>DNA<213>Homosapiens<400>30atgggccatcatcatCELtcatcstcatcatcatcactcgagcggccatatcgacgacgac60gacaaggctggaggaccgggatctcgtgctcgtgcagcaggagcacgtggctgtcgtctg120cgttctcaactagtgccggtgcgtgcactcggactgggacaccgttccgacgaactagta180cgttttcgtttttgttc的gatcttgtcgtcgtgcacgttctccgcatgatctstctcts240gcatctctactaggagccggsgcacta^gaccgccgccgggatctagscctgtatctcaa300ccttgttgtagacctactagatacgaagcagtatctttcactctetcatgg360agasccgtagatsgactatctgcaaccgciatgtggctgtctaggatgata414200710136803.X<210>31.<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>31aaggaaaaaagcggccgccatggaacttggacttggagg<210>32<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>32ttttttccttggcggccgctcagcccaggcagccgcagg<210>33<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>33gagcgagccctcagcc權利要求1.分離的Neublastin核酸，所述核酸含有選自下列的序列a)SEQIDNO1的核苷酸序列；b)核酸序列，其含有編碼表達包含SEQIDNO2的AA1-AA105的Neublastin多肽或由其衍生的神經(jīng)營養(yǎng)多肽的開放閱讀框，其中，所述神經(jīng)營養(yǎng)多肽通過在所述Neublastin多肽的序列中添加、缺失和/或替代少于10.5個氨基酸或通過對該序列中少于10％的殘基進行保守替代而衍生自所述Neublastin多肽，其中，所述神經(jīng)營養(yǎng)多肽具有在SEQIDNO2的第8、35、39、72、73、101和103位保守的7個半胱氨酸殘基；c)核酸，其在高度嚴緊的溶液雜交條件下能與具有SEQIDNO1核苷酸序列的核酸或其互補鏈特異性雜交，并編碼神經(jīng)營養(yǎng)多肽。2.權利要求1的核酸，其編碼的多肽是SEQIDNO:2的3.權利要求l的核酸，其中所述編碼的神經(jīng)營養(yǎng)多肽包含GDNF亞族基序LGLG-FRxCxGxC-xxCCRP畫SAxxCxC。4.權利要求1的核酸，所述編碼的神經(jīng)營養(yǎng)多肽是神經(jīng)營養(yǎng)因子的GDNF亞族成員。5.含有權利要求1至4之任一項的核酸的表達栽體。6.以權利要求1至4之任一項的核酸和/或權利要求5的表達載體體外轉化的細胞。7.權利要求6的細胞，其中所述細胞是真核細胞。8.權利要求7的細胞，其中所述細胞選自哺乳動物細胞和包括酵母細胞的真菌細胞。9.權利要求8的細胞，其中所述細胞選自中國倉鼠卵巢細胞、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b和人神經(jīng)干細胞。10.神經(jīng)營養(yǎng)多肽，所述多肽含有由SEQIDNO:2的AA廣AA^組成的氨基酸序列、或者通過添加、缺失和/或替代少于10.5個氨基酸而從該序列衍生的序列、或者通過對由SEQIDNO:2的AA廣AA^組成的氨基酸序列中少于10%的殘基進行保守替代而由該序列衍生的序列，或者所述多肽由能夠在高度嚴緊的溶液雜交條件下與具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸或其互補鏈特異性雜交的核酸編碼，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)多肽具有在SEQIDNO:2的第8、35、39、72、73、101和103位保守的7個半胱氨酸殘基。11.權利要求10的神經(jīng)營養(yǎng)多肽，其包含GDNF亞族基序LGLG-FRxCxGxC-xxCCRP-SAxxCxC。12.權利要求10的神經(jīng)營養(yǎng)多肽，其中所述多肽是GDNF亞族成員。13.權利要求10的神經(jīng)營養(yǎng)多肽，其含有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。14.權利要求10-13任一項的多肽，其中所述多肽是糖基化的。15.權利要求10的多肽，其中所述多肽由權利要求1至4之任一項的核酸所編碼。16.制備權利要求10至15之任一項的多肽的方法，所述方法包括由所述多肽的編碼核酸表達所述多肽的步驟。17.權利要求16的方法，所述方法包括在允許生產(chǎn)所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有所述Neublastin神經(jīng)營養(yǎng)因子核酸的細胞的步驟。18.權利要求17的方法，其進一步包括從所述培養(yǎng)基中回收所述多肽的步驟。19.組合物，其含有權利要求10-15之任一項的多肽和藥物可接受的栽體。20.權利要求10-15之任一項的多肽在制備藥物中的用途，其中所述藥物用于治療涉及受損傷的和受創(chuàng)傷的神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病。21.權利要求20的用途，其中所述疾病是外周神經(jīng)的創(chuàng)傷、髓質和/或脊髓神經(jīng)的創(chuàng)傷、腦缺血神經(jīng)元損傷、神經(jīng)病及尤其是外周神經(jīng)病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側索硬化或任何其他神經(jīng)變性疾病，和與癡呆有關的記憶損壞。22.生產(chǎn)權利要求10-15之任一項的Neublastin多肽的方法，所述方法包括(a)將編碼表達權利要求10-15之任一項的Neublastin多肽的多核苷酸導入細胞或通過同源重組將調節(jié)序列導入細胞，以使該調節(jié)序列能調節(jié)內源性Neublastin基因的表達，從而制備Neublastin生產(chǎn)細胞；(b)在導致Neublastin多肽表達的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)Neublastin生產(chǎn)細胞。23.編碼Neublastin多肽的合成基因，所述合成基因包含SEQIDNO:29或30所示序列。24.由下列任一序列構成的Neublastin多肽GPGSRARAAGARGC(SEQIDNO:9的AA30-43);LGHRSDELVRFRFC(SEQIDNO:9的AA57隱70);CRRARSPHDLSL(SEQIDNO:9的AA74畫85);LRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的AA94-107);STWRTVDRLSATAC(SEQIDNO:9的AA123-136)。CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQIDNO:9的AA108-124);或ALRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的AA93-107)。25.針對權利要求24所述任何肽產(chǎn)生的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及neublastin神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，編碼neublastin多肽的核酸和特異性結合neublastin多肽的抗體，及其制備和使用方法。文檔編號A61P25/00GK101113449SQ20071013680公開日2008年1月30日申請日期1999年7月5日優(yōu)先權日1998年7月6日發(fā)明者C·漢森,N·布洛姆,T·E·約翰森申請人:恩斯吉恩有限公司