專利名稱：一種抗呼吸道病毒的藥物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗病毒新藥鹽酸阿比朵爾，以及該藥的抗多種呼吸道病毒的作用。具體地說，本發(fā)明屬于一種具有良好抗病毒活性的新化合物，該化合物在制備能發(fā)揮抗柯薩奇病毒B3、腺病毒Ad7、副流感病毒、鼻病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感和急性呼吸道病毒感染為臨床上發(fā)病率高、發(fā)病范圍廣的疾病，因流感病毒具有抗原變異性，加之其具有多重耐藥性，亟需一種安全有效的治療和預(yù)防的藥物?；瘜W(xué)藥物在治療流感和ARVI上占有極為重要的地位。迄今為止，金剛烷胺和金剛烷胺衍生物金剛乙胺作為抗病毒藥物已在臨床廣泛應(yīng)用，但其活性范圍較窄(僅對A型流感病毒有效)，且具有副作用，而且隨著臨床應(yīng)用其耐藥性亦同時(shí)增加。鹽酸阿比朵爾是非核苷類抗病毒藥物，是前蘇聯(lián)藥物化學(xué)研究中心首先研制的，1993年在俄羅斯首次上市，是一新的抗病毒藥物和免疫刺激劑，用于防治流行性感冒和其它急性呼吸道病毒感，它對甲、乙型流感病毒的抗病毒活性最為顯著，該藥能抑制甲、乙型流感病毒復(fù)制的早期階段，能抑制病毒與細(xì)胞漿膜的融合以及病毒與內(nèi)吞囊泡之間的膜融合(PH＝5.0)。同時(shí)鹽酸阿比朵爾在體內(nèi)還可誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，對巨噬細(xì)胞的吞噬功能有顯著的活化作用，具有免疫調(diào)節(jié)作用。而該藥在抗抗柯薩奇病毒B3、腺病毒Ad7、副流感病毒、鼻病毒的作用還未見報(bào)道和發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有藥用價(jià)值的化合物—鹽酸阿比朵爾，該化合物對流感病毒甲型和乙型療效和預(yù)防明顯，服用方便，耐受良好。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種鹽酸阿比朵爾在制備抗柯薩奇病毒、腺病毒Ad7、副流感病毒、鼻病毒藥物中的應(yīng)用。
一種抗病毒新藥——鹽酸阿比朵爾(Arbidol Hydrochloride)，化學(xué)名為6-溴-4-(二甲氨甲基)-5-羥基-1-甲基-2-(苯硫甲基)-1H-吲哚-3-羥酸乙酯鹽酸鹽—水合物，為白色晶狀粉末，分子量531.89，不含影響生物活性的額外化合物和其他雜質(zhì)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 其中HO-表示羥基，Br-表示溴，CH3-表示甲基，CH2N(CH3)2-表示二甲氨甲基，COOC2H5-羥酸基，HCL表示鹽酸，-CH2S-表示硫甲基，H2O表示水。
鹽酸阿比朵爾具有抗柯薩奇病毒B3、腺病毒Ad7、副流感病毒、鼻病毒的藥效學(xué)作用，且在抗病毒生物合成中有明顯的抗病毒作用。
以2和3為起始原料，經(jīng)加成、環(huán)合、溴化、?；?、取代和Mannich反應(yīng)制得目標(biāo)化合物1。反應(yīng)總收率26.6％。合成技術(shù)路線如下
鹽酸阿比朵爾為水溶性藥物，但溶解度一般，DMSO(二甲基亞砜)可促進(jìn)其溶解。是否含有促溶劑DMSO、藥物滅菌方式以及藥物作用細(xì)胞時(shí)間等因素影響鹽酸阿比朵爾對HEp-2細(xì)胞(人咽喉癌細(xì)胞)和HEL細(xì)胞(人胚肺細(xì)胞)的毒性。藥物對細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為折光性增加，壁厚，變圓，破碎，脫落，并且吸光值下降。藥物對細(xì)胞的毒性作用在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率降低。
鹽酸阿比多爾體外具有抗柯薩奇病毒作用，鹽酸阿比朵爾抗柯薩奇病毒生物合成組能明顯減輕CVB3感染細(xì)胞CPE程度，隨著藥物劑量的增加，細(xì)胞皺縮、變圓、脫落、碎裂等CPE特征逐漸減弱。鹽酸阿比朵爾能降低上清中病毒滴度，病毒抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)，病毒滴度則與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)。鹽酸阿比朵爾抗CVB3指數(shù)(TI)藥物抗病毒生物合成組＞藥物抗病毒吸附8h組＞藥物直接滅活組。
鹽酸阿比朵爾有明顯抑制腺病毒Ad7生物合成的作用，表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞腫脹變圓，折光度增強(qiáng)等典型CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。在一定藥物濃度的范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，對Ad7的抑制率增加，并表現(xiàn)出量效關(guān)系。鹽酸阿比朵爾對腺病毒侵入無阻斷(預(yù)防)作用，亦無直接殺傷作用。
鹽酸阿比朵爾有體外抗副流感病毒作用，能明顯干擾病毒生物合成，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞腫脹、變圓、合胞體形成等典型CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，對RSV的抑制率增加，并表現(xiàn)出量效關(guān)系。鹽酸阿比朵爾能阻止RSV病毒的吸附與穿入細(xì)胞，且預(yù)先作用6h療效明顯強(qiáng)于預(yù)先作用2h。鹽酸阿比朵爾對副流感病毒無直接殺傷作用。
鹽酸阿比朵爾對鼻病毒在HEL細(xì)胞中的增殖有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞皺縮、變圓、脫落、折光性增強(qiáng)等CPE特征逐漸減弱，病毒抑制率升高，藥物抗病毒活性增強(qiáng)，藥物濃度與病毒抑制率之間呈正相關(guān)。
鹽酸阿比朵爾在制備抗柯薩奇病毒、腺病毒Ad7、副流感病毒、鼻病毒等急性呼吸道病毒感染藥物中的應(yīng)用。
鹽酸阿比朵爾可制成薄膜包衣片、膠囊劑、顆粒劑、分散劑，口服。制備上述制劑時(shí)，可使用常規(guī)的制劑技術(shù)。在治療急性呼吸道病毒感染及其并發(fā)癥的藥物中可加入該藥成分或在治療過程中聯(lián)合用藥使用該藥。國外研究報(bào)道，鹽酸阿比朵爾作為抗病毒藥物進(jìn)行臨床研究從1983到1990年的流感爆發(fā)期間，共包括9500為患者。對于成年人阿比朵爾包衣片作為治療和預(yù)防由A、B型病毒引起的流感和其它急性呼吸道病毒感染的藥物服用0.1g。治療流感，阿比朵爾建議口服0.2g，飯前服用，每日4次，連續(xù)3天。對于與危重病人接觸的人來說，預(yù)防流感建議飯前口服0.2g，每日1次，連續(xù)5～10天。對于處于流感時(shí)期的急性呼吸道疾病的預(yù)防，阿比朵爾建議飯前口服0.1g，每周2次，連續(xù)20天。阿比朵爾在有9000多名患者參與的臨床研究中表現(xiàn)很好的耐藥性；未見副作用報(bào)道。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.對流感病毒甲型和乙型均有效。2.既有治療作用，也有預(yù)防作用；3.兼有直接抑制病毒和誘導(dǎo)內(nèi)源性干擾素的雙重作用。4.可口服給藥，使用方便。5.為非核苷類化合物，毒性低、耐受良好。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1鹽酸阿比朵爾對HEp-2細(xì)胞和HEL細(xì)胞的細(xì)胞毒性用胰蛋白酶將生長良好的HEp-2細(xì)胞和HEL細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按1×105/ml濃度分種于96孔板，每孔0.1ml，置37。C、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞長成單層后，棄培養(yǎng)液上清，換含不同濃度的含藥維持液，每個(gè)濃度設(shè)四個(gè)復(fù)孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照。繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄培養(yǎng)上清，每孔加入含5mg/mlMTT(四甲基偶氮唑鹽)的不含血清的MEM培養(yǎng)基50μl，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO∶乙醇體積比為1∶1)100μl，振蕩5～10分鐘，在酶標(biāo)儀570nm波長處讀取OD值，并根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，找出藥物對細(xì)胞的半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。
細(xì)胞存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照組OD值)×100％藥物對兩種細(xì)胞的毒性作用均表現(xiàn)為為折光性增加，壁厚，變圓，破碎，脫落，并且吸光值下降。藥物對細(xì)胞的毒性作用在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率降低，結(jié)果見下表表1不同滅菌方式下鹽酸阿比朵爾對HEp-2細(xì)胞和HEL細(xì)胞的毒性作用

-表示個(gè)別濃度沒有做1組鹽酸阿比朵爾用二甲基亞砜(DMSO)與雙蒸水(V∶V為1∶1)制成水劑，過濾除菌后對HEp-2細(xì)胞的毒性。
2組鹽酸阿比朵爾用二甲基亞砜(DMSO)與雙蒸水(V∶V為1∶9)溶解，過濾除菌后對HEp-2細(xì)胞的毒性。
3組鹽酸阿比朵爾用二甲基亞砜(DMSO)與雙蒸水(V∶V為1∶9)溶解，8磅15min高壓后對HEp-2細(xì)胞的毒性。
4組鹽酸阿比朵爾用ddH2O制成水劑，過濾除菌后對HEL細(xì)胞的毒性。
實(shí)施例2鹽酸阿比朵爾體外抗柯薩奇病毒作用擬定鹽酸阿比朵爾對CVB3的作用分成四個(gè)組。I組(藥物抗病毒生物合成組)先加病毒液吸附細(xì)胞2h后再加含藥維持液。II組(藥物直接作用組)病毒液與不同濃度的藥物作用2h，然后將混合液與細(xì)胞孵育2h后更換細(xì)胞維持液。III組和IV組(藥物抗病毒吸附2h、8h組)將不同濃度的藥物加入到細(xì)胞內(nèi)分別作用2h、8h后，棄去藥液，再加病毒液，吸附2h后更換細(xì)胞維持液。
上述四組實(shí)驗(yàn)組每孔劑量設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立未感染細(xì)胞對照、病毒對照和溶劑對照。35℃、5％CO2培養(yǎng)，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化。待病毒對照孔細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)程度呈+++～++++，且對照細(xì)胞正常時(shí)，MTT法進(jìn)行活細(xì)胞染色，在570nm波長讀取OD值，根據(jù)OD值判斷不同濃度藥物對病毒抑制作用的大小，公式如下

取實(shí)驗(yàn)孔、病毒對照孔、細(xì)胞對照孔的培養(yǎng)上清液系列對數(shù)稀釋，測定TCID50Probit回歸方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和半數(shù)有效濃度(ED50)，治療指數(shù)(TI)＝藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)/半數(shù)有效濃度(ED50)，用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50，應(yīng)用LSD方法進(jìn)行不同組別之間的兩兩比較，判斷其間差別有無顯著性，數(shù)據(jù)處理用SPSS 11.5軟件完成。
實(shí)驗(yàn)表明鹽酸阿比多爾抗病毒生物合成組能明顯減輕CVB3感染細(xì)胞CPE程度，阿比朵爾抗病毒生物合成組中隨著藥物劑量的增加，細(xì)胞皺縮、變圓、脫落、碎裂等CPE特征逐漸減弱。阿比朵爾能降低上清中病毒滴度，病毒抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)，病毒滴度則與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)。DMSO對照組顯示DMSO無抗病毒作用。鹽酸阿比朵爾抗CVB3指數(shù)(TI)藥物抗病毒生物合成組＞藥物抗病毒吸附8h組＞藥物直接滅活組，說明該藥主要是通過抑制病毒生物合成而發(fā)揮抗病毒作用。
表2鹽酸阿比朵爾抗CVB3不同作用方式時(shí)病毒抑制率比較

I組藥物抗病毒生物合成組；II組藥物直接作用組；III組藥物抗病毒吸附2h組；IV組藥物抗病毒吸附8h組；①病毒抑制率；②上清病毒滴度實(shí)施例3鹽酸阿比朵爾體外抗腺病毒Ad7作用擬定鹽酸阿比朵爾對腺病毒Ad7的作用分成四個(gè)組。I組(藥物抗病毒生物合成組)先加病毒液吸附細(xì)胞2h后再加含藥維持液。II組(藥物直接作用組)病毒液與不同濃度的藥物作用2h，然后將混合液與細(xì)胞孵育2h后更換細(xì)胞維持液。III組、IV組和V組(藥物抗病毒吸附2h、4h、8h組)將不同濃度的藥物加入到細(xì)胞內(nèi)分別作用2h、4h、8h后，棄去藥液，再加病毒液，吸附2h后更換細(xì)胞維持液。
上述五組實(shí)驗(yàn)組每孔劑量設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立未感染細(xì)胞對照、病毒對照和溶劑對照。35℃、5％CO2培養(yǎng)，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化。待病毒對照孔細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)程度呈+++～++++，且對照細(xì)胞正常時(shí)，MTT法進(jìn)行活細(xì)胞染色，在570nm波長讀取OD值，根據(jù)OD值判斷不同濃度藥物對病毒抑制作用的大小，公式如下 Probit回歸方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和半數(shù)有效濃度(ED50)，治療指數(shù)(TI)＝藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)/半數(shù)有效濃度(ED50)，用LinearRegression對藥物劑量與其產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng)(細(xì)胞存活率、抑制率)進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷是否存在量效關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鹽酸阿比朵爾有明顯抑制腺病毒Ad7生物合成的作用，表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞腫脹變圓，折光度增強(qiáng)等典型CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。在一定藥物濃度的范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，對Ad7的抑制率增加，并表現(xiàn)出量效關(guān)系。鹽酸阿比朵爾對腺病毒侵入無阻斷(預(yù)防)作用，亦無直接殺傷作用。結(jié)果見下表
表3鹽酸阿比朵爾對Ad7生物合成的抑制作用

++++75％以上細(xì)胞病變；+++75％～50％細(xì)胞病變；++50％～25％細(xì)胞病變；+25％以下細(xì)胞病變；-無細(xì)胞病變實(shí)施例4鹽酸阿比朵爾體外抗副流感病毒作用擬定鹽酸阿比朵爾對副流感病毒的作用分成四個(gè)組。I組(藥物抗低滴度病毒生物合成組)先加病毒液10-2吸附細(xì)胞2h后再加含藥維持液。II組(藥物抗高滴度病毒生物合成組)先加病毒液10-3吸附細(xì)胞2h后再加含藥維持液。III組和IV組(藥物抗病毒吸附2h、6h組)將不同濃度的藥物加入到細(xì)胞內(nèi)分別作用2h、6h后，棄去藥液，再加病毒液，吸附2h后更換細(xì)胞維持液。
上述四組實(shí)驗(yàn)組每孔劑量設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立未感染細(xì)胞對照、病毒對照和溶劑對照。35℃、5％CO2培養(yǎng)，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化。待病毒對照孔細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)程度呈+++～++++，且對照細(xì)胞正常時(shí)，MTT法進(jìn)行活細(xì)胞染色，在570nm波長讀取OD值，根據(jù)OD值判斷不同濃度藥物對病毒抑制作用的大小，公式如下

Probit回歸方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和半數(shù)有效濃度(ED50)，治療指數(shù)(TI)＝藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)/半數(shù)有效濃度(ED50)，用LinearRegression對藥物劑量與其產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng)(細(xì)胞存活率、抑制率)進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷是否存在量效關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鹽酸阿比朵爾有體外抗副流感病毒作用，能明顯干擾病毒生物合成，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞腫脹、變圓、合胞體形成等典型CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，對RSV的抑制率增加，并表現(xiàn)出量效關(guān)系。鹽酸阿比朵爾能阻止RSV病毒的吸附與穿入細(xì)胞，且預(yù)先作用6h療效明顯強(qiáng)于預(yù)先作用2h。鹽酸阿比朵爾對副流感病毒無直接殺傷作用。結(jié)果見下表表4鹽酸阿比朵爾抗副流感病毒不同作用方式時(shí)病毒抑制率比較

I組藥物抗低滴度病毒生物合成組；II組藥物抗高滴度病毒生物合成組；III組藥物抗低滴度病毒吸附4h組；IV組藥物抗低滴度病毒吸附6h組實(shí)施例5鹽酸阿比朵爾體外對鼻病毒增殖的抑制作用先用100TCID50/0.1ml的鼻病毒每孔0.1ml感染細(xì)胞，吸附2h后，吸去病毒，加入不同濃度的藥物，每孔劑量設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立未感染細(xì)胞對照、病毒對照和溶劑對照。35℃、5％CO2培養(yǎng)，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化。待病毒對照孔細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)程度呈+++～++++，且對照細(xì)胞正常時(shí)，MTT法進(jìn)行活細(xì)胞染色，在570nm波長讀取OD值，根據(jù)OD值判斷不同濃度藥物對病毒抑制作用的大小，公式如下

Probit回歸方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和半數(shù)有效濃度(ED50)，治療指數(shù)(TI)＝藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)/半數(shù)有效濃度(ED50)，用LinearRegression對藥物劑量與其產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng)(細(xì)胞存活率、抑制率)進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷是否存在量效關(guān)系。
鹽酸阿比朵爾對鼻病毒在HEL細(xì)胞中的增殖有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞皺縮、變圓、脫落、折光性增強(qiáng)等CPE特征逐漸減弱，病毒抑制率升高，藥物抗病毒活性增強(qiáng)，藥物濃度與病毒抑制率之間呈正相關(guān)。結(jié)果見下表表5鹽酸阿比朵爾抗鼻病毒作用

權(quán)利要求
1.鹽酸阿比朵爾在制備抗鼻病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通式(I)的化合物，其中HO－表示羥基，Br－表示溴，CH
文檔編號A61P31/00GK101073569SQ20071013748
公開日2007年11月21日 申請日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者楊占秋, 熊海蓉, 何靜, 石麗橋, 關(guān)意洪, 肖紅 申請人:武漢大學(xué)