專利名稱：：作為抗傳染病替代藥物的益生微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種益生微生物組合物，以及一種用該益生微生物組合物調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
：相關(guān)文獻(xiàn)的描述，包括信息發(fā)表在37CER1.97和37CER1.98。益生菌是一種有活性的微生物，應(yīng)給予適量的益生菌，它可以授予"寄主"有益健康的效果(摘自聯(lián)合國(guó)食物與農(nóng)業(yè)組織及世界健康組織，替換醫(yī)藥2001)。益生菌普及用與人類，及動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)添加劑，例如說，酵母菌常作為給家禽的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。優(yōu)樂乳和乳酸菌，乳酸桿菌(丄"cto^c/〃w)和雙歧桿菌(及;/^oZ)ac/eWwm)，通常用來預(yù)防及治療與腹瀉，和有關(guān)腸胃感染的疾病(Alvaez，etal，2001;Fuller1989;Majamaa,etal1995)。許多益生菌獨(dú)特的特點(diǎn)，例如抗感染的性質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，增加防疫功能，代謝功能以及改變腸的蠕動(dòng)及吸收功能。這些功能都使益生菌'成為對(duì)人類及動(dòng)物的替代醫(yī)藥(WalkerandBuckley,2006)。雖然益.生菌的產(chǎn)物，如短連脂肪酸(SCFA)，細(xì)胞壁的蛋白酣糖(peptidoglycan)和短連去氧核糖核酸(DNA)含有CPG排列，可以有益生菌的功能。使用有活性的微生物，給人類和動(dòng)物吃，是目前主要應(yīng)用和研究益生菌的方針(WalkerandBuckley,2006)。為了使益生菌對(duì)人類及動(dòng)物發(fā)揮最大的效果，我們必須將活的細(xì)菌傳送到腸內(nèi)并在腸內(nèi)生長(zhǎng)、繁殖(KailasapathaandChin2000)。乳酸桿菌(Z^cto6aa7/us)及雙歧桿菌(5折cfotocfen'wm)是兩種最常見的乳酸益生菌，常在科學(xué)文獻(xiàn)中討論，也常在一般商品中見到。這兩屬細(xì)菌是屬于適合厭氧環(huán)境的細(xì)菌，這兩屬細(xì)菌中大部分的種及小種對(duì)氧氣以及高溫都很敏感(Gomesetal,1995;TalwakarandKailasapathy,2004)，所以在室溫，一直又開又關(guān)的環(huán)境下，是非常困難維持這兩類細(xì)菌的活性。因此，對(duì)于目前的商品來說，長(zhǎng)期保存的方法，以及在不同溫度的運(yùn)送條件，常有不同的結(jié)果發(fā)表(Tuomolaetal,2001)。美國(guó)專利號(hào)碼5,968,569，聲明在寵物食物中膠質(zhì)，淀粉網(wǎng)包含有益生微生物，特別聲明是酵母菌屬0&cc/^rcw7;;ces)及乳酸片球菌(PeGf/ococcwsacW/a"/c/)。美國(guó)專'利號(hào)碼6,551,663，聲明給寵物的奶粉中含有乳酸酵素及乳酸，并包含專利5,968,569所聲明的益生菌。美國(guó)專利號(hào)碼6,780,447聲明動(dòng)物食物包含山梨酸(sorbicacid)以及有活性及無活性的微生物，這些微生物是指乳酸片球菌CR"c/^/fl^d)。美國(guó)專利號(hào)碼6,827,957聲明動(dòng)物食物中的特別組合，包含一層軟質(zhì)的內(nèi)層及硬質(zhì)的外殼與益生菌混合在一起，特別是指酵母菌屬(Sacc/wramj/CM)。美國(guó)專利號(hào)碼6,827,397，用脂肪來包含酵母菌，包括各式'不同的益生菌，包括布拉酵母菌(&cc/wro，cei1tow/"ni/0禾口乳酸片球菌(7W/ococc"i1"cW/"c//c/)。美國(guó)專利申請(qǐng)中2003/0049240，揭示一種方法，是用乳酸桿菌(丄fl"oZ)flc/〃船)及雙歧桿菌CB拆AtocfeWww)，治療螺桿菌(helicobacter)的感染。美國(guó)專利申請(qǐng)中2003/010卯25，聲稱一種方法用來制造一種微粒，外面涂有活性的微生物。美國(guó)專利申請(qǐng)中2004/0197352，聲稱益生菌的前身其中的成份和減少肌肉素(creatine)和BUN包含各種不同種的微生物。美國(guó)專利申請(qǐng)中2003/0165472，聲稱一種用來儲(chǔ)存及運(yùn)輸辦生物。美國(guó)專利申請(qǐng)中2006/0008511，聲稱益生微生物包含在黃原膠(xanthangum)，殼聚糖(chitosan)及明膠(gelatin)的混合物中。以前的例子無論相關(guān)與否都是用來說明。
發(fā)明內(nèi)容以下的體系與觀念配合各種系統(tǒng)工具及方法來解釋，說明具代表性，并不局限于此點(diǎn)的空間。在不同的體系中，有一些上述的問題就相對(duì)減少或是解決，當(dāng)我們用不同的方法系統(tǒng)來解決問題。所揭示的具體實(shí)施方式包括一種寵物用制品，該制品包括包囊在黃原膠和殼聚糖的混合物中的益生菌。又所揭示的具體實(shí)施方式，包括準(zhǔn)備給寵物食用的食物，包含益生微生物包裝在一種明膠膠囊中，這種益生微生物是酵母菌(&ccAflramj;ce^及乳酸細(xì)菌。在此項(xiàng)揭示中，酵母菌是指酵母菌屬(&cc/wromyce4乳酸細(xì)菌是指乳酸片球菌CP^//ococc^flaW//fl"/c/)。酵母菌是特別指布拉釀酒酵母(&cc/ar麵j/ceycerev/"化ZowAsvi/"，又口qSacc/^rcwy^sZow/aW/。所謂乳酸菌是指乳酸片球菌(尸eafococc船ac/aWac"c/)。在這項(xiàng)揭示中，黃原膠(xanthangum)的濃度是在0.2-2.0%(百分比重量/容積)，殼聚糖的濃度在0.1-1.0%(重量/容積)，而酸堿度(PH)在2-7之間。更具體一點(diǎn)來說，黃原膠(xanthangum)的濃度在1.25%(重量/容積)左右，殼聚糖的濃度在0.4%左右(重量/容積)，而酸堿(PH)度在4.15左右。所揭示的具體實(shí)施方式包括治療鳥及哺乳動(dòng)物腸胃有關(guān)的傳染病。在這治療的過程中，包括將益生菌包裝在里面，或是將益生菌加在動(dòng)物的詞料和零食里，當(dāng)益生菌喂于鳥及哺乳類，以如此的方式可以增強(qiáng)鳥類與哺乳類的免疫功能，抵抗病原。圖l表示，酸堿度(PH)和黃原膠和殼聚糖膠囊硬度的關(guān)系。圖2表示，益生菌的活性與有無黃原膠和殼聚糖膠囊在減溫的關(guān)系。圖3表示，益生菌的活性與有無黃原膠和殼聚糖膠囊在增溫的關(guān)系。圖4表示，益生菌的活性與有無黃原膠和殼聚糖膠囊在酸性環(huán)境的關(guān)系。圖5表示，益生菌對(duì)抗體產(chǎn)生的效應(yīng)。圖6表示，益生菌對(duì)細(xì)胞免疫的效應(yīng)。圖7表示，被(￡.flcen/M肌"")感染雞糞便中的胞囊蟲。圖8表示，被(￡.acm;w仏Vzfl)或是(五.te"e/fe)感染的雞，糞便中的胞囊蟲。具體實(shí)施例方式有活性的乳酸菌與酵母菌用來喂食給貓狗寵物的益生菌，是被一種微生物的生物多聚合物黃原膠(xanthangum)和殼聚糖(Chiosan)混合保護(hù)包裝而成的。黃原膠(xanthangum)是一種多糖類膠，用很少的量，即可溶解在7JC中，加上些許的攪拌，就變成非常濃稠的溶液，它可以在溶液上形成一層強(qiáng)韌的保護(hù)膜，可以幫助益生菌提高對(duì)熱分解的忍耐度。甲殼素(chitin)也是一種多醣類，大部分是由不分支連的葡萄胺(N-acetyl-glucosamine)單位體。殼聚糖(Chitosan)是一種去除胺基(acetyl)的甲殼素，這種聚合物通常用來處理水，沖洗照相的乳劑以及改進(jìn)人造合成纖維，織布的染色力，和傷口愈合的準(zhǔn)備。益生微生物被包裹在水溶液中，含有0.5-2.5%(重量百分比，重量/體積)的黃原膠(Xanthangum)以及0.2-0.8。/。(重量/容積)的殼聚糖(chitosan)膠囊，此溶液的酸堿度(PH)在2至7之間，比較更適宜的溶液是含有1.25%的黃原膠(xanthan)和0.4M的殼聚糖(chitosan)膠囊(重量/容積)，酸堿度(PH)在4:15，此種被包裹而仍有活性的微生物細(xì)胞每毫升仍能形成10^菌株單位體(cfWml)。將有活性的益生微生物包裹在黃原膠(xanthan)和殼聚糖(chitosan)的混合液中，它能保存微生物的活性，并將正確的活性益生菌的劑量，送到寵物的腸胃中，如此使喂食益生菌給貓狗能達(dá)到最大的效益。通常貓狗都不會(huì)拒絕食用益生菌，包裹在黃原膠(xanthan)和殼聚糖(chitosan)的混合液中。發(fā)明者希望不要被局限在這個(gè)解釋，他們建議當(dāng)益生微生菌包含在黃原膠(xanthangum)和殼聚糖(chitosan)溶液中，特殊的功效是因?yàn)檫@種膠囊混合液形成一處特殊的黃原膠殼聚糖(xanthanchitosan)結(jié)合復(fù)體。這個(gè)復(fù)體在溶液中帶有兩種相交的電極的電解質(zhì)。由于不同的電極互相吸引而形成聚合電解質(zhì)。根據(jù)測(cè)在中性的溶液中，黃原膠(xanthangum)大部分是帶負(fù)電極，而殼聚糖(chitosan)大部分是帶有正電極，這兩種聚合物帶有不同電極在水溶液中，就會(huì)結(jié)合成一個(gè)穩(wěn)定的聚合復(fù)體和強(qiáng)韌的膠囊。當(dāng)酸堿值(PH)升高也就是溶液變?cè)趬A性，就會(huì)使殼聚糖的胺基部分去除(去離子)，使兩種聚合物之間產(chǎn)生比較不穩(wěn)定的結(jié)合，導(dǎo)致成較弱的保護(hù)膠囊。圖1黃原膠(xanthan)和殼聚糖(chitosan)的膠囊的硬度的酸堿值(PH)在2至8之間的關(guān)系。膠囊在上述適常的溶液環(huán)境下形成的。利用TA.XT25可以測(cè)量出膠囊的硬度與韌性，與不同酸堿值的關(guān)系，測(cè)量時(shí)用一個(gè)5公斤測(cè)值器，在距離l毫米下測(cè)量，圖1表示膠囊最強(qiáng)韌尖峰是落在酸堿值3至4之間。當(dāng)酸堿值在6至8之間，膠囊的韌性也相對(duì)減弱，圖1的數(shù)據(jù)也符合前一段理論上的討論。黃原膠(xanthan)和殼聚糖(chitosan)的黃原膠和殼聚糖Xanthanchitosan因正負(fù)兩極相吸形成聚合復(fù)體的穩(wěn)定性與酸堿值有關(guān)。圖2顯示，低溫效應(yīng)下，益生菌的活性與有無黃原膠(xanthan)和殼聚糖(chitosan)的膠囊的關(guān)系。在(TC將有膠囊和沒有膠囊的益生菌置放1小時(shí)，沒有膠囊保護(hù)的活性益生菌數(shù)目從10"菌株體/毫升(cfu/ml)，降至1083,株體/毫升。有膠囊的活性微生物數(shù)目從1093菌株體/毫升，降至109菌株體/毫升，圖2顯示在低溫下，膠囊對(duì)益生微生物的保護(hù)效果。圖3顯示，高溫效應(yīng)下，益生菌的活性與有無黃原膠(xanthan)和殼聚糖(chitosan)的膠囊的關(guān)系。在60°C將有膠囊和沒有膠囊的益生菌置放150秒，沒有膠囊保護(hù)的活性微生菌數(shù)目從109菌株體/毫升降至107菌株體/毫升。有膠囊的活性微生菌數(shù)目從109菌株體/毫升降至108'9菌株體/毫升。圖3顯示，在高溫下，膠囊對(duì)益生微生物的保護(hù)效果。圖4顯示，在酸堿質(zhì)低(酸性溶液)時(shí)，益生菌的活性與有無黃原膠(xanthan)和殼聚糖(chitosan)的黃原膠膠質(zhì)(xanthan)和殼聚糖聚甲殼糖(chitosan)的混合液膠囊的關(guān)系。將有膠囊與沒有膠質(zhì)膜的益生菌，放置在酸堿值2的環(huán)境下0至60分不鐘等，在30分鐘后，沒有膠囊的活性微生菌從原來109降至10"菌株體/毫升，在60分鐘后，降至1055菌株體/毫升。有膠囊的活性微生菌從原來109降至10"菌株體/毫升，在30分與60分鐘后，圖4顯示，在酸性高的溶液，膠囊對(duì)益生微生物的保護(hù)效果！益生菌可作為替代醫(yī)藥，可以替適燒烤的雞防衛(wèi)寄生蟲引起的傳染病。鳥類的球蟲病是在家禽養(yǎng)殖業(yè)最常見，最主要的寄生蟲病，嚴(yán)重可以致死，輕者造成消化不良，吸收不佳，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，并減少下蛋的機(jī)會(huì)(Lillehojetal.,2004)。球蟲病最明顯的病狀就是抑制生長(zhǎng)，減緩體重的增加，在比較嚴(yán)重的狀況，會(huì)減輕體重，這些都會(huì)影響到家禽業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益(DalloulandLillehoj,2006)。目前，藥物及活菌疫苗是兩種主要漢療球蟲病的方法，但是由于使用預(yù)防疫病的藥物管理手續(xù)增多，以及疫苗成本提高，替代治療方法的需求也就相對(duì)提高，對(duì)于被艾美爾球蟲感染的子雞，雖然觀察到雞體內(nèi)的抗體增加，但是細(xì)'胞免疫性的增加，才是治療疾病的根本基礎(chǔ)(DalloulandLillehoj,2004)。最近益生菌研究的進(jìn)展，證明活的細(xì)萬可以影響寄主體液免疫性增加，尤其是對(duì)由輪狀病毒(rotavirus)、大腸菌(E.coli)及沙門桿菌(Salmonella)引起有關(guān)腸的疾病(IsolauriE.,2003;Majamaa,etal1995;Perdigonetal2001)。為了更有效使用益生菌成為一種替代醫(yī)藥，對(duì)抗由艾美爾球蟲引起的傳染病，我們必須要證明使用益生菌喂食并被艾美爾球蟲感染的子雞，其雞體內(nèi)的體液免疫及細(xì)胞免疫均有提高，并有很好的效果。檢査使用益生菌對(duì)被艾美爾球蟲感染的子雞，在其體任何所產(chǎn)生任何可能的毒性。.將15-20只一天大的小雞，列為一組，共有6組。從第一天起喂予不同的飼料，一組是對(duì)照組只喂食一般市面上的飼料，另外喂食添加益生菌。乳酸片球菌(P^/A7^^c/)的詞料，在喂食有益生菌的飼料中又分為五種不同的飼料，依照不同濃度的益生菌區(qū)分成0，0.01%，0.05%，0.1%及0.4%。在第10天，除了對(duì)照組的變化(沒有喂食乳酸片球菌i^^Vcoccttfac/A7a"/c/，沒有感染)，其他所有的子雞都給予口服感染5000個(gè)艾美爾球蟲(&'mw/aacervw/Z"a)的發(fā)芽的卵囊蟲。在感染后的第0，6，9天之后，測(cè)量所有小雞的重量，并記錄他們體重的增值數(shù)。在感染后6天，開始收集小雞的糞便，連續(xù)收集4天(感染后第6天到第9天)，收集糞便放于小桶內(nèi)，并記錄糞便中的卵囊蟲。將不同實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組所收集的數(shù)據(jù)差異，以"差異分析"(ANOVA)用統(tǒng)計(jì)的程式GRAPJIPADINSTAT分析，這是統(tǒng)計(jì)軟體程式的注冊(cè)商標(biāo)，是由GraphPad軟件公司所設(shè)計(jì)的。公司位于圣地牙哥，加利佛尼亞州。數(shù)據(jù)是這個(gè)程式分析后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組之間與對(duì)照組有明顯的差異，其概率P0.05，此外還用Dunnett比較試驗(yàn)法，來比較每組的中間值。圖表1(TABLE-US-00001)顯示乳酸片球菌(尸ocfococcwsa"A7fl"/c/)對(duì)被球蟲菌感染的子雞的生長(zhǎng)以及雞糞中卵囊蟲的數(shù)目卻有明顯的影響與作用。首先檢視子雞被5000個(gè)艾美爾球蟲的卵囊蟲感染后1-9天體重增加的比較，一共有6組，依序?yàn)?，2，3，4，5，6。每組給0，5000，5000，5000，5000個(gè)卵囊蟲。以及喂不同百分比的乳酸片球菌(P.acidilactici)，分別是0%，0%，0.01%，0.05%，0.1%和0.4%。平均每組的體重增值依次為396克，343克，362克，366克，395克和382克，其標(biāo)準(zhǔn)差為45，51，58，36，44。其次在糞便中所收集的艾美爾球蟲的卵囊蟲每組平均值依次約為0x108，2.65x108，1.97x108，2.39x108,1.39x108，2.10x108，其標(biāo)準(zhǔn)差為0.67，0.50，0.27，0.23，0.60。A.被5000個(gè)發(fā)芽卵囊蟲感染后子雞1-9天體重增加量，以克為單位。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>當(dāng)想要將一個(gè)試劑應(yīng)用成為一個(gè)新的藥物之前，一定要去除此試劑會(huì)產(chǎn)生任何有毒素的副作用之可能性，然后才能運(yùn)行應(yīng)用這試劑，做各種數(shù)能的研究。乳酸片球菌(P"c^/""/d)是一種自然生長(zhǎng)在動(dòng)物和人類腸內(nèi)的微生物，從來沒有任何文獻(xiàn)上記載，這種乳酸片球菌有明顯的毒害作用。為了要確保調(diào)查乳酸片球菌有可能造成對(duì)這種適合嫩雞產(chǎn)生毒害的副作用，我們喂0.1-0.4%的乳酸片球菌給嫩雞或是被艾美爾球蟲發(fā)芽卵囊蟲(五.acen^/^")感染的雞。如同表1A顯示，無論是否被艾美爾球蟲感染的嫩雞，只要喂食乳酸片球菌，就沒有體重減輕或是狹死的現(xiàn)象。更進(jìn)一步的結(jié)果顯示，被艾美爾球蟲感染的嫩雞喂能混合種的益生菌，也就是說乳酸片球菌Pac/A7fl改'c)與布拉酵母菌CS.&^^^7)濃度分別為0.01%和1.0%。這些被感染的雞在感染期間，體重反而增加比較多，整個(gè)實(shí)驗(yàn)的過程當(dāng)中，我們?cè)谖挂嫔o雞吃之后，沒有觀察到任何主要器官有任何變化。這些器官包括，肝、心臟、腎、脾。此項(xiàng)'實(shí)驗(yàn)與類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明被艾美爾球蟲感染的嫩雞，可以喂以比正常濃度高40倍的稚球乳酸菌(也就是說，-濃度在0.01%至0.4。/。)或是喂以混合乳酸片球菌和布拉酵母菌濃度可以從O.Ol高達(dá)至1.0%，都不會(huì)偵察到任何形態(tài)上的變化。為了證明乳酸片球菌(尸"c/A7a"/c)可以用來防御子雞被艾美爾球蟲感染所產(chǎn)生的病癥。我們觀察是否使用乳酸片球菌來喂雞，然后再口服一種艾美爾球蟲的發(fā)芽卵囊蟲(五/附^&^//^")。有趣的是被感染艾美爾球蟲的子雞，又喂以乳酸片球菌顯示卵囊蟲的數(shù)目量減少比沒有喂食乳酸片球菌的子雞產(chǎn)生的卵囊蟲數(shù)大約少20-40%百分比(參見圖7)。在相似的狀況下，我們觀察到當(dāng)子雞被五.acervw/f"a感染時(shí)，若喂以混合兩種益生菌乳酸片球菌和布拉酵母菌，卵囊蟲的數(shù)目會(huì)減少到30-50%百分比。當(dāng)子雞被五.化//6朋感染，又喂以同樣的混合益生菌，卵囊i的數(shù)目比沒有喂食益生菌的雞減少10-20%(參見圖8)，因此這些結(jié)果顯示益生菌可以減低病原或是寄生蟲對(duì)雞體內(nèi)的損害。喂食益生菌可以使被艾美爾球蟲感染的嫩雞，刺激雞體內(nèi)的體液免疫反應(yīng)。圖5顯示在喂食濃度不同的益生菌混合種(乳酸片球菌和布拉酵母菌)。以沒有益生菌混合種(以NOR代表)，0.1%或0.2%的比例摻和益生菌混合種在一般的飼料中喂食21天(以MG0.1和MG0.2代表)，檢驗(yàn)雞體內(nèi)產(chǎn)生抗艾美爾球蟲的抗體(Anti-ETMICZ)反應(yīng)。比較孵化12天后沒有被感染的子雞，'和被5000個(gè)艾美爾球蟲(五.^朋//0)的卵囊蟲感染子雞，在感染卵囊蟲后10天，取雞的血清，檢驗(yàn)抗艾美爾球蟲的抗體。雞體內(nèi)產(chǎn)生抗艾美爾球蟲的抗體(Anti-ETMICZ)反應(yīng)不同，每一個(gè)帶狀條代表中間值加減標(biāo)準(zhǔn)差(N-3)，被感染艾美爾球蟲的雞和沒有被感染的雞，他們的中間值有明顯的不同，概率小于0.05(P<0.05)。為了評(píng)估抗體對(duì)艾美爾球蟲抗原，ETMIC2的反應(yīng)。ETMIC2是艾美爾球蟲中的一種五/wer/a蛋白，它的基因已經(jīng)被分離出來，并加以分析評(píng)估(Dallouletal,2006)并用ELISA檢定雞體內(nèi)的血清。在所有被艾美爾球蟲(￡.fe"e〃力感染的子雞，他們的血清中明顯的都引起產(chǎn)生對(duì)艾美爾球蟲蛋白的抗體。更進(jìn)一步說，在使用喂食益'生菌乳酸片球菌CPfl"力7ac"c/)又被蟲感染的雞，他體內(nèi)的血清對(duì)艾美爾球蟲的抗體，明顯的高過沒有喂食益生菌又被蟲感染的雞，體內(nèi)血清中的抗體，其概率PO.05(如圖5)。這項(xiàng)結(jié)果明顯的證明益生菌乳酸片球菌CPac/^7a"/"')是能夠刺激產(chǎn)生體液免疫性的抗體，來抵抗特定的寄生蟲感染的嫩雞。全身性的細(xì)胞免疫性反應(yīng)，淋巴球的繁殖。圖6顯示ConcanavalineA(conA)可以導(dǎo)引脾細(xì)胞的繁殖。當(dāng)嫩雞感染艾美爾球蟲后，又喂食普通飼料或含有不同濃度0.01%，0.1%或1.0%'的混合益生菌乳酸片球菌和布拉酵母菌用5000個(gè)艾美爾球蟲￡.acerra"朋(EA)或是&"e//a(ET)的卵囊蟲感染孵化14后天的子雞，取出脾細(xì)胞加以培養(yǎng)，并加入conA繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，接著用含有放射性的[SH]-thymidine，來測(cè)量細(xì)胞繁殖，每一個(gè)帶狀條代表中間值加減標(biāo)準(zhǔn)差(N:3)。感染不同種的艾美爾球蟲(EA或是ET)的雞，他們細(xì)胞繁殖的中間值不同。概率(P)小于0.05(P<0.05)。我們利用被艾美爾球蟲感染的嫩雞，一組喂食普通飼料，另一組喂食含有益生菌的飼料，利用conA促使脾細(xì)胞繁殖反應(yīng)的檢測(cè)，來決定是否被喂食含有益生菌如乳酸片球菌的雞能產(chǎn)生全身性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，來對(duì)抗艾美爾球蟲的感染。在被EA艾美爾球蟲感染的嫩雞中，喂以含有0.1%益生菌的嫩雞，他們的脾細(xì)胞繁殖速'度明顯的比其他任何一組喂以不同飼料嫩雞的脾細(xì)胞都快(P0.05)。這些不同的飼料是指普通不含益生菌或是含有不同濃度的益生菌飼料，在被ET艾美爾球蟲感染的嫩雞中，喂食以含有0.01%和0.1%益生菌的嫩雞組，明顯的顯示他們的脾細(xì)胞在受conA的刺激下，繁殖速度比其他實(shí)驗(yàn)組快，而喂以0.1%益生菌的雞之脾細(xì)胞繁殖速度又比0.01%的快。圖7顯示比較被艾美爾球蟲E(ET)感染的嫩雞，被艾美爾球蟲ET，感染的雞糞中卵囊蟲的數(shù)目。喂食普通的飼料(REG)或是含有0.1M益生菌(MG0.1)或是含有0.2。/。的益生菌(MG0.2)。感染后的6至9天，每天收集雞糞中的卵囊蟲。MG代表含有雞球乳酸菌的飼料，每一個(gè)帶狀條代表中間值加減標(biāo)準(zhǔn)差(N-5個(gè)籠子)。圖8，用5000個(gè)艾美爾球蟲的卵囊蟲(EA或是ET)，感染12天孵化后的子雞雞糞中卵囊蟲的數(shù)目，在感染，這些被感染的子雞喂食普通詞料(REG)，含0.01%的混合益生菌(MO.Ol)，0.P/。(M0.1)或1.0%(M1.0)。M是代表混合乳酸片球菌(Pac/^7fl"/c/)和布拉酵母菌(S.Zww/aWz7)，每一個(gè)帶狀條是代表中間值加減標(biāo)準(zhǔn)差^=5籠)。益生菌可做為狗消化不良或是狗受病毒感染的替代醫(yī)藥。益生菌的應(yīng)用——對(duì)于狗消化不良的疫病。應(yīng)用益生菌成功的例子邁特靈MITOMAXTM，是一種混合乳酸片球菌(尸acW/a"/c/)和布拉酵母菌(S.6oM/flW/Z)益生菌。它可以幫助子雞抵制艾美爾球蟲的感染，使我們想進(jìn)一步的做田間試驗(yàn)來評(píng)估是否邁特靈MITOMAXTM可以幫助解決狗消化不良的問題。邁特靈MITOMAXTM是益生菌的注冊(cè)商標(biāo)，屬于ImagilinTechnology,LLC，位于波多馬克，馬里蘭州。它是混合乳酸片球菌(尸flcM/a"/W和布拉酵母菌(S.Z)owto^7)被包裝在明膠的膠囊中。這個(gè)田間評(píng)估是與巴西圣保羅3家動(dòng)物醫(yī)院的4位獸醫(yī)進(jìn)行合作實(shí)驗(yàn)(表2)，狗的體重分布于2公斤到26公斤，狗齡大約1歲至15歲不等。這些狗都總有不同程度的腸胃消化不良的病癥，每天喂以1顆或2顆的益生菌，按狗的體重來決定是1顆還是兩顆。經(jīng)過14天使用益生菌的治療，大部分的狗都有明顯的改進(jìn)，不再受消化不良的現(xiàn)象。這項(xiàng)結(jié)果很明確的顯示，益生菌對(duì)于治療消化不良的狗有很好的效果。表2(TABLE-US-0002)將益生菌對(duì)治療狗消化不良的田間試驗(yàn)^H故的總結(jié)，此項(xiàng)田間試驗(yàn)是在巴西圣保羅的動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行的。表2益生菌對(duì)有消化不良病癥的狗患的田間評(píng)估，評(píng)估是在巴西圣保羅市的動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)'行。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*:消化不良有不同的病癥，分為0=腹瀉，V^區(qū)吐，。=便秘，OCH本臭，F(xiàn)二腸胃脹氣，LA:失專胃口，病情程度++++=非常嚴(yán)重，+++=嚴(yán)重，++=輕微到嚴(yán)重之間，+=輕微。**:益生菌治療是指口服邁特靈MITOMAX的膠囊包含了混合乳酸片球菌和布拉酵母菌。如果狗的體重少于20公斤，每天口服一顆邁特靈MITOMAX,如果狗的體重超過20公斤以上，每天2顆邁特靈MITOMAXTM。益生菌是一種替代醫(yī)藥，可用來停止狗因小病毒感染引起'的血性腹瀉。被小病毒感染的狗，會(huì)有嚴(yán)重的腸、胃癥狀，如嘔吐和血性腹瀉。被感染的小狗，如果沒有適當(dāng)?shù)尼t(yī)療，幾天內(nèi)就會(huì)病死，因?yàn)檫@是病毒引起的疾病，抗生素不能有效的撲減病毒，狗的復(fù)健是依賴狗的免疫系統(tǒng)來對(duì)抗小病毒的感染，擴(kuò)散，因此這會(huì)是很好的實(shí)例來描述益生菌用來做替代醫(yī)藥處理被小病毒感染的小狗。四只已被檢試證實(shí)受小病毒感染的小狗，雖然經(jīng)過綜合抗生素的處理后，血性腹瀉還是無法停止，這四只小狗喂食益生菌混合乳酸片球菌CP"C/A7"C"C^和布拉酵母菌'(S.tow/"W/"，2-3天后血性腹瀉完全停止，大便也恢復(fù)正常的塊狀，經(jīng)過連續(xù)2個(gè)星期服用益生菌，也沒有任何的復(fù)發(fā)個(gè)案(表3)。表3益生菌對(duì)小病毒感染狗的療效*。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*:由加州蘭卡斯特的動(dòng)物急救診所的Dr.Volkenbourgh,DVM所執(zhí)行。":標(biāo)準(zhǔn)小病毒感染狗的處理是用綜合抗生素(NoraiosolR,Reglan，Cefazolin，MetronidazoleorAmpiliccin，+/-Famotidine)于感染的小狗，有些狗會(huì)接受多糖淀粉(hetastarch)或血漿運(yùn)送。益生菌的處理是喂用1天1顆邁特靈MITOMAX—乳酸片球菌PacW/a化W和布拉酵母菌S.6ow/aW"'的綜合劑。益生菌對(duì)動(dòng)物和人體的效用取決于益生菌的活性，膠質(zhì)囊包裝的益生菌，經(jīng)過貯藏在低溫4GC或常溫25QC，二年后，貯藏后的活性益生蘆的數(shù)目被檢試到和原來的益生菌的活性數(shù)目是相似的。艾美爾球蟲感染的嫩雞，喂食飼料，包含0.01%到0.4%的益生菌乳酸片球菌PacW//a"/c/后，形態(tài)上或體重上和沒有被感染的嫩雞，'沒有明顯的差別。類似的結(jié)果也同樣在不同的種艾美爾球蟲(EA或ET)感染的嫩雞得到。益生菌(乳酸片球菌Pac/A7""/c/或乳酸片球菌Pac/^7flc,/c/和布拉酵母菌S.6w/wA7的綜合劑)對(duì)于艾美爾球蟲感染的嫩雞的效用，取決于l.從大便樣品抽取卵囊數(shù)目的減少量2.促進(jìn)小雞制造抗體3.促進(jìn)小雞脾細(xì)胞的繁殖，益生菌(乳酸片球菌Poc/fiWfl"/c/或乳酸片球菌PflC7V/z7a"/c/和布拉酵母菌S.tow/an力7的綜合劑)。從動(dòng)楊醫(yī)療診所的田間試驗(yàn)評(píng)估，證明對(duì)腸胃消化病，如瀉肚，嘔吐，喪失食欲，口臭是有效果的。最重要的是，口服益生菌綜合劑(乳酸片球菌Pac/A/a"/c/和布拉酵母菌51.^M/aW/02-3天后，被小病毒感染的犬類，健康能立即恢復(fù)，這些結(jié)果描述益生菌可用來做代替醫(yī)藥，對(duì)付傳染性疾病。最適合的益生菌是酵母菌和乳酸菌，乳酸菌是小球菌屬(尸W/ococc船)、乳酸桿菌屬(丄acto6(2c"/MS)、桿菌屬(5flc/〃ws)、雙歧桿菌屬(說yktoZ)ac&n.wm)、鏈球菌屬(5^印tococc"力、腸球菌屬CE"feracoccw50或酵母菌屬。酵母菌屬是Saccharomyces,囊包益生菌對(duì)致病的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲和單胞體是有醫(yī)療效果的。.囊包益生菌對(duì)鉤蟲、蛔蟲、鞭蟲，絳蟲是有醫(yī)療效果的，囊包益生菌對(duì)球蟲，如賈第蟲屬是有效果的。當(dāng)人感染傳染性腸胃病后，服用適當(dāng)劑量的囊包益生菌，囊包益生菌對(duì)抗人體傳染性腸胃病是有效的，囊包益生菌對(duì)抗魚類傳染性腸胃病是有效的，粉狀益生菌和囊包益生菌是有相似的醫(yī)療效果的。權(quán)利要求1.一種益生微生物組合物，其包括至少一種包囊在明膠中、或黃原膠與殼聚糖的混合物中的益生微生物。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述益生微生物是酵母菌或乳酸菌。3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述益生微生物是小球菌屬(尸e&ococc船)、乳酸桿菌屬(丄a"okzc/〃w》、桿菌屬(5fld〃附)、雙歧桿菌屬0B訴(/o6acten'wm)、鏈球菌屬(&reptococcws)、或腸球菌屬C&7化racoccws)細(xì)菌或酵母菌屬4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述小球菌屬細(xì)菌是乳酸片球菌(戶e^ococc^ac/力&"/"')，或者所述酵母菌屬酵母是布拉釀酒酵母5.—種調(diào)節(jié)寄主對(duì)抗原的免疫反應(yīng)以及治療鳥類、魚類以及哺乳類動(dòng)物的傳染病的方畢，所述方法包括向需要增強(qiáng)所述免疫反應(yīng)的寄主或向需要所述治療的鳥類、魚類或哺乳類動(dòng)物施用如權(quán)利要求1所述的益生微生物組合物。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述益生微生物包含在動(dòng)物的食物、寵物的零食、動(dòng)物的風(fēng)味料、發(fā)酵過的乳制品或酸奶中。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述鳥類是雞、鸚鵡、長(zhǎng)尾小鸚鵡、鵒子、火雞、鴨或鵝。8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述哺乳類是狗、貓、天,鼠、亞洲大鼠、老鼠、兔子、猴子、猩猩、豬或人。9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述傳染病由病原性細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或原生動(dòng)物引起。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述病毒是細(xì)小病毒(pan/ov/n^)、輪狀病毒(ratov/r船)或流行感冒病毒(〖"yMe/zavzV^)。11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述寄生蟲是鉤蟲、蛔蟲、鞭蟲或絳蟲。12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述原生動(dòng)物是艾美爾球蟲(五/men》)、賈第蟲(Gfarafe)、隱？包子蟲(Co^tos;w〃Vif"w)、弓形蟲(rcwcp/aswa)、培原蟲(尸/oswc^'ww)、萊什曼原蟲(丄eis/zwflm.a)或是環(huán)包子蟲(C>c/o5p3ra)。13.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)是增加抗體的產(chǎn)生或增加T細(xì)胞及輔助T細(xì)胞的繁殖。14.一種增強(qiáng)鳥類、魚類和哺乳類動(dòng)物對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的方法,所述方法包括向所述鳥類、魚類或哺乳類動(dòng)物施用如權(quán)利要求1所述的^生微生物組合物。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述增強(qiáng)免疫反應(yīng)包括增加抗體的產(chǎn)生或增加T細(xì)胞的繁殖。16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述益生微生物包含在動(dòng)物的食物、寵物的零食、動(dòng)物的風(fēng)味料、發(fā)酵過的乳制品或酸奶中。17.—種益生微生物組合物，其包含至少一種粉狀益生微生物。全文摘要在這項(xiàng)提案，提供一個(gè)具代表性的新體系，是用來改進(jìn)喂食益生菌的方法。將益生菌特別是乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和布拉酵母菌(Saccharomycesboulardii)混合在不同的膠質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，包括黃原膠(Xanthan)，殼聚糖(chitosan)或明膠(gelatin)。使用這種混合膠質(zhì)保護(hù)，可以保護(hù)益生菌的活性，并幫助抵抗，多種惡劣的環(huán)境和不利生長(zhǎng)的溫度。這種具代表性的新方法也提供多種方法，用有活性的益生菌，贊助治療，鳥類及哺乳動(dòng)物的傳染病。此外，益生菌也能常作輔佐劑，以提高抗體的產(chǎn)生，以及促進(jìn)細(xì)胞性的免疫效果。更特別的是使用益生菌在此提示，可以減少糞便中卵囊蟲的數(shù)目，增加抗體的產(chǎn)生。在被艾美爾球蟲感染的雞，能促進(jìn)脾細(xì)胞(splenocytes)的繁殖，此外如被小病毒(parvovirus)感染的狗，益生菌也能減輕他的病癥。文檔編號(hào)A61K36/064GK101172118SQ200710139878公開日2008年5月7日申請(qǐng)日期2007年7月25日優(yōu)先權(quán)日2006年7月26日發(fā)明者林哲志申請(qǐng)人:美國(guó)醫(yī)邁科技有限公司