專(zhuān)利名稱(chēng)：：真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在抑制△5-去飽和酶中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的新用途。
背景技術(shù)：
：花生四烯酸(arachidonicacid,ARA)是co-6多元不飽和脂肪酸代謝過(guò)程的產(chǎn)物。在自然狀況下，ARA極少以游離形式存在于細(xì)胞內(nèi)，一般都存在于細(xì)胞膜的磷脂上，特別是在卵磷脂、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺的第二個(gè)碳的位置上。當(dāng)細(xì)胞受外來(lái)刺激活化時(shí)(包括物理性、化學(xué)性、生理性或其它物質(zhì))，細(xì)胞膜的磷脂可藉由磷脂酶的活化與作用，而將磷脂上的ARA水解并釋出游離的ARA。而游離的ARA經(jīng)由環(huán)氧化酶(cyclooxygenases,COX)或脂質(zhì)氧化酶(lipoxygenases,LOX)的酶促反應(yīng)，會(huì)快速形成一些可以提供細(xì)胞內(nèi)外信息的脂質(zhì)介體一也稱(chēng)為類(lèi)二十酸。這些ARA的代謝產(chǎn)物將會(huì)影響生物反應(yīng)的程序，包含發(fā)炎反應(yīng)。這些產(chǎn)物可以很快地形成并作用在受刺激或感染的地方，然后再以自發(fā)性的衰退或借助酶而被破壞。所述類(lèi)二十酸包括前列腺素和凝血噁烷。前列腺素與凝血噁烷根據(jù)其結(jié)構(gòu)可被分為PGD、PGE、PGG、PGH或TXA、TXB;或根據(jù)其具有的雙鍵數(shù)量前列腺素可被分為PGE1、PGE2或PGE3，其中與引起發(fā)炎(pro-inflammaotry)有關(guān)的是PGE2、PGD2與TXA2。每一種類(lèi)二十酸皆由其它特別的酶衍生而來(lái)，這些酶有些是分布于特定的組織中，例如TXA2就是由含有凝血噁烷合成酶的血小板產(chǎn)生的。PGD2主要是肥大細(xì)胞經(jīng)由環(huán)氧化酶路徑^j射產(chǎn)生的。同時(shí)，前列腺素與發(fā)炎反應(yīng)中熱與痛的發(fā)病現(xiàn)象有關(guān)，其中PGE2與痛覺(jué)過(guò)敏有關(guān)，即其可以促使皮膚對(duì)于疼痛具有高度的過(guò)敏現(xiàn)象，隨后，組織胺與緩動(dòng)素與細(xì)胞激素相互作用而產(chǎn)生發(fā)熱現(xiàn)象。亞麻酸(linolenicacid，LA)是一種co-6多元不飽和脂肪酸，經(jīng)過(guò)A6-去飽和酶的作用后，會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)?，亞麻?gamma-linolenicacid，GLA)。GLA是人類(lèi)或動(dòng)物代謝亞麻酸的第一個(gè)產(chǎn)物，上述步驟的反應(yīng)速率相當(dāng)緩慢，是多元不飽和脂肪酸代謝的速率決定步驟。在延伸酶(elongase)的作用下，絕大部份的GLA會(huì)立即轉(zhuǎn)變?yōu)槎?Y-亞麻酸(dihomo-g-linolenicacid，DGLA),然后經(jīng)過(guò)A5-去飽和酶的作用，部分DGLA就會(huì)形成ARA。而另一部分DGLA則經(jīng)過(guò)COX的作用，形成抗發(fā)炎性的類(lèi)二十酸PGE1，形成的PGE1會(huì)顯著抑制發(fā)炎性的類(lèi)二十酸PGE2的形成。在o)-6多元不飽和脂肪酸的代謝過(guò)程中，A6-去飽和酶與A5-去飽和酶是兩個(gè)決定反應(yīng)速率的酶，特別是A5-去飽和酶，它決定了體內(nèi)ARA的形成。GLA主要來(lái)自幾種特殊植物的種子，例如含有23%的玻璃苣籽油(BorageOil)、18%的黑醋栗籽油(BlackcurrantSeedOil)以及9%的月莧草籽油(EveningPrimoseoil)。在動(dòng)物體內(nèi)則是極少出現(xiàn)。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證實(shí)GLA具有抗發(fā)炎以及調(diào)節(jié)免疫能力的功效。A6-去飽和酶極易受到年紀(jì)、體內(nèi)荷爾蒙以及疾病狀態(tài)的影響而減低活性，相應(yīng)地，其體內(nèi)GLA含量也較低。在體內(nèi)，A6-去飽和酶的活性也會(huì)隨著各種疾病，包括關(guān)節(jié)炎，糖尿病，高血壓，濕滲和牛皮癬而下降。除此以外，生活模式因素如壓力、吸煙、酒類(lèi)、亞麻酸以及飽和與反式脂肪酸過(guò)高的相關(guān)產(chǎn)品，以及維生素B6、鋅和鎂的缺乏等都會(huì)抑制A6-去飽和酶的活性。上述原因皆會(huì)減少GLA的在體內(nèi)的生成，GLA含量的減少相對(duì)也減少DGLA在體內(nèi)的含量，而進(jìn)一步導(dǎo)致DGLA與ARA共同竟?fàn)幁h(huán)氧化酶/脂質(zhì)氧化酶的情況失去平衡，使得ARA大量產(chǎn)生發(fā)炎性前列腺素。近年來(lái)，有不少研究機(jī)構(gòu)嘗試找出抑制A5-去飽和酶的有效物質(zhì)。但是效果皆不理想，且現(xiàn)有的抗發(fā)炎藥物在患者體內(nèi)容易產(chǎn)生抗藥性，故效果不佳。因此，有必要提供一種新型抗炎藥物以滿(mǎn)足發(fā)炎患者的需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(fUngiimmunodulatoryprotein,FIP)在抑制△5-去飽和酶中的應(yīng)用。所述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白優(yōu)選為靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白或金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。其中該抑制A5-去飽和酶活性是用于預(yù)防或治療由△5-去飽和酶、花生四烯酸、或發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度失調(diào)所引發(fā)的慢性或急性發(fā)炎反應(yīng)、發(fā)炎癥狀或發(fā)炎疾病。所述發(fā)炎疾病為氣喘、動(dòng)脈硬化、肥胖、糖尿病、腸胃疾病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、牙周病、癌癥、自體免疫性疾病、過(guò)敏、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、月經(jīng)痛或痛風(fēng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在抑制A5-去飽和酶時(shí)還應(yīng)用Y-亞麻酸。所述Y-亞麻酸來(lái)自于植物或微生物食品的萃取物。本發(fā)明所述預(yù)防或治療發(fā)炎反應(yīng)為以下兩種成分的作用機(jī)制的加成效果(a)通過(guò)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白抑制A5-去飽和酶的作用，并減少花生四烯酸的濃度，進(jìn)而降低發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度，及(b)"亞麻酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)槎?Y-亞麻酸并增加其濃度，大量形成抗發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，在在抑制△5-去飽和酶時(shí)還應(yīng)用二高-y-亞麻酸。通過(guò)抑制A5-去々包和酶的活性，可降低ARA的生成量，從而降^f氐由ARA轉(zhuǎn)變而成的類(lèi)二十酸的量；或者，增加DGLA的濃度，而A5-去飽和酶的含量不變，則體內(nèi)的DGLA無(wú)法大量轉(zhuǎn)變?yōu)锳RA，進(jìn)而使DGLA的濃度高于ARA。本發(fā)明借助對(duì)co-6多元不飽和脂肪酸代謝的調(diào)控，而提供一種新型抗炎藥，幫助患者減輕不舒服的癥狀。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白，于1989年由日本學(xué)者Kino等人自G./M"WMm菌絲體中分離出來(lái)，命名為L(zhǎng)Z-8(LingZhi-8)。LZ-8由110個(gè)氨基酸所組成，分子量為12,420Da，并且與免疫球蛋白重鏈區(qū)的可變區(qū)域的氨基酸序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)有某種程度的相似性。LZ-8原態(tài)(nativeform)是以同源二聚體的形式存在，具有促進(jìn)淋巴球增殖以及抑制全身性過(guò)敏反應(yīng)(systemicanaphylaxisreaction)和局部過(guò)敏反應(yīng)(Arthusreaction)的作用。此外，LZ-8對(duì)于綿羊紅血球會(huì)產(chǎn)生凝集作用，對(duì)人類(lèi)紅血球卻不發(fā)生任何凝集反應(yīng)，這顯示LZ-8在人體醫(yī)學(xué)上有其應(yīng)用的潛力。本發(fā)明所述的"抑制A5-去飽和酶活性"，可用于預(yù)防或治療由A5-去飽和酶、ARA或發(fā)炎性(pro-inflammatory)類(lèi)二十酸的濃度失調(diào)所引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)、癥狀與疾病。此類(lèi)疾病較佳的具體實(shí)例包括但不限于，氣喘(JoftheAmericanDieteticAssociation,January2005，98-106)、動(dòng)脈硬化(Prostaglandins,LeukotrienesandEssentialFattyAcids76(2007)251-268)、肥胖(Nutrition，2001;17,953-966)、糖尿病(JLipidRes.2006Sep;47(9):2028-41.;ProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids.2003Feb;68(2):151畫(huà)62;)、腸胃疾病、潰瘍性結(jié)腸炎(Clin.Sci.,1987,73，361-364)、克羅恩氏病(Clin.Sci.，1987,73,361—364)、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎(JointBoneSpine.2005Dec;72(6):533國(guó)9.Epub2004Dec15)、骨質(zhì)疏松(Clin.Nutr.,2000,19,271-276)、牙周病(Clin.Nutr.,2000,19，271-276)、癌癥(RecentResultsCancerRes,2007;174:37-47.;Toxicology.2000Nov16;153(1-3):1l國(guó)26.)及自體免疫性疾病(Lipids.2003Apr;38(4):323國(guó)41.;ProcNutrSoc.1998Nov;57(4):555國(guó)62.)、過(guò)敏(CurrDrugTargetsInflammAllergy.2005Apr;4(2):151-5.)、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RheumatolInt.2003Jan;23(1):27-36.Epub2002Sep6.)、月經(jīng)痛或痛風(fēng)(ArthritisRheum.2000Aug;43(8):1779-89.;Inflammation.1997Apr;21(2):205畫(huà)22)等慢性或急性發(fā)炎疾病(EquineVetJ.1984May;16(3):163-75)。本發(fā)明所述的"真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白"包括但不限于，靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(LZ-8，F(xiàn)IP-gts)或金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-fVe)。本發(fā)明所述的"抗發(fā)炎，，是通過(guò)抑制A5-去飽和酶的作用，并減少花生四烯酸的濃度，進(jìn)而降低發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度。本發(fā)明的藥物中可包含Y-亞麻酸，其用于預(yù)防或治療由A5-去飽和酶、花生四烯酸或發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度失調(diào)所引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)、癥狀與疾病。該疾病較佳具體實(shí)例包括但不限于氣喘、動(dòng)脈硬化、肥胖、糖尿病、腸胃疾病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、牙周病、癌癥、自體免疫性疾病、過(guò)敏、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、月經(jīng)痛或痛風(fēng)的發(fā)炎疾病。詳言之，預(yù)防或治療發(fā)炎反應(yīng)為以下兩種成分的作用機(jī)制的加成效果:(a)借助真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白抑制A5-去飽和酶的作用，并減少花生四烯酸的濃度，進(jìn)而降低發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度，及(b)GLA可以轉(zhuǎn)變?yōu)镈GLA并增加其濃度，大量形成抗發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度，抑制發(fā)炎性類(lèi)二十酸的形成。本發(fā)明中的GLA可來(lái)自于植物或微生物食品的萃取物，可從市場(chǎng)上購(gòu)得或通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法制備而成。圖1為co-6多元不飽和脂肪酸的代謝圖；圖2為rFIP的細(xì)胞毒性MTT分析結(jié)果；圖3為GLA的細(xì)胞毒性MTT分析結(jié)果；圖4為DGLA為100M時(shí)，rFIP對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的A5-去飽和作用、DGLA與ARA的影響；圖5為DGLA為25M時(shí)，rFIP對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的A5-去飽和作用、DGLA與ARA的影響；圖6為不同濃度的GLA與rFIP對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的A5-去飽和作用、DGLA與ARA的影響。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(flmgiimmunodulatoryprotein,FIP)在A5畫(huà)去飽和酶中的新應(yīng)用。所述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白為靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白或金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。本發(fā)明的應(yīng)用中還可包括Y-亞麻酸。一、實(shí)驗(yàn)材料與測(cè)試l丄rFIP(重組真菌免疫蛋白)的制備與活性測(cè)試?yán)媒湍妇?Saccharomycescerevisiae)表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)rFIP。依據(jù)酵母菌營(yíng)養(yǎng)需求篩選出帶有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)形面包酵母菌抹，經(jīng)由Westernblot方式確認(rèn)篩選出帶有rFIP的酵母菌。測(cè)試蛋白質(zhì)的純度與rFIP活性。純化的rFIP濃縮液保存于-20。C以供實(shí)驗(yàn)使用。1.2.RAW264.7巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞，由BALB/c小鼠以Abelson鼠白血病度引發(fā)而來(lái)，購(gòu)自食品工業(yè)發(fā)展研究所。以含10。/。FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37。C、5。/。C02的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%匯合時(shí)，移除培養(yǎng)液同時(shí)添加少量的培養(yǎng)液，利用刮杓將細(xì)胞從75T燒瓶中將細(xì)胞刮干凈，并放入離心管，離心后再加入培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1x106細(xì)胞/ml，種入96孔組織培養(yǎng)盤(pán)或10-cm細(xì)胞培養(yǎng)亞，培養(yǎng)于37。C含有5。/oC02之培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼附4小時(shí)后，再加入不同濃度的rFIP或GLA反應(yīng)24小時(shí)。二、實(shí)驗(yàn)藥品氯仿；3-(4，5-二曱基p塞唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑溴化物；噻唑蘭)(MTT，Sigma,M國(guó)2128，USA)DMEM培養(yǎng)基、二曱基石充氧化物(DMSO)乙醇、胎牛血清(FBS)、異丙醇(J.T.Baker，USA)月旨多糖(LPS，Sigma，L-2755Escherichiacoli(E.Coli)SerotypeUSA)磷酸緩沖液(D-PBS,GIBCOBRL,USA)臺(tái)盼蘭(Sigma，USA)三、儀器設(shè)備二氧化>談恒溫培養(yǎng)箱無(wú)菌抽風(fēng)拒恒溫式水溫槽血球計(jì)數(shù)器倒立式相位差顯微鏡酶聯(lián)免疫吸附分析儀(ELISA)酸堿測(cè)定儀GC分析儀四、脂質(zhì)萃取首先將細(xì)胞濃度為lxl()6細(xì)胞/mL的RAW264.7細(xì)胞植入在10mL/10cm培養(yǎng)盤(pán)，在37。C培養(yǎng)4小時(shí)后，加入不同濃度的rFIP或/和GLA反應(yīng)24小時(shí)后，利用PBS洗凈2次后，加入3mL的PBS，然后利用刮灼將培養(yǎng)盤(pán)上的RAW264.7細(xì)胞刮下，并放入已標(biāo)示的8mL具螺旋蓋的玻璃試管，將玻璃管放入離心機(jī)，以1000rpm離心5分鐘將PBS移除，最后把玻璃螺旋管放入-20。C冰箱冷凍。玻璃螺旋管待測(cè)樣品于室溫解凍后，立即萃取細(xì)胞中總脂質(zhì)于玻璃螺旋管加入0.5mL去離子水使細(xì)胞破裂，加入20ml的氯仿/曱醇混合液(2:1，v/v),至少靜置1小時(shí)或置于冰箱隔夜，以萃取總脂質(zhì)。萃取后，加入占總體積20%的0.9o/oNaCl溶液，以分離氯仿和水層。待測(cè)樣品于4。C,1000rpm,離心5分后，分上下二層，將內(nèi)含總脂質(zhì)的氯仿層移置10mLTdfon-螺帽的玻璃管中。置于定速氮?dú)饬飨?，?0。C讓氯仿蒸發(fā)至干。再將剩余吹干的脂質(zhì)以0.5mL氯仿重新溶解。加入2mL三氟化硼甲醇溶液，渦旋(vortex),蓋子旋緊，于90°C加熱15min。冷卻后，加入適量的己烷，均勻混合后，再將曱基化脂肪酸萃取出來(lái)，即可直接做GC分析。五、氣相色譜分析條件(GC分析)取2^L上述處理后之樣品(標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品)，利用自動(dòng)化氣相色譜儀桌上型HP6890(HewlettPackard,PA，USA)配有火焰離子化偵測(cè)器(Flameionizationdetector)來(lái)分析脂肪酸的組成。所使用的氣相層析管柱選用Omegawax320TM毛細(xì)血管柱(30,0mx320pmIDx0.25pm膜)其它條件設(shè)定如下載氣i殳定H2流速為32mL/min;設(shè)定空氣流速為350mL/min。入口設(shè)為分裂模式;加熱器205。C;壓力20psi;總流速14.7mL/min設(shè)定烘烤溫度起始溫度14(TC,起始時(shí)間l分鐘，溫度上升速率12。C/分鐘，最終溫度205。C維持20分鐘。50。C/分鐘，最終溫度245°C維持5分鐘設(shè)定注入口溫度205°C設(shè)定檢測(cè)器溫度235°C六、評(píng)估rFIP或GLA的劑量對(duì)巨噬細(xì)胞存活率的影響RAW264.7巨噬細(xì)胞以lxl(T細(xì)胞/mL的濃度置入96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度IOO、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125ug/mL的rFIP與500、200、100、50、25、10|iM的GLA培養(yǎng)24小時(shí)后，棄置培養(yǎng)液，剩下的細(xì)胞則進(jìn)行MTT分析。MTT分析參考Mosmann等人(1983)的方法，MTT原是黃色的水溶性化合物，可被脫氫酶還原成紫色結(jié)晶，而當(dāng)細(xì)胞活性高或數(shù)目多時(shí)，則細(xì)胞內(nèi)脫氫酶活性也越高，細(xì)胞內(nèi)則會(huì)有越多紫色的結(jié)晶形成。以DMEM將MTT儲(chǔ)存液稀釋10倍，將經(jīng)過(guò)rFIP或/和GLA處理的細(xì)胞，加入55m1/孔MTT溶液，隨后將其置37°C、5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)，移除上清液，再加入100)a1/孔的O.04NHC1/異丙醇以150rpm震蕩將色劑溶出，并于室溫下避光l小時(shí)，最后以ELISA讀取540nm的吸光值。試劑配方1)MTT溶液以PBS配置成5mg/mLMTT儲(chǔ)存液，再以0.2jum過(guò)濾膜過(guò)濾，并避光儲(chǔ)存；2)酸-異丙醇0.06NHC1溶于異丙醇。七、I.評(píng)估rFIP和GLA的劑量對(duì)巨噬細(xì)胞存活率的影響首先須確定rFIP是否會(huì)抑制或毒殺RAW264.7巨噬細(xì)胞。將不同濃度的rFIP加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，由MTT分析結(jié)果得知rFIP的濃度《10jig/mL時(shí)無(wú)顯著的細(xì)胞毒性(圖2)。不同濃度的GLA(10-500jliM)加入RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，觀察其GLA對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性。在MTT分析結(jié)果中得知GLA的濃度《100yM時(shí)并無(wú)顯著的細(xì)胞毒性(圖3)。II.利用脂肪酸分析方法來(lái)評(píng)估rFIP或rFIP+GLA對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的A5-去飽和酶的去飽和作用的影響l.rFIP對(duì)RAW264.7巨嗟細(xì)胞脂肪酸組成的影響將濃度為lxlO'細(xì)胞/ml的巨噬細(xì)胞種入含有培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)亞中，培養(yǎng)于37。C含有5。/。c02的培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼附4小時(shí)后，再加入IOg/mL的rFIP,培養(yǎng)24小時(shí)后，以上述第四項(xiàng)的步驟萃取細(xì)胞的脂肪酸并進(jìn)行分析。結(jié)果如表1所示，rFIP對(duì)于巨噬細(xì)胞的脂肪酸組成并沒(méi)有造成顯著的影響。表1rFIP對(duì)于巨噬細(xì)胞的脂肪酸組成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由于A5-去飽和作用是將DGLA轉(zhuǎn)變?yōu)锳RA，我們將DGLA的濃度固定為25^M與100^M,與不同濃度(2.5,5,10,20|ig/mL)的rFIP加入細(xì)胞的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時(shí)，再以上述第四項(xiàng)的步驟萃取細(xì)胞的脂肪酸并進(jìn)行分析。2.不同濃度的rFIP對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的A5-去飽和作用(DGLA—ARA)、DGLA與ARA的影響從圖4上可以清楚的看出，細(xì)胞脂肪酸的組成在加入了100M的DGLA與不同濃度(2.5，5，10&20g/ml)的rFIP培養(yǎng)之后，ARA的量逐漸降低；相對(duì)地，DGLA的量則增加。同時(shí)若計(jì)算并比較A5-去飽和作用的轉(zhuǎn)換率氣可以看到轉(zhuǎn)換率由26.2%降至17.4%。*轉(zhuǎn)換率的公式([ARA]/([ARA]+[DGLA])}x100%圖5和圖4的內(nèi)容相似，只是將100M的DGLA的濃度降為25M。觀察是否可以得到相似的結(jié)果。從結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與圖4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果極為相似ARA的量逐漸降低;DGLA的量則上升。A5-去飽和作用的轉(zhuǎn)換率也從66.8。/。降至48.3%。從圖4與圖5可以發(fā)現(xiàn)rFIP可以抑制A5-去飽和作用(DGLA—ARA)，而且抑制的能力隨著rFIP濃度的增加而增加；同時(shí)rFIP也會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)DGLA與ARA的含量。3.不同濃度的GLA與rFIP對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的A5-去飽和作用(DGLA—ARA)、DGLA與ARA的影響由于GLA會(huì)經(jīng)由巨噬細(xì)胞的延伸酶作用而轉(zhuǎn)變?yōu)镈GLA，所以本實(shí)驗(yàn)不必再外加DGLA。固定rFIP的濃度為10pg/mL,然后分別加入不同濃度的GLA(12.5,25,50,100joM)，培養(yǎng)24小時(shí)后，以上述第四項(xiàng)的步驟萃取細(xì)胞的脂肪酸并進(jìn)行分析。由圖6的結(jié)果可以看出，細(xì)胞生長(zhǎng)在一般的培養(yǎng)基只含有少量的n-6PUFA，所以細(xì)胞生長(zhǎng)在培養(yǎng)基內(nèi)所產(chǎn)生的DGLA與ARA就偏低(0pM);但是當(dāng)GLA開(kāi)始加入之后(12.5pM),DGLA與ARA的量就開(kāi)始上升。GLA濃度不斷上升后，因?yàn)閞FIP會(huì)抑制A5-去飽和作用，ARA的量就不再上升，反而開(kāi)始下降(50一)；而DGLA的量卻繼續(xù)增加。等到lOOpM時(shí)，ARA的量持續(xù)往下降，但DGLA仍然上升。使兩種脂肪酸的量差距變大。除此之外，rFIP+GLA的配方也使得A5-去飽和作用的轉(zhuǎn)換率從88.0。/。降至30.4%。所以rFIP+GLA可以增加體內(nèi)DGLA的含量，抑制ARA的含量，并抑制A5-去飽和作用(DGLA—ARA)。*轉(zhuǎn)換率的7>式{[ARA]/([ARA]+[DGLA])}x100%本發(fā)明的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可制成具有完整細(xì)胞的酵母菌，可以直接以口服方式施用并可以在生物體中發(fā)揮生物活性，不用任何純化的步驟，從而減少生產(chǎn)上的成本。本發(fā)明提供有關(guān)純化的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或含真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白宿主細(xì)胞的服用途徑。服用方式可以是用靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、口服、經(jīng)黏膜層吸收、皮膚接觸吸收或以浸泡于液體中的形式或其它可應(yīng)用的藥物傳遞路徑。而其中以口服應(yīng)用方式為優(yōu)先考慮方法。本發(fā)明提供的純化的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或含真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白宿主細(xì)胞可以廣泛使用于哺乳類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、曱殼類(lèi)及畜產(chǎn)、家禽類(lèi)。這里所指的哺乳類(lèi)及家禽類(lèi)為豬、雞。所指魚(yú)類(lèi)是石斑魚(yú)、鮭魚(yú)、鱒魚(yú)。所指曱殼類(lèi)是蝦、龍蝦、草奸、斑節(jié)奸、白奸。本發(fā)明應(yīng)用在淡水或海水動(dòng)物，如魚(yú)類(lèi)時(shí)，也可以浸泡在含有靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的液體中，通過(guò)鰓吸附到魚(yú)體內(nèi)。本發(fā)明提供口服包含本發(fā)明真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白組合物的應(yīng)用而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的功能。此靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白可以是從靈芝制備出來(lái)或從大腸桿菌(Aco//,或真菌例如面包酵母菌(&rcw/cei1cerer/i7aej制備獲得。權(quán)利要求1.真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在抑制Δ5-去飽和酶中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中該抑制A5-去飽和酶活性是用于預(yù)防或治療由厶5-去飽和酶、花生四烯酸、或發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度失調(diào)所引發(fā)的慢性或急性發(fā)炎反應(yīng)、發(fā)炎癥狀或發(fā)炎疾病。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述發(fā)炎疾病為氣喘、動(dòng)脈硬化、肥胖、糖尿病、腸胃疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、牙周病、癌癥及自體免疫性疾病、過(guò)敏、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、月經(jīng)痛或痛風(fēng)。4.如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中所述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白為靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白或金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述預(yù)防或治療發(fā)炎反應(yīng)、發(fā)炎癥狀或發(fā)炎疾病是通過(guò)抑制A5-去飽和酶的作用，并減少花生四烯酸的濃度，進(jìn)而降低發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，進(jìn)一步包括應(yīng)用Y-亞麻酸。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其是用于預(yù)防或治療由A5-去飽和酶、花生四烯酸或發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度失調(diào)所引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)、發(fā)炎癥狀或發(fā)炎疾病。8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白為靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白或金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白，且所述Y-亞麻酸來(lái)自于植物或微生物食品的萃取物。9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述發(fā)炎疾病為氣喘、糖尿病、腸胃疾病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、牙周病、癌癥、自體免疫性疾病、過(guò)敏、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、月經(jīng)痛或痛風(fēng)的發(fā)炎疾病。10.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述預(yù)防或治療發(fā)炎反應(yīng)為以下兩種成分的作用機(jī)制的加成效果(a)通過(guò)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白抑制A5-去飽和酶的作用，并減少花生四烯酸的濃度，進(jìn)而降低發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度，及(b)Y-亞麻酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)槎?Y-亞麻酸并增加其濃度，大量形成抗發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度。全文摘要本發(fā)明提供真菌調(diào)節(jié)免疫蛋白抑制Δ5-去飽和酶的新用途，通過(guò)抑制Δ5-去飽和酶活性，可預(yù)防或治療由Δ5-去飽和酶、花生四烯酸、或發(fā)炎性類(lèi)二十酸的濃度失調(diào)所引發(fā)的慢性或急性發(fā)炎反應(yīng)、發(fā)炎癥狀或發(fā)炎疾病。特別地，在使用該真菌調(diào)節(jié)免疫蛋白時(shí)，同時(shí)應(yīng)用γ-亞麻酸，抑制Δ5-去飽和酶的效果更佳。所述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白優(yōu)選靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白或金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。文檔編號(hào)A61K38/16GK101376020SQ20071014722公開(kāi)日2009年3月4日申請(qǐng)日期2007年8月29日優(yōu)先權(quán)日2007年8月29日發(fā)明者莊路德,楊乾隆,陳子智,黃永勝申請(qǐng)人:益生生技開(kāi)發(fā)股份有限公司