專利名稱：甘草素在制備治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘草素用于制備治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的用途，尤其涉及甘草素在制備治療老年性癡呆和帕金森病藥物中的用途。

背景技術(shù)：
甘草為豆科(Leguminosae)植物甘草屬(Glycyrrhiza Linn)多種植物的根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，有益氣補(bǔ)中、清熱解毒、祛痰止血、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效。近年來發(fā)現(xiàn)甘草不但有較強(qiáng)的解毒作用，還有抗?jié)儭⒖寡装Y、鎮(zhèn)痙鎮(zhèn)咳、降血壓、降血脂、抗癌作用等。甘草的化學(xué)成分以黃酮類和三萜化合物為主，還有少量的生物堿、木質(zhì)素和香豆素等。其中的二氫黃酮類化合物甘草苷(Liquiritin)的分子式為C21H22O9，分子量為418.4，化學(xué)名為7-羥基黃烷酮-4’-O-葡萄糖苷(7-Hydroxyflavanone 4’-O-glucoside)。甘草苷元，或稱甘草素(Liquiritigenin)的分子式為C15H12O4，分子量為256.3，化學(xué)名為(2S)-7-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-2，3-dihydro-4H-1-benzopyran-4-one，或4’，7-Dihydroxyflavanone(4’，7-二羥基黃烷酮)，結(jié)構(gòu)式見式(I)。文獻(xiàn)報(bào)道，甘草素具有抗急性肝損傷(Chem Biol Interact 2006，161(2)125-138)、抑制黃嘌呤氧化酶(Cell molLife Sci，2000，57(3)500-505)等活性。

老年性癡呆病是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為主要臨床癥狀的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其發(fā)病率隨著年齡增長而急劇上升，我國65歲以上老年人的患病率為1％～5％，85歲以上達(dá)到20％～40％。老年癡呆的病理改變包括廣泛的神經(jīng)元丟失(主要通過凋亡)、腦內(nèi)出現(xiàn)無數(shù)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles)和老年斑(senile plaque)等。目前已上市的老年癡呆治療藥物有乙酰膽堿酯酶抑制劑安理申、他克林等、谷氨酸受體阻滯劑美金剛等，這些藥物可以在一定程度上改善或緩解輕度患者的癡呆癥狀，但不能阻止或逆轉(zhuǎn)病變的進(jìn)一步發(fā)展。
帕金森病(Parkinsons disease，PD)也是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性和壞死，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的不足，最終造成PD特有的運(yùn)動(dòng)功能障礙。由于PD的病因復(fù)雜，社會(huì)危害大，隨著高齡化社會(huì)的到來，尋找具有抗PD功效的天然藥物尤為重要。至今，左旋多巴仍是治療帕金森病的最有效藥物。但這類制劑具有較大的副作用，應(yīng)用數(shù)年后，其療效減弱，出現(xiàn)開關(guān)現(xiàn)象、劑末現(xiàn)象等。近年的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，左旋多巴可能具有一定的神經(jīng)毒作用，加速殘存多巴胺能神經(jīng)元的死亡。因此迫切需要一種療效確切、具有神經(jīng)營養(yǎng)作用而毒性輕微的新型藥物。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供甘草素的新用途，具體涉及甘草素在制備治療神經(jīng)退行性疾病(主要為老年性癡呆和帕金森病)的新型藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明經(jīng)過廣泛深入的研究，在篩選抗神經(jīng)退行性疾病的藥物中出人意料地發(fā)現(xiàn)甘草素具有神經(jīng)元保護(hù)及營養(yǎng)作用，而無明顯的雌活性(雌活性指促進(jìn)乳腺或子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖、增生等)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其對癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶有促進(jìn)作用和增強(qiáng)帕金森病模型小鼠的隨意運(yùn)動(dòng)能力。因此，可將甘草素用于制備防治老年性癡呆病和帕金森病的藥物。
為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用甘草素的藥理試驗(yàn)及結(jié)果來說明其在制備治療神經(jīng)退行性疾病(主要為老年性癡呆和帕金森病)的新型藥物中的應(yīng)用。
(1)甘草素的制備。將市售甘草苷溶解于甲醇后，加入含β-葡糖苷酶(Sigma公司)的醋酸緩沖液。乙醚萃取三次，留取乙醚層。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干乙醚液，刮取蒸干后固體備用。以10～20％乙腈溶解分離出固體后，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測其分離度。質(zhì)譜確定分離的化合物。本發(fā)明所述的甘草素加入輔料后可制成膠囊、片劑、顆粒劑、滴丸和針劑等劑型。
(2)甘草素抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測甘草素對抗β淀粉樣蛋白Aβ25～35導(dǎo)致大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)凋亡作用。結(jié)果顯示，甘草素在0.2μg/ml即顯示明顯的抗細(xì)胞凋亡作用。
(3)甘草素促進(jìn)原代海馬神經(jīng)元軸突生長促進(jìn)作用。分離大鼠原代海馬神經(jīng)元，在體外觀察甘草素對神經(jīng)元軸突生長的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示，甘草素在0.02μg/ml即顯示明顯的促進(jìn)軸突生長。
(4)甘草素增強(qiáng)記憶作用。采用小鼠跳臺試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)觀測其對東莨菪堿所致老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的促進(jìn)作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，甘草素能明顯減少跳臺試驗(yàn)的錯(cuò)誤次數(shù)，延長潛伏期，縮短Morris水迷宮試驗(yàn)的潛伏期，同時(shí)增加模型小鼠腦組織膽堿能M1受體表達(dá)的作用，表明甘草素具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶作用。
(5)甘草素抗帕金森病的實(shí)驗(yàn)研究。采用MPTP致帕金森病模型模型，觀察給藥后模型小鼠自發(fā)活動(dòng)數(shù)的變化，結(jié)果顯示甘草素組小鼠在測試時(shí)間內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)顯著增多，提示甘草素能提高模型小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮程度和隨意運(yùn)動(dòng)能力。
(6)甘草素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示甘草素?zé)o明顯的細(xì)胞增殖作用，而其糖苷甘草苷則具有明顯的刺激MCF-7細(xì)胞增殖作用，表明甘草素?zé)o明顯的雌活性，提示使用甘草素?zé)o刺激雌性生殖系統(tǒng)細(xì)胞增殖、增生等的潛在副作用。
通過上述的藥理試驗(yàn)和結(jié)果可以得出甘草素對神經(jīng)元具有保護(hù)及營養(yǎng)作用，能夠改善癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和帕金森病模型小鼠的隨意運(yùn)動(dòng)能力，而無明顯的對雌性生殖系統(tǒng)等的潛在副作用。
由本發(fā)明提供的方法制備的新藥具有顯著的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)作用而無明顯的黃酮類化合物的雌活性，在臨床上可能會(huì)有顯著療效而無明顯的毒性，因而產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 甘草素的制備 將市售甘草苷溶解于甲醇后，加入含β-葡糖苷酶(Sigma公司)的醋酸緩沖液。乙醚萃取三次，留取乙醚層。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干乙醚液，刮取蒸干后固體備用。以10～20％乙腈溶解分離出固體后，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測其分離度。經(jīng)分析可知該反應(yīng)48h后僅得一種產(chǎn)物，說明甘草苷已完全水解，“歸一法”計(jì)算其純度為98.74％。經(jīng)質(zhì)譜分析其分子量為256，可以確定該物質(zhì)為甘草素。
實(shí)施例2 甘草素膠囊劑 取甘草素原料500克，藥用淀粉1000克，攪拌均勻，裝入0號膠囊，每粒0.3克，每次口服2粒，每日三次。
實(shí)施例3 甘草素片劑制備 取甘草素原料500克，藥用淀粉500克，攪拌均勻，用適量乙醇制粒，經(jīng)整粒，壓片，每片0.2克，口服，每次2片，每日三次。
實(shí)施例4 甘草素滴丸的制備 稱取300克聚乙二醇4000為基質(zhì)，在水浴上溶化，加入甘草素原料100克，攪拌均勻，傾入保溫管中，用恒溫裝置保溫，使含甘草素的聚乙二醇液體在80-90℃條件下滴入預(yù)冷的液體石蠟中(4-10℃)，滴完后，將藥丸傾入濾紙上吸干石蠟油，再加入少量滑石粉，混勻，得甘草素滴丸1000粒。口服，1次2粒，1日3次。
實(shí)施例5 甘草素注射劑的制備 取甘草素原料30克，丙二醇40ml，聚乙二醇-400 100ml，混合，水浴加熱30min，加注射用水至600ml，超聲波中處理20min，再在水浴中加熱，調(diào)節(jié)pH值7.0-7.2。過濾，灌封，滅菌即得。每支2ml，肌肉注射，1次2ml，每日3次，或與生理鹽水，5％葡萄糖液500ml，混勻后，靜脈滴注，每日1次，每次3支。
實(shí)施例6 甘草素抗凋亡作用 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測甘草素對抗Aβ25～35導(dǎo)致大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)凋亡作用。實(shí)驗(yàn)分組如下對照組；Aβ25～35處理組；Aβ25～35不同劑量藥物組。取100μl的細(xì)胞懸液于流式管中，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI溶液(20μg/ml)混勻，室溫避光孵育15分鐘，加400μl PBS，流式細(xì)胞儀分析。
與正常組比，Aβ處理模型組凋亡率明顯增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；各加藥組凋亡率與模型組比顯著降低(P＜0.01)，并隨培養(yǎng)體系中藥物濃度增加，凋亡率降低更明顯，結(jié)果表明甘草素有抗Aβ致PC12細(xì)胞凋亡的作用。
表1 甘草素抗Aβ25～35致PC12細(xì)胞的凋亡作用 注＊＊與對照組比P＜0.01；＊與模型組比P＜0.01 實(shí)施例7 甘草素促進(jìn)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突生長作用 SD大鼠乳鼠，出生12h內(nèi)，♀♂兼用。大鼠乳鼠經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75％乙醇消毒后，斷頭置于含解剖液的平皿中，分離出全腦，解剖顯微鏡下分離海馬組織。將其置于0.25％胰蛋白酶中并用剪刀剪碎。每隔4min吸取胰酶至含血清離心管中，并加入新鮮胰酶直至無肉眼可見的組織塊。200目金屬篩網(wǎng)過濾后以1000rpm·min-1離心10min。將其重懸于10％胎牛血清的DMEM/F-12種植液，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的24孔板，培養(yǎng)過夜后換為3％胎牛血清、1％N2、1％B27和3ng·mL-1阿糖胞苷的DMEM/F-12培養(yǎng)液。加入終濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02、0.2、2μg·mL-1甘草素，同時(shí)加入2ng·mL-1NGF；以2ng·mL-1NGF為對照組。2d后于熒光顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計(jì)軸突長度，方法為每組10張，每張測量各神經(jīng)元軸突長度，求和后除以其神經(jīng)元總數(shù)。
甘草素本身對原代海馬神經(jīng)元軸突生長無促進(jìn)作用，但在2ng·mL-1NGF存在下可明顯促進(jìn)其軸突生長，其軸突長度明顯長于對照組(P＜0.01)。在2ng·mL-1NGF存在下，甘草素在0.02～2μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)對原代海馬神經(jīng)元軸突生長有促進(jìn)作用(表2)。
表2 甘草素對原代海馬神經(jīng)元軸突生長的促進(jìn)作用 注n＝10＊與對照組比P＜0.01 實(shí)施例8 甘草素對老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的促進(jìn)作用 采用小鼠跳臺試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)觀測甘草素對東莨菪堿所致老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的促進(jìn)作用。昆明小鼠，體重14～16g，雌性。小鼠按體重均衡的原則隨機(jī)原則分組給藥(劑量見下表)。給藥7d后，造模并進(jìn)行試驗(yàn)。小鼠跳臺試驗(yàn)如下將動(dòng)物放置在平臺上，適應(yīng)環(huán)境3min，然后通以36V電壓，訓(xùn)練5min。24h后測驗(yàn)，記錄第一次跳下平臺的潛伏期、5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)和總電擊時(shí)間，以此作為記憶成績。
Morris水迷宮試驗(yàn)如下試驗(yàn)前一天先將小鼠放入水迷宮中自由游泳2min以適應(yīng)環(huán)境。每日上午訓(xùn)練前15min腹腔注射東莨菪堿5mg·kg-1，每日給予甘草素一次。第一天小鼠訓(xùn)練3次，每次分別從3個(gè)不同入水點(diǎn)將小鼠面向容器壁放入水中游泳，若小鼠在90s內(nèi)不能找到水下平臺，則將其直接置于平臺上并停留30s。第二天開始每天上下午各訓(xùn)練一次，記錄小鼠入水后爬上平臺所用的時(shí)間、路經(jīng)軌跡等作為檢測小鼠對空間和線索學(xué)習(xí)的指標(biāo)，24小時(shí)后按步進(jìn)行復(fù)測，共訓(xùn)練3天。
每組取4只鼠腦組織做免疫組化測定膽堿能M1受體水平，每只鼠做兩張切片，免疫組化采用SABC法，DAB顯色，最后用蘇木素進(jìn)行核復(fù)染。每組取一張切片作為同型對照。數(shù)據(jù)分析時(shí)，每張切片按海馬和皮層相同部位選取5個(gè)視野，結(jié)果用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)4.0進(jìn)行處理，分析平均光密度和積分光密度。
跳臺試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比，模型組5min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加，潛伏期顯著縮短。與模型組比，甘草素組錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，潛伏期也有明顯延長(見表3)。
表3 甘草素對東莨菪堿小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型跳臺成績的影響 注與正常對照組相比***P＜0.001；與模型組相比#＜0.05，##P＜0.01. Morris水迷宮結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組小鼠找到平臺的潛伏期逐漸縮短。與正常對照組相比，模型組(東莨菪堿5mg·kg-1)各次訓(xùn)練的潛伏期明顯延長。甘草素組從第5次訓(xùn)練開始與模型組顯示出顯著差異，潛伏期明顯縮短。結(jié)果如表4所示 表4 甘草素對東莨菪堿小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型水迷宮上臺潛伏期的影響 注(1)與正常組相比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組相比#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001. (2)第1-3次為第一天訓(xùn)練結(jié)果，第4、5次為第二天訓(xùn)練結(jié)果，第6、7次為第三天訓(xùn)練結(jié)果 平均光密度結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組平均光密度值顯著下降，說明細(xì)胞染色程度下降，M1受體水平降低。而甘草素組平均光密度值均比模型組有所提高，說明藥物可能使M1受體水平提高。積分光密度結(jié)果亦顯示模型組比正常對照組顯著降低，而甘草素組比模型組顯著升高，提示甘草素能促進(jìn)M1受體表達(dá)。結(jié)果見表5。
表5 甘草素對東莨菪堿造成小鼠獲得性學(xué)習(xí)記憶障礙模型腦組織M1受體水平的影響 注與正常組相比***P＜0.001；與模型組相比#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001. 實(shí)施例9 甘草素對MPTP致帕金森病模型小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響 成年C57BL小鼠，雌雄不拘，體重18-22克。CS-2型小鼠自主活動(dòng)程序儀，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)為Sigma公司產(chǎn)品。將小鼠隨機(jī)分成四組，每組12只，分別為正常對照組、模型組以及甘草素組(劑量為30，90mg·kg-1)。連續(xù)灌胃給藥14d，于第11天開始灌胃給藥前1h腹腔注射MPTP 30mg·kg-1(對照組給予等體積的生理鹽水)，連續(xù)4d，最后1次給藥后1d，進(jìn)行行為學(xué)指標(biāo)測試，將小鼠放入自主活動(dòng)箱中，每次同時(shí)測定4只小鼠，每個(gè)活動(dòng)箱中1只，由記錄儀自動(dòng)記錄小鼠活動(dòng)，測定每只小鼠5min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)。
腹腔注射MPTP后0.5h，除正常對照組外，其余各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的運(yùn)動(dòng)障礙，表現(xiàn)為動(dòng)作遲緩、震顫、豎毛、豎尾和活動(dòng)減少等。與模型組比較，甘草素組小鼠在測試時(shí)間內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)顯著增多，提示甘草素能提高模型小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮程度和隨意運(yùn)動(dòng)能力，對PD有治療作用。結(jié)果見表6。
表6 甘草素對對MPTP致帕金森病模型小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響 注與正常組相比***P＜0.001；與模型組相比#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001. 實(shí)施例10 甘草素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 將MCF-7細(xì)胞用含10％無雌血清的無酚紅1640培養(yǎng)液傳代2次，按常規(guī)方法消化離心，以1.2×104/180μl/孔的濃度接種于96孔板，待18-24小時(shí)細(xì)胞貼壁完全后加入適當(dāng)濃度的甘草苷、甘草素或雌二醇20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，于試驗(yàn)結(jié)束前加MTT(5mg/ml)20ul/孔，培養(yǎng)4小時(shí)后棄去上清，加DMSO080μl/孔，震蕩溶解后540nm處測定0D值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。結(jié)果見表7。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草素在濃度10μg/ml以下無明顯的細(xì)胞增殖作用，而其糖苷甘草苷則具有明顯的刺激MCF-7細(xì)胞增殖作用，表明甘草素?zé)o明顯的雌活性，而甘草苷有明顯的雌活性，提示使用甘草素?zé)o刺激乳腺或子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖或增生等的潛在副作用。
表7 甘草素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響
權(quán)利要求
1.下式(I)的甘草素在制備治療老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
2.甘草素(I)在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。
3.一種用于治療老年性癡呆和帕金森病的藥物的組合物，其包括作為活性成份的權(quán)利要求1的甘草素及藥用賦形劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及的技術(shù)領(lǐng)域，是將甘草素及含有上述成分的組合物用于制備治療老年性癡呆和帕金森病藥物中的用途。本發(fā)明所述的甘草素加入輔料后可制成膠囊、片劑、顆粒劑和針劑等劑型。甘草素對神經(jīng)元具有保護(hù)及營養(yǎng)作用，而無明顯的雌活性，能夠改善癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和帕金森病模型小鼠的隨意運(yùn)動(dòng)能力。
文檔編號A61K31/352GK101152173SQ20071016354
公開日2008年4月2日 申請日期2007年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日
發(fā)明者崔福貴 申請人:崔福貴