專利名稱：一種泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療。與本發(fā)明相關(guān)的背景技術(shù)泌尿生殖系統(tǒng)疾病通常累及男女兩性，包括泌尿系統(tǒng)和生殖系 統(tǒng)的感染和/或炎癥。例如，根據(jù)美國國家少兒健康和發(fā)育研究所 (NICHD)的統(tǒng)計(jì)，"大多數(shù)女性一生中至少患過一種類型的陰道 炎。"《陰道炎》(Vaginitis),發(fā)表于《美國國家兒少健康和發(fā)育研 究,斤-在線刊物》(iVart'owa/ /"s份wte o/ C/w7<af //ea/A owd //w/waw Deve/opwe/i^Pi/W/cariww 2000年1月 12日1務(wù)定，<http:〃www.nichd.nih.gov/publications/pubs/vag 1 .html> )。 導(dǎo)致陰道 炎的原因包括從細(xì)菌、真菌或病毒感染到乳液、噴霧或者貼身衣物 所含的化學(xué)物質(zhì)的刺激。同樣地，對(duì)于有細(xì)菌和真菌感染的女性， 這些感染因素經(jīng)常來自肛門區(qū)，從此處經(jīng)過會(huì)陰到達(dá)陰道或尿道。常見的一類陰道炎是念珠菌或酵母菌感染，主要由白色念珠菌 感染引起。念珠菌屬于人體正常菌群，存在于皮膚、口腔和消化道(Robbins，《疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)》第五版(/wrf/zo/og/c 5必& o/ 2Xyeose 5沐Saunders公司，費(fèi)城(1994) p.354 )，女性陰道也 可有少量存在。它們最適合的生長環(huán)境是諸如陰道或口腔的溫暖潮 濕環(huán)境.念珠菌通常不致病，但當(dāng)環(huán)境改變時(shí)，例如女性絕經(jīng)后、 懷孕期、或應(yīng)激時(shí)發(fā)生體內(nèi)激素水平的改變，會(huì)過度繁殖造成酵母 菌感染。此情況也可見于免疫抑制或身體機(jī)能受損的個(gè)體，如接受 化療、服用免疫抑制劑的病人，或艾滋病患者。目前對(duì)于念珠菌感染的治療包括非處方藥物，其活性成分如布 康唑硝酸鹽(Femstat )、克霉唑(Gyne-Lotrimh^及其它)、咪康唑 (1^01^1&1@及其它)和漆康唑(Vagistat )。這些藥物作為陰道感染 的局部用藥，可以裂解念珠菌的細(xì)胞壁.其它類似的治療包括處方 藥物，其活性成分來自與氟康唑(Diflucan )、三康唑(Terazol ) 和酮康唾(Nizoral )等同一系列。雖然通常的觀點(diǎn)認(rèn)為陰道炎與念珠菌有關(guān)，但據(jù)NICHD的調(diào) 查(《陰道炎》(^g/"/fe))，實(shí)際上細(xì)菌性陰道炎是育齡婦女最常 見的陰道感染疾病。陰道內(nèi)的細(xì)菌過度繁殖會(huì)導(dǎo)致與念珠菌性陰道 炎相似的細(xì)菌性陰道炎，其治療藥物不同。另一方面，男性陰莖也可以感染念珠菌，累及陰莖頭和包皮。 陰莖頭包皮炎是陰莖頭和包皮的非特異性感染，由多種^l生物引 起，包括真菌(如念珠菌)和化膿性細(xì)菌(如葡萄球菌)(Robbins， 《疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)》第五版(o/D&eose 5rt e^O ., Saunders公司，費(fèi)城(1994 ) p.1008 )。葡萄球菌為革蘭氏染色陽性細(xì)菌，通常存在于人體的皮膚和其 它粘膜。特別值得一提的是金黃色葡萄球菌，為毒性致病源，可以 引起皮膚損傷、心內(nèi)膜炎、呼吸系統(tǒng)感染、食物中毒、甚至中毒性 休克綜合征等多種病癥。對(duì)于采用高吸收性月經(jīng)棉條的女性而言， 金黃色葡萄球菌可以在陰道內(nèi)形成菌落，并分泌一種稱為中毒性休克綜合征毒素(TSST-1 )的毒素。據(jù)FDA的統(tǒng)計(jì)，目前報(bào)導(dǎo)的大 約半數(shù)中毒性休克綜合征病例與月經(jīng)期棉條關(guān)，多為年輕女性(《月 經(jīng)棉條與石棉、二惡英以及中毒性休克綜合征》(rampo似 爿Ae對(duì)os, Z)/ojc/",在7b:ac 5/wc矢)， FDA i殳備與放射健康中 心(July 23,1999 ) ， <http:y7www.fda.gov/cdrh/ocd/tamponsabs.html> )。金黃色葡萄球菌感染一般用曱氧西林(methicillin)治療。此藥 雖然很有效，但金黃色葡萄球菌的一些菌抹已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性，只有 少數(shù)抗生素能有效治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)。常 用于治療MRSA的抗生素之一是萬古霉素(vancomycin),但是， 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對(duì)萬古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌菌株(Khuishid， M.A.等，《對(duì)萬古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌》(Staphylococcus aureus with Reduced susceptibility to Vancomycin )， 發(fā)表于伊利諾斯1999《發(fā)病率與死亡率周報(bào)》(MoAW0; "wd M)W鄉(xiāng) 股e詠 鄉(xiāng)ow)， 48(51): 1165-1167(2000 ) ，<http:〃www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm485 lal.htm>)?？顾幮跃ǖ某霈F(xiàn)使應(yīng)用其他方法用于治療細(xì)菌感染成 為必要。除真菌和細(xì)菌感染外，病毒性陰道炎也比較常見。此類感染大 多通過性交傳播，包括單純皰療病毒(HSV)或人類乳頭狀病毒(HPV)引起的感染。例如，HSV病毒，在生殖系統(tǒng)的入口處復(fù)制， 也感染支配生殖器的神經(jīng)。為了躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)，HSV病毒潛伏 在這些神經(jīng)元中，在某些環(huán)境條件下活化，如應(yīng)激、免疫抑制、放 射或病毒感染等。目前治療HSV感染的藥物包括阿昔洛韋(acyclovir )、法昔洛韋(famciclovir )、或4戈昔洛韋(valacyclovir) 等。對(duì)于泌尿系統(tǒng)，根據(jù)美國醫(yī)藥協(xié)會(huì)的調(diào)查數(shù)據(jù)，泌尿道感染 (UTIs)是促使就醫(yī)的最常見疾患之一 (《女性健康》一《尿道感染治療的患者才旨導(dǎo) )，《在線《建康4言息-AMA #:康透#見》 1998年10月30日更新，<http:〃www. ama-assn. org/insight/h—focus/ wom一hlthAiti/uti. html>。此類感染性疾患主要是由埃希氏大腸桿菌(E.coli.)引起，但念珠菌和葡萄球菌也有參與。同樣地，這些感 染始于尿道，向膀胱發(fā)展引起膀胱炎。最后，病菌可沿輸尿管上行 至雙腎，導(dǎo)致腎盂腎炎。男性和女性均可感染。既然泌尿-生殖系統(tǒng)疾病不局限于單一病因，那么目前的治療 就需要針對(duì)特定病因采用不同的藥物。當(dāng)然，要先確定病因。檢測(cè) 病源需要時(shí)間，但更重要的是對(duì)女性要進(jìn)行婦科檢查以確定是否有 特異感染因素存在。隨著抗生素和其它藥物應(yīng)用的增加，耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌這類的微生物就越容易對(duì)目前所用藥物產(chǎn)生抗藥性。這樣，就持 續(xù)需要新的廣諳抗菌藥物。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明用于治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病，它的一個(gè)方面涉及的由單 一或多種肽組成的用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療體系，其中多肽的 氨基酸序列有KPV (序列號(hào)1號(hào))，MEHFRWG (序列號(hào)2號(hào))， HFRWGK (序列號(hào)3號(hào))，SYSMEHFRWGLPV (序列號(hào)4號(hào))。單 個(gè)或多個(gè)多肽也可以通過上述氨基酸序列形成二聚體。泌尿生殖系 統(tǒng)疾病包括感染、炎癥，或者二者兼有。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 例中，泌尿-生殖系統(tǒng)疾病包括陰道、外陰、尿道、陰莖和/或直腸 的感染和/或炎癥。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，單一或多種多肽溶于載 體內(nèi)。在第三個(gè)優(yōu)選實(shí)例中， 一種或多種多肽與棉條結(jié)合，以避免 中毒性休克綜合征。在第四個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中， 一種或多種多肽與避 孕工具相結(jié)合，以防止性傳播疾病或感染。在第五個(gè)實(shí)施例中，一種或多種多肽與栓劑結(jié)合，以便于插入陰道或肛門。在本發(fā)明的第 六個(gè)實(shí)施例中， 一種或多種多肽溶于液體載體中，以用于陰道灌注。附困簡(jiǎn)要描述

圖1: ot-MSH和/或其衍生物對(duì)金黃色葡萄球菌生長的抑制效應(yīng)。圖2: a-MSH和/或其衍生物對(duì)尿激酶(UK)誘導(dǎo)的金黃色葡 萄球菌生長的影響。圖3: ot -MSH和/或其衍生物對(duì)白色念珠菌(C albicans )生長 的抑制效應(yīng)。圖4: oc-MSH和/或其衍生物與氟康唑抗真菌活性的比較。圖5A-5D: ot-MSH和/或其衍生物對(duì)白色念珠菌芽管形成的 4中制效應(yīng)。圖6: a-MSH和/或其衍生物抗念珠菌的強(qiáng)化中性粒細(xì)胞殺傷 力的效應(yīng)。圖7、 8、 9: a-MSH和/或其衍生物抑制白色念珠菌生長的機(jī)制。圖10-13: a-MSH和/或其衍生物對(duì)慢性感染細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制 和表達(dá)的抑制效應(yīng)。圖14: a-MSH和/或其衍生物抑制病毒復(fù)制、表達(dá)和活化的機(jī)制。圖15: oc-MSH和/或其衍生物對(duì)急性感染細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制和表 達(dá)的抑制效應(yīng)。圖16:用于本發(fā)明一方面的一種KPV 二聚體形式的4匕學(xué)結(jié)構(gòu) 示例.發(fā)明詳述以下所引用的文獻(xiàn)在此作為參考文獻(xiàn)。本發(fā)明是關(guān)于采用oc-黑素細(xì)胞刺激素(a-MSH)和/或其衍生物治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病 的一種方法和系統(tǒng)。ct-MSH是經(jīng)典的由13個(gè)氨基酸組成的肽(序 列號(hào)4號(hào))，由較大的前體分子——前黑阿皮素原經(jīng)翻譯后修飾產(chǎn) 生。它與同是來自前黑阿皮素原的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的 1 — 13氨基酸序列相同。許多種細(xì)胞均可分泌a-MSH，包括垂體細(xì) 胞、單核細(xì)胞、黑素細(xì)胞和角化細(xì)胞。oc-MSH可見于大鼠皮膚、 人體表皮以及正常和垂體切除術(shù)大鼠消化道的粘膜屏障(可參閱 Eberie，A.N.，《促黑激素》(rAe Afe/a"c^o/ / >w )，瑞士巴塞爾Karger (1998 );Lipton， J.m.等，《ot-MSH神經(jīng)免疫調(diào)質(zhì)的抗炎影響》-MSTn，《今日免疫學(xué)》(//w附m"o/. 7b^y) 18,140-145 ( 1997 ); Thody， A丄等，《ct-MSH的免疫反應(yīng)性，在正常和垂體切除大鼠消 4b道的分布》(7>w/ w"oreflC/ve "-il^fe/a"ocj^e 5W附m/a"wg i/o/vnowe,i^/ o; ;^je"o附/zec 及ato )，《生命科學(xué)》(丄z/e. Sc/. ) 18， 2127-2132 (1981 ))?，F(xiàn)已知道oc-MSH及其衍生物具有很強(qiáng)的解熱和抗炎特性，而 且毒性極低。它可以降低宿主細(xì)胞的離體前炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并且 可以降低動(dòng)物炎癥才莫型的局部和全身反應(yīng)。例如，oc-MSH的核心 序列(4-10)(序列號(hào)2號(hào))具有學(xué)習(xí)和記憶行為效應(yīng)，但解熱和 抗炎活性很低。相反，解熱和抗炎活性的活化信息序列位于oc-MSH的C-末端M酸序列，即賴氨酸 一 脯氨酸-纈氨酸("Lys-Pro-Val " 或"KPV")(序列號(hào)1號(hào))。此三肽在體和離體情況下與母體分子 有相同的活性。a-MSH和/或其衍生物的抗炎活性在下述兩項(xiàng)專利 有闡述，并包括在所列的參考中美國專利第5，028，592號(hào)，1991 年7月2曰提交于Lipton， J.M.，題為《Lys Pro Val解熱和抗炎成分 及其4吏用方'法》(^wrt^)re"cy4w".-/^/7a/w <2fOA7 Z>w iVo CowpowY/ow flr"i/Afe^ic^ o/Ose);美國專利第5,157,023號(hào)，1992 年10月20日提交于Lipton， J.M.，題為《Lys Pro Val解熱和抗炎成分 及其4吏用方'法》(y4w";p)Te"c aw/ v4"H" i/7a/w附fl^oA7丄ys尸ro Co附po礎(chǔ)o附朋d Ms^oc/ o/ L/ie )。(參閱Catania A.等，《ct -MSH 對(duì)宿主機(jī)體反應(yīng)的調(diào)節(jié)》("-Afe/朋ocyfe W附w/ariwg //o;vno"e z" fAe JWb^m/fl"ort o/ i/oW / eacrio/w)，《內(nèi)分泌、綜述》(endocr. Rev.) 14,564-576 ( 1993); Lipton， J. M.等，《a-MSH神經(jīng)免疫調(diào)質(zhì)的抗 炎芳》響》(y4rt"-/^/7"/wwato/7 zV /7wewce ^/" Ae A^wro/附加w"o/wodw/"torcr-MS/n，《今日免疫學(xué)》(/附/ m"o/. 7bda少)18,140-145 ( 1997); Rajora， N.等，《a-MSH產(chǎn)生受體及其對(duì)新喋呤的影響，在人單核/巨喧細(xì)胞系》("-A/S/f iVodwcrio" "ece/ ton朋cf /^wewce o" iVeop/eW", zV " A麵a" M "oc>^e//w"c/"o/>Aage CW/ )，《白血病生 物學(xué)雜志》(J丄ewJfeoc.腸/.) 59,248-253 ( 1996); Star, R. A.等，《ot -MSH對(duì)巨噬細(xì)胞一氧化氮合成酶自分泌調(diào)節(jié)的證明》(五vWewce o/ i4Wocn>7e Modw/Wow o/ Micrap/uage iWWc Qx油辦w^we & " -MSTZ)， Proc.胸7. (77辟92，8015-8020( 1995 ); Lipton， J.M.等，《神經(jīng)肽a-MSH在急慢性全身性炎癥的抗炎作用》C72柳/c a"d j少他;m.c /"y7a附wWow )，爿肌A^1^cyk/. Sc/. 741,137-148 (1994); Fajora, N.等，《ot-MSH調(diào)節(jié)大腦炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷木植亢?循環(huán)腫瘤壞死因子-ot》("-A/57/ AfoJw/af/ort丄oca/ Cz>cw/W/"g A^cro57;s FaCor "/w ￡jc/7e〃>wert^//丑ro/" /"y "附附a"ow ),《才申 經(jīng)科學(xué)雜志》( /. We",/.) 17,2181-2186 ( 1995 ); Richards, D. B. 等，《a-MSH (11-13) (lys-pro-val)對(duì)兔發(fā)熱的作用》(o/物質(zhì)》5,815-817 ( 1984); Hiltz M E.等，《神經(jīng)肽a-MSH COOH 末端片斷的抗炎活'性》(爿"f"7 /7"附w"too; o/ a COOWe加z'"fl/ Firagffie加o/決e Wewro; e/7"cfe a-A/S//)， FASEB雜志3,2282-2284 (1989 )。除了抗炎和解熱功能外，本發(fā)明的另一方面涉及a-MSH和/或 其衍生物的抗孩殳生物和抗感染活性。如下所述，ot-MSH和/或其衍 生物有重要的抗感染用途，包括如下的應(yīng)用降低微生物生存力， 降低酵母菌長芽，在不損害中性粒細(xì)胞對(duì)微生物的殺傷能力的情況 下殺傷孩t生物，治療與^t生物感染有關(guān)的炎癥而不降低省史生物的殺 傷力，增加微生物細(xì)胞內(nèi)cAMP的積累，抑制病毒性致病源的復(fù)制 與表達(dá)。在本發(fā)明的首選實(shí)施例中，這些抗微生物或抗感染活性最主要 與C-末端^^酸序列-KPV有關(guān)。此三肽與a-MSH及其書f生物在 很大濃度范圍內(nèi)均有效，包括通常存在于人體漿液的皮摩爾濃度。正如在技術(shù)背景部分中所討論的，泌尿生殖系統(tǒng)疾病并不局限 于單一病因。從細(xì)菌、真菌到病毒在內(nèi)的多種微生物和感染因素可 以單獨(dú)或聯(lián)合引起多種病癥，包括陰道炎、外陰炎、尿道炎、陰莖 頭包皮炎、念珠菌病、行傳播疾病以及中毒性休克綜合征。a-MSH 和/或其《汙生物可局部用于上述疾病狀態(tài)的感染和/或炎癥部位以達(dá) 到治療目的，可利用現(xiàn)有技術(shù)的施藥方法。例如，ot-MSH及其衍 生物可以溶于一些溶液中，諸如磷酸鹽緩沖液、透明質(zhì)酸、甲基纖 維素、羧曱基纖維素或乙醇。還可以用一般的載體，如油骨、油脂、 膠體、可溶性彈丸、氣溶膠噴霧、栓劑、灌注所用液體溶劑或者具 吸收性的物質(zhì)，攜帶ot-MSH和/或其4汁生物作為活性成分治療泌尿 生殖系統(tǒng)疾病。這些載體可用敷料器施用于感染或炎癥部位，敷料 器可以是注射器或類注射器式的器具、繃帶、導(dǎo)管、帶活塞的管子、涂藥用抹刀或其它類型的平面敷料器、避孕套、海綿、棉簽、或手 指.更明確地說，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例是將ot -MSH和/或其衍 生物溶于以液體基底的栽體，然后將溶有oc-MSH和/或其衍生物的 栽體儲(chǔ)存于密封加壓箱內(nèi)。打開釋放閥門或通過其它方式將栽體從 密封加壓箱內(nèi)釋放時(shí)，會(huì)形成氣溶膠泡沫并被裝進(jìn)注射器和注射器 類的器具。接著，注射器部分插入陰道，其內(nèi)容物也就釋放入陰道 腔內(nèi)。注射器或注射器類的器具及其開口也可以有不同的大小、形 狀和長度，以插入不同的泌尿生殖區(qū)，如尿道或肛門，本發(fā)明的另 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例為包含栽體的栓劑。此載體如膠體 或甘油在常溫下為固體或半固體，但是插入陰道或肛門后在體溫下 便融化。載體融化后，攜帶所溶的ct-MSH和/或其衍生物至泌尿生 殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病部位。我們采用油脂、油奮、膠體、噴霧、泡沫材料或止痛香骨等形 式將a-MSH和/或其衍生物涂于外陰、陰莖頭和陰莖包皮等外生殖 器部分。其組分為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知。在本發(fā)明的另一方面，還可以在棉條的生產(chǎn)加工過程中用cx -MSH和/或其衍生物進(jìn)行處理，這樣棉條中存在ot -MSH和/或其衍 生物，可以抑制分泌中毒性休克綜合征(TSST-1 )的微生物的生長， 如金黃色葡萄球菌，此種棉條的加工處理技術(shù)為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)所 熟知。采用a-MSH和/或其衍生物處理的棉條吸收性材料進(jìn)行治 療， 一種方法是將棉條的吸收性材料浸泡于含有a -MSH和/或其衍 生物的溶液，然后予以干燥。可供選擇的另一種方法，是將a-MSH 以干燥4分末形式噴灑到棉條的吸收性材料上。在本發(fā)明的另 一方面，a -MSH和/或其衍生物可通過避孕工具 轉(zhuǎn)運(yùn)至感染部位，這些避孕工具包括避孕套、隔膜、海綿或其它用于防止懷孕或性傳播疾病的屏障型工具.ot-MSH和/或其衍生物可溶于避孕套所用的潤滑劑以及與隔膜共同使用的膠質(zhì)或泡沫材料， 或者溶于與避孕套、隔膜或海綿共用的任何類型的殺精子溶液.在本發(fā)明的另一方面，a-MSH和/或其f汙生物可溶于灌注用的 液體。這些液體可以通過灌注被轉(zhuǎn)運(yùn)至陰道以治療感染和/或炎癥。下述實(shí)施例闡明了 a-MSH和/或其^t生物抗感染的效力及其應(yīng) 用。實(shí)施例中所用的微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及細(xì)胞培養(yǎng)的方法沒 有在文中詳細(xì)說明，但在科研文獻(xiàn)中有大量的報(bào)導(dǎo)。本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知這些方法。下述實(shí)施例中所用的肽類包括ot-MSH (1-13)(序列號(hào)4 號(hào))、(4-10)(序列號(hào)002號(hào))、(6-13)(序列號(hào)003號(hào))、和(ll - 13)(序列號(hào)1號(hào))，均有乙?；腘末端和酰胺化的C末端，以 及促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH ( 1 - 39)和(18 - 39) ( CLIP )。這些 肽類由固相肽合成方法制備，經(jīng)保留相的高效液相色普法純化。部 分實(shí)施例還包括氨基酸序列CKPV (序列號(hào)8號(hào))的二聚體(KPV 二聚體)，此二聚體同樣也有乙?；腘末端和酰胺化的C末端。 圖16顯示了 KPV二聚體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在上述任意一種多肽的N末 端加半胱氨酸，并4吏兩個(gè)多肽的半胱氨酸形成二石危鍵，即可得到二 聚體，同源二聚體和異源二聚體均可由此方法獲得。下述實(shí)施例中所闡述的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用方差的單因素分析和斯 氏t檢驗(yàn)。概率大于0.05被認(rèn)為是有顯著性差異的。實(shí)施例I本實(shí)施例目的在于闡明ot-MSH和/或其衍生物的抗孩i生物特 性，這里選取金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcM^ )為例。金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物(ATCC 29213 )由Ospedale Maggiore di Milano微生物學(xué)系提供。金黃色葡萄球菌(于Hank平衡鹽溶液中 lxloV毫升)在ot-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))、a-MSH (11-13)(序列號(hào)1號(hào))或KPV二聚體存在或缺如的情況下，37C培養(yǎng) 2小時(shí)，肽的濃度為10_15-10_4M。隨后細(xì)胞在冷蒸餾水中沖洗， 并用HBSS稀釋至100個(gè)生物體/毫升。將一微升的等分試樣涂于血 漿瓊脂板，37匸培養(yǎng)24小時(shí)。然后根據(jù)所形成的菌落評(píng)估微生物 的生存力。另一實(shí)驗(yàn)中是在細(xì)菌濃度為lOVlOO毫升的培養(yǎng)液中加 入不同的肽段和500單位的尿激酶(金黃色葡萄球菌的生長促進(jìn) 劑)，并且在37*€水浴中振蕩培養(yǎng)4小時(shí).圖l表明a-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))、cx-MSH (11-13) (序列號(hào)1號(hào))和KPV二聚體均抑制金黃色葡萄球菌菌落的形成。 此抑制效應(yīng)在很大濃度范圍內(nèi)均可發(fā)生，并在10_12 - 1(T4M的濃度 范圍內(nèi)有顯著性差異(p>0.01)。圖2說明了濃度為10_6摩爾/升的 oc-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))和oc-MSH (11-13)(序列號(hào)1 號(hào))明顯抑制尿激酶的生長促進(jìn)作用。這樣，a-MSH或其衍生物 可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，此細(xì)菌會(huì)引起中毒性休克綜合 癥，該病征與月經(jīng)棉條使用、陰道炎、泌尿道感染、以及陰莖頭包 皮炎有關(guān)。實(shí)施例n本實(shí)施例的目的在于闡明a-MSH和/或其4汙生物的抗真菌特 性，這里選取的實(shí)驗(yàn)菌抹是白色念珠菌(Om^Wa a/6!'cam )。白色念珠菌的臨床隔離林由Ospedale Maggiore di Milano微生 物學(xué)系提供，白色念珠菌的培養(yǎng)在沙氏瓊脂斜面板上進(jìn)行，并周期 性地轉(zhuǎn)移到沙氏瓊脂板上，28'C培養(yǎng)48小時(shí).為了制備靜止期酵 母菌，從瓊脂板上杏t取菌落，將其轉(zhuǎn)移到30毫升沙氏葡糖液體培 養(yǎng)基中，32C培養(yǎng)72小時(shí)。將所得細(xì)胞以lOOOxg離心IO分鐘， 用蒸餾水沖洗沉積細(xì)胞兩次.然后計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，并懸浮于Hank 平衡鹽溶液(HBSS)中至需要的濃度。通過0.01%的甲基藍(lán)外排 實(shí)驗(yàn)，以此確定細(xì)菌的生存力.結(jié)果顯示其生存能力大于98%,在HBSS中密度為1 x 106/毫升時(shí)，這些真菌在oc-MSH( 1 - 13 ) (序列號(hào)4號(hào))、oc-MSH (11-13)(序列號(hào)1號(hào))或KPV二聚體 存在或缺如的情況下，37C培養(yǎng)2小時(shí)，肽的濃度為10_ 15 - IO"M。 隨后用冷蒸餾水沖洗細(xì)胞，并用HBSS稀釋至100個(gè)生物體/毫升。 將一毫升的等分樣品涂于血漿瓊脂板上，37匸培養(yǎng)48小時(shí)。微生 物的生存力才艮據(jù)所形成的菌落估計(jì)。圖3表明a-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))、oc-MSH (11-13) (序列號(hào)1號(hào))和KPV二聚體在10_12-10—"M濃度范圍內(nèi)均抑制 白色念珠菌菌落形成的能力(與對(duì)照相比pO.Ol)。此結(jié)果說明， a-MSH或其衍生物能夠抑制白色念珠菌的生長，此真菌是已知導(dǎo) 致念珠菌病、陰道炎、尿道炎和陰莖頭包皮炎的因素。實(shí)施例邁本實(shí)施例的目的在于比較a-MSH和/或其衍生物與氟康唑 (fluconazole)的抗菌活性，后者是已被承認(rèn)的抗真菌藥物。檢測(cè)oc-MSH(l-13)(序列號(hào)4號(hào))、(4-10)(序列號(hào)2號(hào))、 (6-13)(序列號(hào)3號(hào))、(11-13)(序列號(hào)1號(hào))和ACTH (1-39 )、 ( 18 - 39 )以及氟康唑在10 —6 - 10—4M濃度下的抗白色念珠菌的能力，方法同實(shí)施例n。圖4表明，與氟康唑相比，a-MSH(ll-13)(序列號(hào)l號(hào))、(4-10)(序列號(hào)2號(hào))、(6-13)(序列號(hào)3號(hào))和(1-13)(序列號(hào)4號(hào))抗白色念珠菌是非常有效的，其抑 制活性與等摩爾濃度的氟康唑是類似的.相比之下，具有行為效應(yīng)^f旦極少抗炎活性的核心cx-MSH序列(4-10)(序列號(hào)2號(hào))產(chǎn)生了近50 %的對(duì)菌落形成單位抑制效應(yīng)。雖然此抑制效應(yīng)具有顯著性 (與對(duì)照相比p<0.01 )，但是明顯弱于含有KPV信號(hào)序列的oc -MSH片斷，這些KPV信號(hào)序列包括oc-MSH(6-13)(序列號(hào)3號(hào))、(11 -13)(序列號(hào)1號(hào))(pO.Ol)，或者母體分子ot-MSH (1-13) (p<0.05)。圖4也表明ACTH (1-39)及其片斷(18-39)不能降低白色念珠菌的生存力。甚至在IO"M濃度下(圖中未顯示)，ACTH肽段也同樣無效。由此本實(shí)施例i兌明oc-MSH或其書f生物在抑制白色念珠菌生長 方面與氟康唑同樣有效。實(shí)施例IV本實(shí)施例的目的在于闡明oc-MSH及其衍生物對(duì)白色念珠菌出 芽或芽管形成的抑制作用。芽管形成是白色念珠菌感染發(fā)病^L理的 重要方面，包括粘附于宿主上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的過程，從橢圓形的芽 生孢子到各種絲狀體的形態(tài)轉(zhuǎn)變，如芽管、假菌絲、菌絲。(Gow， N.A.,《白色念珠菌芽管的生長》(Gwm r"6e o/ Ca"力c/"a/6/ca似)，《當(dāng)4戈醫(yī)學(xué)真菌話題》(Curr. Topics Med. Myco.) 8，43-55 (1997))。蒸餾水沖洗培養(yǎng)所得的靜止期白色念珠菌兩次，然后將菌體懸 浮于HBSS中，密度為2x 106/毫升。于此菌液中加入10%的滅活 馬血清(由英國Paisley GIBCO/BRL提供)，37匸振蕩培養(yǎng)45分鐘， 可以誘導(dǎo)白色念珠菌菌絲的生長。HBSS沖洗菌體兩次以去除馬血 清，然后在濃度為10—6M的ct-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))、(6-13)(序列號(hào)3號(hào))或(11-13)(序列號(hào)l號(hào))存在的條件下， 37X:繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘，并不斷振蕩。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在光學(xué)顯 微鏡下計(jì)算出絲狀菌體的百分比。此實(shí)驗(yàn)以重復(fù)三次，至少計(jì)數(shù)了 200個(gè)細(xì)胞。采用裝配在Axioskop Zeiss顯微鏡上的MC100相機(jī)拍 攝顯微照片.圖5A至5D表明cc-MSH(l-13)(序列號(hào)4號(hào))或(11-13) (序列號(hào)1號(hào))可以抑制由馬血清誘導(dǎo)的白色念珠菌芽管形成。oc -MSH (1 - 13 )(序列號(hào)4號(hào))使絲狀菌體數(shù)目降低28 - 32% , a -MSH (11-13)(序列號(hào)1號(hào))導(dǎo)致絲狀菌體數(shù)目降低54-58%。 雖然圖中未顯示，a-MSH (6-13)(序列號(hào)3號(hào))同樣可以引起 絲狀菌體數(shù)目降低近50 % 。由此說明oc -MSH或其書1"生物通過抑制 芽管形成可以抑制念珠菌發(fā)病機(jī)理的一種模式。實(shí)施例V對(duì)病原體殺傷力的降低是感染期間應(yīng)用皮質(zhì)類固醇和其它非甾 體類消炎藥物治療的負(fù)面作用(Stevens, D丄.，《非甾體類消炎藥物 (NSAIDs)是否能促進(jìn)細(xì)菌性感染發(fā)展為中毒性休克綜合征》尸rogrew/ow o/ 5flc&Wa/ /w々c"o朋fo 7b;)ac S7zoc Syw^ome )，《'降床 感染'性疾病》(Clin.Infect.Dis.) 21,977 — 80 ( 1997 ); Capsoni， F.等， 《皮質(zhì)類固醇對(duì)中性粒細(xì)胞功能的影響抑制抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo) 的細(xì)月包毒'性(ADCC )》(^fe" o/ CorricoWeWo必ow iVew^pp/n'/C^otoxzc/ ^Z)a^ ),《免疫藥理學(xué)雜志》( / T)wmmo/ /w^waco/.) 5,217-30 ( 1983 ))。本實(shí)施例闡明a-MSH和/或其衍生物抑制感染 源的生長，而且不降低中性粒細(xì)胞抗感染的能力。本實(shí)施例進(jìn)一步 表明oc-MSH和/或其衫f生物確實(shí)可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞殺傷感染源 的能力。來自健康志愿者的靜脈血(20毫升)肝素抗凝處理后，加入右 旋糖苷沉淀劑并采用Ficoll-Hypaque (購于美國密蘇里州圣路易斯 的Sigma化學(xué)制劑公司)離心機(jī)離心分離中性粒細(xì)胞，4氐滲休克下 紅細(xì)胞溶解，中性粒細(xì)胞則至少占細(xì)胞懸浮液的97%。由胎盤蘭排 除法得到的細(xì)胞生存力大于98%.中性粒細(xì)胞再懸浮于HBSS中， 以用于實(shí)驗(yàn)。將白色念珠菌(1 x 106 )與AB型血清置于37X:振蕩水浴中調(diào)理 30分鐘。隨后，在單純培養(yǎng)基上或含有濃度為l(T15 - 1(T4M的a -MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))或ot-MSH (11-13)(序列號(hào)1號(hào))培養(yǎng) 基上與中性粒細(xì)胞一起培養(yǎng)，于振蕩水浴中37'C培養(yǎng)2小時(shí)。2小 時(shí)后，將培養(yǎng)管置于冰上以中斷生長，沖洗細(xì)胞外生物體兩次，并 4'C離心(1000xg),于懸浮液中加入2.5%的脫氧膽酸鈉溶液，振 蕩試管5分鐘。然后加入冷蒸餾水得到密度為106個(gè)細(xì)胞/毫升的菌 液，再在HBSS中按1/100地比例依次稀釋兩次，從而得到密度為 100個(gè)細(xì)胞/毫升的菌液。從此菌液中取一毫升的等分樣品涂于血瓊 脂板，37X:培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后選取三分之一計(jì)數(shù)菌落形成單 位，并采用五個(gè)不同個(gè)體來源的血漿重復(fù)計(jì)數(shù)。圖6表明a-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列 號(hào)1號(hào))在10M2 - 10"M濃度范圍內(nèi)(pO.Ol)確實(shí)能夠增強(qiáng)中性 粒細(xì)胞對(duì)白色念珠菌的殺傷力，同時(shí)圖6表明它們?cè)诤艽蟮臐舛确?圍內(nèi)都可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的殺傷力，即使是在相當(dāng)于人血漿oc -MSH濃度的皮摩爾濃度條件下。由此本實(shí)施例i兌明a-MSH或其衍生物可以同時(shí)抗感染和炎 癥，此特性也適用于念珠菌病、陰道炎、尿道炎、陰莖頭包皮炎或 痔瘡。本實(shí)施例提示oc-MSH和/或其彩于生物的抗微生物特性的一般細(xì) 胞機(jī)制，以及抗真菌特性的特殊機(jī)制。
經(jīng)甲苯/乙醇滲透作用的白色念珠菌(106/毫升)，在10_6M濃 度的a-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))、(11-13)(序列號(hào)1號(hào))或 毛喉碎(forskolin)(已知能夠增加細(xì)胞內(nèi)cAMP )存在或缺失的條 件下，37X:下振蕩培養(yǎng).三分鐘后加入用水冷卻的乙醇以中止反應(yīng)。 cAMP 7jc平由市售酶免疫試劑盒(購于英國Amersham )測(cè)定兩次， 在測(cè)定之前根據(jù)產(chǎn)品說明通過液相方法對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行抽提。在另 一個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，白色念珠菌暴露于濃度為25、 50和lxi0-SM的 雙脫氧腺苷(ddAdo， Sigma) 2小時(shí)，再與ot-MSH或其衍生物作 用2小時(shí)。雙脫氧腺苷是蛋白抑制劑，抑制腺苷酸環(huán)化酶。采用與 實(shí)施例II相同的方法測(cè)定毛喉辟和雙脫氧腺苷對(duì)白色念珠菌菌落 形成的影響。
圖7表明ot-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列 號(hào)1號(hào))可提高白色念珠菌內(nèi)cAMP含量，其cAMP的增加量與等 摩爾毛喉萜誘導(dǎo)的增加量的數(shù)量級(jí)相同.圖8顯示與cc-MSH (l-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列號(hào)1號(hào)) 一樣，毛喉萜也明 顯抑制白色念珠菌生長(與對(duì)照相比p<0.01 )。圖9表明雙脫氧腺 苷能過扭轉(zhuǎn)oc-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列號(hào) 1號(hào))對(duì)白色念珠菌生長的影響。
本實(shí)施例說明ot-MSH及其衍生物抑制白色念珠菌和其它微生 物生長的作用最可能是通過增加cAMP水平實(shí)現(xiàn)的，cAMP含量的 提高抑制mRNA和蛋白合成(參閱Bhattacharya A.等，《cAMP對(duì) 白色念珠菌RNA和蛋白合成的作用》(E#e"o/C>c"c^MPo" AA^ /Vwe/" S7"f/1ey/sCa"J/cto a/6/ca似)，《生4匕與生理研究通ifO〉 (5/0/ /zj^/cy. i ^. Ccw附w". ) 77: 1483 - 44 ( 1997 ))。實(shí)施例vn
本實(shí)施例闡明ct-MSH或其矛;t生物抑制人體細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的
能力，或者更確切地說，闡明oc-MSH抑制慢性感染的人單核細(xì)胞
內(nèi)mv-i病毒的復(fù)制和表達(dá)，
fflV-l慢性感染的幼單核細(xì)胞Ul細(xì)胞系是潛伏型單核細(xì)胞 fflV感染的體外模型，這些細(xì)胞攜帶兩套整合的HIV原病毒拷貝， HIV的基本表達(dá)較低。但是，根據(jù)RNA轉(zhuǎn)錄、p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶 釋放等測(cè)定的病毒復(fù)制可以被不同的刺激活化，如TNF-oc、 IL-6、 IL-IO、 PMA或細(xì)胞擁擠狀態(tài)。
上述細(xì)胞置于由完全培養(yǎng)基(含有10毫摩爾Hepes的RPMI 1640培養(yǎng)基)、包含2毫摩爾L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)、 10%熱滅 活的FCS (美國猶他州Logan的Hyclone實(shí)驗(yàn)室提供)、100單位/ 毫升的青霉素和100微克/毫升的鏈霉素(紐約，Grand Island, Gibco 實(shí)驗(yàn)室提供)，組成的培養(yǎng)基中維持對(duì)數(shù)期生長，以觀察ct-MSH和 /或其衍生物對(duì)HIV復(fù)制的影響。首次的試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)用來確定上述 培養(yǎng)條件下的最佳細(xì)胞密度、刺激物濃度HIV-1 p24抗原生成的動(dòng) 力學(xué)。在使用前，用HBSS沖洗細(xì)胞三次以去除細(xì)胞外病毒。然后 在濃度為10_15-10—4摩爾范圍的ot-MSH (1-13)(序列號(hào)4號(hào)) 或(11 - 13 )(序列號(hào)1號(hào))存在或缺乏的條件下，將細(xì)J!包以2x 105/ 毫升的密度(1毫升的最終體積)鋪于24孔的平底培一，培養(yǎng)皿 中只有培養(yǎng)基或加入TNF-a (io毫微克/毫升)(英國英格蘭牛津
R&D系統(tǒng)提供)。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，Ul細(xì)胞中單獨(dú)加入濃度為10—5M的oc -MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))，這些細(xì)胞是經(jīng)過TNF-a ( 10毫微 克/毫升)、IL-6 ( 20毫孩t克/毫升)、IL-10 ( 20毫孩t克/毫升)(英國 英格蘭牛津的R&D系統(tǒng)提供)、PMA ( 1毫微克/毫升) (Sigma-Aldrich)或細(xì)胞擁擠刺激的。將密度為2 x 105/毫升的Ul細(xì)胞在37C、 5。/。C02的條件下不更換培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，細(xì)胞即可 達(dá)到擁擠狀態(tài)。由細(xì)胞因子或PMA激活的培養(yǎng)只能持續(xù)48小時(shí)。 然后離心以分離上清液，采用市售ELISA試劑盒(美國紐約Buffalo 的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品有P艮公司生產(chǎn))檢測(cè)p24抗原，采用市售逆轉(zhuǎn)錄酶 ELISA反向分析試劑盒(瑞典Lund Innovagen生產(chǎn))檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶 的釋》丈。對(duì)于所有這些實(shí)驗(yàn)，在第一天加入oc-MSH (11-13)(序 列號(hào)l號(hào))，每一種條件下的結(jié)果的測(cè)定均重復(fù)三次。
圖10表明a-MSH(l-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列 號(hào)1號(hào))在較大濃度范圍內(nèi)明顯抑制TNF-ct刺激的Ul細(xì)胞的p24 抗原釋放.對(duì)于上述二種肽最有效的濃度均是10—SM，分別產(chǎn)生52.7 %和56.0%的抑制效應(yīng)。圖11表明a-MSH (11-13)(序列號(hào)1 號(hào))也抑制IL-6、 IL-IO、 PMA或細(xì)胞擁擠狀態(tài)誘導(dǎo)的Ul細(xì)胞的 p24抗原和逆轉(zhuǎn)錄酶釋放。此外，圖12表明，根據(jù)Northern印記分 析的測(cè)定結(jié)果，oc-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))還可以抑制PMA 刺激的Ul細(xì)胞的剪切和未剪切HIV-1 RNA的轉(zhuǎn)錄，
由此本實(shí)施例i兌明oc-MSH或其書f生物能夠抑制由TNF-a、 IL-6和IL-10途徑誘導(dǎo)的病毒基因的轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例Vffl
本實(shí)施例進(jìn)一步闡明了 ct-MSH抑制病毒復(fù)制和活4匕的能力， 或者更確切地說，闡明了向Ul細(xì)胞中加入ct-MSH的中和性抗體 明顯增加p24抗原的釋放。
Ul細(xì)胞的培養(yǎng)方法與實(shí)施例VII中所述的類似。采用親和純化的 兔抗a -MSH抗體(瑞典，Malmo，Euro-Diagnostica提供)阻斷Ul 細(xì)胞內(nèi)源性a-MSH的產(chǎn)生，此抗體對(duì)介質(zhì)以1:250稀釋。對(duì)照抗 體選用同等稀釋度的兔IgG?？筧-MSH抗體和對(duì)照抗體處理的細(xì) 胞(2 x IOV毫升)在培養(yǎng)基或PMA ( 1毫微克/毫升)中共同培養(yǎng)。37C培養(yǎng)48小時(shí)后，分離上清液并檢測(cè)p24抗原的釋放。在擁擠 狀態(tài)實(shí)驗(yàn)中，Ul細(xì)胞的培養(yǎng)同上述方法，抗oc -MSH抗體和對(duì)照IgG 在第一天加入，第七天收集上清液。圖13表明在靜止?fàn)顟B(tài)、PMA誘導(dǎo)狀態(tài)、或U1細(xì)胞擁擠狀態(tài)， 阻斷a-MSH會(huì)明顯增加p24抗原的釋放.本實(shí)施例強(qiáng)有力地提示 病毒復(fù)制受a-MSH的影響。實(shí)施例k本實(shí)施例闡明了 ot -MSH和/或其衍生物抑制病毒復(fù)制和表達(dá)的 機(jī)制，或者更確切地說，闡明了 a-MSH或其衍生物抑制TNF-a誘 導(dǎo)的NF-kB活化和結(jié)合的機(jī)制。取20 x 106個(gè)Ul細(xì)胞(在完整培養(yǎng)基中密度為2 x 105/毫升) 制備核提取物，以測(cè)定NF-kB活性水平，其中U1細(xì)胞先在濃度 為10—5m的oc-MSH( 11 - 13)(序列號(hào)1號(hào))存在或缺失的條件下 用TNF-a (20毫微克/毫升)刺激4小時(shí)。用冷PBS沖洗細(xì)胞一次， 緩沖液A ( 10毫摩爾Hepes (pH7.9)， 1.5毫摩爾MgCl2, 10毫摩 爾KC1， 0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)沖洗兩次，離心， 置于冰上，在加入0.1。/。NP-40的緩沖液A中培養(yǎng)IO分鐘。隨后， 棄去上清液，核碎片懸浮于15孩i升的緩沖液C (20毫摩爾Hepes(pH7.9)， 1.5毫摩爾MgCl2，0.42摩爾KC1， 0.2毫摩爾EDTA， 25%甘油，0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)中，冰上培養(yǎng)15 分鐘，混勻，離心.用75微升標(biāo)定的緩沖液D (20毫摩爾Hepes(pH7.9), 0.05毫摩爾KC1， 0.2毫摩爾EDTA， 20%甘油，0.5毫 摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)稀釋上清液，.80X:保存。結(jié)合反 應(yīng)于室溫下進(jìn)行10分鐘，反應(yīng)體系中含有IO微克核提取蛋白和0.5 毫微克32P標(biāo)記的NF - k B ( 30,000 cpm/微升)或者API混合于緩 沖液A(12毫摩爾Tris-HCl ( pH7.8 ), 60毫摩爾KC1， 0.2毫摩爾 EDTA和0.3毫摩爾DTT)，再加入10%甘油、2微克/毫升牛血清白蛋白和1孩i克/毫升單鏈DNA (Pharmacia Biotech )。此研究中用 于NF — k B的寡核苷酸有+GAT CCA AGG GGA CTT TCC GCT GGG GAC TTT CCA TG,和-GAT CCA TGG AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC CCT TG。每一個(gè)寡核苷酸退火與其互補(bǔ)結(jié)合，并 且用多聚核苷酸酶在末端標(biāo)記"P-Y-ATP。為了確定特定鏈，在與 標(biāo)記探針溫浴之前，核提取物先與IOO倍過量的未標(biāo)記探針溫浴五 分鐘。然后，混合物在lxTBE條件下，于5% (30:1)聚丙烯酰胺 凝膠上進(jìn)行電泳，再將凝膠干燥，進(jìn)行放射自顯,影。圖14表明TNF-oc明顯增強(qiáng)NF-KB的結(jié)合活性，但是與濃度 為10_5M的ot-MSH (11-13)(序列號(hào)1號(hào))共同培養(yǎng)明顯降低 NF-kB的活化。但是oc-MSH (11-13)(序列號(hào)1號(hào))并不改變 靜止細(xì)胞NF- k B的活化。此現(xiàn)象il明ct -MSH和/或其書f生物通過 調(diào)控NF-kB的結(jié)合而抑制病毒復(fù)制和表達(dá)。病毒物質(zhì)的復(fù)制通常依賴被感染細(xì)胞的活化狀態(tài)，受病毒和宿 主的相互作用調(diào)控.這些宿主因素可能包4舌TNF-ct和其它細(xì)胞因 子，如白介素。與HIV-1感染和活化類似，單純皰療病毒(HSV)-在宿主細(xì)月包因子作用下也可以從潛伏狀態(tài)活4匕。例如，TNF-(X和 IL-6， i旦不包括IL-l和IL-3,已經(jīng)確定可以活化HSV感染。用抗 IL-6抗體中和IL-6可明顯抑制HSV的活化，相比之下中和ot或P 干擾素卻沒有影響。(參閱Baker， M.等，《白介素-6和單純皰滲病 毒1型的關(guān)系對(duì)行為和免疫病理的提示》(7Tze及e/加'o朋/^5e/wWo/" /附附Mwo/7af/20/ogy )， 《大腦4亍為免疫》(5e/zav./附/mwo/. ) 13 (3): 201-11 ( 1999); Noisakran S.等，《體外 移植的潛伏感染的三叉神經(jīng)節(jié)中HSV-1活化過程中'淋巴細(xì)胞延遲 動(dòng)力學(xué)》(Z^附/ Aocj^ey Z)e/ay K&erics q/" i/SF-/及earc"va"o" /" v&ra ￡":c/7/a"e;s o/Z^ewf /"/e"eaf 7Hge/m'"a/ G^rtg〃a ),《神經(jīng)免疫 學(xué)雜志》(《/ 7Veww/附www/. ) 95 ( 1-2): 126-35 ( 1999); Walev， I.等，《TNF- a對(duì)小鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏單純皰滲病毒的復(fù)活和復(fù)制 的增S雖作用》(五w/wwceme/rf " o/及eac"vartVwi ep/fcario" o/Z^rfe"f //er/ es S7加/ /ex P7rws^^"o/m 7Wge/w/"a/ o/ A/zce )，《病毒學(xué)文獻(xiàn)》(Arch. Virol.) 140 (6): 987-92 ( 1995);Domk-Optize， I.等，《內(nèi)源性毒素刺激巨噬細(xì)胞導(dǎo)致持續(xù)單純皰疹病 毒感染的復(fù)活》(SW腦/加'ow o/ Mwrop/wges 五"ctotoc/w i eyw/to f" ^ i ea"/va"o" q/" o尸ers7'他raf //"er/ ey iS7/w/ /ejc Krws / "/o")，《斯 堪的納維亞免疫雜志》(Scand. J. Immunol.) 32 (2 ): 69-75 (1990 ); Fauci, A. S.，《fflV所致疾病發(fā)病才凡理中宿主因子的作用》(HoW Fwon z" Ag尸a快oge"e^ o/ /f/FwWwced D/seoye )， 《自然》 (iVaf臟)384:529 ( 1996))。TNF-oc或包括HSV在內(nèi)的病毒感染可以導(dǎo)致IkB的把向損 害，后者又可活化NF- k B的核轉(zhuǎn)位。核轉(zhuǎn)位促進(jìn)NF- k B與DNA 操縱子的結(jié)合，從而促進(jìn)大量炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，包括TNF-ot、 IL-6 和其它細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子的表達(dá)又進(jìn)一步復(fù)活其它HSV感 染的細(xì)胞以產(chǎn)生HSV病毒(參閱Patel， A.等，《單純皰滲病毒I型 對(duì)持續(xù)NF-kB核轉(zhuǎn)位的誘導(dǎo)提高病毒復(fù)制的效率》(i/e^M7h2"/ocWow /"creoyas Ae j^ cz'e"cy o/ / e/ //cartow ),《病毒學(xué)》 (W油gy) 247(2):212-22 ( 1998 ))。因此，a-MSH和/或其4汙生物通過阻斷NF-kb的結(jié)合抑制更 多活化HSV的炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)。本實(shí)施例以及實(shí)施例VII-VUI表明a-MSH和/或其衍生物抑制病毒復(fù)制、表達(dá)和復(fù)活，此作用是通過抑制機(jī)體細(xì)胞因子或其它病毒感染誘發(fā)的NF-KB的結(jié)合而 實(shí)現(xiàn)的。實(shí)施例x本實(shí)施例闡明ct-MSH和/或其衍生物抑制急性感染人體細(xì)胞內(nèi) 病毒復(fù)制的能力，或者更確切地說，闡明ct-MSH抑制實(shí)際感染的 人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)內(nèi)HIV-l復(fù)制和表達(dá)的能力。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離來自正常個(gè)體的PBMCs。 單核細(xì)胞由Percoll梯度分離，然后選取24孔組織培養(yǎng)板，在加入 20%FCS的RPMI完全培養(yǎng)基內(nèi)使其分化7天，成為巨噬細(xì)胞 (MDM)，細(xì)胞密度為IOV毫升。用嗜單核細(xì)胞的HIVBot-l林 (1:10)感染MDM,過夜。未稀釋的病毒群包含107個(gè)感染單位/ 毫升。24小時(shí)后，沖洗MDM并將其重新懸浮于完整介質(zhì)中。 一周 更換三次，連續(xù)三周.采用市售ELISA Retrosys RT試劑盒(瑞典 lund Innovagen生產(chǎn))，感染后每周測(cè)定反轉(zhuǎn)錄酶的釋放量。HIV感 染時(shí)及其后的每一天加入10_5M的oc-MSH (11-13)(序列號(hào)1 號(hào))，直到最后采樣.圖15表明ot-MSH明顯抑制急性感染的MDM中逆轉(zhuǎn)錄酶的釋 放。此抑制效應(yīng)在第6天更顯著，但第21天仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此本實(shí)施例說明感染部位的病毒復(fù)制可以被cx -MSH和/或其 衍生物抑制。所以，通常性傳播疾病，尤其是HIV,可以通過cc-MSH 和/或其衍生物與避孕工具的結(jié)合運(yùn)用而被抑制，避孕工具如用于性 交的避孕套、隔膜、海綿和/或性交后所用的含ct-MSH和/或其衍生 物的栓劑、油脂、油骨、凝膠或氣溶膠泡沫。本實(shí)施例闡明ot-MSH和/或其^t生物的生物學(xué)功能相當(dāng)物。雖然這里所述特定氨基酸序列是有效的，但對(duì)于熟悉本專業(yè)的 技術(shù)人員來說，很容易做到替換或去除氨基酸而不改變肽類的有效 性 進(jìn)一步來說，oc-MSH序列的穩(wěn)定可以大幅度提高肽類活性， 替換D-氨基酸構(gòu)型為L型可以提高或降低肽類活性。例如，oc-MSH 的穩(wěn)定類似物，[Nle4，D-Phe7]-ot-MSH，其解熱作用是母體肽分子大 約10倍有余，此物質(zhì)已知對(duì)黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞有明顯的生物 學(xué)活性。確切地說，在ot-MSH (11-13)(序列號(hào)1號(hào))的C-末端 加入氨基酸能夠降低或加強(qiáng)解熱效應(yīng)。加入甘氨酸形成10-13序 列(序列號(hào)5號(hào))，可以略孩i減弱其效應(yīng)；形成9-13序列(序列 號(hào)6號(hào))，幾乎無解熱作用；而8-13序列(序列號(hào)7號(hào))的解熱 效應(yīng)強(qiáng)于11-13序列(序列號(hào)1號(hào)).已知Ac-[D-Kll]-ot-MSH 11-13-NH2具有和ot-MSH (11 - 13 )(序列號(hào)1號(hào))的L型三肽相 同的總體效應(yīng)。但是在三肽的12位以D-脯氨酸替換將導(dǎo)致其活性 的喪失(參閱Holdeman，M.等，《一種有效a-MSH類似物的解熱活 性》(爿"印戸"c Jc"v砂。/a尸ofe"f ct-MS7/爿wa/og)，《肽物質(zhì)》(Pe/ "cfes) 6,273-5 ( 1985 ); Deeter， L. B.等，《兔中樞給予a -MSH 片斷的解熱4爭(zhēng)'〖生》(i4wn]pyreric尸ro/ eWz'es o/ cew伊a〃y j^/m'w&fered or 掘// Frag歸"a Ae 《肽物質(zhì)》(尸印"Vfes) 9,1285-8(1989); Hiltz，M.E.，《ct-MSH (11 - 13 )類似物的抗炎活性立 體化學(xué)改變的影響》(」""-// /7awwatoo^c//v/i^o/ "-MS7/ 〃7-73 J y4"a/ogs:7i^/7Mg"ces < /4/fera"。W5 /w &e/-eocAe/m'5f/y )， 《狀物質(zhì)》(尸取由)12,767-71 ( 1991 ))。生物學(xué)功能相當(dāng)物也可通過替換具有近似親水值的氨基酸來獲 得。例如，異亮氨酸和亮氨酸(親水指數(shù)分別是+4.5和+3.8)可以 用來替換纈氨酸(親水指數(shù)為+4.2),這樣仍可得到具有相似生物學(xué)功能的蛋白?？晒┻x擇的另一種方法針對(duì)親水指數(shù)為負(fù)值的氨基酸，如賴氨酸(-3.9)可用精氨酸(4.5)替換，等等. 一般而言， 和被替換氨基酸親水指數(shù)差別在單位+/- 1范圍內(nèi)的氨基酸能夠成 功地進(jìn)行替換。此外，這些經(jīng)修飾的a -MSH和/或其衍生物的類似物也能夠象 圖16中所描述的KPV二聚體一樣形成二聚體。實(shí)施例xn女性經(jīng)受著陰道、外陰和/或尿道的不適。醫(yī)生的檢查包括上述 部位取材的培養(yǎng)。確定了包括任何感染和炎癥在內(nèi)的不適之后，醫(yī) 生可以開處方，如適當(dāng)?shù)目股?、抗真菌藥、抗病毒藥或消炎藥。此外，治療也可以包括劑量達(dá)到藥理學(xué)效應(yīng)的a-MSH和/或其衍生 物的局部應(yīng)用，a-MSH和/或其衍生物由藥貪、油脂、膠體、可溶 性藥丸、噴霧、栓劑、用于灌注的溶液、或者棉條吸收材料攜帶到 達(dá)局部，才艮據(jù)醫(yī)生的判斷，局部治療可一次或多次^f吏用，直到疾病 治愈。本實(shí)施例在醫(yī)生的判斷下適用，也可應(yīng)用于有陰莖、睪丸和/ 或尿道不適的男性病人。此外，a-MSH和/或其衍生物的局部治療 也可不在醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行，而以非處方藥物形式使用。上迷實(shí)施例I -XII闡明了 oc-MSH和/或其衍生物的抗感染活性 和應(yīng)用。其中引用數(shù)據(jù)的目的只是便于說明實(shí)施例，并不是把本發(fā) 明局限于這些實(shí)施例范圍內(nèi)。應(yīng)該明了的是，對(duì)上述實(shí)施例的修改 并不偏離本發(fā)明的精神。而且，這些實(shí)施例可單獨(dú)或聯(lián)合進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種包含兩個(gè)連接在一起的單體的二聚體，其中，兩個(gè)單體中的每個(gè)單體包括具有氨基酸序列Lys-Pro-Val的C末端。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中，所述單體在N末端連接。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中，所述二聚體是一個(gè)同型 二聚體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中，所述二聚體是一個(gè)異質(zhì) 二聚體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中，所述二聚體包括至少一 個(gè)D型氨基酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中，每個(gè)單體具有一個(gè)N末 端的半胱氨酸，其中所述N末端的半胱氨酸通過一個(gè)二石克鍵將 單體連接在一起。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中，所述二聚體被N端乙酰 化、或C端酰胺化、或者二者兼有。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病的一種或多種多肽所形成的二聚體。泌尿生殖系統(tǒng)疾病包括感染、炎癥、或者二者兼有。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，泌尿生殖系統(tǒng)疾病包括陰道、外陰、尿道、陰莖、和/或直腸的感染、和/或炎癥。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種或多種多肽溶于載體內(nèi)。而另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種或多種多肽與棉條結(jié)合，用來預(yù)防中毒性休克綜合癥。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種或多種多肽與避孕工具結(jié)合，以防止性傳播疾病或感染。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種或多種多肽與栓劑結(jié)合，以便于插入陰道或肛門。
文檔編號(hào)A61F13/20GK101240017SQ20071016672
公開日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2000年3月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月24日
發(fā)明者安娜·卡塔尼亞, 詹姆斯·利普頓 申請(qǐng)人:曾根公司