專(zhuān)利名稱(chēng)：一種雙基因協(xié)同修飾的組織工程化骨及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程化骨，具體地說(shuō)關(guān)于一種雙基因協(xié)同修飾的 組織工程化骨及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨形成蛋白(BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族，其中BMP2 、 4 、 5 、 6 、 7等與骨、軟骨、肌腱、牙周組織、牙本質(zhì)的形成有極為密切的關(guān)系，均 有明確的誘導(dǎo)成骨的作用。但傳統(tǒng)的BMP蛋白制備,無(wú)論是從骨基質(zhì)中提 純，還是用基因工程表達(dá)，程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，活性不穩(wěn)定;在修復(fù)大面積骨 缺損時(shí)，BMP的用量大,可能會(huì)生毒性反應(yīng)；BMP作為外源性蛋白植入體內(nèi)， 也可能引起免疫反應(yīng)。近年有學(xué)者探索應(yīng)用BMP基因治療的方法加速骨 缺損的修復(fù)。1988年Wozney等首先克隆出hBMPl-4cDM。隨后陸續(xù)克隆 獲得了 BMP家族中的其它成員，為骨缺損修復(fù)的BMP基因治療奠定了基 礎(chǔ)。BMP基因轉(zhuǎn)移的載體各有特點(diǎn)，反轉(zhuǎn)錄病毒能將目的基因整合到靶細(xì) 胞基因組中，可長(zhǎng)期表達(dá)，腺病毒不論靶細(xì)胞增殖狀況均可高效轉(zhuǎn)移，介導(dǎo) 的基因轉(zhuǎn)移是非整合型的；棵DNA直接轉(zhuǎn)導(dǎo)方法簡(jiǎn)單，無(wú)免疫原性，安全， 費(fèi)用低,缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低。應(yīng)用BMP基因治療結(jié)合組織工程技術(shù)促進(jìn)新骨的形成已成為目前骨再生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
Nell-l (Nel樣I型分子)是具有成骨能力的新基因，與顱縫早閉有 關(guān)。Nell-l編碼90kDa的多肽，并最終形成三聚體分泌到胞外，種系間基 因序列高度保守。最近的研究顯示，Nell-l促進(jìn)成骨的能力較強(qiáng)。Nell-1 在一定的范圍內(nèi)成骨能力與BMP-2相當(dāng)。有意思的是該基因可以促進(jìn)成骨 細(xì)胞的分化以及成骨分化終末階段所伴隨的凋亡，而對(duì)成纖維細(xì)胞系或原 代的成纖維細(xì)胞卻沒(méi)有作用，其作用部位可能是在成骨信號(hào)通路的下游， 或者通過(guò)與BMP成骨作用不同的機(jī)制促進(jìn)成骨。
BMPs與Nel卜l促進(jìn)成骨的機(jī)制有所不同BMPs是通過(guò)細(xì)胞膜受體， SMAD蛋白、Cbf a-l轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)成骨；而Nell-1目前認(rèn)為它處于成 骨轉(zhuǎn)錄因子Cbf a-l的下游。發(fā)現(xiàn)Nell-l與BMP-2協(xié)同促進(jìn)骨髓基質(zhì) 細(xì)胞成骨將有助于揭示成骨信號(hào)通if各中的某些才幾制。Nell-1與BMPs強(qiáng) 大的協(xié)同成骨能力，還可以用來(lái)修復(fù)大塊的骨組織缺損，并可能減少因 為大量4吏用BMP造成的全身系統(tǒng)性毒副作用。應(yīng)用Nell-l與BMPs協(xié)同 修飾bMSCs復(fù)合生物支架材料構(gòu)建組織工程化骨具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于
(1)提供一種Nel卜l與BMP-2協(xié)同》務(wù)飾bMSCs構(gòu)建組織工程化骨； (2 )提供組織工程化骨用途。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的目的是通過(guò)以 下技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的選擇Nell-l與BMP-2基因協(xié)同轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)擴(kuò)增的大鼠bMSCs， Nel卜l基因是成骨能力較強(qiáng)的新基因，目前的研究認(rèn)為在 細(xì)胞水平上，Nel卜l單獨(dú)誘導(dǎo)一定程度的成骨分化，它可能操縱了一些 成骨相關(guān)基因的下游途徑，并影響了其他信號(hào)通^各,促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。 作為一種新克隆的成骨相關(guān)基因，Nell-l具有潛在的安全性以及明顯的 成骨作用，它的產(chǎn)物蛋白可能成為骨組織工程中一種新的生長(zhǎng)因子。
骨形成蛋白(BMP)屬于TGF-P超家族，其中BMP-2、 4、 7等均有明 確的獨(dú)立誘導(dǎo)成骨能力。Wozney于1988年首先克隆出BMP-2、 4基因， 從而為骨缺損修復(fù)的BMP基因治療奠定了 _^5出。BMP基因治療較傳統(tǒng)方法 直接應(yīng)用BMP蛋白具有不少潛在的優(yōu)越性。比如，基因產(chǎn)物可以局部和耙 向釋放，可以最大限度地增加局部治療效果，減小全身副作用，內(nèi)源性表 達(dá)的蛋白可能具有更大的生物學(xué)活性，因此已成為骨修復(fù)研究的熱點(diǎn)。本 發(fā)明選擇有明確的誘導(dǎo)成骨作用的BMP-2基因與Nell-1協(xié)同修飾大鼠 bMSCs作為組織工程化骨的種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化骨，促進(jìn)頜骨缺損修 復(fù)。
骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells ， bMSCs)具有來(lái)源豐富， 采集方便,容易在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增的特點(diǎn)，并具有明確的成骨潛能， 是組織工程化骨理想的種子細(xì)胞。該細(xì)胞在體外培養(yǎng)具有較強(qiáng)的傳代增殖 能力，外源目的基因易于導(dǎo)入，因此也是骨缺損基因治療較為理想的耙細(xì) 胞。應(yīng)用bMSCs來(lái)表達(dá)基因有許多優(yōu)點(diǎn)，bMSCs 4艮容易采集并進(jìn)行組織 培養(yǎng)，其自身具有成骨潛能。本發(fā)明利用Nell-l與BMP-2基因協(xié)同轉(zhuǎn)染大 鼠、狗、兔、羊、豬等bMSCs ，然后將基因修飾的細(xì)胞與生物支架材料復(fù) 合(如磷酸三鈣、多孔羥基磷灰石、珊瑚、藻酸4丐、膠原等)可以構(gòu)建組織工程化骨。以上海貝奧路生物材料有限公司研制的微孔結(jié)構(gòu)及降解率可
控P-磷酸三鈣(p-tricalcium phosphate, p-TCP)為例,可以起到臨時(shí) 支架作用，引導(dǎo)骨生長(zhǎng)，允許周?chē)墓窍虿牧现薪?rùn)長(zhǎng)入，然后材料被逐 漸吸收，無(wú)炎癥或排斥反應(yīng)，不產(chǎn)生局部或全身性毒性反應(yīng)。TCP是 磷酸三鈣不同相結(jié)晶物的一種。自二十世紀(jì)70年代以來(lái)，P-TCP—直是 骨替代材料研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，其分子式為Ca3(P04)2,工業(yè)合成P-TCP 粉料的鈣/磷比為1.49-1.51,與正常骨組織的鈣磷比接近。P-TCP的 成分與骨基質(zhì)的無(wú)機(jī)成分[Ca!。(P04)6(OH)2 ]相似，故被認(rèn)為具有良好的生 物相容性。P-TCP具有吸收緩慢，低免疫反應(yīng)和低毒性等特點(diǎn)，并具有 骨引導(dǎo)性，適合作為組織工程修復(fù)頜骨的材料。應(yīng)用Nel卜l與BMP-2基 因協(xié)同轉(zhuǎn)染bMSCs作為組織工程化骨的種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，構(gòu)建組 織工程化骨修復(fù)大鼠臨界頜骨缺損。綜上，本發(fā)明用貼壁法對(duì)大鼠bMSCs 進(jìn)行了培養(yǎng)，以Nell-l與BMP-2基因協(xié)同轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠bMSCs促 進(jìn)bMSCs成骨分化。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下 一種Nell-l與BMP-2基因協(xié)同修飾bMSCs 構(gòu)建組織工程化骨，它由下列方法制得:(1 )腺病毒介導(dǎo)的Nell-1與BMP-2 基因協(xié)同轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物、 生物支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程化骨。腺病毒介導(dǎo)的Nell-l與BMP-2以 MOI=50pfu/cell轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源鼠、 兔、羊、狗、豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞，生物支架材料是磷酸三4丐、多孔羥基磷灰 石、珊瑚、藻酸釣、膠原，生物支架材料是l3-磷酸三鈣，細(xì)胞密度為5 x 10Vml的細(xì)胞懸液與生物支架材料復(fù)合。Nell-l與BMP-2協(xié)同{務(wù)飾bMSCs構(gòu)建組織工程化骨在頜骨缺損^^復(fù) 領(lǐng)域中應(yīng)用。
本發(fā)明所公開(kāi)一種雙基因協(xié)同修飾的組織工程化骨及其應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn) 表現(xiàn)在本發(fā)明把基因治療與組織工程方法結(jié)合起來(lái)，以bMSCs作為基因 治療的靶細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用其作為組織工程化骨的種子細(xì)胞，通過(guò)基因協(xié)同 修飾bMSCs后的自分泌和旁分泌作用，加速成骨。組織學(xué)結(jié)果顯示 Nel卜l與BMP-2協(xié)同修飾的組織工程化骨修復(fù)大鼠臨界骨組織缺損時(shí)， 新骨形成效果優(yōu)于Nell-l或BMP-2單獨(dú)修飾的組織工程化骨


圖1: N + B組新骨面積大，骨組織周?chē)梢?jiàn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分布，出現(xiàn)更
多板層骨樣組織和骨陷窩樣結(jié)構(gòu)(HE染色，放大倍數(shù)100)。
圖2: N + B組新骨面積大，骨組織周?chē)梢?jiàn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分布，出現(xiàn)更
多板層骨樣組織和骨陷窩樣結(jié)構(gòu)(HE染色，放大倍數(shù)200)。
圖3: N組新骨面積形成較N+B組少(HE染色，放大倍數(shù)IOO)。
圖4: N組新骨面積形成較N+B組少(HE染色，放大倍數(shù)200)。
圖5: B組新骨面積形成較N+B組少(HE染色，放大倍數(shù)IOO)。
圖6: B組新骨面積形成較N+B組少(HE染色，放大倍數(shù)200)。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果分析和相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)附圖，對(duì)Nell-l與 BMP-2協(xié)同轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)頜骨缺損修復(fù)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。Nell-1與BMP-2協(xié)同修飾的組織工程化骨促進(jìn)頜骨缺損的修復(fù)
一、 Nell-l與BMP-2基因協(xié)同轉(zhuǎn)染大鼠bMSCs
步驟一、原代bMSCs的獲取及培養(yǎng)無(wú)菌狀態(tài)下，取SPF級(jí)6周齡雄 性Fischer 344大鼠脛骨和股骨骨髓，所得細(xì)胞懸液離心，吸去上清液和 漂浮于液面的脂肪，加DMEM培養(yǎng)液，均勻吹散，置于培養(yǎng)條件為37。C恒 溫混合氣體(含95%空氣，5%C02)， 100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 周換液3次，待90y。左右的細(xì)胞融合時(shí)予以傳代，培養(yǎng)至第2至3代時(shí)， 更換培養(yǎng)液為DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用于研究。
步驟二、 Nel卜l與BMP-2基因協(xié)同轉(zhuǎn)染bMSCs 細(xì)月包生長(zhǎng)至70 - 80% 融合時(shí)，予以傳代，24小時(shí)后細(xì)胞全部附著于底壁，此時(shí)吸去DMEM誘導(dǎo) 分化培養(yǎng)液，無(wú)血清DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液洗滌2次，加入一半量包含 Nell-l與BMP-2各50pfu/細(xì)胞工作濃度腺病毒載體的無(wú)血清DMEM成骨誘 導(dǎo)培養(yǎng)液，加入稀釋的攜基因的腺病毒載體后，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一小時(shí)， 期間每隔15分鐘均勻輕搖晃，使病毒充分接觸細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染效率。一 小時(shí)后加入另外半量的含20%血清的培養(yǎng)液。此時(shí)培養(yǎng)液中FBS含量為 10%。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，PBS液洗滌兩次，加入全量
成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液。Nell-1基因及BMP-2基 因從美國(guó)Origen爿^司獲得。
二、 構(gòu)建組織工程化骨促進(jìn)頜骨缺損修復(fù)
步驟一、組織工程化骨的構(gòu)建 將基因轉(zhuǎn)染3天的bMSCs消化，制 成細(xì)胞密度為5 x 107/ml的細(xì)胞懸液，緩慢滴加到直徑為5mm的圓柱形P-TCP材料至飽和狀態(tài)，使得材料濕潤(rùn)，而液體不流出。
步驟二、大鼠下頜骨缺損模型創(chuàng)建及缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)無(wú)菌狀態(tài)下將成
年Fisher 344大鼠麻醉、頜下區(qū)備皮、消毒，在大鼠頜下做平行于下頜 下緣的切口，切開(kāi)皮膚，皮下組織和肌肉-骨膜層并翻瓣，暴露下頜骨的 頰側(cè)和舌側(cè)骨板。用Kavo高速鉆機(jī)帶5mm外徑的鉆頭在下頜升支制造5醒 直徑的圓形缺損，過(guò)程中始終緩慢注射生理鹽水冷卻。在鉆孔過(guò)程中注意 對(duì)頜骨舌側(cè)軟組織的保護(hù)，防止傷及翼靜脈叢。將bMSCs-TCP復(fù)合物 填充于缺損中。隨后以4-0縫線縫合肌肉-骨膜層和皮膚-皮下組織層。。
步驟三、取材、組織病理學(xué)觀察 將大鼠注射過(guò)量戊巴比妥致死， 銳性分離軟硬組織，以骨剪取出移植物，脫4丐、脫水，石蠟包埋、切片、 HE染色和成骨面積分析。比豐支Nell-l與BMP-2協(xié)同修飾的組織工程化骨 與基因單獨(dú)修飾的組織工程化骨成骨的效果。
Nell-1 {務(wù)飾bMSCs構(gòu)建組織工程化骨
步驟一、原代bMSCs的獲取及培養(yǎng)無(wú)菌狀態(tài)下，取SPF級(jí)6周齡雄 性Fischer 344大鼠脛骨和股骨骨髓，所得細(xì)胞懸液離心，吸去上清液和 漂浮于液面的脂肪，加DMEM培養(yǎng)液，均勻吹散，置于培養(yǎng)條件為37。C恒 溫混合氣體(含95%空氣，5%C02 ), 100 %飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 周換液3次，待90%左右的細(xì)胞融合時(shí)予以傳代，培養(yǎng)至第2至第3代時(shí)， 更換培養(yǎng)液為DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用于研究。
步驟二、Nel1-l基因轉(zhuǎn)染bMSCs 第3代細(xì)胞生長(zhǎng)至70 - 80%融合時(shí)， 予以傳代，24小時(shí)后細(xì)胞全部附著于底壁，此時(shí)吸去DMEM誘導(dǎo)分化培養(yǎng) 液，無(wú)血清DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液洗滌2次，加入半量工作濃度Nell-1腺病毒載體的無(wú)血清DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一小時(shí)，期 間每隔15分鐘均勻輕搖晃，使病毒充分接觸細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染效率。 一小 時(shí)后加入另外半量的含20°/。血清的培養(yǎng)液。此時(shí)培養(yǎng)液中FBS含量為10%。 置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，PBS液洗滌兩次，加入全量成骨 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液。Nell-l基因從美國(guó)Origen公 司獲得。
步驟三、組織工程化骨的構(gòu)建 將基因轉(zhuǎn)染3天的bMSCs消化，制 成細(xì)胞密度為5 x 107ml的細(xì)胞懸液，緩慢滴加到直徑為5腿的圓柱形P -TCP材料至飽和狀態(tài)，使得材料濕潤(rùn)，而液體不流出。
步驟四、大鼠下頜骨缺損模型創(chuàng)建及缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)無(wú)菌狀態(tài)下將成 年Fisher 344大鼠麻醉、領(lǐng)下區(qū)備皮、消毒，在大鼠頜下做平行于下頜 下緣的切口，切開(kāi)皮膚，皮下組織和肌肉-骨膜層并翻瓣，暴露下頜骨的 頰側(cè)和舌側(cè)骨板。用Kavo高速鉆機(jī)帶5匪外徑的鉆頭在下頜升支制造5mm 直徑的圓形缺損，過(guò)程中始終緩慢注射生理鹽水冷卻。在鉆孔過(guò)程中注意 對(duì)頜骨舌側(cè)軟組織的保護(hù)，防止傷及翼靜脈叢。將bMSCs-P-TCP復(fù)合物 填充于缺損中。隨后以4-O縫線縫合肌肉-骨膜層和皮膚-皮下組織層。
步驟五、取材、組織病理學(xué)觀察 將大鼠注射過(guò)量戊巴比妥致死， 銳性分離軟硬組織，以骨剪取出移植物，脫4丐、脫水，石蠟包埋、切片、 HE染色觀察。
BMP - 2修飾bMSCs構(gòu)建組織工程化骨
步驟一、原代bMSCs的獲取及培養(yǎng)無(wú)菌狀態(tài)下，取SPF級(jí)6周齡雄 性Fischer 344大鼠脛骨和股骨骨髓，所得細(xì)胞懸液離心，吸去上清液和漂浮于液面的脂肪，加DMEM培養(yǎng)液，均勻吹散，置于培養(yǎng)條件為37。C恒 溫混合氣體(含95%空氣，5%C02)， 100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 周換液3次，待90%左右的細(xì)胞融合時(shí)予以傳代，培養(yǎng)至第2至3代時(shí)， 更換培養(yǎng)液為DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用于研究。
步驟二、 BMP-2基因轉(zhuǎn)染bMSCs 第3代細(xì)胞生長(zhǎng)至70 - 80%融合時(shí)， 予以傳代，24小時(shí)后細(xì)胞全部附著于底壁，此時(shí)吸去DMEM誘導(dǎo)分化培養(yǎng) 液，無(wú)血清DMEM成骨i秀導(dǎo)培養(yǎng)液洗滌2次，加入半量工作濃度BMP-2 &泉 病毒載體的無(wú)血清DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，加入稀釋的攜基因的腺病毒載 體后，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一小時(shí)，期間每隔15分鐘均勻輕搖晃，使病毒充 分接觸細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染效率。 一小時(shí)后加入另外半量的含20%血清的培養(yǎng) 液。此時(shí)培養(yǎng)液中FBS含量為10%。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，吸去培養(yǎng) 液，PBS液洗滌兩次，加入全量成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每3天 換液。BMP-2基因從美國(guó)Origen公司獲得。
步驟三、組織工程化骨的構(gòu)建 將基因轉(zhuǎn)染的bMSCs消化，制成細(xì) 胞密度為5 x 107ml的細(xì)胞懸液，緩慢滴加到直徑為5腿的圓柱形(3 -TCP 材料至飽和狀態(tài)，使得材料濕潤(rùn)，而液體不流出。
步驟四、大鼠下頜骨缺損模型創(chuàng)建及缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)無(wú)菌狀態(tài)下將成 年Fisher 344大鼠麻醉、頜下區(qū)備皮、消毒，在大鼠頜下做平行于下頜 下緣的切口，切開(kāi)皮膚，皮下組織和肌肉-骨膜層并翻瓣，暴露下頜骨的 頰側(cè)和舌側(cè)骨板。用Kavo高速鉆機(jī)帶5mm外徑的鉆頭在下頜升支制造5mm 直徑的圓形缺損，過(guò)程中始終緩慢注射生理鹽水冷卻。在鉆孔過(guò)程中注意 對(duì)頜骨舌側(cè)軟組織的保護(hù)，防止傷及翼靜脈叢。將bMSCs-|3-TCP復(fù)合物填充于缺損中。隨后以4-0縫線縫合肌肉-骨膜層和皮膚-皮下組織層。
步驟五、取材、組織病理學(xué)觀察 將大鼠注射過(guò)量戊巴比妥致死，
銳性分離軟硬組織，以骨剪取出移植物，脫4丐、脫水，石蠟包埋、切片、 HE染色觀察。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Nel卜l與BMP-2協(xié)同修飾的組織工程化骨促進(jìn)頜骨缺損的修復(fù) 術(shù)后8周的組織學(xué)HE染色顯示N + B組(Nell-1與BMP-2協(xié)同》務(wù)飾 的組織工程化骨)》務(wù)復(fù)區(qū)域新骨面積大于N組(Nell-l修_飾bMSCs構(gòu)建 組織工程化骨)和B組(BMP-2修飾bMSCs構(gòu)建組織工程化骨)，骨質(zhì)生 長(zhǎng)未超出材料的體積范圍。N + B組成骨作用較N組和B組明顯，骨樣組 織周?chē)梢?jiàn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分布，出現(xiàn)更多板層骨樣組織和骨陷窩樣結(jié)構(gòu) (圖l、圖2)，而此時(shí)N組(圖3、圖4)和B組(圖5、圖6)的成骨均 未及N + B組。
權(quán)利要求
1、一種雙基因協(xié)同修飾的組織工程化骨，它由下列方法制得(1)腺病毒介導(dǎo)的Nell-1與BMP-2協(xié)同轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物、生物支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程化骨。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于Nell-l與BMP-2 腺病毒載體工作濃度分別為50pfu/細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于腺病毒介導(dǎo)的 Nell-l與BMP-2以MOI=50pfu/cell轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于骨髓基質(zhì)細(xì)胞來(lái) 源鼠、兔、羊、狗、豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于骨髓基質(zhì)細(xì)胞來(lái) 源鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。，
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織工程化骨，其特征在于生物支架材料是 磷酸三4丐、多孔羥基磷灰石、珊瑚、藻酸4丐、膠原。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織工程化骨，其特征在于生物支架材料是
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于細(xì)胞密度為5x 10Vml的細(xì)胞懸液與生物支架材料復(fù)合。
9、 權(quán)利要求l-8任一所述的組織工程化骨在頜骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組織工程化骨，具體地說(shuō)關(guān)于一種雙基因協(xié)同修飾的組織工程化骨及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種Nell-1與BMP-2協(xié)同修飾bMSCs構(gòu)建組織工程化骨，它由下列方法制得(1)腺病毒介導(dǎo)的Nell-1與BMP-2基因協(xié)同轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物、生物支架材料構(gòu)建組織工程化骨修復(fù)大鼠下頜骨臨界骨組織缺損。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在Nell-1與BMP-2基因協(xié)同修飾的組織工程化骨修復(fù)大鼠臨界骨組織缺損，材料網(wǎng)孔內(nèi)新骨成骨多，新骨形成效果優(yōu)于Nell-1或BMP-2單獨(dú)修飾的組織工程化骨。
文檔編號(hào)A61L27/36GK101444643SQ200710171058
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2007年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者劉根桃, 慶 常, 張志愿, 張秀麗, 蔣欣泉, 君 趙, 陳建國(guó) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院