專利名稱：一種在生物降解性材料上錨定生長(zhǎng)因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在生物降解性材料上錨定生長(zhǎng)因子的方法，具體地 說(shuō)，涉及一種使生長(zhǎng)因子在經(jīng)過(guò)等離子體處理的生物降解性材料上有效固 定、保持生物活性，又能逐漸從該生物降解性材料上脫落、緩慢釋放的方 法。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)因子是具有傳遞生物信號(hào)、調(diào)節(jié)細(xì)胞行為功能的多肽，能夠剌激 或阻止細(xì)胞的粘附、增殖、分化、遷移和基因表達(dá)，也能夠影響其它生長(zhǎng) 因子的分泌和行為。至今已被識(shí)別和表征的生長(zhǎng)因子有成纖維生長(zhǎng)因子
(FGF)、鹼性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)、皮膚生長(zhǎng)因子(EGF)、 (3 轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGF-(3)、 a轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGF-a)、骨形態(tài)蛋白(BMP)、 血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和胰島素類生長(zhǎng)因子(IGF-I)等。由于生 長(zhǎng)因子已經(jīng)在組織再生、傷口治愈和血管形成等方面顯示出良好的治療效 果，使對(duì)它們新功能的認(rèn)識(shí)和新應(yīng)用的開(kāi)發(fā)研究也不斷地被深入。
生長(zhǎng)因子一般在有水存在及室溫環(huán)境下是很容易失去生物活性的，因 此直接使用生長(zhǎng)因子時(shí)就會(huì)由于體內(nèi)生理環(huán)境的影響而使生長(zhǎng)因子失活。 例如，將生長(zhǎng)因子以溶液形式注入體內(nèi)時(shí)就會(huì)導(dǎo)致活性下降而難以達(dá)到預(yù) 期的效果。由于生長(zhǎng)因子的作用強(qiáng)弱及其使用效果同生長(zhǎng)因子的有效濃度 間呈很強(qiáng)的依賴關(guān)系，因此，如何能在體內(nèi)環(huán)境下仍然保持生長(zhǎng)因子的生 物活性、并且使其具有較長(zhǎng)的使用有效期，成為生長(zhǎng)因子能否真正在臨床 得以應(yīng)用和發(fā)揮作用的關(guān)鍵所在。
根據(jù)藥物控制釋放的原理，利用大多數(shù)高分子材料都呈疏水性的特 點(diǎn)，用生物條件下可降解的高分子來(lái)包埋或微包囊生長(zhǎng)因子，就既可達(dá)到 防止生長(zhǎng)因子直接與水接觸、防止失活的保護(hù)作用，又可利用高分子包埋 或包囊層屏障所起的限制和控制作用實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子的緩慢釋放，使生長(zhǎng)因子的壽命和有效作用時(shí)間得到延長(zhǎng)。而生物降解高分子包埋層或包囊層又 可在體內(nèi)降解、最終自行消失、不會(huì)產(chǎn)生任何殘留，在植入體內(nèi)并生長(zhǎng)因 子釋放完后也不需通過(guò)手術(shù)從體內(nèi)取出。因此關(guān)鍵是采用何種生物降解材 料，以及采用何種生長(zhǎng)因子的保護(hù)和控制技術(shù)，達(dá)到既對(duì)生長(zhǎng)因子具有物 理保護(hù)作用、又對(duì)生長(zhǎng)因子的溶解和擴(kuò)散起調(diào)節(jié)控制作用，從而實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng) 因子緩慢釋放的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種在生物降解性材料上錨定生長(zhǎng)因子的方法， 以期達(dá)到既能使生長(zhǎng)因子在生物降解性材料上有效地固定，其生物活性得 到保護(hù)，爾后又能逐漸從該生物降解性材料上脫落、緩慢釋放的目的。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的在生物降解性材料上錨定生長(zhǎng)因子的 方法，其步驟如下-
A) 將生物降解性材料進(jìn)行等離子體處理；
B) 將步驟A處理后的生物降解性材料浸入生長(zhǎng)因子的溶液中，進(jìn)行
生長(zhǎng)因子錨定處理；
C) 將步驟B處理后的生物降解性材料取出，冷凍干燥。 所述的方法，其中，所述的生物降解性材料是合成類生物降解高分子
或天然生物降解高分子，且具有幾何形狀和尺寸的致密或多孔結(jié)構(gòu)的膜、 管、微球或支架。
所述的方法，其中，所述生物降解性材料選自聚L-乳酸(PLLA)、 聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PL-DL-LA)、共聚 (乙交酯/丙交酯)(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚(乙交酯/丙交酯/ 己內(nèi)酯)三元共聚物(PGLC)、聚己內(nèi)酯/聚乙二醇嵌段共聚物(PCE)、 聚己內(nèi)酯/聚乙二醇/聚丙交酯三元共聚物(PCEL)、聚羥丁酯(PHB)、 聚羥戊酯(PHV)、膠原、明膠、殼聚糖、透明質(zhì)酸其中一種，或它們間 的共混物。
所述的方法，其中，所述的等離子體處理?xiàng)l件是氣壓O.l — lOOPa; 等離子體處理功率IO—IOOW;處理時(shí)間3 — 120分鐘。
所述的方法，其中，步驟A所述的等離子體處理是在氧氣、空氣、氨氣、氮?dú)狻⒍趸?、氬氣、氦氣或它們的混合氣體氣氛中進(jìn)行的。
所述的方法，其中，步驟B所述的生長(zhǎng)因子溶液其濃度是
50ng/ml-200嗎/ml。
所述的方法，其中，步驟B所述的生長(zhǎng)因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子
(FGF)、鹼性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)、皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(NGF)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子
(TGF)、骨衍生性生長(zhǎng)因子(BDGF)、骨形態(tài)蛋白(BMP)、血小板衍生 生長(zhǎng)因子(PDGF)或胰島素類生長(zhǎng)因子(IGF-I)。
所述的方法，其中，步驟B所述的生長(zhǎng)因子溶液中的溶劑是水、磷 酸緩沖液、Tris (三羥甲基氨基甲烷，tYishydroxymethylaminomethane)緩 沖液、MES (2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，2-(N-Morphilino)ethanesulfonic acid) 緩沖液、PIPES (哌嗪-N ， N-雙 (2-乙磺酸)， piperazine-N,N-bis(2-ethanesulfomc acid))緩沖液、MOPS(3陽(yáng)(N-嗎啡啉)丙 石黃酸，3-(N-Morpholino) propane sulfonic Acid)緩沖液、Bicine(N,N—二羥 乙基甘氨酸，N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine)緩沖液、Glycylglycine(雙甘 氨二肽)緩沖液或Tricine(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸， N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine)緩沖液。
所述的方法，其中，步驟B所述的生長(zhǎng)因子錨定處理時(shí)間為3 — 300 分鐘。
本發(fā)明提供的在生物降解性材料上錨定生長(zhǎng)因子的方法，其生長(zhǎng)因子 可有效地保持生物活性，并持續(xù)釋放一周以上?？勺鳛閭鬏斏L(zhǎng)因子的載 體推動(dòng)外源性生長(zhǎng)因子發(fā)揮臨床治療的作用，也可用于生物降解性材料支 架的表面改性而應(yīng)用于組織工程。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的在生物降解性材料上錨定生長(zhǎng)因子的方法中，操作步驟
是
O將生物降解性材料在是在氧氣、空氣、氨氣、氮?dú)狻⒍趸肌?氬氣、氦氣或它們間混合氣體的氣氛下進(jìn)行等離子體處理，并將經(jīng)過(guò)等離 子體處理過(guò)的生物降解性材料在該等離子體處理的氣氛下繼續(xù)保持一定時(shí)間。
進(jìn)行等離子體處理的條件是氣壓是O.l-lOOPa，功率為10-100瓦， 等離子體處理時(shí)間是3-120分鐘。
本發(fā)明采用生物降解性材料是合成類生物降解高分子，也可為天然生 物降解高分子。合成類生物降解高分子為聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳 酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PL-DL-LA)、共聚(乙交酯/ 丙交酯)(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚(乙交酯/丙交酯/己內(nèi)酯)三 元共聚物(PGLC)、聚己內(nèi)酯/聚乙二醇嵌段共聚物(PCE)、聚己內(nèi)酯/ 聚乙二醇/聚丙交酯三元共聚物(PCEL)，以及聚羥丁酯(PHB)、聚羥 戊酯(PHV)和二者的共聚物等脂肪族聚酯類高分子或其共混物。天然生 物降解高分子為膠原、明膠、殼聚糖和/或透明質(zhì)酸。
本發(fā)明發(fā)明采用的生物降解性材料是各種幾何形狀和尺寸的致密或 多孔結(jié)構(gòu)的膜、管、微球和支架。
2) 同時(shí)，將生長(zhǎng)因子溶于溶劑中，配成生長(zhǎng)因子溶液，生長(zhǎng)因子溶 液濃度是50ng/ml-200|ig/ml。
本發(fā)明采用的生長(zhǎng)因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、鹼性成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)、皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (ECGF)、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(NGF)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGF)、骨衍生性 生長(zhǎng)因子(BDGF)、骨形態(tài)蛋白(BMP)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF) 和胰島素類生長(zhǎng)因子(IGF-I)。
本發(fā)明配制生長(zhǎng)因子溶液的溶劑是水、磷酸緩沖液、Tris緩沖液、MES 緩沖液、PIPES緩沖液、MOPS緩沖液、Bicine緩沖液、Glycylglycine緩 沖液和Tricine緩沖液。
3) 將生物降解性材料立即浸入生長(zhǎng)因子溶液，進(jìn)行生長(zhǎng)因子錨定處 理，浸泡時(shí)間為3-300分鐘。
4) 將經(jīng)過(guò)錨定處理的生物降解高分子從生長(zhǎng)因子溶液中取出，進(jìn)行 冷凍干燥；
5) 得到經(jīng)過(guò)等離子體處理-生長(zhǎng)因子錨定的生物降解高分子，備用。 通過(guò)上述方法固定在聚內(nèi)酯支架上的生長(zhǎng)因子，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定
法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)體夕卜模擬體內(nèi)溫度和剪切力環(huán)境進(jìn)行固定效率和穩(wěn)定性評(píng)估，在相同的生長(zhǎng)因子溶液中，經(jīng)等離 子處理固定的生長(zhǎng)因子的數(shù)量和穩(wěn)定性大大增加。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步描述本發(fā)明方法的各個(gè)方面，不只局限于所提 到的生長(zhǎng)因子和生物降解性材料。通過(guò)改變等離子體處理的條件，還可在 任何幾何形狀和尺寸的生物降解性材料表面固定多肽或蛋白類的生長(zhǎng)因 子。
實(shí)施例1
共聚(乙交酯/丙交酯)(PLGA)(分子量8萬(wàn))溶解在三氯甲烷中
后，注入聚四氟乙烯模具，待三氯甲烷完全揮發(fā)后，再在室溫真空條件下
脫溶劑48小時(shí)，得到厚度為0.1毫米的無(wú)孔致密結(jié)構(gòu)PLGA膜，然后進(jìn)
行以下條件的等離子體處理 氣氛二氧化碳
氣壓50Pa
等離子體功率20 W 等離子體處理時(shí)間20分鐘 在二氧化碳?xì)夥障吕^續(xù)保持時(shí)間IO分鐘。
將等離子體處理過(guò)的PLGA膜迅速浸入濃度為500ng/ml的堿性成纖 維生長(zhǎng)因子(bFGF)的磷酸緩沖液溶液(pH 7.4)中120分鐘后進(jìn)行冷凍干 燥。將錨定有bFGF的PLGA膜在37"C磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外釋放， 釋放時(shí)間可以持續(xù)7天。在錨定有bFGF的PLGA膜上進(jìn)行成纖維細(xì)胞的 培養(yǎng)，結(jié)果顯示成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及增殖都比沒(méi)有錨定bFGF的PLGA 膜有很大的提高。
實(shí)施例2
同實(shí)施例1的方法，但生物降解性材料是聚(乙交酯/丙交酯/己內(nèi)酯) 三元共聚物(PGLC)(分子量5萬(wàn))，溶劑是二氧六環(huán)，在將該高分子 溶液注入聚四氟乙烯模具后，先在-40。C下冷凍，然后再在真空和-4(TC以 下脫溶劑48小時(shí)，得到厚度為2毫米的多孔結(jié)構(gòu)支架。然后進(jìn)行以下條 件的等離子體處理
氣氛二氧化碳
氣壓30Pa等離子體功率50 W 等離子體處理時(shí)間15分鐘 在二氧化碳?xì)夥障吕^續(xù)保持時(shí)間20分鐘。
將等離子體處理過(guò)的PGLC多孔結(jié)構(gòu)支架迅速浸入濃度為200pg/ml 的重組骨形態(tài)蛋白(BMP—2)水溶液中120分鐘后進(jìn)行冷凍干燥。將錨 定有BMP—2的PGLC膜在37。C磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外釋放，釋放 時(shí)間可以持續(xù)28天。在錨定有BMP—2的PGLC多孔結(jié)構(gòu)支架上進(jìn)行成 骨細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及成骨能力都比沒(méi)有錨定 BMP—2的PGLC多孔結(jié)構(gòu)支架有很大的提高。
實(shí)施例3
同實(shí)施例l的制膜方法，但生物降解性材料是聚DL-乳酸(PDLLA) (分子量8萬(wàn))，用的溶劑是四氫呋喃，得到厚度為0.2毫米的無(wú)孔致密 結(jié)構(gòu)PDLLA膜，然后進(jìn)行以下條件的等離子體處理 氣氛氧氣 氣壓40Pa
等離子體功率40 W 等離子體處理時(shí)間20分鐘 在氧氣氛下繼續(xù)保持時(shí)間30分鐘。
將等離子體處理過(guò)的PDLLA膜迅速浸入濃度為50ng/ml的神經(jīng)細(xì)胞 生長(zhǎng)因子(NGF)的Tris緩沖液(pH7.4)中150分鐘后進(jìn)行冷凍干燥。 將錨定有NGF的PDLLA膜在37'C磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外釋放，釋 放時(shí)間可以持續(xù)8天。在錨定有NGF的PDLLA膜上進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)， 結(jié)果顯示神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及增殖都比沒(méi)有錨定NGF的PDLLA膜有很
大的提高。 實(shí)施例4
同實(shí)施例2的方法，但是用的生物降解性材料是聚L-乳酸(PLLA) 共聚物(分子量12萬(wàn))，在將該高分子溶液與80—100目的氯化鈉顆粒 注入聚四氟乙烯模具并且混合均勻后，先在0。C下保持24小時(shí)，然后再在 真空和-40。C以下脫溶劑48小時(shí)，再用蒸餾水洗去氯化鈉后得到厚度為3 毫米的PLLA多孔結(jié)構(gòu)支架。然后進(jìn)行以下條件的等離子處理氣氛氮?dú)?br> 氣壓O.lPa
等離子體功率60 W 等離子體處理時(shí)間30分鐘 在氮?dú)夥障吕^續(xù)保持時(shí)間20分鐘。
將等離子體處理過(guò)的PLLA多孔結(jié)構(gòu)支架迅速浸入濃度為120pg/ml 的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF) MES緩沖液中(pH 6.9)3小時(shí)后進(jìn)行冷凍干 燥。將錨定有ECGF的PLLA多孔支架在37。C磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外 釋放，釋放時(shí)間可以持續(xù)30天。在錨定有ECGF的PLLA多孔結(jié)構(gòu)支架 上進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及增殖都比沒(méi)有錨 定ECGF的PLLA多孔結(jié)構(gòu)支架有很大的提高。
實(shí)施例5
同實(shí)施例4的方法，但是生物降解性材料是共聚(L-乳酸/DL-乳酸) (PLDLLA)(分子量15萬(wàn))，溶劑是三氯甲垸，在將該高分子溶液與 60 — 80目的氯化鈉顆粒注入聚四氟乙烯模具并且混合均勻后，先在室溫下 保持24小時(shí)，然后用蒸餾水洗去氯化鈉，再在真空和-4(TC以下脫溶劑48 小時(shí)后得到厚度為3毫米的PLDLLA多孔結(jié)構(gòu)支架。然后進(jìn)行以下條件的 等離子處理.-
氣氛氨氣和氧氣混合氣
氣壓20Pa
等離子體功率100W
等離子體處理時(shí)間5分鐘 在混合氣氛下繼續(xù)保持時(shí)間10分鐘
將等離子體處理過(guò)的膜迅速浸入20)_ig/ml骨衍生性生長(zhǎng)因子(BDGF) 磷酸緩沖液溶液((pH 7.0)中90分鐘后進(jìn)行冷凍干燥。將錨定有BDGF的 PLDLLA多孔支架在37。C磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外釋放，釋放時(shí)間可以 持續(xù)30天。在錨定有PLDLLA的多孔結(jié)構(gòu)支架上進(jìn)行成骨細(xì)胞的培養(yǎng)， 結(jié)果顯示成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及增殖都比沒(méi)有錨定BDGF的PLDLLA多 孔結(jié)構(gòu)支架有很大的提高。
實(shí)施例6同實(shí)施例1的制膜方法，但是生物降解性材料是聚羥丁酯(PHB)(分 子量為20萬(wàn))，然后將PHB致密膜進(jìn)行以下條件的等離子處理 氣氛氦氣
氣壓30Pa
等離子體功率15W 等離子體處理時(shí)間100分鐘 在氦氣氛下繼續(xù)保持時(shí)間15分鐘
將等子體處理過(guò)的膜迅速浸入5pg/ml骨形態(tài)蛋白(BMP—7) MOPS 緩沖液溶液(pH7.2)中120分鐘后進(jìn)行冷凍干燥。將錨定有BMP — 7的 PHB膜在37。C磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外釋放，釋放時(shí)間可以持續(xù)10天。 在錨定有BMP—7的PHB膜上進(jìn)行成骨細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示成骨細(xì)胞 的生長(zhǎng)狀態(tài)及成骨能力比沒(méi)有錨定BMP—7的PHB膜有很大的提高。
實(shí)施例7
同實(shí)施例3的制膜方法，但是生物降解性材料是明膠，溶劑是去離子 水，得到厚度為0.5毫米的無(wú)孔致密結(jié)構(gòu)明膠膜，然后進(jìn)行以下條件的等 離子體處理
氣氛空氣
處理功率120 W 處理時(shí)間3分鐘
在空氣氣氛下繼續(xù)保持時(shí)間5分鐘
將等離子體處理過(guò)的膜迅速浸入2pg/ml血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF) Tricine緩沖液溶液(pH6.6)中30分鐘后進(jìn)行冷凍干燥。將錨定有PDGF 的明膠膜在37。C磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外釋放，釋放時(shí)間可以持續(xù)10 天。在錨定有PDGF的明膠膜上進(jìn)行基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示持基質(zhì) 干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及增殖比沒(méi)有錨定的PDGF的明膠膜有很大的提高。
實(shí)施例8
同實(shí)施例3的制膜方法，但是生物降解性材料是聚己內(nèi)酯/聚乙二醇/ 聚丙交酯三元共聚物(PCEL)(分子量4萬(wàn))，然后進(jìn)行以下條件的等 離子體處理
氣氛氨氣氣壓60Pa
等離子體功率50 W 等離子體處理時(shí)間20分鐘 在氨氣氣氛下繼續(xù)保持時(shí)間15分鐘
然后將等離子體處理過(guò)的膜迅速浸入120pg/ml人重組皮膚生長(zhǎng)因子 (EGF)Tris緩沖溶液(pH 7.6)中3分鐘后進(jìn)行冷凍干燥。將錨定有EGF的 PCEL膜在37t:磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外釋放，釋放時(shí)間可以持續(xù)12 天。在錨定有EGF的PCEL膜上進(jìn)行皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示皮膚細(xì)胞 的生長(zhǎng)狀態(tài)及增殖都比沒(méi)有錨定EGF的PCEL膜有很大的提高。
實(shí)施例9
同實(shí)施例4的PLLA多孔支架，然后對(duì)多孔支架進(jìn)行以下條件的等離 子體處理
氣氛氬氣
氣壓lOOPa
等離子體功率10W 等離子處理時(shí)間110分鐘 在氬氣氣氛下繼續(xù)保持時(shí)間10分鐘。
將等離子體處理過(guò)的PLLA多孔結(jié)構(gòu)支架迅速浸入濃度為20嗎/ml轉(zhuǎn) 移生長(zhǎng)因子(TGF — pi) Glycylglycine緩沖溶液(pH 7.5)中3小時(shí)后進(jìn) 行冷凍干燥。將錨定有的TGF — (31的PLLA多孔支架在37'C磷酸緩沖液 溶液中進(jìn)行體外釋放，釋放時(shí)間可以持續(xù)30天。在錨定有TGF — f31的 PLLA多孔結(jié)構(gòu)支架上進(jìn)行似成骨細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示似成骨細(xì)胞的生 長(zhǎng)狀態(tài)及成骨能力都比沒(méi)有錨定TGF — (31的PLLA多孔結(jié)構(gòu)支架有很大 的提高。
實(shí)施例10
同實(shí)施例4的(PLGA (分子量8萬(wàn))+膠原粉)(重量比100: 1) 混合材料多孔支架，然后對(duì)多孔支架進(jìn)行以下條件的等離子體處理-
氣氛二氧化硫
氣壓lOOPa
等離子體功率15W等離子處理時(shí)間90分鐘
在二氧化硫氣氛下繼續(xù)保持時(shí)間30分鐘。
將等離子體處理過(guò)的(PLGA+膠原粉)多孔結(jié)構(gòu)支架迅速浸入濃度為 20嗎/ml的鹼性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)磷酸緩沖液(pH 7.4)中2 小時(shí)后進(jìn)行冷凍干燥。將錨定有的b-FGF的(PLGA+膠原粉)多孔支架在 37'C磷酸緩沖液溶液中進(jìn)行體外釋放，釋放時(shí)間可以持續(xù)10天。在錨定 有b-FGF的(PLGA+膠原粉)多孔結(jié)構(gòu)支架上進(jìn)行似成軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)， 結(jié)果顯示似成軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及生成能力都比沒(méi)有錨定b-FGF的 (PLGA+膠原粉)多孔結(jié)構(gòu)支架有很大的提高。
對(duì)照例
將按實(shí)施例1 _ 10方法制得的無(wú)孔致密結(jié)構(gòu)膜和多孔結(jié)構(gòu)支架不進(jìn)行 等離子處理及生長(zhǎng)因子錨定而直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示各種細(xì)胞的生 長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞數(shù)量與經(jīng)過(guò)等離子處理及生長(zhǎng)因子錨定的實(shí)施例1 —10的相 應(yīng)結(jié)果比較，不僅細(xì)胞的生長(zhǎng)情況大大變差、而且細(xì)胞數(shù)量大大減少、死 細(xì)胞數(shù)量大大增加。
權(quán)利要求
1、一種在生物降解性材料上錨定生長(zhǎng)因子的方法，其步驟如下A)將生物降解性材料進(jìn)行等離子體處理；B)將步驟A處理后的生物降解性材料浸入生長(zhǎng)因子溶液中進(jìn)行生長(zhǎng)因子錨定處理；C)將步驟B處理后的生物降解性材料取出，冷凍干燥。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，.其中，所述的生物降解性材料是合成 類生物降解高分子或天然生物降解高分子，且具有幾何形狀和尺寸的致密 或多孔結(jié)構(gòu)的膜、管、微球或支架。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述生物降解性材料選自-聚L-乳酸、聚DL-乳酸、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)、共聚(乙交酯/丙交酯)、聚己內(nèi)酯、聚(乙交酯/丙交酯/己內(nèi)酯)三元共聚物、聚己內(nèi) 酯/聚乙二醇嵌段共聚物、聚己內(nèi)酯/聚乙二醇/聚丙交酯三元共聚物、聚羥 丁酯、聚羥戊酯、膠原、明膠、殼聚糖、透明質(zhì)酸其中一種或它們間的共 混物。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述的等離子體處理?xiàng)l件是 壓力0.1 — 100Pa;等離子體處理功率10—100W;處理時(shí)間3 —100分鐘。
5、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，步驟A所述的等離子體處理是 在氧氣、空氣、氨氣、氮?dú)?、二氧化碳、二氧化硫、氬氣、氦氣或它們?混合氣體氣氛中進(jìn)行的。
6、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，步驟B所述的生長(zhǎng)因子溶液濃 度是50ng/ml-200嗎/ml。
7、 如權(quán)利要求1或6所述的方法，其中，步驟B所述的生長(zhǎng)因子是: 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、鹼性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子、骨衍生性生長(zhǎng)因 子、骨形態(tài)蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子或胰島素類生長(zhǎng)因子。
8、 如權(quán)利要求1或6所述的方法，其中，步驟B所述的生長(zhǎng)因子溶 液中的溶劑是水、磷酸緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、PIPES緩沖液、MOPS緩沖液、Bicine緩沖液、Glycylglycine緩沖液或Tricine緩沖液。
9、如權(quán)利要求l所述的方法，其中，步驟B所述的生長(zhǎng)因子錨定處 理時(shí)間為3—300分鐘。
全文摘要
一種在生物降解性材料上錨定生長(zhǎng)因子的方法，其步驟為A)將生物降解性材料進(jìn)行等離子體處理；B)將步驟A的生物降解性材料浸入生長(zhǎng)因子溶液中進(jìn)行生長(zhǎng)因子錨定處理；C)將步驟B的生物降解性材料取出，冷凍干燥。本發(fā)明既能保持生長(zhǎng)因子原有的生物活性，又能持續(xù)地從生物降解性材料上釋放。本發(fā)明通過(guò)有效地選擇等離子體處理的氣體種類、等離子體處理的參數(shù)和錨定條件可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子在生物材料上的固定效率以及控制釋放行為，從而使生長(zhǎng)因子有效地結(jié)合到生物材料制備的器件上，保持生物活性并在體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用。本發(fā)明還可同時(shí)達(dá)到改善生物降解性材料細(xì)胞親和性的作用，從而推動(dòng)聚內(nèi)酯等合成類生物降解高分子在組織工程中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/34GK101411878SQ20071017597
公開(kāi)日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2007年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日
發(fā)明者紅 沈, 王身國(guó), 貝建中 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所