專利名稱：：楊梅果實提取物、其制備方法及其保肝的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及天然藥物領域，具體涉及一種楊梅果實提取物，本發(fā)明還公開了其制備方法及其保肝的用途。
背景技術：
：楊梅(M少n'rarw6rae,Zwcc)屬楊梅科(Myricaceae),為藥食兩用的芳香植物。宋代的《食療本草》和明代的《本草綱目》中均有楊梅藥用功效的記載。在中國大陸、臺灣地區(qū)以及閂本民間有使用楊梅果實、根、樹皮和葉入藥，治療痢疾、腹瀉、胃痛和風濕疼痛等癥。楊梅含有豐富的有機酸、多酚、黃酮、三萜化合物等活性成分(NonakaG.,MutaM.,NishiokaI.Myricatin,agalloylflavanonolsulfateandprodelphinidingallatesfromMyricarubra./V,cfe附,欲y,1983,22,237—241;SakuraiN.,YaguchiY.,InoueT.TriterpenoidsfromMyricarubra/V,c/zem/欲y,1987,26:217—219;SakuraiN.,YaguchiY.，HirakawaT.，NagaiM.，InoueT.TwomyricanolglycosidesfromMyricarubraandrevisionofthestructureofisomyricanone.i^ytoc/2e/w'欲y,1991，30:3077—3079)。從楊梅枝葉和樹皮中分離得到的楊梅素(3，5，7，3'，4',5'-六羥基黃酮myricetin，Myr)，經(jīng)研究顯示，具有抗血栓、改善微循環(huán)，降血糖，保肝護肝，抗氧化，抗腫瘤等作用(陳文梅，紅花黃酮成分抑制血小板激活因子介導的血小板活化作用。藥學學報，2001，36(12):881-885;臧寶霞，楊梅素對血小板活化因子拮抗的作用。藥學學報，2003，38(11)831-833;鐘正賢，廣西藤茶中楊梅樹皮素降血糖的實驗研究。中國現(xiàn)代藥學應用雜志，2003，20(6):466-468;鐘正賢，廣西藤茶中楊梅樹皮素的保肝作用研究。中藥藥理與臨床，2001，17(5):11-13;HaseK,OhsugiM，XiongQB,"a/.Hepatoprotectiveeffectofdw/ez'517Tmw^.OnexperimentalliverinjuriesinducesbycarbontetrachlorideorD-galactosamine/lipopolysaccharide.awe/pAarwa6w〃e打'w.1997，20(4):381-385)。楊梅為我國的特產(chǎn)資源，鑒于地區(qū)差異，目前國際上對楊梅的研究剛剛起步，國內(nèi)也只是對廣西藤茶中含有的楊梅素研究較多，而對于經(jīng)濟作物的楊梅的活性成分的研究還較為欠缺。楊梅果實的藥理學研究還未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種楊梅果實提取物，藥理學試驗證明其具有優(yōu)良的保肝、護肝、治療肝臟疾病的功效。本發(fā)明的楊梅果實提取物用以下方法制備得到楊梅果實去核，用Cm的脂肪族醇提取，濃縮即得。濃縮物可以直接加入藥用輔料或食品輔料制備成藥品或保健食品，也可將濃縮物進一步干燥得到粉末后再進行制備。上述CM的脂肪族醇優(yōu)選乙醇，乙醇的濃度優(yōu)選20%80%，為重量百分比。用此方法得到的是楊梅果實的粗提物，簡稱MC。藥理試驗發(fā)現(xiàn)，MC具有一定的護肝作用。在得到粗提物的的基礎上，發(fā)明人對粗提物進一步提取，分別依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇對粗提物萃取，得到其不同部位的精提物，藥理試驗顯示，氯仿提取物(簡稱MCE)顯示了優(yōu)異的保肝、護肝功能，其效果大大優(yōu)于其它部位的提取物。下面是部分藥理學實驗數(shù)據(jù)-一、楊梅果實粗提物(ME)對肝臟的防護作用1、ME對CCU誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用小鼠48只分6組，對照組以生理鹽水灌胃0.2ml/d，CC14組及給藥組(50、150、450mg/kg)分別以等量生理鹽水及不同濃度ME0.2ml/d，陽性對照藥聯(lián)苯雙酯(DDB)以200mg/kg灌胃0.2ml/d，連續(xù)灌胃5天，第6天腹腔注射0.3。/。CCU0.1ml/10g，24h后處死動物，取血清測定sALT和sAST水平。表lME對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注*p<0.05vs對照組，**p<0.01vs對照組，*p<0.05vsCCU組，*Ap<0.01vsCCU組，X±SD由表1可知，小鼠腹腔注射CCU后，其血清ALT和AST活性顯著升高，分別為對照組的6.84和2.35倍(pO.Ol)。而小鼠預先給予不同劑量ME灌胃，高劑量組小鼠血清AST及ALT活性與損傷組相比明顯下降(p<0.05)。2、ME對D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用小鼠40只分5組，對照組以生理鹽水灌胃0.2ml/d，D-GalN組及給藥組(50、150、450mg/kg)分別以等量生理鹽水及不同濃度ME0.2ml/d，連續(xù)灌胃5天，第6天腹腔注射D-GalN(450mg/kg,0.1ml/10g)，于注射D-GalN1小時后腹腔注射LPS(10ug/kg)，并在注射LPS后12h處死動物，取血清測定sALT和sAST水平。表2ME對D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注*p<0.05vs對照組，**p<0.01vs對照組，Ap〈0.05vsD-GalN組，X±SD由表2可知，小鼠腹腔注射D-GalN后，其血清ALT和AST活性顯著升高，分別為對照組的7.43和3.18倍(pO.Ol)。而小鼠預先給予不同劑量ME灌胃，高劑量組小鼠血清AST及ALT活性與損傷組相比均明顯下降。3、ME對乙酰氨基酚(APAP)誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用小鼠40只分5組，對照組以生理鹽水灌胃0.2ml/d，APAP組及給藥組(50、150、450mgA:g)分別以等量生理鹽水及不同濃度ME0.2ml/d，連續(xù)灌胃5天，第6天腹腔注射APAP(160mg/kg,0.1ml/1Og)，16h后處死動物，取血清測定sALT和sAST水平。表3ME對APAP誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注*p<0.05vs對照組，，^pO.05vsAPAP組，X±SD由表3可知，小鼠腹腔注射APAP后，血清ALT和AST活性升高，分別為對照組的3.48和2.53倍(P<0.05)。而小鼠預先給予不同劑量ME灌胃，高劑量組小鼠血清AST與損傷組相比明顯下降(P<0.05)。二、楊梅果實氯仿萃取物(MCE)對肝臟的防護作用1、MCE對CCU誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用小鼠48只分6組，對照組以生理鹽水灌胃0.2ml/d，CC14組及給藥組(50、150、450mg/kg)分別以等量生理鹽水及不同濃度MCE0.2ml/d，陽性對照藥聯(lián)苯雙酯(DDB)以200mg/kg灌胃0.2ml/d，連續(xù)灌胃5天，第6天腹腔注射0.3%CC140.1ml/10g，24h后處死動物，取血清測定sALT和sAST水平。組織切片HE染色，觀察形態(tài)學變化。表4MCE對CC14誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"p〈0.05vs對照組，"p〈0.01vs對照組，Ap〈o.05vsCCU組，AAp<0.01vsCCU組，X±SD由表4可知，小鼠腹腔注射CCl4后，其血清ALT和AST活性顯著升高，分別為對照組的7.78禾口2.01倍(pO.Ol)。而小鼠預先給予不同劑量MCE灌胃，各劑量組小鼠血清AST及ALT活性與損傷組相比均顯下降。高劑量組可以完全抑制CCl4對肝臟造成的損傷作用，恢復到對照組水平。MCE能以劑量依賴方式抑制CC14引起的小鼠SALT及sAST活性的顯著上升。肝臟切片顯示，給予0.3e/。CCU24小時后，肝細胞索紊亂，細胞界限不清，以中央靜脈為中心的大量細胞壞死、脂肪變性。預先用MCE灌胃的小鼠，CCU損傷后肝組織結構較損傷組有明顯改善，低劑量組小鼠細胞壞死及脂肪變性減少，中劑量和高劑量組細胞界限清楚，肝細胞排列規(guī)則，與聯(lián)苯雙酯保護的小鼠肝組織無差異(見圖l)。3、MCE對D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用小鼠40只分5組，對照組以生理鹽水灌胃0.2ml/d，D-GalN組及給藥組(50、150、450mg/kg)分別以等量生理鹽水及不同濃度MCE0.2ml/d，連續(xù)灌胃5天，第6天腹腔注射D-GalN(450mg/kg,0.1ml/1Og)，于注射D-GalN1小時后腹腔注射LPS(10ug/kg)，并在注射LPS后12h處死動物，取血清測定sALT和sAST水平。組織切片HE染色，觀察形態(tài)學變化。表5MCE對D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注*p^0.05vs對照組，**p<0.01vs對照組，Ap<0.05vsD-GalN組，▲血p0.01vsD-GalN組，》±SD由表5可知，小鼠腹腔注射D-GalN后，其血清ALT和AST活性顯著升高，分別為對照組的8.87和2.87倍(pO.Ol)。而小鼠預先給予不同劑量MCE灌胃，中劑量和高劑量組小鼠血清AST及ALT活性與損傷組相比均顯下降。肝臟切片顯示，給予D-GalN13小時后，中央靜脈、肝竇淤血明顯，肝竇充溢枯否氏細胞，血管擴張充血，出現(xiàn)彌散性的多發(fā)性片狀壞死。預先用MCE灌胃的小鼠，肝組織結構較損傷組有明顯改善，中央靜脈及肝竇淤血減輕，肝竇中枯否細胞減少，血管擴張減輕，高劑量組未見片狀壞死(見圖2)。3、MCE對APAP誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用小鼠40只分5組，對照組以生理鹽水灌胃0.2ml/d，APAP組及給藥組(50、150、450mg/kg)分別以等量生理鹽水及不同濃度MCE0.2ml/d，連續(xù)灌胃5天，第6天腹腔注射APAP(160mg/kg,0.1ml/10g)，16h后處死動物，取血清測定sALT和sAST水平。組織切片HE染色，觀察形態(tài)學變化。表6MCE對APAP誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注*p<0.05vs對照組，，vsAPAP組，X±SD由表6可知，小鼠腹腔注射APAP后，血清ALT和AST活性升高，分別為對照組的3.57和2.13倍(PO.05)。而小鼠預先給予不同劑量MCE灌胃，高劑量組小鼠血清AST及ALT活性與損傷組相比明顯下降(P<0.05)。肝臟切片顯示，給予APAP24小時后，胞漿成顆粒狀、空泡樣變性壞死；細胞核濃縮、碎裂、消失；形成以中央靜脈為中心的圓盤狀大量細胞壞死。預先用MCE灌胃的小鼠，肝組織結構較損傷組有較大改善，胞漿及細胞核細胞壞死減少，中央靜脈周的圓盤狀細胞壞死減弱(見圖3)。CC14、D-GalN和APAP肝損傷常用于篩選護肝藥。一般認為，肝細胞的壞死范圍與轉(zhuǎn)氨酶活性呈正相關。本研究發(fā)現(xiàn)，ME及MCE對三種類型的實驗性肝損傷均有不同程度的保護作用，能抑制由藥物引起的轉(zhuǎn)氨酶的升高，減輕肝細胞濁腫，脂肪樣變，炎癥浸潤及壞死等病理改變。因此，可以認為，ME和MCE對實驗性肝損傷確有明顯的保護作用。可以用于研發(fā)預防和治療肝病的新制劑。圖l是MCE對抗CCU誘導的小鼠肝臟組織損傷圖2是MCE對抗D-GalN誘導的小鼠肝臟組織損傷圖3是MCE對抗APAP誘導的小鼠肝臟組織損傷具體實施例方式實施例1楊梅果實粗提物的制備楊梅新鮮果肉1.7kg,加入50%乙醇750ml回流提取1小時，過濾；濾渣再次用500ml50%乙醇回流提取1小時；合并兩次濾液、減壓濃縮，干燥。實施例2楊梅果實精提物的制備楊梅新鮮果肉1.7kg，加入30%乙醇750ral回流提取1小時，過濾；濾渣再次用500ml30%乙醇回流提取1小時；合并兩次濾液、減壓濃縮；濃縮液氯仿萃取兩次，回收溶劑，減壓濃縮、干燥，得精提物4.23g。實施例3楊梅果實精提物的制備楊梅新鮮果肉2kg，加入50%乙醇1000ml回流提取1小時，過濾；濾渣再次用600ml50%乙醇回流提取1小時；合并兩次濾液、減壓濃縮；濃縮液用氯仿萃取兩次，回收溶劑，減壓濃縮、干燥，得干浸膏4.49g。實施例4楊梅果實精提物的制備-楊梅凍存果肉1.9kg，加入75%乙醇750ml回流提取1小時，過濾；濾渣再次用500ml75%乙醇回流提取1小時；合并兩次濾液、減壓濃縮；濃縮液用氯仿萃取，回收溶劑，減壓濃縮、干燥，得4.49g。實施例5楊梅果實精提物的制備楊梅凍存果肉2.3kg，加入75%乙醇1000ml浸泡提取3天，過濾；濾渣再次用600ml75%乙醇浸泡提取1天；合并兩次濾液、減壓濃縮；濃縮液用氯仿萃取，回收溶劑，減壓濃縮、干燥，得干浸膏4.95g。實施例6楊梅果實提取物片劑取實施例2方法制備的楊梅果實提取物10g，加微粉硅膠2g，乳糖2g，混勻過100目篩，加水制成軟材，30目制粒，6(TC干燥，整粒加0.2g硬脂酸鎂,混勻壓片。權利要求1、一種楊梅果實提取物，其特征是用以下方法制備得到楊梅果實去核，用C1-4的脂肪族醇提取，濃縮即得。2、權利要求l的楊梅果實提取物，其中Cm的脂肪族醇是乙醇。3、權利要求2的楊梅果實提取物，其中乙醇的濃度是20%80%，為重量百分比。4、權利要求1的楊梅果實提取物，其中制備方法還包括將濃縮液用氯仿萃取，氯仿萃取液濃縮、干燥，即得。5、一種治療保肝的藥物組合物，其中含有權利要求1至4中任一項的楊梅果實提取物及藥物上可接受的載體。6、權利要求1至4中任一項的楊梅果實提取物用于制備保肝藥物的用途。7、權利要求1至4中任一項的楊梅果實提取物用于制備治療肝臟疾病的藥物的用途。8、權利要求7的用途，其中肝臟疾病是肝損傷、肝炎、脂肪肝或肝硬化。全文摘要本發(fā)明涉及天然藥物領域，具體涉及一種楊梅果實提取物，本發(fā)明還公開了其制備方法及其保肝的用途。文檔編號A61K36/185GK101185664SQ20071019096公開日2008年5月28日申請日期2007年11月30日優(yōu)先權日2007年11月30日發(fā)明者文余,徐力致,楊曉荷,湯亞紅,王玉才,趙曉寧,鐘增濤,靜高,高曉文申請人:南京大學