專利名稱：：一種納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種細(xì)胞多肽生長因子的緩釋物。本發(fā)明還涉及該細(xì)胞多肽生長因子緩釋物的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞生長因子是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的一類蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)，其分子量從幾百到幾萬不等，也常稱之為多肽生長因子。與經(jīng)典的多肽和蛋白質(zhì)激素相比，多肽生長因子并沒有特定的內(nèi)分泌腺和內(nèi)分泌細(xì)胞，而是通過一些細(xì)胞的旁分泌和自分泌釋放并擴散到耙細(xì)胞，從而協(xié)調(diào)機體自身的統(tǒng)一以及對外界的反應(yīng)。由于多肽生長因子在生命科學(xué)領(lǐng)域和臨床上具有重要的理論和實際意義，近年來有關(guān)生長因子的鑒定、結(jié)構(gòu)和基因工程的研究進(jìn)展很快，部分多肽生長因子類藥物己廣泛應(yīng)用于臨床，并取得了比較好的臨床療效，但是這類藥物普遍存在著穩(wěn)定性差，易變性失活和清除等缺陷。特別是用于感染的創(chuàng)口湖面時，倉'J口/創(chuàng)面的分泌物、酶及細(xì)菌毒素等艦了生長因子的分解，變性和失活等。這嚴(yán)重影響了多肽類生長因子類藥物與創(chuàng)口/創(chuàng)面新生組織的接觸，從而嚴(yán)重影響了其生物學(xué)效用的發(fā)揮，且直接將多肽類生長因子作用于創(chuàng)口/創(chuàng)面時很難達(dá)到足夠的持續(xù)作用時間，因為作為蛋白質(zhì)在室溫下是非常不穩(wěn)定的，特別是有水存在時更是如此，它的半衰期小于l小時，遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于在傷口部位誘導(dǎo)細(xì)胞DNA合成所需的遲滯時間。這段時間約為812小時(參見《外科研究雜志》43:333,1987年)。另一方面，細(xì)胞的增殖周期(或細(xì)胞周期)是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束開始生長，到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。細(xì)胞增殖周期可分為兩個時期，即間期和分裂期。增殖周期也可分為GhS、G2、M四個時期。在增生的組織當(dāng)中處于增生的細(xì)胞占有一定的比例，而且處于一個相對平衡的狀態(tài)，生長因子對細(xì)胞的增殖作用主要是作用于細(xì)胞增殖間期，直接將多肽類生長因子作用于創(chuàng)面只在短時間作用與分裂間期的某一個時期的細(xì)胞之后，引起一個波浪式的細(xì)胞增生加速，之后重新回到原來相對平衡的狀態(tài)。而緩釋劑型生長因子制劑能持續(xù)有效地作用于處于分裂分裂間期，從而改變了增生細(xì)胞的平衡狀態(tài)，也就是讓處于增生期的細(xì)胞比例上調(diào)，這樣的結(jié)果是使增生組織持續(xù)穩(wěn)定快速地生長。而且目前多肽類生長因子制備過程復(fù)雜，價格較昂貴，反復(fù)多次給藥不僅造成了藥物的浪費，同時也加重了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。所以如何將這類藥物制成緩釋且持續(xù)穩(wěn)定、安全、有效作用于創(chuàng)口湖面的制劑，已成為生物醫(yī)學(xué)工程和藥劑學(xué)領(lǐng)域中一個極富挑戰(zhàn)性和具有實用價值的研究熱點。納米銀材料與現(xiàn)代藥理學(xué)存在著密切的關(guān)系。銀在納米狀態(tài)下的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)顯著增強，使其殺菌能力產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍。只用極少量的納米銀即可產(chǎn)生強力的殺菌作用。納米銀能有效殺滅多種病原體(包括霉菌、滴蟲、細(xì)菌、支原體、衣原體、病毒等)。目前認(rèn)為納米銀殺菌機理主要有兩個其一是銀離子緩釋殺菌抗菌，即指在其使用過程中，抗菌劑緩慢釋放出Ag，在很低濃度下即能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，或者強烈吸引細(xì)菌體中酶蛋白的巰基(-SH)，并迅速結(jié)合在一起，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)部酶的失活，從而破壞細(xì)菌的呼吸系統(tǒng)及營養(yǎng)輸送系統(tǒng)，致使細(xì)菌死亡，產(chǎn)生殺菌作用。通過緩釋Ag，可發(fā)揮持久的抗菌效果。其二是銀離子的活性氧化抗菌，也就是高氧化狀態(tài)銀的還原勢能極高，在光的作用下抗菌劑和水或空氣作用，生成的活性氧(0-禾n-OH)，具有很強的氧化還原作用，最終殺滅細(xì)菌。而且其殺菌特點包括不受細(xì)菌的類別P蹄U，具有廣譜抑殺菌作用，對抗生素賴藥的細(xì)菌也具有同樣作用，不產(chǎn)生賴藥性，并具具有安全無毒副作用以及相對環(huán)保等優(yōu)點。國內(nèi)外已經(jīng)有較多學(xué)者研究證實并報道納米銀既有抗菌性又有抗炎性。它的抗炎機理主要為抑制TOF-a、IL-12等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡。同樣銀還具有促進(jìn)去腐生肌收斂的作用，并可以促進(jìn)上皮細(xì)胞再生，加快組織修復(fù)與再生，因此能促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，促進(jìn)物理治療后滲出液的吸收。國內(nèi)外大量實驗研究證實納米銀無生物毒性，臨床也已經(jīng)開發(fā)出多種主要藥效成分為納米銀的藥物(如阿希米，邦列安，納米銀敷料等)，臨床效果顯著。納米顆粒藥物緩釋劑在有效控制藥物劑量、降低藥物毒副作用、提高藥物穩(wěn)定性和有效利用率、實現(xiàn)藥物耙向輸送及減輕患者痛苦等方面的功能備受關(guān)注。目前國內(nèi)外一般是將游離的多肽生長因子埋植入高分子凝膠等材料中，使之呈緩釋狀態(tài)，以延長其作用時間。多數(shù)納米緩釋藥物一味追求緩釋，藥效長達(dá)半個月至半年不等,并多采用靜脈給藥方式,而創(chuàng)面用緩釋藥物緩釋時間一般以12-48小時為適宜，所以現(xiàn)階段已經(jīng)研制出的緩釋藥物能有效應(yīng)用于創(chuàng)面的藥物很少。納米銀作為緩釋藥物載體目前少有報道，但國內(nèi)外許多研究證實納米銀及溶膠的生物相容性好，在與生物分子和蛋白質(zhì)作用時，對生物分子和蛋白質(zhì)的構(gòu)象影響不大，即一般對生物分子和蛋白質(zhì)的活性影響不大，研究表明生物分子和蛋白質(zhì)主要以非特異性物理吸附為主而鍵合在納米銀粒子上(參考AppliedSpectroscopy，58:570，2004.)。此種作用在保證生物大分子或者蛋白質(zhì)的生物活性情況下又具有一定的緩釋作用，為創(chuàng)口/創(chuàng)面的緩釋藥物發(fā)明提供了重要方向。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的是設(shè)計一個形成穩(wěn)定的細(xì)胞多肽生長因子的緩釋物，使生長因子緩慢而持續(xù)穩(wěn)定地作用于創(chuàng)口/創(chuàng)面細(xì)胞，在恰當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)維持有效的作用濃度，鵬創(chuàng)口/創(chuàng)面更快的修復(fù)并降低不良反應(yīng)。另一方面本發(fā)明還提供了這種細(xì)胞多肽生長因子的緩釋物的制備方法以及它的用途。本發(fā)明提供細(xì)胞多肽生長因子的緩釋物是一種納米銀-細(xì)胞生長因子復(fù)合體，多肽生長因子通過納米吸附性或/和以-C00和-CN及-H與Ag發(fā)生簡單的鍵合反應(yīng)，而吸附在納米銀的表面形成復(fù)合體。這些作用均在物理吸附及簡單的化學(xué)成鍵范圍，作用力不象共價鍵那么強，不至于影響多肽生長因子的生物學(xué)活性，不形成牢固穩(wěn)定的結(jié)合，多肽生長因子能隨著創(chuàng)口/創(chuàng)面藥物濃度的下降，周圍環(huán)境的改變以及時間的推移而脫離納米銀表面后繼續(xù)發(fā)生生物學(xué)效用。其吸附與結(jié)合在納米銀表面的生長因子通過TEM電鏡觀察得到證實，從圖中可以看至!]，標(biāo)記2為納米銀的表面，標(biāo)記1為重組生長因子(見圖1)。本發(fā)明提供一種納米銀-細(xì)胞生長因子復(fù)合體。這種復(fù)合保證細(xì)胞多肽生長因子活性前提下使其通過物理吸附為主而鍵合在納米銀粒子上，由于多肽類生長因子并不能把納米銀粒子完全包覆，所以經(jīng)過抗菌學(xué)檢觀糊米銀的抗菌效果與沒有復(fù)合細(xì)胞多肽生長因子納米銀抗菌效果無區(qū)別。納米銀溶液終有效抗菌濃度為202000ppm;本發(fā)明所用生長因子終濃度為0.011000ug/ml。本發(fā)明還提供一種相對簡單的創(chuàng)口創(chuàng)面緩釋藥物系統(tǒng)，其多肽生長因子的緩釋作用通過MTT細(xì)胞增殖實驗得以證實。實驗結(jié)果提示，納米銀與細(xì)胞生長因子復(fù)合體能更好更有效地促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，結(jié)合和吸附在納米銀粒子表面的生長因子能以一定速度緩慢從其表面脫離下來發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)，起到了緩釋的作用，從而增強了藥物的療效。本發(fā)明中還可以采取高分子聚合物封包形成納米緩釋微球以及添加納米硅溶膠等來進(jìn)一步控制緩釋時間，使緩釋時間》24小時。本發(fā)明中提到的高分子聚合物可采用應(yīng)用最廣泛的生物可降解合成高分子材料，常用的有聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)、明膠、殼聚糖、多聚賴氨酸，聚烯丙基胺等。本發(fā)明所采用的未經(jīng)過修飾的納米銀，最好粒子粒徑在1100nm，以免因修飾造成納米銀抗菌活性的下降。納米粒子TEM照片見附圖3(納米銀粒徑30nm左右，分散性良好)。本發(fā)明中，所述多肽生長因子可以是重組人表皮生長因子(rhEGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、人及鼠表皮生長因子(hEGF及mEGF)、血小板來源的生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF),結(jié)締組織生長因子(CTGF)，角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，多效生長因子(Ptn)、淋巴管生長因子(VEGF-C及VEGF-D)之中的一種或多種。本發(fā)明提供的細(xì)胞多肽生長因子的緩釋物可以按如下步驟制備(1)納米銀溶液配制將納米銀粉分散在水中，分散212個小時；(2)向上述溶液里面加入多肽生長因子粉劑或者多肽生長因子溶液?？蓪⑸鲜鋈芤撼楦沙蓛龈煞郾４?。優(yōu)選多月太生長因子加入納米銀溶液的條件是在pH-5.08.0,溫度在T=060'C，反應(yīng)時間為0.524h。還可以用高分子聚合物封包形成納米緩釋微球。或者添加納米硅溶膠。本發(fā)明中除了活性成分多肽生長因子和有效成分納米銀之外，其復(fù)合體還可含有局部制劑時常永的可藥用保護(hù)劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、防腐劑及鹽溶液(NaCl)等。所述的藥用敷料，可包括保護(hù)劑、增塑劑、表面活性劑、填充劑、防腐劑。其中所述保護(hù)劑，可選取人血白蛋白，甘露醇；表面活性劑，可選取吐溫80、卵磷脂；所述的增塑劑，可選取甘油、山梨醇；所述的填充劑，可選取甘露醇、淀粉、碳酸轉(zhuǎn)(CaC03)、二氧化硅(5102);所述的防腐劑，可選取尼泊金丁醋、苯甲酸鈉、山梨酸、尼泊金乙醋、尼泊金甲醋、尼泊金丙醋；所述可藥用的成膜材料可由以下物質(zhì)的一種或幾種替換PVA、淀粉、糊精、纖維素、明膠、膠原、蟲膠、阿拉伯膠、瓊脂、纖維素衍生物、聚乙烯胺類、聚乙烯氨基縮醛衍生物。本發(fā)明的復(fù)合體可以以凍干粉形式存儲，然后在使用時溶解于適宜的溶劑。所以本發(fā)明可以長期穩(wěn)定存儲，并且可以將本發(fā)明凍干粉生產(chǎn)成不同狀態(tài)的劑型，如懸浮劑，凝膠劑及膜劑等，所以本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的復(fù)合體可以用于燒燙傷創(chuàng)面，手術(shù)及外傷創(chuàng)口/創(chuàng)面，慢性潰瘍，角膜創(chuàng)傷，口腔潰瘍，宮頸糜爛，糖尿病足，褥瘡以及各種竇道等的愈合治療藥物。本發(fā)明操作簡單，與納米銀表面發(fā)生鍵合與吸附作用的生長因子隨時間及環(huán)境條件改變逐步發(fā)生脫落,所以具有穩(wěn)定的緩釋給藥系統(tǒng)，使生長因子緩慢而持續(xù)穩(wěn)定地作用于創(chuàng)口/創(chuàng)面，能夠在較長的時間里維持有效的作用濃度，同時納米銀天然的抗感染作用將為生長因子的生物作用提供一個清潔的微環(huán)境，促進(jìn)創(chuàng)口/創(chuàng)面更快的修復(fù)愈合并降低不良反應(yīng)。減少用藥次數(shù)和藥物浪費，減輕病人痛苦同時降低醫(yī)療費用。圖1納米銀粒子與細(xì)胞生長因子吸附的TEM電鏡觀察圖，其中1:重組人表皮生長因子2:納米銀粒子表面；圖2表示MTT法觀察納米銀-生長因子復(fù)合體溶人真皮成纖維細(xì)胞增殖作用；其中(a)24h時復(fù)合體組；(b)48h時，50ug/L復(fù)合體組，(c)48h時，10ug/L復(fù)合體組；(d)空白組；(e)納米銀組。圖3是納米粒子的TEM電鏡圖，納米銀粒徑30咖左右，分散性良好。本發(fā)明通過下列實施例和實驗作了更為具體的解釋，但是，本發(fā)明并不以任何方式局限于這些實施例。具體實施方式實施例11、納米銀-人重組表皮細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體(Ag-rhEGF)的制備依照下列步驟，可得到Ag-rhEGF復(fù)合體溶液(1)納米銀溶液配制將粒徑在30nm&右的納米銀粉2g分散在純水里面，超聲分散10個小時。磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值后，使之pH在7.0。(2)向上述納米銀溶液里面加入人重組表皮生長因子(rhEGF)2g,繼續(xù)超聲分散3個小時，室溫輕度振蕩或者靜置反應(yīng)8h。(3)低溫真空抽干機抽干成凍干粉，-2(TC保存。(4)配置成溶液時可加入適量保護(hù)劑、防腐劑、穩(wěn)定劑及鹽溶液(NaCl)混合反應(yīng)。具體配方可如下AG+hEGF復(fù)合體4mg苯甲酸鈉15g磷酸氫二鈉680.46mg甘露醇10g吐溫8010g甘油10g凈化水適量總量實施例2納米銀-堿性成纖維細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體(Ag-bFGF)的制備依照下列步驟，可得到Ag-bFGF復(fù)合體溶液(1)納米銀溶液配制將粒徑在30nm左右的納米銀粉2g分散在純水里面，超聲分散10個小時。磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值后，使之pH在7.0。(2)向上述納米銀溶液里面加入人成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)2g。繼續(xù)超聲分散3個小時，室溫輕度振蕩或者靜置反應(yīng)8h。(3)低溫真空抽干機抽干成凍干粉，-2(TC保存。(4)配置成溶液時可加入適量保護(hù)劑、防腐劑、穩(wěn)定劑及鹽溶液(NaCl)混合反應(yīng)。具體配方可如下AG+bFGF復(fù)合體4mg苯甲酸鈉15g磷酸氫二鈉680.46mg甘露醇10g吐溫8010g甘油10g凈化水適量總量1L實施例3含有納米硅溶膠的納米銀-人成纖維細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體的制備(1)納米銀溶液配制將粒徑在30nm左右的納米銀粉2g分散在純水里面，超聲分散10個小時。磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值后，使之pH在7.0。(2)向上述納米銀溶液里面加入人成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)2g，繼續(xù)超聲分散3個小時，室溫輕度振蕩或者靜置反應(yīng)8h。(3)向(2)制得的溶液里加入10mg納米硅溶膠，超聲分散4h。(4)低溫真空抽干機抽干成凍干粉，-2(TC保存。(5)配置成溶液時可加入適量保護(hù)劑、防腐劑、穩(wěn)定劑及鹽溶液(NaCl)混合反應(yīng)。具體配方可如下:AG+bFGF復(fù)合體4mg納米硅溶膠10mg苯甲酸鈉15g磷酸氫二鈉680.46mg甘露醇10g吐溫8010g甘油10g凈化水適量總量1L實施例4緩釋微球膠體溶液制劑的制備(1)納米銀溶液配制將粒徑在30nm納米銀粉分散在純水里面，超聲分散10個小時。磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值后，使之pH在7.0之間。納米銀溶液終濃度在有效抗菌濃度2000ppm。(2)向上述溶液里面加入多肽生長因子或者多肽生長因子溶液，使多肽生長因子終濃度在2yg/ml，繼續(xù)超聲分散3個小時。(3)室溫輕度振蕩或者靜置反應(yīng)8h。(4)冷凍真空抽干機抽干成凍干粉，按重量份稱取各組分，將凍干粉溶于緩沖液中，制成濃度為03%的水相溶液；將聚乳酸溶于二氯甲烷甘油=36:1的混合溶劑中，制成濃度為1060%的油相溶液。(5)將上述水相溶液、油相溶液混合，制備油包水型乳液，然后加入到由重均分子量為325萬的聚乙烯醇樹脂與緩沖液制成1020%的溶液中，超聲分散45min，制成微L液。(6)將步驟(5)得到的微乳液在室溫下低速攪拌4h，通過自然揮發(fā)或抽提，除去有機溶劑二氯甲烷，即得納米銀-細(xì)胞生長因子復(fù)合體納米微球膠體溶液。實施例5緩釋膜劑的制備一種細(xì)胞生長因子與納米銀復(fù)合體膜劑，包括①、有效傷口治療量人表皮細(xì)胞生長因子(hEGF)0%1%(w/w)，②、納米銀0%2%(w/w)，③、可藥用的材料10%90%(w/w)，④、藥用輔料0%40%(w/w)，與所述hEGF同屬一類的多膚生長因子重組人表皮生長因子(rfiEGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、鼠表皮生長因子(mEGF)、血小板來源的生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，結(jié)締組織生長因子(CTGF)，角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，多效生長因子(Ptn)、淋巴管生長因子(VEGF-C及VEGF-D)，人生長激素(GH)，均可作為生長因子替代bFGF制成相應(yīng)的膜劑。其更為具體的配比如下(1)由本實施例三提供的納米銀-細(xì)胞生長因子凍干粉0.013%(w/w)(2)可藥用的成膜材料PVA1090%(w/w)(3)生長因子保護(hù)劑及藥用填充劑甘露醇010%(w/w)(4)藥用增塑劑甘油015%(w/w)(5)藥用防腐劑山梨酸0.050.2%(w/w)(6)藥用表面活性劑卵磷脂02%(w/w)膜劑具體制備方法同一般生物活性藥物制膜，不是本發(fā)明的范圍。實驗部分(下述三試驗所指的納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體溶液均由實施例1制得。)實驗1納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體抗菌效果的實驗。本研究所采用的納米銀溶液是經(jīng)過微生物學(xué)實驗檢測的，其抗抑菌性對各種病原微生物作用效果24小時達(dá)到99.9%以上，本實驗主要驗證經(jīng)過納米銀經(jīng)過細(xì)胞生長因子的復(fù)合反應(yīng)后其抗抑菌效應(yīng)的比較是否有差別，具體實驗方法采取在鋪滿細(xì)菌的培養(yǎng)皿表面貼無菌濾紙片法，細(xì)菌株采用中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗禾權(quán)供的質(zhì)控細(xì)菌株，種類覆蓋革蘭氏陽性，陰性菌，真菌、厭氧菌、球菌、桿菌、支原體、衣原體等，實驗分4組，分別為納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體組，納米銀組，生長因子組，生理鹽水組，每兩小時在紙片上滴生理鹽7jC兩滴保持濕潤，37t:孵育箱孵育24小時后用大分規(guī)和游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)大小(mm)，其結(jié)果詳見附表l。附表l納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體抗病原微生物效果對照觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從附表l中研究結(jié)果表明，納米銀組與生長因子與納米銀復(fù)合組對以上八種病原體均有較強抑制作用，且對易產(chǎn)生賴藥的金葡球菌，綠膿桿菌等也有良好的抑制作用，經(jīng)過統(tǒng)計分析表明這兩組在抗菌性能上無明顯差異(P〉0.05)，生長因子組和生理鹽水組對細(xì)菌無抑制作用。由此可見，納米銀經(jīng)過和生長因子復(fù)合反應(yīng)形成復(fù)合體后對納米銀本身的抗菌性能沒有影響。實驗2納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體的促細(xì)胞增殖實驗MTT法觀察納米銀-生長因子復(fù)合體溶液對人真皮成纖維細(xì)胞增殖作用，疤痕患者的手術(shù)中取患者疤痕約23cm2,經(jīng)過消毒處理后消化、離心、培養(yǎng)、傳代，傳代10代以后得到高純度成纖維細(xì)胞，MIT法測定活性細(xì)胞數(shù)加入納米銀-生長因子復(fù)合體溶液后分別在第24h、48h、72h和96h時，各取出一個細(xì)胞培養(yǎng)板做MTT實驗，測定各孔的吸光度，所得數(shù)據(jù)用SPSS13.O統(tǒng)計軟件包進(jìn)行方差分析和兩兩比較。其中復(fù)合體組相當(dāng)于50yg/L的量的rhEGF，預(yù)實驗證實IOyg/L，50ug/L的rhEGF濃度對細(xì)胞增殖實驗結(jié)果無顯著差別(P〉0.05)。實驗結(jié)果如2:從圖2中可以得出a)24h時候復(fù)合體組(a)與其余各組無顯著性差異(P〉0.05)(2)48h時復(fù)合體組，50iig/L(b)，10ug/L(c)的rhEGF組光密度值(OD)無明顯差別，空白組(d)與納米銀組(e)之間光密度值(OD)無明顯差別(P〉0.05)，但是復(fù)合體組，10!xg/L，50ug/L的rhEGF組光密度值(OD)明顯大于空白組與納米銀組(P〈0.05)，(3)72h時及96h時復(fù)合體組光密度值(OD)明顯大于其他四組(P〈0.05)，10yg/L,50ng/L的rhEGF組的光密度值(OD)無顯著性差異(P〉0.05)，空白組與納米銀組之間光密度值(OD)無明顯差別(P〉0.05)，但是10ug/L，50pg/L的rhEGF組組光密度值(OD)明顯大于空白組與納米銀組(P〈0.05)。由以上的實驗結(jié)果可見細(xì)胞生長因子與納米銀復(fù)合體能更好更有效地促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，結(jié)合和吸附在納米銀粒子表面的生長因子能以一定速度緩慢從其表面脫離下來發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)，起到了緩釋的作用，從而增強了藥物的療效。實驗3動物創(chuàng)面愈合實驗觀察納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體的促愈合作用取Wistar大鼠40只，隨機分為實驗組湖米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體溶液)，陽性對照組金因肽(rhEGF，2000IU/ml，深圳華生元基因工程發(fā)展有限公司)和陰性對照組(空白對照組)及納米銀組，每組10只，先涂上硫化鈉糊劑，5rain后用玻璃棒輕輕刮去脫毛劑,再用清水將脫毛區(qū)洗凈擦干即可。肌注速眠新麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾后在背部脊柱兩側(cè)對稱部位做皮膚全層切口，去除兩橢圓形皮膚塊及筋膜，制成短徑2cm，長徑3cm的創(chuàng)面，用無菌紗布壓迫止血，實驗組每天滴注納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體溶液，對照組滴注金因肽，一天滴注一次，陰性對照組滴注生理鹽水，一天滴注一次。傷后7，行創(chuàng)面測量和大體觀察，主要觀察肉芽組織填充率；傷后14天進(jìn)行創(chuàng)面測量和大體觀察，主要觀察創(chuàng)面縮小比例。具體數(shù)據(jù)見附表2。附表2納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體促創(chuàng)面愈合療效對照觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從附表2中可以得出通過動物實驗表明納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體溶液療效確切，統(tǒng)計學(xué)分析表明在傷后7天實驗組和金因肽組療效比較接近，無統(tǒng)計學(xué)意義(P〉0.05)，但都優(yōu)于生理鹽水組及納米銀組(P〈0.05);在傷后14天時，因為納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體溶液的藥物緩釋效應(yīng)，實驗組療效要優(yōu)于金因肽組(P〈0.05)，由此動物實驗表明納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體能夠促進(jìn)創(chuàng)面的愈合且優(yōu)于單用細(xì)胞生長因子，納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋復(fù)合體的構(gòu)建具有實用性和創(chuàng)新性。權(quán)利要求1.一種納米銀多肽生長因子的緩釋物是納米銀-細(xì)胞生長因子復(fù)合體，多肽生長因子通過納米吸附性或/和以-COO和-CN及-H與Ag發(fā)生簡單的鍵合反應(yīng)，而吸附在納米銀的表面形成復(fù)合體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米銀多肽生長因子的緩釋物，其特征在于納米銀溶液濃度為202000ppm;生長因子濃度為0.011000pg/ml。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的納米銀多肽生長因子的緩釋物，其特征在于其中加入高分子聚合物封包形成納米緩釋微球或添加納米硅溶膠。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米銀多肽生長因子的緩釋物，其特征在于所述的高分子聚合物選自聚乙醇酸(PGA)、聚孚L酸(PLA)、乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)、明膠、殼聚糖、多聚賴氨酸，聚烯丙基胺。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的納米銀多肽生長因子的緩釋物，其特征在于未經(jīng)過修飾的納米銀，粒子粒徑在1100nm。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米銀多肽生長因子的緩釋物，其特征在于所述的多肽生長因子可以是重組人表皮生長因子(rhEGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、人及鼠表皮生長因子(hEGF及raEGF)、血小板來源的生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)、^島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，結(jié)締組織生長因子(CTGF)，角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，多效生長因子(Ptn)、淋巴管生長因子(VEGF-C及VEGF-D)之中的一種或多種。7、制備權(quán)利要求l-6之一所述的納米銀多肽生長因子的緩釋物的方法，包括下列步驟(1)納米銀溶液配制將粒徑在1100nm^內(nèi)米銀粉分散在水中，分散212個小時；(2)向上述溶液里面加入多肽生長因子粉劑或者多肽生長因子溶液。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備納米銀多肽生長因子的緩釋物的方法，其特征在于多肽生長因子加入納米銀溶液的條件是在PH=5.08.0,溫度在T=060'C，反應(yīng)時間為0.524h。9、一種藥物，含有權(quán)利要求l"6之一所述的納米銀多肽生長因子的緩釋物或/和藥學(xué)上可用的輔料。10、一種細(xì)胞生長因子緩釋膜劑，由下列成分組成(1)權(quán)利要求1一6之一提供的納米銀-細(xì)胞生長因子緩釋物0.013%(w/w)(2)可藥用的成膜材料PVA1090%(w/w)(3)生長因子保護(hù)劑及藥用填充劑甘露醇010%(w/w)(4)藥用增塑劑甘油015%(w/w)(5)藥用防腐劑山梨酸0.050.2%(w/w)(6)藥用表面活性劑卵磷脂02%(w/w)11、權(quán)利要求1~6之一所述的納米銀多肽生長因子的緩釋物用于制備愈合治療的藥物。12、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的用途，其中所說的愈合治療是指手術(shù)及外傷創(chuàng)口/創(chuàng)面，慢性潰瘍，角膜創(chuàng)傷，口腔潰瘍，宮頸糜爛，糖尿病足，褥疫以及各種竇道的愈合治療。全文摘要本發(fā)明涉及一種細(xì)胞多肽生長因子的緩釋物。本發(fā)明還涉及該細(xì)胞多肽生長因子緩釋物的制備方法及其用途。本發(fā)明提供細(xì)胞多肽生長因子的緩釋物是一種納米銀-細(xì)胞生長因子復(fù)合體，多肽生長因子通過納米吸附性或/和以-COO和-CN及-H與Ag發(fā)生簡單的鍵合反應(yīng)，而吸附在納米銀的表面形成復(fù)合體。本發(fā)明提供的緩釋物利用納米銀天然的抗感染作用將為生長因子的生物作用提供一個清潔的微環(huán)境，促進(jìn)創(chuàng)口/創(chuàng)面更快的修復(fù)愈合并降低不良反應(yīng)，并且減少用藥次數(shù)和藥物浪費，減輕病人痛苦同時降低醫(yī)療費用。文檔編號A61P1/02GK101371925SQ20071019269公開日2009年2月25日申請日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日發(fā)明者周建大,王少華申請人:周建大