專利名稱：：一種人中期因子蛋白封閉肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)的分子生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種人中期因子蛋白封閉肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病，腫瘤的防治是一個(gè)全球性問(wèn)題，引起世界各國(guó)的廣泛重視。開(kāi)發(fā)切實(shí)有效的抗腫瘤藥物，是當(dāng)前亟待解決的重大課題。目前的傳統(tǒng)腫瘤化療藥物有垸化劑、抗代謝藥物、抗腫瘤抗生素、鉑類抗腫瘤藥物等，作用機(jī)制多為抑制細(xì)胞的DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的特異性較差，故常具有較大的副作用，例如骨髓抑制、肝腎功能損害。隨著分子生物學(xué)在腫瘤防治研究的多層次全方位滲透，臨床上也越來(lái)越多地將腫瘤生物治療與傳統(tǒng)的化學(xué)治療相結(jié)合，從而達(dá)到最佳的治療效果。以現(xiàn)代分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子免疫學(xué)等前沿科學(xué)為基礎(chǔ)，強(qiáng)調(diào)腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的分子基礎(chǔ)，針對(duì)CD分子、膜受體信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管形成等靶位，設(shè)計(jì)相應(yīng)藥物(單抗或小分子等)，用于腫瘤的防治，治療具有針對(duì)性、特異性(靶向性)和有效性，對(duì)正常造血、免疫和主要器官功能大都沒(méi)有負(fù)面影響和明顯毒性報(bào)道。這種腫瘤治療新思維和新模式，將成為現(xiàn)代腫瘤綜合治療新模式的里程碑。尤其是分子靶向治療，已有多個(gè)藥物在腫瘤治療上成功應(yīng)用。中期因子Midkine(MK)是一種受視黃酸誘導(dǎo)的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，人MK基因位于染色體llqll.2，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。成熟的人MK蛋白由121個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量為13.4KD,是一個(gè)分泌性的堿性肝素結(jié)合蛋白。研究表明，MK可促進(jìn)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和遷移，在神經(jīng)發(fā)生和器官發(fā)生過(guò)程中的上皮一間充質(zhì)相互作用中發(fā)揮作用。MK在很多方面顯示與腫瘤發(fā)生有關(guān)的活性，包括促細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡、促纖維蛋白溶解和血管新生等，而且在許多惡性腫瘤及其衍生腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)增加，可能成為腫瘤診斷和治療的一個(gè)耙點(diǎn)。傳統(tǒng)的分子靶向抗腫瘤藥物多為單抗類藥物(例如賀賽汀、美羅華等)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多肽作為藥物在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，相應(yīng)的研究也日益受到重視。多肽類藥物具有分子量小、無(wú)免疫原性、可控緩釋、可口服給藥、生產(chǎn)方便等優(yōu)點(diǎn)。由于新給藥技術(shù)的發(fā)展、新生產(chǎn)技術(shù)和極具活力的研發(fā)活動(dòng)的開(kāi)展，許多制藥公司、生物技術(shù)公司都步入了這一領(lǐng)域。在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步都為多肽類藥物的研究提供了新的動(dòng)力。多肽與靶蛋白的結(jié)合力，類似抗原抗體反應(yīng)的分子間作用力。親合力高的多肽有可能達(dá)到抑制靶蛋白活性這種效果。噬菌體展示技術(shù)于1985年首先由Smkh發(fā)明，在1988年由Parmley和Smith提出構(gòu)建噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)的設(shè)想，而在1990年則由三個(gè)研究小組構(gòu)建并成功篩選噬菌體肽庫(kù)，從而標(biāo)志著噬菌體肽庫(kù)技術(shù)的誕生。噬菌體肽庫(kù)的基本原理是將隨機(jī)肽段的DNA序列插入到噬菌體衣殼蛋白的基因組，插入的DNA經(jīng)噬菌體表達(dá)以后，以肽展示在噬菌體衣殼蛋白上，肽段與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白而呈現(xiàn)于噬菌體表面，并利用噬菌體能大量復(fù)制的特點(diǎn)，得到不同重組噬菌體的多個(gè)拷貝，而不影響噬菌體的浸染與擴(kuò)增能力。這一技術(shù)使基因型和表型得以巧妙地結(jié)合，從而為不同的研究提供了有利工具。生物大分子之間的相互作用，實(shí)質(zhì)上是功能位點(diǎn)間的相互作用，并不一定需要整個(gè)分子的完全接觸，MK與其受體間的相互作用以及MK與抗-MK抗體間的相互作用也不例外。因此，只要能找到受體分子或封閉性抗體分子上與MK結(jié)合的肽序列(或模擬肽)來(lái)競(jìng)爭(zhēng)性或封閉性抑制MK與其受體相結(jié)合，進(jìn)而就能達(dá)到抑制MK促腫瘤生長(zhǎng)的作用。在噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中恰恰包含了極大量的，在氨基酸組成序列上相互有差異的小肽，這些小肽呈現(xiàn)于噬菌體表面，他們可以在序列上充當(dāng)或模擬生物大分子間相互作用的功能位點(diǎn)。噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其篩選通量大，操作簡(jiǎn)便。目前已經(jīng)商品化的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)最常用的是由美國(guó)NewEnglandBiolabs公司(簡(jiǎn)稱NEB)在M13噬菌體基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的噬菌體文庫(kù)，M13噬菌體是一種溶源性噬菌體，它只感染而不裂解宿主菌，最終以分泌蛋白的形式排出，宿主菌保持其原有的活性，并不斷分泌擴(kuò)增的噬菌體。NEB公司的產(chǎn)品包括7肽庫(kù)，12肽庫(kù)，環(huán)7肽庫(kù)三種文庫(kù)，其中前面兩種屬于非構(gòu)象型肽庫(kù)，第三種是一個(gè)構(gòu)象型肽庫(kù)。兩類肽庫(kù)的區(qū)別主要在于，構(gòu)象型肽庫(kù)是將兩個(gè)半胱氨酸的核苷酸序列加于隨機(jī)肽DNA序列的兩端，二硫鍵能夠相結(jié)合成環(huán)從而使呈現(xiàn)的肽段形成具有功能活性的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而模擬天然分子的相互作用；而非構(gòu)象約束型肽庫(kù)所呈現(xiàn)的肽段則為線形，則不使所呈現(xiàn)的隨機(jī)肽形成二硫鍵。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與人中期因子蛋白特異性結(jié)合的封閉肽，在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種人中期因子蛋白封閉肽(下文中用MK-P3表示)，具有如下氨基酸序列CTSTAMDNC。所述MK-P3通過(guò)以下方法篩選得到(1)選擇靶蛋白選擇人中期因子蛋白作為隨機(jī)肽庫(kù)篩選的耙蛋白。采用原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)并純化得到人中期因子重組蛋白。(2)生物淘洗篩選以人中期因子蛋白為靶蛋白，對(duì)噬菌體表面的隨機(jī)7肽庫(kù)和環(huán)7肽庫(kù)進(jìn)行生物淘洗3輪。(3)測(cè)定特異性隨機(jī)肽序列生物淘洗后，選取pfu值約為100的平板上的藍(lán)色噬斑，感染宿主菌，37。C培養(yǎng)，離心后，上清中加入PEG/NaCl，于0。C沉淀M13噬菌體單鏈DNA，離心后沉淀溶于TBS/NaN3，得樣品ssDNA用于測(cè)序。(4)序列分析對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，確定篩選得到的中期因子特異結(jié)合多確定MK-P3的氨基酸序列后，其合成可采用Fmoc-氨基酸樹(shù)脂固相合成法進(jìn)行，經(jīng)過(guò)HPLC純化，質(zhì)譜(MS)鑒定，純度>90%。采用MTT法，檢測(cè)MK-P3對(duì)HepG2和HUVEC細(xì)胞增殖的影響；制備BALB/c小鼠移植瘤模型，檢測(cè)MK-P3對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及微血管密度的影響。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MK-P3具有抗腫瘤作用，可用于制備抗腫瘤藥物。進(jìn)一步，所述MK-P3可應(yīng)用于制備抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。再進(jìn)一步，所述MK-P3可應(yīng)用于制備抑制惡性腫瘤新生血管生成的藥物。本發(fā)明提供了一種人中期因子蛋白封閉肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，該多肽可抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、尤其是抑制惡性腫瘤新生血管生成，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)，具有重大臨床意義。圖1為MK封閉肽對(duì)HepG2細(xì)胞(A)和HUVEC(B)增殖的抑制作用；圖2為BALB/c小鼠移植瘤HE染色(X200);A為模型對(duì)照；B為MK-P3;圖3為BALB/c小鼠移植瘤MVD(X200);A為模型對(duì)照；B為MK-P3。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例l:人中期因子蛋白封閉肽的篩選(一)人中期因子蛋白的表達(dá)純化根據(jù)人中期因子的mRNA序列，可溶性表達(dá)并純化人中期因子蛋白。(二)噬菌體多肽庫(kù)的篩選及陽(yáng)性克隆的鑒定和序列分析噬菌體7肽庫(kù)和環(huán)7肽庫(kù)篩選(固體包被法)MK重組蛋白包被平皿，包被量為15pg/孔，經(jīng)封閉液封閉后，洗滌平皿。加入10iul原庫(kù)/L(100fil0.r/^TBST稀釋)，室溫輕搖10-60min后洗滌平皿，酸性洗脫液100pl洗脫結(jié)合噬菌體，洗脫液離心后，以150jillMTris-HCl(PH9.1)中和后。收集洗脫物，取少量用于測(cè)定洗脫物滴度，其余用于擴(kuò)增。噬菌體滴度的測(cè)定挑選生長(zhǎng)良好的ER2537單菌落，接種于LB/Tet中，孵育至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD6oo=0.5)。LB培養(yǎng)基IO倍比稀釋噬菌體，以l:10加入ER2537中，混均后涂板(LB/IPTG/Xgal)培養(yǎng)。噬斑計(jì)數(shù)以噬斑數(shù)為100左右的平皿為準(zhǔn)?；厥章?％)二洗脫噬菌體數(shù)/加入噬菌體數(shù)x100。/^。噬菌體的擴(kuò)增ER2537單菌落接種于LB/Tet中過(guò)夜培養(yǎng)，以1:100接種至LB中，加入待擴(kuò)增的噬菌體，37°C，270r/m培養(yǎng)4.55h。收集培養(yǎng)物離心，上清中加入1/6體積的PEG/NaCl，4。C沉淀過(guò)夜。離心，用1mlTBS懸浮沉淀(并至少溶解1h)，離心后用1/6體積的PEG/NaCl再次沉淀，冰上孵育60min;4°C，12000xg，離心10min，棄上清，再次離心30sec，用槍頭吸棄殘留上清。TBS(0.02。/。NaN3)重懸沉淀(至少溶解1h)，離心去除不溶雜質(zhì)。上清4'C保存。擴(kuò)增后的洗脫物進(jìn)行滴度測(cè)定，準(zhǔn)備進(jìn)行下一輪篩選。第二、三輪篩選程序與第一輪篩選相仿，僅有以下幾點(diǎn)不同1、投入篩選的肽庫(kù)為上一輪篩選的洗脫擴(kuò)增物，控制噬菌體數(shù)量在l2xl0"pfu。2、結(jié)合后的洗滌過(guò)程中，使用的洗滌液PBST中Tween-20的濃度提高至0.5%,洗滌次數(shù)增至10次。3、第三輪篩選的洗脫物取lOpl鋪板測(cè)滴度，余者4t:保存，不再擴(kuò)增。隨機(jī)挑選第三輪分隔良好的藍(lán)色噬斑，培養(yǎng)后進(jìn)行ELISA分析和DNA序ELISA方法比較陽(yáng)性噬菌體克隆對(duì)靶蛋白的結(jié)合能力-在噬菌體洗脫液滴度測(cè)定時(shí)，在<100個(gè)藍(lán)斑的平板上，挑選輪藍(lán)色克隆，2mlER2537菌液，37。C震蕩培養(yǎng)5h。2次離心，稀釋用于ELISA檢測(cè)。MK蛋白100pg/孔包被酶標(biāo)板過(guò)液，封閉，洗滌后加陽(yáng)性噬菌體克隆，以各輪未結(jié)合噬菌體做陰性對(duì)照。室溫孵育2h，TBST洗滌后加入HRP標(biāo)記抗M13抗體(1:5000)，室溫震蕩lh，TBST洗板，顯色后于酶標(biāo)板測(cè)4卯nm處A值。測(cè)序模板的快速純化擴(kuò)增噬斑，在第一次離心后，吸取500)ul含有噬菌體的上清，轉(zhuǎn)入新的離心管中。加入200ialPEG/NaCl，室溫靜置10min。離心，用100|^1碘化物緩沖液重懸沉淀物，加入250fal乙醇。室溫孵育10min，室溫短暫孵育將選擇性沉淀單鏈?zhǔn)删wDNA，而大部分噬菌體蛋白保留在溶液中。離心10min，用70%乙醇洗滌沉淀物，真空吸干后，用30piTE緩沖液重懸沉淀物。取5|_il作為測(cè)序模板，送出測(cè)序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)3輪篩選，7肽庫(kù)中與MK特異性結(jié)合的噬菌體已從原始肽庫(kù)中篩選并富集出來(lái)(見(jiàn)表l)。各陽(yáng)性克隆與目標(biāo)蛋白均具有一定結(jié)合力(見(jiàn)表2)，將篩選出的陽(yáng)性克隆送上海中科新生命生物技術(shù)有限公司測(cè)序，根據(jù)DNA序列推導(dǎo)相應(yīng)的氨基酸序列，共測(cè)出14組不同序列(見(jiàn)表3)。選擇與靶蛋白結(jié)合力高及序列測(cè)定重復(fù)次數(shù)多的陽(yáng)性克隆序列，合成了3條線性肽和3條環(huán)肽(見(jiàn)表4)，序列分別為CVIHWDFIC;CTWLHWWAC;CTSTAMDNC;LLWYDEI;HAIYPRH;PVPRSRP，委托杭州中肽公司合成。表1:以MK為靶分子篩選噬菌體7肽庫(kù)及環(huán)7肽庫(kù)的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>名稱多肽序列MK陽(yáng)P1CVIHWDFICMK-P2CTWLHWWACMK-P3CTSTAMDNCMK陽(yáng)P4LLWYDEIMK-P5HAIYPRHMK-P6PVPRSRP實(shí)施例2:MTT法檢測(cè)封閉肽對(duì)人HepG2肝癌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)生長(zhǎng)的抑制作用實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)由篩選出的多肽MK-P3作用于HepG2和HUVEC兩種細(xì)胞，其中每種細(xì)胞又分為15|imol/L、50pmol/L和150pmol/L3個(gè)濃度梯度組。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖人肝癌細(xì)胞系(HepG2)及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)由浙江大學(xué)傳染病研究所提供，用含10%小牛血清及100U/ml青霉素，100ng/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，置37°C,5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至96孔板，200^1/孔，3Xl()3個(gè)細(xì)胞/每孔，每組設(shè)3孔，重復(fù)3次，37°C，5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)60-80%融合后，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，加入不同濃度MK封閉肽，設(shè)不加封閉肽孔為空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加20^MTT，37°C，5%002培養(yǎng)箱孵育卯min,測(cè)定4卯nm光吸度值"49Q)，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)倍增數(shù)量評(píng)價(jià)封閉肽對(duì)H叩G2和HUVEC生長(zhǎng)的影響，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(％)=["柳對(duì)照一Am用藥)/^柳對(duì)照]X100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果-MK封閉肽抑制HepG2和HUVEC增殖MK-P3在15Mg/ml時(shí)即能顯著抑制HepG2和HUVEC增殖作用，當(dāng)濃度進(jìn)一步升高至50)Lig/m和150pg/ml，其抑制作用也隨之增強(qiáng)，具有劑量依賴性(圖1)。實(shí)施例3:制備BALB/c小鼠移植瘤模型，分析MK封閉肽在小鼠體內(nèi)的抗血管生成及抗腫瘤活性作用動(dòng)物模型建立H22細(xì)胞由浙江大學(xué)傳染病研究所提供；BALB/c小鼠，18-20g，雌雄各半，由上海必凱實(shí)驗(yàn)中心提供，。將H22細(xì)胞注射入BALB/c小鼠腹腔，10-14d左右取腹水，收集腫瘤細(xì)胞。用1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞懸液濃度至5X10"ml，每只BALB/c小鼠背部皮下取一點(diǎn)種植細(xì)胞懸液0.1ml，觀察小鼠背部腫瘤形成情況及其表面有無(wú)紅腫及破潰。實(shí)驗(yàn)分組及處理取BALB/c小鼠96只，隨機(jī)分為8組，每組12只(1)MK-P3組腹腔注射MK-P30.5mg'kg";(2)模型對(duì)照組腹腔注射PBS;(3)陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射5-FU10mg'kg—、以上各組動(dòng)物于注射H22細(xì)胞當(dāng)日開(kāi)始給藥，1-7組每日腹腔注射給藥2次，5-FU每日一次，連續(xù)注射給藥21天。開(kāi)始給藥后第28天BALB/c小鼠處死，切取腫瘤稱重，計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)=(模型對(duì)照組平均瘤重量-治療組平均瘤重量)/模型對(duì)照組平均瘤重量X100。/。。腫瘤組織液氮凍存?zhèn)溆?。免疫組織化學(xué)(ABC法)檢測(cè)腫瘤組織中微血管密度腫瘤組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4pm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中微血管密度(MVD):用VIII抗體標(biāo)記微血管，了解腫瘤組織新生血管情況并檢測(cè)腫瘤組織中微血管密度(MVD)。ABC免疫組織化學(xué)法按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行。MVD判斷方法先在40倍顯微鏡下觀察整張切片的血管分布情況，選擇癌灶內(nèi)微血管最密集的5個(gè)區(qū)域，即"熱點(diǎn)"，然后在200倍鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域中的血管數(shù)，取5個(gè)區(qū)域的平均值作為該只小鼠腫瘤MVD，取同一組內(nèi)小鼠腫瘤的平均MVD作為該組腫瘤的平均MVD。計(jì)數(shù)由2位不知臨床資料的病理科高年資醫(yī)生完成。染成棕色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞族，只要他們和鄰近的微血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分幵，就視為一個(gè)微血管；同一個(gè)血管的"頭"與"尾"正巧在同一切面上，也作為2個(gè)微血管計(jì)算。血管腔和紅細(xì)胞不作為判斷微血管的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果-MK封閉肽抑制BALB/c小鼠腫瘤生長(zhǎng)細(xì)胞接種后第七天，BALB/c小鼠背部皮下開(kāi)始出現(xiàn)腫塊，到第14天，各小鼠背部皮下均出現(xiàn)腫瘤塊，小鼠移植瘤率高達(dá)100%。MK封閉肽對(duì)移植瘤均有不同程度抑制作用，MK-P3的抑瘤率為56.4%。(見(jiàn)表5)。表5:MK封閉肽抗BALB/c小鼠移植瘤試驗(yàn)瘤重與抑瘤率分組瘤重(g)抑瘤率(％)MK-P10.5mg.kg-1組2.42±0.56*22.0MK-P20.5mg.kg-1組2.31±0.645*25.4MK-P30.5mg.kg-'組1.35±0.88**56.4MK-P40.5mg-kg-'組2.31±0.49*25.5MK-P50.5mg'kg-1組2.26±0.34**27.0MK-P60.5mg'kg-1組2.50±0,16*19.313陽(yáng)性對(duì)照(5-FU10mg'kg-')組1.692±0.563*45.4模型對(duì)照(PBS0.1ml/只)組3.099±0.452—x±s，n=12，*尸<0.05，**尸<0.01，丄j投M對(duì)照紹比抑瘤率(％)=(投M對(duì)照組平均瘤巫呈-治療組平均瘤重ifO/投艱對(duì)照組平均瘤2呈X100。/。免疫組織化學(xué)結(jié)果腫瘤組織蘇木素-伊紅(HE)染色腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈多邊形，核大，深染而不規(guī)則，可見(jiàn)核分裂現(xiàn)象。MK-P3處理組出現(xiàn)不同程度的腫瘤細(xì)胞壞死現(xiàn)象。(圖2)微血管密度(MVD):MK封閉肽處理組MVD明顯低于模型對(duì)照組(圖3)。因此，MK封閉肽可能通過(guò)抑制腫瘤血管新生來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。序列表.ST25.txtSEQUENCELISTING〈110>湖州市中心醫(yī)院<120>—種人中期因子蛋白封閉肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用<130〉〈160>6<170>Patentlnversicm3.2<210>1<211>9〈212〉PRT<213〉Unknown<220〉<223>人工序列〈400〉1CysVallieHisTrpAspPhelieCvs15<210>2<211>9<212〉PRT<213〉Unknown〈220><223>人工序列<400〉2CysThrTrpLeuHisTrp丁rpAlaCys1.5<210〉3〈211〉9〈212〉PRT<213>Unknown〈220><223>人工序列<400〉3CysThrSerThi'AlaMetAspAsnCvs1'5〈210〉4<211>7<212>PRT〈213〉Unknown《220〉〈223〉人工序列<400〉4LeuLeuTrpTyrAspGlulie15<210>5<211〉7〈212〉PRT<213>Unk訓(xùn)n<220><223〉人工序列序列表.ST25.txt<400>5HisAlalieTyrProArgHis15<210〉6〈211>7〈212>PRT<213>Unknown<220><223>人工序列〈400〉6ProValProArgSerArgPro1權(quán)利要求1、一種人中期因子蛋白封閉肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的人中期因子蛋白封閉肽具有如下氨基酸序列CTSTAMDNC。2、如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述的人中期因子蛋白封閉肽應(yīng)用于制備抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。3、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的人中期因子封閉肽應(yīng)用于制備抑制惡性腫瘤新生血管生成的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及一種人中期因子蛋白封閉肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的人中期因子蛋白封閉肽具有如下氨基酸序列CTSTAMDNC。本發(fā)明提供了一種人中期因子蛋白封閉肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，該多肽可抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、尤其是抑制惡性腫瘤新生血管生成，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)，具有重大臨床意義。文檔編號(hào)A61P35/00GK101255190SQ20071030130公開(kāi)日2008年9月3日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者戴利成,沈建芬申請(qǐng)人:湖州市中心醫(yī)院