專利名稱：：一種用于防治黃褐斑的中藥組合物及其制備方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥，特別涉及一種用于防治黃褐斑的中藥組合物及其制備方法和其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：黃褐斑又名黧黑斑，表現(xiàn)為面黑、黧黑、面塵、面軒、肝斑、面生黑斑等癥狀，為一種多因性色素沉著病，影響患者容貌，給其造成嚴(yán)重的心理壓力。但黃褐斑的發(fā)病原因和機(jī)理復(fù)雜，其中肝氣郁滯、腎水(陽)不足和血瘀內(nèi)阻為其最多見的證型，其次是脾土虧虛。目甜，多數(shù)研究認(rèn)為，黃褐斑是由于黃褐斑患者皮損部位黑色素細(xì)胞活性增強(qiáng)，黑素和黑素小體均增加，進(jìn)而表現(xiàn)出色斑。病理狀態(tài)下，真皮內(nèi)巨噬細(xì)胞可吞噬滴落入真皮的黑色素體，或沉著于真皮上層，或在細(xì)胞內(nèi)降解，一部分經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移。色素的產(chǎn)生與排泄失去平衡，并過剩地聚集在表皮細(xì)胞內(nèi)的部分，就形成色素沉著。黑色素的排泄有兩條途徑--是從腎內(nèi)排泄，另一是經(jīng)皮膚排出，即黑色素被轉(zhuǎn)移到角質(zhì)蛋白中，隨表皮生長移行到角質(zhì)層，最后隨角質(zhì)層周期換新而脫落。治療黃褐斑的方法包括針灸推拿(如局部針刺、體針、穴位注射、拔罐、刮痧、推拿、祌闕穴貼敷、埋線、埋針、耳穴等)、外治法(如乳霜、面膜、洗劑、熏蒸方)和方藥治療等。已有方藥包括逍遙散、加味逍遙散、六味地黃湯、桃紅四物湯、血府逐瘀湯、二至丸、歸脾湯等；最常用的中藥依次為當(dāng)歸、茯苓、川芎、白芍、柴胡、紅花、甘草、熟地、白術(shù)、桃仁、丹皮、生地、赤芍、丹參、白芷、山萸肉、益母草、山藥、女貞子、香附等。但這些治療方法的效果不是很理想，不能從根本上治療黃褐斑，并且還有一定的副作用。因此，提高一種高效安全的防治黃褐斑的藥物己成為人們的迫切需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于防治黃褐斑的中藥組合物，其特征在于，制備該組合物所用藥效成分的原料組成按重量份為姜黃7.5-25份，山楂6-20份，枸杞4.5-16份，丹參6-20份，紅花3-10份。進(jìn)一步，制備該組合物所用藥效成分的原料組成按重量份為姜黃10-20份，山楂8-16份，枸杞6-12份，丹參8-16份，紅花4-8份。3進(jìn)一步，制備該組合物所用藥效成分的原料組成按重量份為姜黃15份，山楂12份，枸杞9份，丹參12份，紅花6份。進(jìn)一步，優(yōu)選組合物中的姜黃為片姜黃。進(jìn)一步，優(yōu)選組合物中的山楂為生山楂。本發(fā)明的中藥組合物具有活血化瘀，疏經(jīng)活絡(luò)，改善皮膚的血液循環(huán)，增強(qiáng)皮膚抵抗力，調(diào)節(jié)肝脾等作用，以內(nèi)治外，可有效的治療色素沉著性皮膚病，特別是用于防治黃褐斑。其中，姜黃性溫，味辛、苦。歸肝脾經(jīng)。有活血行氣、通經(jīng)之痛的功效。為"血中之氣藥"，可用于血瘀氣滯的心、腹、胸、脅痛，經(jīng)閉，產(chǎn)后腹痛及跌打損傷和風(fēng)濕痹痛。山楂性微溫，味酸甘。歸脾、胃、肝、經(jīng)。有消食化積、行氣散瘀的功效。主要用于肉食積滯，瀉痢腹痛，疝氣痛，瘀阻胸腹痛和痛經(jīng)。枸杞性平，味甘。歸肝、腎經(jīng)。具有補(bǔ)肝腎，明目的功效?？捎糜诟文I不足，腰酸遺精，頭目暈眩，視力減退，內(nèi)障目昏，消渴等。此外，本品含有甜菜堿、多糖、粗脂肪、粗蛋白、硫胺素、核黃素、胡蘿卜素、抗壞血酸、尼克酸及鈣、磷、鐵、鋅等元素。具有升高外周白細(xì)胞、增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬能力，有增強(qiáng)細(xì)胞與體液免疫的作用；對造血功能有促進(jìn)的作用；還能抗衰老、抗突變、抗腫瘤、保肝及降血糖等。丹參性微寒，味苦。歸心、肝經(jīng)。有活血調(diào)經(jīng)，涼血消腫，安神的功效?？捎糜趮D女月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)，經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀滯腹痛，瘡瘍癰腫，熱病煩躁神昏及雜病心悸失眠。有報道稱，丹參能擴(kuò)張外周血管，改善微循環(huán)；有抗凝，促進(jìn)纖溶，抑制血小板聚集，抑制血栓形成的作用；能提高機(jī)體的耐缺氧能力；能促進(jìn)組織的修復(fù)。此外，還有增強(qiáng)免疫力，降低血糖及抗腫瘤的作用。紅花性溫，味辛。歸心、肝經(jīng)。最消瘀熱，少則養(yǎng)血性溫。有活血通經(jīng)，祛瘀止痛的功效。用于血滯經(jīng)閉，痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀滯腹痛，跌打損傷，血栓閉塞紫腫疼痛，斑疹色暗，熱郁血瘀等。取本品有活血化斑之功。近代有以紅花注射液肌注，防治多形性紅斑者。上述各味中藥之間協(xié)同作用，使得本發(fā)明的中藥組合物對心、肝、脾等有不同程度的裨益，具有疏通經(jīng)絡(luò)和血液循環(huán)等作用，還可改善心態(tài)，增強(qiáng)健康信念，提高自身素質(zhì)，從根本上防治黃褐斑。本發(fā)明的組合物可為本領(lǐng)域熟知的各種劑型。所述的適合于本發(fā)明的劑型可以為口服制劑、外用制劑及注射劑。口服制劑可選自口服液、湯劑、片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑、散劑、滴丸、糖漿劑、合劑、露劑或茶劑等；外用制劑可選自膠劑、貼膏劑、膏藥、軟膏劑、搽劑、洗劑、涂抹劑或凝膏劑等；注射劑可選自針劑、輸液及凍干粉針等?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的制劑技術(shù)手段來完成本發(fā)明組合物的制備。所述的藥學(xué)上可接受的載體為本領(lǐng)域熟知，為用于制備上述制劑的常用賦形劑或輔料?？诜苿┗蛲庥弥苿┏Ｓ玫馁x形劑或輔料包括但不僅限于填充劑或稀釋劑、潤滑劑或助流劑或抗粘著劑、分散劑、濕潤劑、粘合劑、調(diào)節(jié)劑、增溶劑、抗氧劑、抑菌劑、乳化劑等。粘合劑，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃芪膠、纖維素及其衍生物、明膠漿、糖漿、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮，優(yōu)選的纖維素衍生物為微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、羥丙甲基纖維素；填充劑，例如乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纖維素及其衍生物、無機(jī)鈣鹽、山梨醇或甘氨酸，優(yōu)選無機(jī)鈣鹽為硫酸鈣、磷酸鈣、磷酸氫鈣、沉降碳酸鈣；潤滑劑，例如微粉硅膠、硬脂酸鎂、滑石粉、氫氧化鋁、硼酸、氫化植物油、聚乙二醇；崩解劑，例如淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纖維素，優(yōu)選的淀粉衍生物為羧甲基淀粉鈉、淀粉乙醇酸鈉、預(yù)膠化淀粉、改良淀粉、羥丙基淀粉、玉米淀粉；濕潤劑，例如十二烷基硫酸鈉、水或醇等；優(yōu)選口服制劑的藥學(xué)上可接受的載體為微晶纖維素、硬脂酸鎂或乙醇等。所述注射劑常用的賦形劑或輔料包括但不僅限于抗氧劑，例如亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉和焦亞硫酸鈉；抑菌劑，例如O.5%苯酚、0.3%甲酚、0.5%三氯叔丁醇；調(diào)節(jié)劑，例如鹽酸、枸櫞酸、氫氧化鉀(鈉)、枸櫞酸鈉及緩沖劑磷酸二氧鈉和磷酸氫二鈉；乳化劑，例如聚山梨酯-80、沒酸山梨坦、普流羅尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂；抗氧劑，例如亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、二丁基苯酸等；增溶劑，例如吐溫-80、膽汁、甘油等。另外，還可將活性成分與藥學(xué)上可接受的緩控釋載體按其制備要求加以混合，再按照本領(lǐng)域熟知的緩控釋制劑的制備方法，如加入阻滯劑包衣或?qū)⒒钚猿煞治⒛一笤僦瞥晌⑼?，如緩釋微丸或控釋微丸；所述的緩控釋載體包括但不僅限于油脂性摻入劑、親水膠體或包衣阻滯劑等，所述的油脂性摻入劑為單硬脂酸甘油酯、氫化蓖麻油、礦油、聚硅氧烷、二甲基硅氧烷；所述的親水膠體為羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等纖維素衍生物，或PVP、阿拉伯膠、西黃耆膠或卡波普等；所述的包衣阻滯劑為乙基纖維素(EC)、羥丙甲基纖維素(HMPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、丙稀酸類樹脂等。本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備用于防治黃褐斑的中藥組合物有效成分的方法，其特征在于，將制備該組合物所用藥效成分的原料混合后，采用水提醇沉方法提取其有效成分。進(jìn)一步，所述的水提醇沉方法提取其有效成分是指，取處方量的五味藥材，加入藥材量6一10倍的去離子水，煎煮三次，第一次1.5小時，第二次1小時，第三次0.5小時；過濾，收集合并煎煮液，濃縮至相對密度1.05—1.3，冷卻，加入95%乙醇，使其含醇量達(dá)到60-80%;靜置，過濾，濃縮醇提取液，即得。進(jìn)一步，優(yōu)選去離子水的用量為藥材量的7—9倍，更優(yōu)選為8倍。進(jìn)一步，優(yōu)選煎煮液的濃縮相對密度為1.1一1.25，更優(yōu)選為1.15—1.2。本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明的中藥組合物用于制備美容祛斑的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選所述的美容祛斑為色素沉著性皮膚病，更優(yōu)選為防治黃褐斑。具體實施例方式以下將結(jié)合實施例具體說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限定本發(fā)明的實質(zhì)。實施例1口服液的制備口服液的組成片姜黃120g，生山楂96g，枸杞72g，丹參96g，紅花48g。制備方法取處方量的五味藥材，加入藥材量8倍的去離子水，煎煮三次，第一次1.5小時，第二次1小時，第三次0.5小時；過濾，收集合并煎煮液，濃縮至相對密度1.15，冷卻，加入95%乙醇，使其含醇量達(dá)到65%。靜置24小時，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至相對密度1.2。加純化水至1000ral，攪勻，灌裝至10ml口服液瓶中，滅菌，包裝即得。實施例2湯劑的制備將片姜黃15g，生山楂9g，枸杞9g，丹參12g和紅花6g，加入藥材量8倍的去離子水，煎煮三次，第一次1.5小時，第二次1小時，第三次0.5小時；過濾，收集合并煎煮液，即制得本發(fā)明的湯劑。以下通過藥效試驗例或毒性試驗例來以驗證本發(fā)明藥物組合物對黃褐斑的防治效果。試驗例1本發(fā)明中藥組合物對黃褐斑的防治作用1、動物分組與造模、灌胃治療方法取雌性昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只。造模時間45天，灌胃治療時間45天。①正常組以10。/。NaS2水溶液脫去背部毛，裸露出皮膚l塊，面積約1.5cmX1.5cm。每周脫毛一次，每天肌肉注射注射用水，5ml/kg體重。連續(xù)觀察小鼠的脫毛部位皮膚變化情況。45天后，停止造模，每天灌胃去離子水0.6ml。②模型組同正常組脫毛處理，每日注射0.4%黃體酮，5ral/kg體重。每閂將小鼠置于特制束縛桶內(nèi)束縛，并在束縛同時以波長為320nm的中波紫外線(UVB)照射小鼠1次，束縛照射時間60min，連續(xù)觀察。45天后，停止造模，每天灌胃去離子水0.6ml。③陽性對照組(逍遙散治療組，3.43g/kg):同正常組脫毛處理，每日注射0.4%黃體酮，5ml/kg體重。每R將小鼠置于特制束縛桶內(nèi)束縛，并在束縛同時以波長為320nm的中波紫外線(UVB)照射小鼠1次，束縛照射時間60min，連續(xù)觀察。45天后，停止造模，每天灌胃逍遙散0.6ml。④組合物的高劑量組(14.19g/kg):同正常組脫毛處理，每日注射0.4%黃體酮，5ml/kg體重。每日將小鼠置于特制束縛桶內(nèi)束縛，并在束縛同時以波長為320nm的中波紫外線(UVB)照射小鼠1次，束縛照射時間60min，連續(xù)觀察。45天后，停止造模，每天灌胃組合物0.9ml。⑤組合物的中劑量組(9.46g/kg):同正常組脫毛處理，每閂注射0.4%黃體酮，5ml/kg體重。每日將小鼠置于特制束縛桶內(nèi)束縛，并在束縛同時以波長為320nm的中波紫外線(UVB)照射小鼠1次，束縛照射時間60min，連續(xù)觀察。45天后，停止造模，每天灌胃組合物0.6ml。⑥組合物的低劑量組(4.73g/kg):同正常組脫毛處理，每日注射0.4%黃體酮，5ml/kg體重。每日將小鼠置于特制束縛桶內(nèi)束縛，并在束縛同時以波長為320nm的中波紫外線(UVB)照射小鼠1次，束縛照射時間60min，連續(xù)觀察。45天后，停止造模，每天灌胃組合物0.3ml。2、取材第91天上午8點開始取材，取材前12小時斷食水。雙側(cè)眼球取血處死，取肝臟0.5g，背部脫毛皮膚取2塊0.5cm*0.5cm大小后，再取0.5g。血液室溫靜置4小時后4'C低溫離心，取上清液備用。0.5g肝臟和皮膚用預(yù)冷生理鹽水(4'C)沖洗，除盡雜質(zhì)，拭干，分別放入有2.0ml預(yù)冷生理鹽水的小試管內(nèi)，用細(xì)胞粉碎機(jī)勻漿(肝臟2次，皮膚4次)，每次5s。勻漿后加入預(yù)冷生理鹽水至5ml。以3500r/m離心15tnin，，取上清液備用。0.5c.m*0.5cm皮膚1塊以10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。另l塊液氮冰存，冰凍切片備用。3、行為學(xué)實驗方法3.1曠場實驗分別于46天和90天清晨8時，在無噪聲的實驗環(huán)境條伴下進(jìn)行。操作者握住小鼠的尾巴根部1/3處，輕輕將小鼠放入26cmX16cmX13cm的長方形實驗盒內(nèi)的中央格，并開始計時。底部均分為6格(2X3),分別觀察并記錄3min內(nèi)小鼠行走的格數(shù)和直立的次數(shù)。實驗要求在單盲的條件下進(jìn)行，避免實驗者了解組別后對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。觀察指標(biāo)穿格次數(shù)、理毛修飾時間和次數(shù)、直立次數(shù)。進(jìn)行4次，每次間隔3分鐘。取后3次的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)用于統(tǒng)計。3.2甩尾實驗用一塊軟布輕輕裹住實驗小鼠的身軀僅露出尾巴，使之不能逃脫又不至于太難受。將鼠尾尖端約1.5cra部分浸入53'C的水浴內(nèi)，同時用秒表測出鼠尾從浸入到甩出水面的時間(精確到O.ls)。連續(xù)做4次，每次間隔30s。取后3次的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)用于統(tǒng)計。3.3體重變化每天測量小鼠的體重，并進(jìn)行分析統(tǒng)計。4、實驗指標(biāo)的測定4.1血清ACTH、CORT的測定(競爭法)加入25ul標(biāo)準(zhǔn)品、25ul血清標(biāo)本于相應(yīng)反應(yīng)板孔中。每孔加入200ul酶聯(lián)物，輕輕混勻30秒，20-25°C120分鐘。洗板，甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板，并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干)；這樣反復(fù)洗滌3次。每孔加入100ul顯色液，室溫15分鐘。每孔加入50ul終止液。輕輕混勻30秒；60分鐘內(nèi)在450nm處讀0D值。4.2皮膚、肝臟MDA、SOD、ZnCu—S0D活性測定采用試劑盒檢測MDA、SOD活性，實驗按照說明書進(jìn)行。4.2.l總SOD(T-SOD)活力的測定按照說明書的要求，進(jìn)行預(yù)實驗計算出最優(yōu)樣本量為30ul。先后加入試劑14以及1%的組織勻漿，用旋渦混勻器充分混勻，置37'C恒溫水浴40分鐘。然后加入顯色劑2ml混勻，IO分鐘后倒入lcm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長550nm處比色。4.2.2CuZn-SOD活力的測定取組織勻槳0.2ml加0.1ml的試劑七，用旋渦混勻器充分混勻l分鐘后，以3500_4000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，取上清液進(jìn)行測試。方法同總SOD。4.2.3MDA活力的測定按照說明書的要求，先后加入試劑13以及1%的組織勻漿，旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，剌一小孔，95'C水浴40分鐘，取出后流水冷卻，然后35004000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，(3000轉(zhuǎn)/分以下離心時間需延長，目的使沉淀完全)。取上清O.lml，532nm處，lcm光徑，蒸餾水調(diào)零，比色測各管吸光度值。4.3HMB45標(biāo)記的皮膚黑色素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)觀察1)常規(guī)石蠟包埋切片(5um)，脫蠟至水。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。2)3XHA室溫孵育5-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘*3次。3)10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘，滴加一抗HMB45，4。C過夜。4)PBS沖洗，2分鐘*3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘；5)PBS沖洗，2分鐘*3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘；6)PBS沖洗，2分鐘*3次。顯色劑顯色(DAB)5-10分鐘。87)自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片。采用Image-ProPlus5.0圖像分析系統(tǒng)軟件分析、計算各組黑色素細(xì)胞及黑色素顆粒陽性表達(dá)部位的面積和光密度。4.4皮膚黑色素細(xì)胞N0S的表達(dá)1)常規(guī)石蠟包埋切片(5um)，脫蠟至水。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。2)3XHA室溫孵育5-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘*3次。3)10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘，滴加一抗N0S，4'C過夜。4)PBS沖洗，2分鐘*3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1XBSA-PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘；5)PBS沖洗，2分鐘*3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘；6)PBS沖洗，2分鐘*3次。顯色劑顯色(DAB)5-IO分鐘。7)自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片。采用Image-ProPlus5.0圖像分析系統(tǒng)軟件分析、計算各組N0S陽性表達(dá)部位的面積和光密度。4.5皮膚酪氨酸酶的mRNA表達(dá)1)冰凍切片(5um)，置打孔液中室溫10分鐘，給細(xì)胞打孔改變組織細(xì)胞的通透性使探針快速順利的穿透細(xì)胞膜。0.1MPBS沖洗3次。2)置仏02封閉液室溫20分鐘，以封閉內(nèi)源性^02酶。0.1MPBS沖洗3次。3)滴加復(fù)合消化工作液，覆蓋組織表面，室溫20分鐘，0.1MPBS沖洗3次。0.2Xssc沖洗一次(室溫3分鐘)。4)滴加預(yù)雜交工作液，蓋上原位雜交專業(yè)蓋玻片，覆蓋組織42'C濕盒孵育4小時。5)揭去蓋玻片，以0.2Xssc沖洗三次，每次洗滌5分鐘。6)滴加雜交工作液，覆蓋組織37'C濕盒孵育5小時。7)揭去蓋玻片，以2Xssc37。C沖洗三次，每次洗滌5分鐘。0.2Xssc37。C沖洗三次，每次洗滌5分鐘。0.1MTBS37'C沖洗3-5次，每次洗滌5分鐘。8)滴加小鼠抗地高辛生物素標(biāo)記的抗體工作液，覆蓋組織37'C濕盒孵育45-60分鐘。0.1MPBS沖洗3次，每次洗滌5分鐘。9)滴加高敏過氧化氫酶鏈親和素復(fù)合物工作液，覆蓋組織37'C濕盒孵育50分鐘，0.1MPBS沖洗3次，每次洗滌5分鐘。10)DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察至細(xì)胞內(nèi)胞漿陽性顏色與細(xì)胞外背景顏色反差對比明顯時用蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。11)蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片。引物序列如下鼠酪氨酸酶5'—GGTCCCTCAGGTGTTCCATCGCATAAA探針濃度8ug/ml雜交液，探針適用于小鼠。5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖像分析5.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS11.0軟件進(jìn)行多組間單因素的方差分析以及治療前后對照的配對T檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。5.2圖像分析圖像在ImageproPlus5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每組8-10張切片，每張切片分析3個視野進(jìn)行圖像處理。處理前先用同等條件下拍攝的測微尺圖像和空白片進(jìn)行空間和光密度校正，分別測量各分區(qū)任意面積平均光密度(meanopticaldensity,MOD)、積分吸光度(intergralopticaldensity,IOD)和陽性物面積(area,wm)。數(shù)據(jù)結(jié)果按如下公式計算陽性面積=陽性物面積/測量總面積，100=積分吸光度測量值/測量總面積。6、實驗結(jié)果6.1行為學(xué)本研究中肝郁證的行為學(xué)觀察包括曠場實驗、甩尾試驗、體重變化觀察和食量觀察，分別反映小鼠的興奮性和活躍度、反應(yīng)性和體重、食欲。肝郁證包括肝氣疏泄不及和太過兩種情況，慢性束縛造模法限制了動物的自由行動，致使情緒受抑，情懷不遂出現(xiàn)疏泄不及?；颊吲R床通常表現(xiàn)為郁郁寡歡、精神萎靡、情緒低落、食欲不振、體重下降，因此，小鼠行為學(xué)的表現(xiàn)是判斷肝郁證模型成功與否的主要指標(biāo)之一。6.1.1曠場實驗曠場實驗可以反映實驗動物的興奮性和活躍度，包括穿格次數(shù)、直立次數(shù)、理毛時間、理毛次數(shù)的觀察。6.1.1.1穿格次數(shù)的計算和統(tǒng)計各模型組的穿格次數(shù)的均較空白組降低并有極顯著差異，見表1。逍遙散、組合物高、中、低治療組治療后，穿格次數(shù)有所增加。其中逍遙散治療組與模型無治療組有顯著差異。比較逍遙散、組合物的高、中、低治療組的治療前后效果可見，逍遙散和組合物高劑量治療可以明顯增.加肝郁小鼠的穿格次數(shù)，其中逍遙散治療前后差異極顯著，見表2。表l治療前后穿格數(shù)(x土s，/5min)II^治療前格數(shù)(格)治療后格數(shù)(格)空白治療§74.88±17.63模型治療855.00±19.47《逍遙散治療1051.00±11.13*75.88±12.4547.50±8.65:59.50±11.67:10—的高劑量組—10—40.30±10.34"46.00±9.7廣組合物的中劑量組1054.10±12.32"56.卯±15.13"組合物的低劑量組1049.40±13.99"43.70±8.72"注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，'P<0.01。表2治療前后穿格次數(shù)對照表(治療前一治療后x土s,Z5min)組別n格數(shù)(格)空白治療8—1.00±10.36模型治療87.50±20.08逍遙散治療8—9.75±7.19**組合物的高劑量組10—5.70士6.88'組合物的中劑量組10—2.80±9.68組合物的低劑量組10一4.30±8.56注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。治療前后比較*P<0.05，**P<0.01。6.1.1.2直立次數(shù)的計算和統(tǒng)計各模型組的直立次數(shù)的均較空白組降低并有極顯著差異，見表3。逍遙散、組合物高、中、低治療組治療后，直立次數(shù)有所增加。其中逍遙散治療組與模型無治療組有極顯著差異。比較逍遙散、組合物的高、中、低治療組的治療前后效果可見，逍遙散和組合物高劑量治療可以明顯增加肝郁小鼠的直立次數(shù)，其中逍遙散治療前后差異極顯著，見表4。表3治療前后直立次數(shù)(x士s，/5min)組別n治療前直立(次)治療后直立(次)空白治療830.37±6.6129.50±7.52*模型治療818.88±7.22**20.63±7.48*逍遙散治療1019.80±6.56**32.00±8.00**組合物的高劑量組1016.70±5.06**23.50±6.35組合物的中劑量組1020.11±7.18**23.11±6.09組合物的低劑量組1020.60±8.75"23.60±6.10注與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，"<0.05，**P<0.01。治療前F-3.879，治療后F:3.435。表4治療前后直立次數(shù)對照表(治療前一治療后x土s，/5min)組別n直立(次)空白治療80.88±9.48模型治療逍遙散治療組合物的高劑量組組合物的中劑量組組合物的低劑量組88101010—1.75±6.88—13.75±8.78"—6.80±7.36*一3.00±6.06—3,00±7.72注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。治療前后比較*P<0.05,**P<0.016.1.1.3理毛次數(shù)的計算和統(tǒng)計各模型組的理毛次數(shù)的均較空白組降低并有顯著差異，見表5。逍遙散、組合物高、中、低治療組治療后，理毛次數(shù)有所增加。其中逍遙散治療組與模型無治療組有顯著差異，且與空白組無明顯差異。比較逍遙散、組合物的高、中、低治療組的治療前后效果可見，逍遙散治療可以明顯增加肝郁小鼠的理毛次數(shù)，其中逍遙散治療前后差異極顯著，見表6。表5治療前后理毛次數(shù)(x土s，/5min)組別n治療前理毛(次)治療后理毛(次)空白治療83.13±1.13"3.38±1.06*模型治療81.38±0.52"2.13±0.83*逍遙散治療101.30±0.48"3.25±1.28*組合物的高劑量組100.90±0.74"1.80士0.79**組合物的中劑量組101.60±0.7(T2.20±1.03*組合物的低劑量組101.80±0.79**2.10±1.20'注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。與空白組比較，*P<0.05，林P〈0.01:與模型組比較，*P<0.05，★★P<0.01。治療前F-9.048，治療后F-3.457表6治療前后理毛次數(shù)對照表(治療前一治療后x士s，/5min)組別理毛(次)空白治療8—0.25±1.39模型治療.8一O.75±1.04逍遙散治療8—2.OO土l.51*組合物的高劑量組10—0.90±1.37組合物的中劑量組10—0.60±1.58組合物的低劑量組10—0.30±1.34注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。治療前后比較*P<0.056.1.1.4理毛時間的計算和統(tǒng)計12各模型組的理毛時間的均較空白組降低并有顯著差異，見表7。逍遙散、組合物高、中、低治療組治療后，理毛時間有所增加。與模型組對比，逍遙散治療組有極顯著的差異，與空白組無明顯差異。比較逍遙散、組合物的高、中、低治療組的治療前后效果可見，逍遙散和組合物高劑量治療可以明顯增加肝郁小鼠的理毛時間，差異極顯著，見表8。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表8治療前后理毛時間對照表(治療前一治療后x士s，/5min)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。治療前后比較，*P<0.05,**P<0.01。6.1.2甩尾時間的計算和統(tǒng)計各模型組的甩尾時間的均較空白組延長并有顯著差異，見表9。逍遙散治療后，甩尾時間縮短，與空白組無明顯差異。比較逍遙散、組合物的高、中、低治療組的治療前后效果可見，逍遙散和組合物高、中劑量治療可以明顯縮短肝郁小鼠的甩尾時間，其中組合物高劑量組差異極顯著，見表IO。提示逍遙散與高劑量組合物可以明顯縮短肝郁證小鼠的甩尾時間，提高對外界刺激的反應(yīng)能力，緩解肝郁引起的精神萎靡，對外界反應(yīng)冷淡的癥狀。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>模型治療逍遙散治療組合物的高劑量組組合物的中劑量組組合物的低劑量組81010101016.50±2.80*16.36±2.55*19.85±5.92"17.49±6.30**16.47±3.79*丄O.00±3.10*'8.36±2.80"10.76±2,66*'13.65±3.86*"10.39±2.05"注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。與空白組比較，*P<0.05,林P〈0.01:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。治療前F-13.780,治療后F可O.279。表10治療前后甩尾時間對照表(治療前一治療后x土s，)組別n甩尾時間(s)空白治療8-O.45±0.81模型治療86.50±11.36逍遙散治療87.51±8.64*組合物的高劑量組109.09±12.74**組合物的中劑量組103.84±3.17'組合物的低劑量組106.08±8.63注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。治療前后比較，*P<0.05，林P〈0.016.1.3體重的變化各模型組的體重均較空白組有所下降，并有顯著差異，見表ll。停止造模后，各組的體重上升，其中組合物高劑量組與空白組比較有顯著差異，逍遙散治療組有極顯著差異，并與模型組差異顯著。比較逍遙散、組合物的高、中、低治療組的治療前后效果可見，逍遙散和組合物高劑量治療可以明顯增加肝郁小鼠的體重，差異顯著，見表12。提示逍遙散與高劑量組合物可以明顯增高肝郁證小鼠的體重，緩解肝郁引起的體重下降癥狀。表ll治療前后體重的變化(x土s，/45天)組別n治療前體重增加量(克)治療后體重增加量(克)空白治療83.25±1.910.625±1.99模型治療8一O.13±2.23"0.88±1.55逍遙散治療10L30士1.49'2.80±1.69"*組合物的高劑量組100.70±1.83**2.30±1.89'組合物的中劑量組101.1±2.08*0.78±1.20組合物的低劑量組100.7±1.95"1.30±1.25注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。與空白組比較，*P<0.05，林P〈0.01;與模型組比較，*P<0.05，★*P<0.01。治療前F-2.863，治療后F二2.879。14表12治療前后體重變化對照表(治療前--治療后x土s，/45天)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。治療前后比較，*P<0.05，**P<0.016.1.4行為學(xué)小結(jié)綜上所述，本實驗采用慢性束縛法建立肝郁證動物模型，從行為學(xué)的曠場實驗、甩尾實驗、體重可以發(fā)現(xiàn)，各模型組與空白組均有顯著差異，驗證了肝郁模型的成功，比較逍遙散、組合物的高、中、低治療組的治療前后效果可見，逍遙散和組合物高劑量對肝郁證具有緩解治療作用，其中逍遙散作用更為明顯。逍遙散具有疏肝解郁、健脾和營的作用，因此對于肝郁證模型小鼠具有較好的治療作用。組合物中的君藥片姜黃味辛、苦、溫，歸肝脾經(jīng)，功能破血行氣，通經(jīng)止痛。該方雖然僅有一味藥能夠行氣解郁，但是在大劑量使用的情況下，也具有一定的疏肝解郁的功效。6.2實驗指標(biāo)的測定6.2.1血清ACTH、CORT的測定6.2.1.1ACTH與空白組對照，模型組和逍遙散、組合物高、中、低劑量治療組的血清ACTH值有極顯著的差異。與模型組對照，逍遙散、組合物高、中、低劑量治療組的血清ACTH值也有極顯著的差異。見表13。可見慢性束縛法建立的肝郁證小鼠模型血清ACTH值明顯上升，逍遙散、組合物高、中、低劑量對肝郁證小鼠血清ACTH值有恢復(fù)的作用，以組合物高劑量組最為顯著但是與正常小鼠仍然有一定差距。6.2.1.2C0RT與空白組對照，模型組和逍遙散、組合物高、中、低劑量治療組的血清CORT值上升，具有極顯著的差異。與模型組對照，治療各組無顯著的差異。見表13?？梢娐允`法建立的肝郁證小鼠模型血清CORT值明顯上升，逍遙散、組合物高、中、低劑量對肝郁證小鼠血清CORT值沒有顯著的改變。表13血清中ACTH、CORT的變化(x士s，/ml)組別nACTH(pg/ml)CORT(ng/ml)空白治療825.60±6.87"13.80±4.73**模型治療873.17±17.78"28.76±7.10"逍遙散治療850.82±7.73"**27.13±6.39"組合物的高劑量組1039.80±10.97"**22.56±6.15'*組合物的中劑量組1044.03±11.09"**26.31±3.85"組合物的低劑量組1048.02±8.08"**30.59±10.20"注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。與空白組比較，*P<0.05，》<0.01;與模型組比較，"P〈0.01。治療前F=16.908,治療后F=6.684。6.2.2肝臟、皮膚總SOD、ZuCu—SOD、MDA活性的測定6.2.2.1肝臟總SOD活性的測定和統(tǒng)計與空白組對照，模型組和組合物低劑量組的肝臟總SOD活性值下降，具有極顯著的差異。與模型組對照，治療逍遙散、組合物中劑量組有極顯著的差異。見表14?？梢娐允`+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型肝臟總SOD活性下降，逍遙散、組合物高、中、低劑量均能提高肝臟總SOD活性，其中逍遙散、組合物中劑量組有極顯著的改變。6.2.2.2皮膚總SOD活性的測定和統(tǒng)計與空白組對照，模型組和組合物低劑量組的皮膚總SOD活性值下降，具有顯著的差異；逍遙散、組合物高、中劑量組與空白組無顯著差異。與模型組對照，治療逍遙散、組合物高、中劑量組有極顯著的差異，低劑量組有顯著差異。見表14?？梢娐允`+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型皮膚總SOD活性下降，逍遙散、組合物高、中、低劑量均能提高皮膚總S0D活性，其中逍遙散、組合物高、中劑量治療有極顯著的作用，治療后與空白組沒有顯著差異。表14肝臟、皮膚總S0D活性的變化(x土s，/mg蛋白)Hi肝臟總S0D(nu)總SOD(加)空白治療§81.95±9.09**模型治療856.24±13.04"逍遙散治療878.26±23.32*'組合物的高劑量組1069.65±9.1789.79±24.43*53.06±12.86'79.09±13.85'82.97±16.95，16組合物的中劑量組T574.84±13.26**84.53±15.31**組合物的低劑量組1059.05土11.74"71.01±16.64"注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。肝臟F-4.624，皮膚F-5.0106.2.2.3肝臟ZuCu—SOD活性的測定和統(tǒng)計與空白組對照，模型組和組合物低劑量組的肝臟ZuCu—SOD活性值下降，具有顯著的差異。與模型組對照，治療逍遙散、組合物中劑量組有顯著的差異。見表15?？梢娐允`+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型肝臟ZuCu—SOD活性下降，逍遙散、組合物高、中、低劑量均能提高肝臟ZuCu—SOD活性，其中逍遙散、組合物中劑量具有顯著的治療作用。6.2.2.4皮膚ZuCu—SOD活性的測定和統(tǒng)計與空白組對照，模型組和組合物低劑量組的皮膚ZuCu—SOD活性值下降，具有顯著的差異。與模型組對照，治療逍遙散、組合物中劑量組有顯著的差異。見表15。可見慢性束縛+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型皮膚ZuCu—SOD活性下降，逍遙散、組合物高、中、低劑量均能提高皮膚ZuCu—SOD活性，其中逍遙散、組合物中劑量具有顯著的治療作用。表15ZuCu—SOD活性的變化(x士s，/rag蛋白)組別n肝臟ZuCu—S0D(nu)皮膚ZuCu—S0D(nu)空fi治療851.70±6.25*64.81土9.97**模型治療839.94±10.94*41.66土12.76"逍遙散治療851.81±9.44*51.35±:13.71*組合物的高劑量組1048.10±8.8554.70±7.79*組合物的中劑量組1050.98±8,63*58.57±9.68"組合物的低劑量組1039.31±11.87"40.42±9.96**注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模荊組比較，*P<0.05，**P<0.01。肝臟F:3.395,皮膚F-6.804。6.2.2.5肝臟MDA活性的測定和統(tǒng)計與空白組對照，模型組的肝臟MDA活性值升高，具有顯著的差異。與模型組對照，治療組合物中劑量組有顯著的差異。見表16。可見慢性束縛+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型肝臟MDA活性升高，逍遙散、組合物高、中、低劑量均能降低肝臟MDA活性，其中組合物高劑量具有顯著的治療作用。3.2.2.6皮膚MDA活性的測定和統(tǒng)計與空白組對照，模型組的皮膚MDA活性值升高，具有極顯著的差異。與模型組對照，逍17遙散、組合物高、中劑量組有極顯著的差異，低劑量組有顯著差異，見表16?？梢娐允`+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型皮膚MDA明顯活性升高，逍遙散、組合物高、中、低劑量均能降低皮膚MDA活性，其中逍遙散、組合物高、中劑量具有極顯著的治療作用，與空白組無顯著差異。表16MDA活性的變化(x士s，Ang蛋白)組別n肝臟MDA活性(nmol)皮膚MDA活性(nraol)空白治療85.11±2.65**4.63±0.96**模型治療815.36±2.67"13.23±5.73**逍遙散治療88.57±4.17***6.84±2.73"組合物的高劑量組106.35±3.65**8.05±4.81**組合物的中劑量組109.09±3.17"*7.17±3.61"組合物治療低1010.80±3.43""9.44±3.10"注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為8。與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01;與模荊組比較,*P<0.05，★*P<0.01。肝臟F-9.572，皮膚F-4.867。6.2.3麗B45標(biāo)記的皮膚黑色素細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)觀察6.2.3.1HMB45標(biāo)記的皮膚黑色素細(xì)胞的整體觀察正常組鱗狀上皮較菲薄，由排列整齊的基底細(xì)胞和棘細(xì)胞組成，共2-3層，表面有少量角質(zhì)。真皮中見毛囊，皮脂腺與表皮相連，未見汗腺。皮下脂肪組織未見特殊。HMB^標(biāo)記表皮中幾乎未見黑色素細(xì)胞，毛囊、皮脂腺基底細(xì)胞中見少量黑色素細(xì)胞。模型組HMB，5標(biāo)記的黑色素陽性細(xì)胞明顯增多，與空白組有極顯著差異，成簇分布于毛囊基底細(xì)胞團(tuán)中，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層中亦見單個散在分布的黑色素細(xì)胞，伴細(xì)胞核增大及核上移。表皮細(xì)胞數(shù)增多，局部呈疣狀增生。治療組表現(xiàn)基本同模型組，黑色素陽性細(xì)胞減少，與模型組有顯著差異，提示慢性束縛+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型皮膚黑色素細(xì)胞較正常小鼠顯著增多，逍遙散和組合物有治療作用。6.2.3.2HMB45標(biāo)記的皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒的圖像分析表17剛B45標(biāo)記的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒陽性面積的變化組別n陽性面積(x士s)IOD(x±s)MOD(x±s)空白治療240.0006±0.0002"0.0017±0.0006"0.1328士0.0538"模型治療240.0129±0.0026"0.0038±0.0013**0.2087±0.0604"逍遙散治療240.0024±0.0006'"0.0021±0.0010s**0.137±0.0501**組合物的髙劑量組300.0038±0,0003**0.0035±0.00150.2043±0.0308"18組合物的中劑量組300.0029±0.0003"0.0033±0.0013"0.1799±0.0230"*組合物的低劑量組300.0024土0.0002"0.0026±0.0010'"*0.1815±0.0310"注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為24。與空白組比較，'P<0.05，"P〈0.01;與模型組比較〈0.05，**P<0.01。陽性面積的F=61.170，IOD的F=14.096，MOD的F=ll.896。從表17看出(1)模型組HMB45標(biāo)記的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒的陽性面積較正常組顯著升高(P<0.01)，逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，其中逍遙散治療組和組合物低劑量組下降非常顯著(P<0.01)，組合物高、中劑量組下降趨勢不明顯。(2)模型組HMB45標(biāo)記的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒的IOD較正常組顯著升高(P<0.01)，逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，其中逍遙散治療組和組合物低劑量組下降非常顯著(P<0.01)。組合物中、高劑量組下降趨勢不明顯。(3)模型組HMB45標(biāo)記的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒的MOD較正常組顯著升高(P<0.01)，逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，其中逍遙散治療組下降非常顯著(P<0.01)，組合物中劑量組下降明顯(P<0.05)。組合物高、低劑量組下降趨勢不明顯。綜上所述，模型組HMB45標(biāo)記的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒的陽性面積、IOD、MOD均有顯著的升高，逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，但是總體而言，逍遙散治療組的效果最為顯著，對陽性面積、IOD、MOD均有顯著的降低作用，其次是組合物各劑量組。6.2.4皮膚黑色素細(xì)胞NOS表達(dá)的觀察和分析6.2.4.1皮膚黑色素細(xì)胞NOS表達(dá)的整體觀察正常組鱗狀上皮較菲薄，由排列整齊的基底細(xì)胞和棘細(xì)胞組成，共2-3層，表面有少量角質(zhì)。真皮中見毛囊，皮脂腺與表皮相連，未見汗腺。皮下脂肪組織未見特殊。NOS標(biāo)記表皮中幾乎未見黑色素細(xì)胞，毛囊、皮脂腺基底細(xì)胞中見少量黑色素細(xì)胞。模型組NOS陽性細(xì)胞明顯增多，與空白組有極顯著差異，成簇分布于毛囊基底細(xì)胞團(tuán)中，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層中亦見單個散在分布的黑色素細(xì)胞，伴細(xì)胞核增大及核上移。表皮細(xì)胞數(shù)增多，局部呈疣狀增生。治療組表現(xiàn)基本同模型組，NOS陽性細(xì)胞減少，與模型組有顯著差異，提示慢性束縛+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型皮膚黑色素細(xì)胞較正常小鼠顯著增多，逍遙散和組合物有治療作用。6.2.4.2皮膚黑色素細(xì)胞NOS表達(dá)的圖像分析表18皮膚黑色素細(xì)胞NOS表達(dá)的變化組另寸i陽性面積(x±s)IOD(x±s)MOD(x±s)19空白治療240.0205土O.0058"0.0378±0.0115"0.1673±0.0299"模型治療240.1103±0.0232"0.0875±0.0162"0.2183±0.0515"逍遙散治療240.0496±0.0063""0.0651±0.0120"**0.1908士O.0372**組合物的高劑量組3'00.0555±0.0117**"0.0553±0.(X)92""0.2051±0.0318"組合物的中劑量組300.1160土0.0258"0.0701土0.0112""0.2167±0.0430"組合物的低劑量組300.0616士0.0113""0.0632±0.Oll(T"0.1982±0.0367**注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為24。與空白組比較，'P<0.05，"P〈0.01;與模荊組比較，*P<0.05，★*P<0.01。陽性面積F-143.103，IOD的F=46.929，MOD的F=6.058從表18可以看出(1)模型組的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞NOS表達(dá)的陽性面積較正常組顯著升高(P<0.01),逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，其中逍遙散治療組和組合物高、低劑量組下降非常顯著(P<0.01)，組合物中劑量組下降趨勢不明顯。(2)模型組的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞NOS表達(dá)的IOD較止常組顯著升高(P<0.01)，逍遙散、組合物各劑量治療組有明顯下降趨勢，其中逍遙散治療組和組合物中劑量組下降非常顯著(P<0.01)，組合物高、中劑量組高、低劑量組下降趨勢顯著。(3)模型組的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞NOS表達(dá)的MOD較正常組顯著升高(P<0.01)，逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，其中逍遙散治療組下降顯著(P<0.05)，組合物各劑量組下降趨勢不明顯。綜上所述，模型組的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞NOS表達(dá)的的陽性面積、IOD、MOD均有顯著的升高，逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，但是總體而言，逍遙散治療組的效果最為顯著，其次是組合物各劑量組。6.2.5皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA水平的影響6.2.5.1皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA表達(dá)的整體觀察正常組鱗狀上皮較菲薄，由排列整齊的基底細(xì)胞和棘細(xì)胞組成，共2-3層，表面有少量角質(zhì)。真皮中見毛囊，皮脂腺與表皮相連，未見汗腺。皮下脂肪組織未見特殊?；讓游匆姲麧{棕黃色酪氨酸酶mRNA表達(dá)的黑色素細(xì)胞，毛囊、皮脂腺基底細(xì)胞中見少量黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA的表達(dá)。模型組黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA的表達(dá)明顯增多，與空白組有極顯著差異，成簇分布于毛囊基底細(xì)胞團(tuán)中，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層中亦見多個表達(dá)。表皮細(xì)胞數(shù)增多，局部呈疣狀增生。治療組表現(xiàn)基本同模型組，黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA的表達(dá)減少，與模型組有差異。提示慢性束縛+紫外線+黃體酮法建立的肝郁型黃褐斑小鼠模型皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA20的表達(dá)較正常小鼠顯著增多，逍遙散和組合物有治療作用。6.2.5.2皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA表達(dá)的圖像分析表19皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA表達(dá)的變化組別n陽性面積(x±s)IOD(x±s)MOD(x土s)'空白治療240.0061±0.0010**0.0279±0.0020"0.2016±0.0818**模型治療240.128±0.0368"0.1183±0.0300**0.3346±0.0856'"逍遙散治療240.0728±0.018廣**0.0925±0.0210****0.3214±0.0750"組合物的高劑量組300.0864±0.0126""0.0791±0.0122"**0.3290±0.095廣組合物的中劑量組300.0678士0.0124""0.0905±0.0187"1^0.2642±0.0992""組合物的低劑量組300.0723±0.0102,0.1172士0.0227"0.3343±0.0772"注逍遙散治療組死亡2只，樣本量為24。與空白組比較，卞<0.05，"P〈0.01;與模型組比較，*P<0.05，★*P<0.01。陽性面積F414.440,IOD的F=70.739，MOD的F-10.041。從表19可以看出(1)模型組的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA表達(dá)的陽性面積較正常組顯著升高(P<0.01)，逍遙散、組合物高、中、低劑量治療組有下降趨勢，與模型組差異非常顯著(P<0.01)。(2)模型組的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA表達(dá)的IOD較正常組顯著升高(P〈0.0D，逍遙散、組合物高、中劑量治療組有下降趨勢，與模型組差異非常顯著(P〈0.01)。(3)模型組的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA表達(dá)的MOD較正常組顯著升高(KO.Ol)，逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，其中組合物中劑量組下降非常顯著(P<0.01)，逍遙散、組合物高、低劑量組下降趨勢不明顯。綜上所述，模型組的小鼠皮膚黑色素細(xì)胞酪氨酸酶mRNA表達(dá)的陽性面積、IOD、MOD均有顯著的升高，逍遙散、組合物各劑量治療組有下降趨勢，但是總體而言，逍遙散和組合物高、中劑量治療組的效果最為顯著，其次是組合物低劑量組。6.2.6測定指標(biāo)結(jié)果小結(jié)模型組血清ACTII、CORT明顯上升，皮膚、肝臟的總S0D，ZnCu-S0D下降，MDA上升，HMB45標(biāo)記黑色素細(xì)胞的陽性面積、M0D、IOD升高，NOS表達(dá)陽性面積、M0D、IOD升高，酪氨酸酶mRNA表達(dá)陽性面積、M0D、IOD升高。逍遙散治療組與模型組比較，血清ACTH明顯下降，血清CORT無顯著差異。皮膚、肝臟的總S0D，ZnCu-S0D上升，皮膚MDA下降，肝臟MDA無顯著變化。HMB45標(biāo)記黑色素細(xì)胞的陽性面積、M0D、IOD降低，N0S表達(dá)陽性面積、M0D、IOD降低，酪氨酸酶mRNA表達(dá)陽性面積降低，M0D、IOD無顯著變化。組合物高劑量組與模型組比較，血清ACTH明顯下降，皮膚總SOD上升，皮膚MDA下降。HMB45標(biāo)記黑色素細(xì)胞的MOD降低，NOS表達(dá)陽性面積降低，其余指標(biāo)無顯著變化。組合物中劑量組與模型組比較，血清ACTH明顯下降，皮膚、肝臟的總SOD，ZnCu-SOD上升，皮膚、肝臟MDA下降。HMB45標(biāo)記黑色素細(xì)胞的IOD降低，NOS表達(dá)MOD降低，酪氨酸酶mRNA表達(dá)陽性面積、IOD降低，其余指標(biāo)無顯著變化。組合物低劑量組與模型組比較，血清ACTH明顯下降，皮膚總SOD上升。HMB45標(biāo)記黑色素細(xì)胞的陽性面積降低，NOS表達(dá)陽性面積降低，酪氨酸酶mRNA表達(dá)陽性面積降低，其余指標(biāo)無顯著變化。7、結(jié)論模型組的各個指標(biāo)均有變化，提示黃褐斑模型的成功。本發(fā)明組合物的高、中、低劑量對于小鼠行為學(xué)有較好的改善作用，并且能夠改善血清C0RT、肝臟MDA、酪氨酸酶mRNA表達(dá)M0D、IOD以外的其它所有指標(biāo)，甚至接近正常組，提示對黃褐斑有較好的防治作用。2權(quán)利要求1、一種用于防治黃褐斑的中藥組合物，其特征在于，制備該組合物所用藥效成分的原料組成按重量份為姜黃7.5-25份，山楂6-20份，枸杞4.5-16份，丹參6-20份，紅花3-10份。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥組合物，制備該組合物所用藥效成分的原料組成按重量份為姜黃IO-20份，山楂8-16份，枸杞6-12份，丹參8-16份，紅花4-8份。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥組合物，制備該組合物所用藥效成分的原料組成按重量份為姜黃15份，山楂12份，枸杞9份，丹參12份，紅花6份。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3任-^項所述的中藥組合物，所述屮藥組合物的劑型選g門服制劑、外用制劑、注射劑或其緩控籽制劑，優(yōu)選組合物屮的姜黃為片關(guān)黃，更優(yōu)選組合物屮的山楂為生山楂。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的中藥組合物，所述的口服制劑選自湯劑、口服液、片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑、散劑、滴丸、糖漿劑、合劑、露劑或茶劑。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的中藥組合物，所述的外用制劑選自膠劑、貼膏劑、膏藥、軟膏劑、搽劑、洗劑、涂抹劑或凝膏劑。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的中藥組合物，所述的注射劑選自針劑、輸液或凍千粉針。8、種制備權(quán)利要求1一7任'項所述的中藥組合物有效成分的方法，其特征在于，將制備該組合物所用藥效成分的原料混合后，采用水提醇沉方法提取其有效成分。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述的水提醇沉方法提取其有效成分是指，取處方量的TI味藥材，加入藥材量6—10倍的去離子水，煎煮三次，第-'次1.5小吋，第二次l小吋，第二次O.5小時；過濾，收集合并煎煮液，濃縮節(jié)相對密度L05—1.3，冷卻，加入95%乙醇，使其含醇量達(dá)到60-80%;靜置，過濾，濃縮醇提取液，即得。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述去離子水的用量為藥材量的7—9倍，優(yōu)選為8倍。11、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述煎煮液的濃縮相對密度為1.1—1.25,優(yōu)選為1.15一l.2。12、權(quán)利要求1—7任項所述的中藥組合物用于制備美容祛斑的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選所述的美容祛斑為色素沉著性皮膚病，更優(yōu)選為防治黃褐斑。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于防治黃褐斑的中藥組合物，制備該組合物所用藥效成分的原料組成按重量份為姜黃7.5-25份，山楂6-20份，枸杞4.5-16份，丹參6-20份，紅花3-10份。本發(fā)明的中藥組合物具有活血化瘀，疏經(jīng)活絡(luò)，改善皮膚的血液循環(huán)，增強(qiáng)皮膚抵抗力，調(diào)節(jié)肝脾等作用，可有效的治療色素沉著性皮膚病，特別是用于防治黃褐斑。文檔編號A61K36/9066GK101468182SQ200710301479公開日2009年7月1日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日發(fā)明者吳曉丹,汪南玥,陳家旭申請人:陳家旭