專利名稱：生物型骨修復(fù)材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種骨修復(fù)材料，用于對(duì)骨缺損的修復(fù)，屬于植入類醫(yī)療 器械，具體為生物型骨修復(fù)材料。
背景技術(shù)：
外科手術(shù)或病變所引起的骨缺損是外科常見病之一，骨缺損的治療需用到 大量骨修復(fù)材料，即通常所說(shuō)的人工骨材料。目前被研究及應(yīng)用的骨修復(fù)材料 主要有兩大類 一類是由合成材料制成的骨修復(fù)材料，主要有羥基磷灰石、磷
酸三鈣、聚乳酸(PLA)、聚羥乙酸(PGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚己內(nèi)酰胺(PA6) 等。以上所述的人工骨材料除羥基磷灰石、磷酸三鈣與骨組織中的無(wú)機(jī)骨架組 成相似外，其余高聚物與骨的組成毫無(wú)共同點(diǎn)，只是作為一種形狀支架應(yīng)用。 羥基磷灰石及磷酸三鈣，無(wú)論燒結(jié)成型或以上所述高聚物作粘結(jié)劑粘接成型， 其力學(xué)強(qiáng)度均不理想。燒成陶瓷不但性脆，且過(guò)于堅(jiān)硬，宿主骨組織難于長(zhǎng)入， 因此難與骨組織融為一體。所以，H能的羥基磷灰石及磷酸三鈣，多以粉狀、 顆?；蚋囿w用作骨填料，應(yīng)用受到限制；第二類是以天然骨為原料的骨修復(fù)材 料。最早被應(yīng)用的是動(dòng)物骨，經(jīng)600 80(TC焙燒去有機(jī)質(zhì)后應(yīng)用。焙燒的作用 是除去有強(qiáng)免疫排異原性的有機(jī)質(zhì)，同時(shí)殺滅病菌病毒。但焙燒的骨質(zhì)很脆， 力學(xué)強(qiáng)度變差，且燒去骨基質(zhì)后，誘導(dǎo)骨組織生長(zhǎng)的能力差，只能作為填充料 在小范圍內(nèi)應(yīng)用。目前被用得最多的是尸體骨， 一般只作低溫冷凍及簡(jiǎn)單的酒 精、射線滅菌或戊二醛浸泡滅菌處理后應(yīng)用，常發(fā)生免疫排異反應(yīng)而影響治療 效果。更主要的是尸體骨的來(lái)源大多不是自愿捐贈(zèng)的，即使有少量是自愿捐贈(zèng)， 按各國(guó)有關(guān)法律，捐贈(zèng)的器官是不能用于以盈利為目的的交易的，目前市場(chǎng)上， 作為商品的尸體骨存在一個(gè)倫理、人權(quán)、法律的問(wèn)題。隨著法律法制的健全， 尸體骨的來(lái)源將十分有限。近年來(lái)有不少試圖用動(dòng)物骨代替尸體骨的研究，有 些只是照尸體骨的簡(jiǎn)單深冷及酒精浸泡處理就應(yīng)用；有些進(jìn)行稍微復(fù)雜的處理
如脫脂、氫氟酸處理、戊二醛浸泡等，均未能針對(duì)骨基質(zhì)較強(qiáng)的免疫排異原性 而設(shè)計(jì)相應(yīng)的去抗原措施。因此，目前以動(dòng)物骨為原料的人工骨修復(fù)材料，大 多存在著不可忽略的免疫排異原性而難以誘導(dǎo)宿主的骨組織生長(zhǎng)愈合，修復(fù)效 果欠佳的問(wèn)題，因而未被用戶接受。盡管許多研究者都聲稱自己處理過(guò)的動(dòng)物 骨是去抗原異種骨或無(wú)抗原異種骨，但是由于對(duì)免疫原性的本質(zhì)認(rèn)識(shí)不夠，未 能有針對(duì)性地去封閉或破壞抗原表位(又稱抗原決定簇)，誤以為簡(jiǎn)單的深冷或 戊二醛浸泡就可有效去除抗原。其實(shí)不然，根據(jù)對(duì)免疫反應(yīng)的分子生物學(xué)研究 及免疫化學(xué)的研究結(jié)果認(rèn)為，異種骨組織的免疫原性是由骨基質(zhì)中某些處于特 異敏感位置的活性基團(tuán)或特異構(gòu)象引起的，這些特異活性基團(tuán)或特異構(gòu)象被稱 為抗原表位或抗原決定簇。要有效去除其抗原性必須有針對(duì)性地設(shè)法封閉或破 壞抗原表位的結(jié)構(gòu)，而不能靠簡(jiǎn)單的冷凍、脫脂、戊二醛處理，也不能只靠脫 細(xì)胞，因?yàn)闊o(wú)細(xì)胞的結(jié)締組織，甚至提純的膠原都有一定的抗原性。
實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是針對(duì)以上所述人工骨材料存在的不足，提供一種以動(dòng) 物骨為原料，組成(含有機(jī)和無(wú)機(jī)組成)及結(jié)構(gòu)(包括微孔貫穿結(jié)構(gòu)的多維結(jié) 構(gòu))與天然骨相似，無(wú)抗原、無(wú)病毒、組織相容性好，可誘導(dǎo)受體骨組織生長(zhǎng) 愈合的生物型骨修復(fù)材料。
本實(shí)用新型的技術(shù)方案是這樣的生物型骨修復(fù)材料由動(dòng)物骨經(jīng)脫脂、脫 細(xì)胞、固定處理、多方位除抗原、朊病毒殺滅等步驟處理后形成生物型骨修復(fù) 材料基體，以及偶聯(lián)在基體表面的誘導(dǎo)活性修飾層組成。
所述的誘導(dǎo)活性修飾層是在基體上偶聯(lián)的可非特異性粘附生長(zhǎng)因子的多肽 活性表面層。
所述的誘導(dǎo)活性修飾層是在基體上偶聯(lián)的糖胺聚糖復(fù)合物活性表面層。 本實(shí)用新型的生物型骨修復(fù)材料是以動(dòng)物骨為原料，經(jīng)如下制作步驟制作而成-
A、 選取適用的動(dòng)物骨包括密質(zhì)骨和松質(zhì)骨等；
B、 預(yù)處理進(jìn)行消毒、除雜質(zhì)、機(jī)械切割成型等；
C、 脫脂用有機(jī)溶劑抽提動(dòng)物骨內(nèi)部的脂肪雜質(zhì)；
D、 脫細(xì)胞用表面活性劑或者蛋白酶脫除其中的細(xì)胞；
E、 固定處理:用環(huán)氧化物作為交聯(lián)固定劑將材料中的骨膠原進(jìn)行交聯(lián)固定;
F、 多方位除抗原多種試劑破壞或封閉抗原表位；
G、 朊病毒殺滅殺滅可能存在的朊病毒；
H、 誘導(dǎo)活性修飾將可粘附生長(zhǎng)因子及細(xì)胞的活性組分，引入生物骨表面;
I、 包裝；
J、 射線輻射滅菌； K、經(jīng)檢驗(yàn)后即得成品。
以上B步驟中，所述的消毒所用的消毒劑主要是通用的廣譜消毒劑，如苯 扎溴銨、洗必泰、疊氮化鈉等；
以上C步驟中，抽提動(dòng)物骨內(nèi)部的脂肪雜質(zhì)的有機(jī)溶劑可以是乙酸酯類、 氯仿、四氯化碳、乙醚、丙酮、無(wú)水乙醇等；
以上D步驟中，脫細(xì)胞是用表面活性劑洗脫法和在膠原保護(hù)劑的存在下酶 解法，兩者單獨(dú)應(yīng)用或兩者同時(shí)應(yīng)用來(lái)實(shí)現(xiàn)；表面活性劑可以是乙二胺四乙酸、 苯甲基氟磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonxlOO)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)， 酶解法所用的酶可以是胰蛋白酶和胃蛋白酶。
以上E步驟中，所述的環(huán)氧固定是指用環(huán)氧化物作為交聯(lián)固定劑將材料中
的骨膠原進(jìn)行交聯(lián)固定。這里環(huán)氧化物可以是碳鏈環(huán)氧化物 2 ，式中CH廣CH——(CH2)n—
R=H、 CH3 (CH2) n-或V ， n=0， 1， 2，…n ;也可以是碳氧鏈環(huán)
r—O—(CHR'—CH—0〗x—CH—ch2—ch—
氧化物 \< ，式中R=CnH2n+1-、V ， R， 二H、
CH3-(C2H5)n-， n二O、 1、 2…n， x=0、 1、 2…x。環(huán)氧交聯(lián)固定比傳統(tǒng)戊二醛交聯(lián) 固定的好處是.由于環(huán)氧基較活潑，交聯(lián)可進(jìn)行得很充分，且易通過(guò)交聯(lián)劑的 用量控制交聯(lián)度及相關(guān)性能，交聯(lián)產(chǎn)物較穩(wěn)定，不輕易降解，在細(xì)胞增殖、組 織生長(zhǎng)需要的驅(qū)動(dòng)下，由細(xì)胞分泌出激肽釋放酶協(xié)同膠原酶作用，才將其降解 吸收，呈被動(dòng)降解狀態(tài)，可使降解與組織生長(zhǎng)同步，且其降解產(chǎn)物無(wú)殘留毒性， ,織相容性好。
以上F步驟中，所述的多方位除抗原是指用多種試劑破壞或封閉抗原表位。 包括用親核試劑與引起抗原的特異活性基團(tuán)結(jié)合將其封閉，以及用強(qiáng)氫鍵試劑 改變引起抗原的特異構(gòu)象，其中膠原分子的構(gòu)象主要是由氫鍵形成引起的，這 里所述的活性基團(tuán)主要是-0H*， -NH/， -Sf等。所述的親核試劑可以是酰氨
R—C—Cl ，式中R=CnH2n+1- ， n=0， 1， 2…n;酰胺R_c—nh2 ，式中R=CnH2n+1-, n=0， 1， 2…n;酸酐r — c一o—c一r ，式中R=CnH2n+「， n = l l0;或環(huán)氧
R — CH—CH2 ，"H—(CH>—
化物 ，式中I^CnH2n+「 、 Y ， n=0， 1 10等，所述的
強(qiáng)氫鍵試劑主要是胍類化合物。
以上F步驟中，所述的朊病毒殺滅是殺滅可能存在的朊病毒，可以用IN氫
氧化鈉浸泡骨材料不少于1小時(shí)。
以上G步驟中，所述的誘導(dǎo)活性修飾是指將可粘附生長(zhǎng)因子及細(xì)胞的活性組
分，如某些特定多肽或糖胺聚糖的復(fù)合物引入制品表面(含微孔內(nèi)表面)，使植 入體內(nèi)后能粘附富集機(jī)體自我修復(fù)機(jī)制釋放的生長(zhǎng)因子和種子細(xì)胞，高效地誘
導(dǎo)骨組織生長(zhǎng)；.也可在體外先粘附BMP再植入，這里BMP為骨形態(tài)發(fā)生蛋白。這 里所述的特定多肽是一類可非特異性粘附生長(zhǎng)因子的多肽類物質(zhì)，多肽之一由 為含有16個(gè)賴氨酸(K)和甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、 脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)聚合成的多肽K (16) GRGDSPC;糖胺聚糖復(fù)合 物可以是透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、肝素、乙酰肝素等的復(fù)合物。 引入的方法，可以是偶聯(lián)劑偶聯(lián)方式，也可以化學(xué)吸附。偶聯(lián)劑主要是一些易 與-NH2， -OH， -SH基團(tuán)的活潑氫起反應(yīng)的雙官能團(tuán)物質(zhì)，例如可以是二酰二胺、 二酰二氯、二酸內(nèi)酐、雙環(huán)氧化物、碳化二亞胺等。
上述的主要制備步驟C、 D、 E、 F、 G、 H中，均同時(shí)應(yīng)用了高滲透技術(shù)，在 高滲透反應(yīng)器中進(jìn)行。所謂高滲透技術(shù)就是一個(gè)超聲振蕩與真空脈沖連動(dòng)的高 滲透反應(yīng)器，通過(guò)超聲振蕩及真空脈沖可有效地將骨材料微孔中的氣體及顆粒 雜質(zhì)排出，使相應(yīng)的試劑能滲入微孔深處起作用，確保內(nèi)外作用完全。
制得的產(chǎn)品包裝后，用不小于25KGy的鈷一60廠射線輻照滅菌，可有效殺 滅除朊病毒之外其他已知?jiǎng)游镌葱圆《尽＿@樣，便制得組成及結(jié)構(gòu)與天然骨相 似的，無(wú)菌，無(wú)病毒，不會(huì)引起免疫排異反應(yīng)，生物相容性好，可以誘導(dǎo)骨組 織再生的新型人工骨材料。
本實(shí)用新型的生物型骨修復(fù)材料可根據(jù)需要制成多種人工骨(即骨替代 體)，包括人工肋骨，指骨，胸骨，顱骨等，也可制成骨螺釘，骨板，髓內(nèi)針， 脊椎融合器等骨固定器件，還可制成骨粒，骨塊，骨條等骨填充材料，應(yīng)用于 骨科治療中。
本實(shí)用新型的生物型骨修復(fù)材料的優(yōu)點(diǎn)是直接以動(dòng)物全骨為原料，通過(guò) 環(huán)氧固定、多方位除抗原及誘導(dǎo)活性修飾等先進(jìn)技術(shù)處理，并應(yīng)用了高滲透工 藝，制得了有效去除免疫原性，又保留了含眾多活性組分的骨質(zhì)基，具有骨誘 導(dǎo)活性的新型人工骨材料，在有機(jī)、無(wú)機(jī)組成及多維結(jié)構(gòu)上都與人體骨更接近，
能更好地誘導(dǎo)骨組織再生。并且同時(shí)應(yīng)用NaOH殺滅朊病毒及應(yīng)用Y-射線輻照 殺滅己知病毒，使應(yīng)用更安全。對(duì)比去有機(jī)質(zhì)(脫蛋白)動(dòng)物骨，本實(shí)用新型 的人工骨在組織相容性、力學(xué)性能上都更勝一籌。對(duì)比未經(jīng)專門除抗原處理和 環(huán)氧固定處理，以及滅朊病毒處理，只作簡(jiǎn)單的酒精浸泡、脫脂、戊二醛固定、 Y-射線滅菌的動(dòng)物骨，本實(shí)用新型的人工骨在組織相容性及安全性、去免疫原 性、骨誘導(dǎo)性方面更勝一籌。

圖1為本實(shí)用新型生物型骨修復(fù)材料制成人工骨肋骨的剖面結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本實(shí)用新型生物型骨修復(fù)材料制成骨螺釘示意圖； 圖3為本實(shí)用新型生物型骨修復(fù)材料制成脊椎融合器的示意圖。
具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。 生物型骨修復(fù)材料，如圖1所示，由動(dòng)物骨經(jīng)脫脂、脫細(xì)胞、固定處理、 多方位除抗原、.朊病毒殺滅后形成的生物型骨材料基體1，以及偶聯(lián)在基體表 面的誘導(dǎo)活性修飾層2組成。誘導(dǎo)活性修飾層可以是在基體上偶聯(lián)的可非特異 性粘附生長(zhǎng)因子的多肽活性表面層；所述的多肽可以是由16個(gè)賴氨酸(K)和 甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)、半胱氨
酸(C)聚合成的多肽K (16) GRGDSPC。也可以是在基體上偶聯(lián)的糖胺聚糖復(fù) 合物活性表面層。本實(shí)用新型的生物型骨修復(fù)材料可根據(jù)需要制成多種人工骨 (又稱骨替代體)，包括人工肋骨、指骨、胸骨、顱骨等；也可制成骨板、髓內(nèi) 針、骨螺釘、脊椎融合器等骨固定器件，還可制成骨粒、骨條、骨塊、骨填充 料等。(見圖1、圖2、圖3)
以下為生物型骨修復(fù)材料的具體制作工藝的實(shí)施例。 實(shí)施例l
生物型骨修復(fù)材料是以動(dòng)物骨為原料，經(jīng)如下制作步驟制作而成
A、 選取動(dòng)物骨；
B、 預(yù)處理用0. 1%苯扎溴銨消毒30分鐘，洗凈后用專用工具，如刮骨刀 等，削除肌肉組織及骨膜，洗干凈；
C、 脫脂在高滲透反應(yīng)器內(nèi)用乙酸酯浸提其中脂肪，然后洗凈；
D、 脫細(xì)胞在高滲透反應(yīng)器中用表面活性劑脫細(xì)胞，然后洗凈；
R —CH—CH，
E、 固定處理在高滲透反應(yīng)器中用環(huán)氧化試劑 / 進(jìn)行固定處理，
CH廣CH—(CH2)n—
然后洗凈，式中R《nH2n+廠、V , n=0， 1， 2…n;
F、 多方位除抗原在高滲透反應(yīng)器中用酰氯親核試劑B — C一d封閉引起
抗原的活性基團(tuán)，然后洗凈，式中R《nH2n+廠，n=0， 1， 2…n;
G、 朊病毒殺滅在高滲透反應(yīng)器中用1N氫氧化鈉浸泡不少于60分鐘，洗
凈；
H、 誘導(dǎo)活性修飾在高滲透反應(yīng)器中用偶聯(lián)劑碳化二亞胺(R_N=C=N-R，) 將非特異性粘附生長(zhǎng)因子的多肽K (16) GRGDSPC偶聯(lián)到制品中，洗凈；I、包裝用滅菌生理鹽水作保存液濕態(tài)包裝；
J、 y-射線輻射滅菌用鈷60 Y-射線滅菌，y-射線劑量不低于25Kgy; K、經(jīng)檢驗(yàn)后即得成品。 實(shí)施例2
F、多方位除抗原在高滲透反應(yīng)器中用酰胺親核試劑<formula>formula see original document page 10</formula>封閉引起 抗原的活性基團(tuán)，然后洗凈，式中R二CJ^+廣，n=0， 1， 2…n;
H、誘導(dǎo)活性修飾在高滲透反應(yīng)器中用偶聯(lián)劑二酸內(nèi)酐將多肽K (16) GRGDSPC偶聯(lián)到制品中；
其余步驟類似，不再累贅。 實(shí)施例3
B、預(yù)處理用0. P/。過(guò)氧乙酸消毒30分鐘，洗凈后用削除肌肉組織及骨膜， 洗干凈；
R—0—(CHR'—CH—?！穢—CH—OHt
E、 固定處理在高滲透反應(yīng)器中用環(huán)氧化試劑 <formula>formula see original document page 10</formula> ，
進(jìn)行固定處理，然后洗凈，式中R=CnH2n+1-、 <formula>formula see original document page 10</formula> ， R' =H、 CH3-(C2H5)n-， n=0、 1、 2…n， x二O、 1、 2…x;
R — CH—CH，
F、 多方位除抗原在高滲透反應(yīng)器中用環(huán)氧化物 <formula>formula see original document page 10</formula>和胍類化合
物封閉引起抗原的活性基團(tuán)，然后洗凈，式中1 =(^211+1- 、<formula>formula see original document page 10</formula> ，n=0，
1 10;
H、誘導(dǎo)活性修飾在高滲透反應(yīng)器中用偶聯(lián)劑二酰二氯將多肽K (16) GRGDSPC偶聯(lián)到制品中；
其余步驟類似，不再累贅。本實(shí)用新型生物型骨修復(fù)材料的制備方法中，專門設(shè)計(jì)了應(yīng)用多種活潑試
劑從多方面封閉及破壞抗原表位的多方位除抗原技術(shù)，此外，還設(shè)計(jì)了用25KGy
以上的Y-射線輻射殺滅動(dòng)物原性病毒，以及增加成骨誘導(dǎo)活性的表面活性修飾 步驟。另外還考慮到骨基質(zhì)主要存在骨的微孔中，為使各步反應(yīng)的試劑能深入 微孔內(nèi)與骨基質(zhì)作用，專門設(shè)計(jì)了一套超聲振蕩加真空脈沖的高滲透反應(yīng)器， 確保反應(yīng)試劑能滲入微孔深處與骨基質(zhì)起反應(yīng)，確保作用更充分更有效。使得 本實(shí)用新型的生物型骨修復(fù)材料在組織相容性、成骨誘導(dǎo)活性、實(shí)用性方面都 比現(xiàn)有的，以動(dòng)物骨為原料的制品優(yōu)越。
權(quán)利要求1、生物型骨修復(fù)材料，其特征在于由生物型骨修復(fù)材料基體，以及偶聯(lián)在基體表面的誘導(dǎo)活性修飾層組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物型骨修復(fù)材料，其特征在于所述的誘導(dǎo)活 性修飾層是在基體上偶聯(lián)的可非特異性粘附生長(zhǎng)因子的多肽活性表面肽層。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物型骨修復(fù)材料，其特征在于所述的誘導(dǎo)活 性修飾層是在基體上偶聯(lián)的糖胺聚糖復(fù)合物活性表面層。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種生物型骨修復(fù)材料，由動(dòng)物骨經(jīng)脫脂、脫細(xì)胞、固定處理、多方位除抗原、朊病毒殺滅等步驟后形成的生物型骨材料基體，以及偶聯(lián)在基體表面的誘導(dǎo)活性修飾層組成；誘導(dǎo)活性修飾層可以是在基體上偶聯(lián)的可非特異性粘附生長(zhǎng)因子的多肽活性表面層；也可以是在基體上偶聯(lián)的糖胺聚糖復(fù)合物活性表面層。本實(shí)用新型生物型骨修復(fù)材料有效的去除了免疫原性，又保留了含眾多活性組分的骨質(zhì)基，具有骨誘導(dǎo)活性，在有機(jī)、無(wú)機(jī)組成及多維結(jié)構(gòu)上都與人體骨更接近，能更好地誘導(dǎo)骨組織再生，并且應(yīng)用更安全，組織相容性、力學(xué)性能優(yōu)良。
文檔編號(hào)A61L27/36GK201182778SQ200720059688
公開日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者斌 徐, 徐國(guó)風(fēng) 申請(qǐng)人:廣州知光生物科技有限公司