專(zhuān)利名稱(chēng)：用于免疫疾病的預(yù)防或治療劑以及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于免疫疾病如變應(yīng)性疾病或自身免疫病的預(yù)防或治
療劑，用于免疫疾病的預(yù)防或治療方法以及柳杉(Cedar)花粉抗原融 合蛋白。
背景技術(shù)：
十分期望利用免疫抑制機(jī)制開(kāi)發(fā)能從根本上治療由免疫應(yīng)答異常 導(dǎo)致的免疫疾病包括自身免疫病和變應(yīng)性疾病的方法，因?yàn)檫@些疾病的 許多現(xiàn)有治療方法均為對(duì)癥治療。作為免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中涉及的主要細(xì)胞 群，NKT細(xì)胞、可誘導(dǎo)耐受的樹(shù)突細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞均已報(bào)道過(guò)。 因此，i人為通過(guò)這些免疫細(xì)胞利用免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的方法是能從根本上治 療免疫疾病的方法。
以下報(bào)道作為利用免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的方法是可行的，它們可以引領(lǐng)免 疫疾病的治療。
專(zhuān)利文件1公開(kāi)了將OVA (卵清蛋白)蛋白封裝在包括a-GalCer (a-半乳糖神經(jīng)酰胺)的脂質(zhì)體腔中的方法以及上述脂質(zhì)體對(duì)小鼠中抗 體產(chǎn)生的抑制效應(yīng)。
非專(zhuān)利文獻(xiàn)1中描述了當(dāng)小鼠骨髄細(xì)胞在IL-10存在下進(jìn)行體外培 養(yǎng)時(shí)，CD45RB * CDllc低細(xì)胞增殖，還描述了脾中存在CD45RB高CDllc 低細(xì)胞，可以在小鼠中體外和體內(nèi)地由幼稚CD4 + T細(xì)胞分化和增殖調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞。
非專(zhuān)利文獻(xiàn)2中描述了由小鼠骨髓細(xì)胞人工產(chǎn)生調(diào)節(jié)性樹(shù)突細(xì)胞的 方法。
非專(zhuān)利文獻(xiàn)3中描述了小鼠脾中的低密度B220陽(yáng)性B細(xì)胞具有通 過(guò)用細(xì)菌進(jìn)行刺激而產(chǎn)生IL-IO的能力。
非專(zhuān)利文獻(xiàn)4中描述了，對(duì)小鼠脾臟中的低密度B細(xì)胞施用a-GalCer不能增強(qiáng)NKT細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的能力，并且它們抑制DC激 活的NKT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y和IL-4的能力。
然而，尚未開(kāi)發(fā)出選擇性增強(qiáng)NKT細(xì)胞多種功能中免疫抑制功能 的方法以及在體內(nèi)有效地誘導(dǎo)抗原特異性免疫抑制的方法。
專(zhuān)利文件1:國(guó)際公開(kāi)WO005/120574冊(cè)
非專(zhuān)利文獻(xiàn)1: Wakkach等，Immunity 18: 605-617 (2003)
非專(zhuān)利文獻(xiàn)2: Sato等，Immunity 18: 367-379 (2003)
非專(zhuān)利文獻(xiàn)3: Burke等，The Journal of Immunology 173: 2362-2372 (2004)
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 4 : Bezbradica 等，The Journal of Immunology 174:4696-4705 (2005)

發(fā)明內(nèi)容
待通過(guò)本發(fā)明解決的問(wèn)題
因此，本發(fā)明的目的為提供在NKT細(xì)胞的多種功能中選擇性提高 免疫抑制功能的方法和在體內(nèi)有效誘導(dǎo)抗原特異性免疫抑制的方法，以 及通過(guò)應(yīng)用該方法獲得的藥物。
解決問(wèn)題的手段
作為廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榘珻Dld配體和天 然或重組變應(yīng)原的藥物遞送栽體特異性抑制所述變應(yīng)原引起的IgE產(chǎn) 生，因此可以利用這些藥物遞送栽體特異性治療該變應(yīng)原導(dǎo)致的變應(yīng)性 疾病。另外，由于這些發(fā)現(xiàn)，他們?cè)O(shè)想利用以自身抗原代替變應(yīng)原的藥 物遞送載體類(lèi)似地特異性治療自身抗原引起的自身免疫病，因此完成了 本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供下列發(fā)明等。上述[1的藥劑，其中所述靶抗原為變應(yīng)原，所述免疫疾病為該 變應(yīng)原引起的變應(yīng)性疾病。的藥劑，其中所述藥物遞送載體為脂質(zhì)體。上述[1的藥劑，其中所述CDld配體為a-GalCer。的藥劑，其中將所述CDld配體嵌入脂質(zhì)體膜中，并將 所述變應(yīng)原封裝在脂質(zhì)體腔內(nèi)。
9上述1的藥劑，其中所述靶抗原是自身抗原。
10包含柳杉花粉抗原、Cryjl蛋白和Cryj2蛋白的融合蛋白。
11上述[10]的融合蛋白，其中Cryjl蛋白為Cryjl成熟蛋白，Cryj2 蛋白為Cryj2成熟蛋白。
12]上述10]的融合蛋白，其中Cryjl蛋白和Cryj2蛋白直接連接 或通過(guò)肽接頭連接。
13上述[10的融合蛋白，其中Cryjl蛋白位于其N(xiāo)端一側(cè)，Cryj2 成熟蛋白位于其C端一側(cè)。 至[9中任一項(xiàng)用于該免疫疾病的預(yù)防或治療劑。
15上述14的用于預(yù)防和治療免疫疾病的方法，其中所述受試者 為患有免疫疾病的人患者。


圖1顯示來(lái)自施用了 a-GalCer或a-GC ( a-GalCer )-脂質(zhì)體的小鼠 脾臟的樹(shù)突細(xì)胞(DC )和B細(xì)胞中IFN-y、 IL-4和IL-10的產(chǎn)生。"ND，， 未檢測(cè)到。
圖2A顯示通過(guò)流式細(xì)胞儀分析低密度(LD )B細(xì)胞和高密度(HD ) B細(xì)胞。
圖2B顯示通過(guò)將低密度(LD ) B細(xì)胞或高密度(HD) B細(xì)胞與全 脾細(xì)胞共培養(yǎng)而在培養(yǎng)基中分泌的IL-10的量。
圖3顯示用aGC-脂質(zhì)體脈沖處理的邊緣區(qū)B細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的IL-10產(chǎn) 生。"ND":未檢測(cè)到。
圖4顯示小鼠血中特異性針對(duì)抗Cryjl的IgE濃度，所述小鼠以天 然類(lèi)型Cryjl致敏，并施用aGC-天然類(lèi)型Cryjl-脂質(zhì)體、aGC-脂質(zhì)體 或單獨(dú)的脂質(zhì)體。
圖5顯示Cryjl/2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:8 )。在SEQ ID NO:8展示的核苷酸序列中，由第l至第57位核苷酸殘基(帶下劃線(xiàn)的) 組成的核苷酸序列為來(lái)自pET47b載體的His標(biāo)記區(qū)核芬酸序列；由第 58至第1119位核苷酸殘基組成的核苷酸序列為編碼Cryjl成熟蛋白氨 基酸序列(該氨基酸序列SEQ ID NO:IO由登記為GenBank登錄號(hào) BAA07020的氨基酸序列中第21至第374位氨基酸殘基組成)的核苦 酸序列；由第1120至2283位核苷酸殘基組成的核苷酸序列為編碼Cryj2 成熟蛋白氨基酸序列(該氨基酸序列SEQ ID NO:ll由登記為GenBank 登錄號(hào)P43212的氨基酸序列中第46至第433位氨基酸殘基組成)的核 苷酸序列。
圖6顯示Cryjl/2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:9 )。在SEQ ID NO:9展示的氨基酸序列中，由第1至第19位氨基酸殘基組成的氨基酸 序列(帶下劃線(xiàn)的)為來(lái)自pET47b載體的His標(biāo)記區(qū)氨基酸序列；由 第20至第373位氨基酸殘基組成的氨基酸序列為Cryjl成熟蛋白(該 氨基酸序列SEQ ID NO:10由登記為GenBank登錄號(hào)BAA07020的氨 基酸序列中第21個(gè)至第374位氨基酸殘基組成)的氨基酸序列；由第374至第761位氨基酸殘基組成的氨基酸序列為Cryj2成熟蛋白(該氨 基酸序列SEQ ID NO:ll由登記為GenBank登錄號(hào)P43212的氨基酸序 列中第46至第433位氨基酸殘基組成)的氨基酸序列。
圖7顯示小鼠血清中特異性針對(duì)天然類(lèi)型Cryjl的IgE抗體效價(jià)， 所述小鼠用天然類(lèi)型Cryjl蛋白或recCryjl/2蛋白進(jìn)行過(guò)免疫。*:等 于或低于檢測(cè)限度。
圖8顯示小鼠血清中特異性針對(duì)recCryjl/2的IgE抗體效價(jià)，所述 小鼠用天然類(lèi)型Cryjl蛋白或recCryjl/2蛋白進(jìn)行過(guò)免疫。
圖9顯示小鼠血清中特異性針對(duì)天然類(lèi)型Cryjl的IgG抗體效價(jià)， 所述小鼠用天然類(lèi)型Cryjl蛋白或recCryjl/2蛋白進(jìn)行過(guò)免疫。
圖10顯示用天然類(lèi)型Cryjl進(jìn)行過(guò)免疫的小鼠的血清中，利用 recCryjl/2蛋白抑制特異性針對(duì)天然類(lèi)型Cryjl的IgE抗體效價(jià)的提 高。
圖11顯示用天然類(lèi)型Cryjl致敏并施用aGC-重組Cryjl/2融合蛋 白-脂質(zhì)體、aGC-脂質(zhì)體或鹽水的小鼠的血中抗Cryjl IgE的濃度。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于克疫疾病的預(yù)防或治療劑，其 包含含有CDld配體和靶抗原并具有腔的藥物遞送載體(在下文中必要 時(shí)稱(chēng)為藥物遞送栽體、具有腔的藥物遞送栽體、包含CDld配體的藥物 遞送栽體或者包含靶抗體的藥物遞送栽體)。
本發(fā)明使用的藥物遞送載體無(wú)特別限制，只要它能將藥物遞送至動(dòng) 物并且具有腔即可，包括如脂質(zhì)體和微球。
脂質(zhì)體指通過(guò)封閉微團(tuán)(通過(guò)聚集具有親水區(qū)和疏水區(qū)的兩性分子 而獲得的水溶性顆粒)而獲得的小泡結(jié)構(gòu)。當(dāng)本發(fā)明的藥物包含脂質(zhì)體 作為藥物遞送載體時(shí)，可將CDld配體嵌入脂質(zhì)體膜，并將變應(yīng)原封裝 在脂質(zhì)體腔內(nèi)。使用脂質(zhì)體作為藥物遞送載體時(shí)，可以通過(guò)國(guó)際公開(kāi)WO2005/120574中所述方法產(chǎn)生這些脂質(zhì)體。詳細(xì)地i兌，可以按照 PCT/JP 2005/10254所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將組成脂質(zhì)體的脂質(zhì)與包含 CDld配體的有機(jī)溶劑溶液混合、接著干燥、然后在其中加入水并進(jìn)行 超聲處理而獲得包含CDld配體如a-GalCer的脂質(zhì)體?？梢酝ㄟ^(guò)將組 成脂質(zhì)體的脂質(zhì)與包含CDld配體的有機(jī)溶劑溶液混合、接著干燥、然 后在其中加入靶抗原水溶液并進(jìn)行超聲處理而獲得封裝了耙抗原的脂 質(zhì)體。
微球指使用可體內(nèi)降解的聚合物作為基質(zhì)的細(xì)小的球形物質(zhì)。微球 包括如多孔型微球和膠嚢型微球。
CDld配體指表達(dá)CDld的抗原呈遞細(xì)胞(APC)上呈遞的并因而 能夠活化NKT細(xì)胞的物質(zhì)。CDld配體包括如體內(nèi)存在的a-GalCer及 其衍生物以及IGb3 (isoglobo-糖鞘脂)，優(yōu)選a-GalCer。
靶抗原無(wú)特別限制，只要期望在體內(nèi)抑制針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答即 可。靶抗原可以是天然抗原、重組蛋白或化學(xué)合成的化合物，并包括如 變應(yīng)原、自身抗原和移植異型抗原。下文將對(duì)應(yīng)用于變應(yīng)性疾病和自身 免疫病情況的本發(fā)明藥物進(jìn)行詳細(xì)描述。
變應(yīng)性疾病的應(yīng)用l
變應(yīng)原無(wú)特別限制，只要它是暴露、攝取或應(yīng)用于體內(nèi)時(shí)能夠引起 變態(tài)反應(yīng)的因素即可。這樣的變應(yīng)原包括如包含在以下物質(zhì)中能引起變 態(tài)反應(yīng)的因素花粉(如柳杉、日本扁柏(Japanese Cypress )、豚草屬、 稻、樺木屬、鴨茅和艾菊的)、食品(如牛奶、蕎麥面條、蛋類(lèi)、花生、 小麥、大豆、魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)、水果或其加工食品)、非人類(lèi)生物或其來(lái)源 的材料(如螨、真菌、動(dòng)物或禽類(lèi)的體毛、蜂毒)、化學(xué)品(如基于阿 司匹林的抗生素、磺胺類(lèi)藥物、巴比妥酸鹽衍生物)、醫(yī)療裝備(如天 然橡膠手套)、生活用品(如金屬飾品)、其它物質(zhì)或組合物(如膠乳)。
在包含含有變應(yīng)原作為靶抗原的藥物遞送載體時(shí)，本發(fā)明的藥物可 用作特異性針對(duì)該變應(yīng)原引起的變應(yīng)性疾病的治療劑。本發(fā)明人已發(fā) 現(xiàn)，由于包含CDld配體和變應(yīng)原的該藥物遞送載體特異性抑制由該變 應(yīng)原引起的IgE產(chǎn)生，因此可以使用這樣的藥物遞送載體特異性治療由該變應(yīng)原引起的變應(yīng)性疾病。能使用本發(fā)明的藥物遞送載體進(jìn)行特異性 治療的變應(yīng)性疾病包括如特應(yīng)性支氣管哞喘、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎 (如花粉癥)、變應(yīng)性結(jié)膜炎、食物過(guò)敏和藥物過(guò)敏，
變應(yīng)原的優(yōu)選實(shí)例可為柳杉花粉抗原(例如蛋白質(zhì)如Cryjl和 Cryj2)。柳杉花粉抗原的重組融合蛋白質(zhì)也優(yōu)選作為變應(yīng)原。這些融合 蛋白包括如Cryjl蛋白和Cryj2蛋白的融合蛋白(下文在需要時(shí)稱(chēng)為"融 合蛋白")。
Cryjl成熟蛋白是通過(guò)至少部分地移除位于Cryjl基因表達(dá)的多肽 內(nèi)N端側(cè)的信號(hào)區(qū)而獲得的多肽。例如，參考GenBank登錄號(hào) BAA07020，由374個(gè)氨基酸殘基組成的多肽已登記為Cryjl蛋白。在 登記為BAA07020的由374個(gè)氨基酸殘基組成的多肽中，Cryjl成熟蛋 白對(duì)應(yīng)于由第22至第374位氨基酸殘基組成的多肽。在登記為 BAA07020的由374個(gè)氨基酸殘基組成的多肽中，由第1至第21位氨 基酸殘基組成的區(qū)域?yàn)樾盘?hào)區(qū)。
Cryjl成熟蛋白可以是天然Cryjl成熟蛋白或者突變蛋白，所述突 變蛋白在天然Cryjl成熟蛋白中具有一個(gè)或多個(gè)(如1至10個(gè)、優(yōu)選1 至7個(gè)、更優(yōu)選1至5個(gè)、最優(yōu)選l、 2或3個(gè))修飾(例如，替換、 添加、插入、缺失)或與天然Cryjl成熟蛋白的氨基酸序列具有至少約 95%、優(yōu)選約97%、更優(yōu)選約98%、最優(yōu)選約99%的氨基酸序列同一 性，并且保留天然Cryjl成熟蛋白中的表位。天然Cryjl成熟蛋白包括 登記為BAA07020的由374個(gè)氨基酸殘基組成的多肽+由第22至第374 位氨基酸殘基組成的多肽及其天然存在的同種型(參閱如GenBank登 錄號(hào)D34639、 D26544、 D26545、 AB081309和AB081310 )。所述突變 蛋白可以是經(jīng)修飾而保留Cryjl成熟蛋白中一個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選所 有表位(例如T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位)的蛋白質(zhì)。
Cryj2成熟蛋白是由分別移除位于成熟蛋白編碼區(qū)N端側(cè)的信號(hào)區(qū) 以及位于N端和C端的兩個(gè)pro區(qū)而獲得的多肽。例如，參考GenBank 登錄號(hào)P43212，由514個(gè)氨基酸殘基組成的多肽已登記為Cryj2蛋白。 在登記為GenBank登錄號(hào)P43212的由514個(gè)氨基酸殘基組成的多肽 中，Cryj2成熟蛋白對(duì)應(yīng)于由第46至第433位氨基酸殘基組成的多肽。 在登記為P43212的由514個(gè)氨基酸殘基組成的多肽中，由第1至第22位氨基酸殘基組成的區(qū)域?yàn)樾盘?hào)區(qū)，由第23至第45位氨基酸殘基以及 由第434至第514位氨基酸殘基組成的區(qū)域?yàn)閜ro區(qū)。
Cryj2成熟蛋白可以是天然Cryj2成熟蛋白或者突變蛋白，該突變 蛋白在天然Cryj2成熟蛋白中具有一個(gè)或多個(gè)(如1至10個(gè)、優(yōu)選1 至7個(gè)、更優(yōu)選1至5個(gè)、最優(yōu)選l、 2或3個(gè))修飾(例如，替換、 添加、插入、缺失)或與天然Cryj2成熟蛋白的氨基酸序列具有至少約 95%、優(yōu)選約97%、更優(yōu)選約98%、最優(yōu)選約99。/。的氨基酸序列同一 性，并且保留天然Cryj2成熟蛋白中的表位。天然Cryj2成熟蛋白包括 登記為P43212的由514個(gè)氨基酸殘基組成的多肽中由i 46至第433位 氨基酸殘基組成的多肽及其天然存在的同種型(參閱如GenBank登錄 號(hào)D37765、 D29772、 E10716、 AB081403、 AB081404和AB081405 )。 所述突變蛋白可以是經(jīng)修飾而保留Cryj2成熟蛋白中一個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)、 優(yōu)選所有表位(例如T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位)的蛋白質(zhì)。
可以以默認(rèn)設(shè)置使用普遍用于本領(lǐng)域的程序(如，BLAST, FASTA) 測(cè)定氨基酸序列同一性(％ )。同一性(％ )也可以使用公知的任選算 法測(cè)定，例如Needleman等，(1970)( J. Mol. Biol" 48: 444-453 )，或Myers 和Miller (CABIOS， 1998， 4: 11-17)的算法。Needleman等的算法整合 在GCG軟件包中的GAP程序(可在www.gcg.com得到)中，同一性 (% )也可以使用如BLOSUM62矩陣或PAM250矩陣中的任一種以及 缺口權(quán)重16、 14、 12、 10、 8、 6或4和長(zhǎng)度權(quán)重1、 2、 3、 4、 5或 6來(lái)測(cè)定。Myers和Miller算法整合在ALIGN程序中，該程序是GCG 序列比對(duì)軟件包的一部分。例如，當(dāng)使用ALIGN程序比較氨基酸序列 時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長(zhǎng)度罰分12,缺口罰分4。氨 基酸序列同一性可以通過(guò)上述任一方法來(lái)測(cè)定，在計(jì)算時(shí)可以使用顯示 最低值的方法。
在融合蛋白中，Cryjl成熟蛋白可以位于N端一側(cè)，Cryj2成熟蛋 白可以位于C端一側(cè)；或者Cryjl成熟蛋白可以位于C端一側(cè)，Cryj2 成熟蛋白可以位于N端一側(cè)。融合蛋白可以在Cryjl成熟蛋白和Cryj2 成熟蛋白之間含有或不含有肽接頭。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用本領(lǐng)域的 技術(shù)常識(shí)適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)肽接頭。例如，肽接頭的長(zhǎng)度可以為約30個(gè)或更 少、優(yōu)選約25個(gè)或更少、更優(yōu)選約20個(gè)或更少、更優(yōu)選約15個(gè)或更少、最優(yōu)選約10個(gè)或5個(gè)或更少的氨基酸殘基。
在融合蛋白中，可以向N端或C端加入或在兩者中同時(shí)加入其他肽 部分。這些肽部分無(wú)特別限制，只要將其加入融合蛋白時(shí)保留該融合蛋 白的特性即可。這些肽部分包括，例如，用于純化的標(biāo)簽(如組氨酸(His ) 標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽)。這些肽部分的長(zhǎng)度可以為約30個(gè)或更 少、優(yōu)選約25個(gè)或更少、更優(yōu)選約20個(gè)或更少的氨基酸殘基。
融合蛋白可以是可溶性蛋白。當(dāng)融合蛋白是在可溶性級(jí)分中獲得的 可溶性蛋白時(shí)，該融合蛋白具有可通過(guò)一般純化方法如柱層析進(jìn)行高純 度純化和易于修飾的優(yōu)點(diǎn)。即使融合蛋白在不溶性級(jí)分中獲得，它也可 以通過(guò)增溶處理而以可溶性蛋白而獲得，從而具有上述優(yōu)點(diǎn)。
過(guò)敏反應(yīng)是由信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)而引起的，所述信號(hào)由變應(yīng)原與結(jié)合 在肥大細(xì)胞表面的IgE抗體結(jié)合而產(chǎn)生。融合蛋白不僅不誘導(dǎo)產(chǎn)生特異 性針對(duì)柳杉花粉抗原(如天然類(lèi)型Cryjl)的IgE抗體，而且能利用柳 杉花粉抗原抑制產(chǎn)生特異性針對(duì)柳杉花粉抗原的IgE抗體。同時(shí)，融合 蛋白可以擁有Cryjl成熟蛋白和Cryj2成熟蛋白中的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選 所有)T細(xì)胞表位，因此，融合蛋白具有以下優(yōu)勢(shì)融合蛋白可以是不 能導(dǎo)致過(guò)敏性反應(yīng)的安全的變應(yīng)原，有可能充分地誘導(dǎo)特異性針對(duì)柳杉 花粉抗原的免疫(如細(xì)胞免疫、體液免疫如IgG),能夠抑制由柳杉花 粉引起的過(guò)敏反應(yīng)程度，并且可以覆蓋所有柳杉花粉癥患者的T細(xì)胞抗 原表位，因?yàn)樵撊诤系鞍撞荒芘c特異性針對(duì)天然類(lèi)型Cryjl或Cryj2的 IgE抗體結(jié)合。(銨鹽)(PEG-PE; Avanti Polar Lipids )溶于250 氯仿/甲醇(1:1)溶劑中。另將0.16 mg a-半乳糖 神經(jīng)酖胺(由RIKEN Research Center for Allergy and immunology制 得)溶于250 nL氯仿/甲醇(1:1)溶劑中。隨后，將兩者混合并在蒸發(fā) 器中干燥，在干燥器中真空干燥過(guò)夜。然后，加入200 nL含有濃度為 0.4 mg/mL的recCryjl/2蛋白的水溶液(實(shí)施例7 )。將混合物用超聲粉 碎機(jī)處理10分鐘，并通過(guò)0.22 nm孔徑的膜以除菌。隨后，在裝入了 100 nm孔徑聚碳酸酯膜的LiposoFast-Basic擠壓機(jī)(Avestin Inc.)中通 過(guò)25次來(lái)分選顆粒。通過(guò)以下步驟除去未封裝進(jìn)脂質(zhì)體的recCryjl/2 蛋白4吏用Amicon Ultra-4離心濾器(PL-100 ) (Millipore)濃縮封裝 了 recCryjl/2的脂質(zhì)體，用純凈水洗滌并用純凈水最終調(diào)整為800 水溶液。利用SDS電泳分析含有封裝了 recCryjl/2的脂質(zhì)體(aGC-recCryjl/2脂質(zhì)體)的水溶液。結(jié)果鑒定出recCryjl/2蛋白的 濃度為25嗎/mL。假設(shè)所有的a-GalCer均已摻入脂質(zhì)體膜中，則 Lipo-aGC + Cryjl溶液中a-GalCer的終濃度為200 pg/mL。實(shí)施例10:通過(guò)施用含有a-半乳糖神經(jīng)酰胺和recCryjl/2 (重組融合蛋 白)的脂質(zhì)體抑制體內(nèi)三級(jí)IgE抗體的產(chǎn)生對(duì)用天然類(lèi)型Cryjl ( 0.5 pg/小鼠，Seikagaku Kogyo Co" Ltd.)和 氫氧化鋁凝膠(2 mg/小鼠)致敏兩次、其后用天然類(lèi)型Cryjl (1 pg/ 小鼠，Seikagaku Kogyo Co" Ltd.)加強(qiáng)免疫的BDF1小鼠，在致敏后 第105、 112和119天腹膜內(nèi)施用aGC-recCryjl/2-脂質(zhì)體(aGC: 2 ng， recCryjl/2: 0.5 [ig/小鼠)、aGC-脂質(zhì)體(aGC: 2嗎/小鼠)或單獨(dú)的脂 質(zhì)體三次。在第126天時(shí)，用天然類(lèi)型Cryjl (lpg/小鼠)進(jìn)行第二次 加強(qiáng)免疫。在致敏前以及致敏后第14、 28、 56、 98、 126、 140和160 天時(shí)收集血樣。通過(guò)ELISA測(cè)量血清中抗Cryjl IgE抗體的水平。結(jié)果， 與僅施用脂質(zhì)體的陰性對(duì)照相比，在施用aGC-脂質(zhì)體或 aGC-recCryjl/2-脂質(zhì)體的組中，施用后血液中IgE抗體效價(jià)明顯降低，并且在第二次加強(qiáng)免疫后三級(jí)IgE抗體產(chǎn)生的提高也被抑制(施用 aGC-recCryjl/2-脂質(zhì)體的組中的抑制效果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性)(圖11 )。 根據(jù)以上的結(jié)果提出，可以預(yù)期aGC-脂質(zhì)體在過(guò)敏發(fā)生后對(duì)于降低高 IgE抗體效價(jià)具有治療效果，并且該效果可以通過(guò)在脂質(zhì)體中封裝無(wú)變 應(yīng)原特性的抗原而進(jìn)一步增強(qiáng)。工業(yè)適用性本發(fā)明的藥劑可用于特異性治療由靶抗原引起的疾病，所述藥劑含 有包括CDld配體和靶抗原(例如變應(yīng)原、自身抗原)并具有腔的藥物 遞送載體。本發(fā)明的藥劑可包含柳杉花粉抗原的融合蛋白?？梢园诒景l(fā)明 藥劑中的融合蛋白具有很好的效果，表現(xiàn)為所述融合蛋白能成為不會(huì) 引起過(guò)敏反應(yīng)的安全變應(yīng)原，能抑制由柳杉花粉引起的過(guò)敏反應(yīng)程度， 能充分誘導(dǎo)特異性針對(duì)柳杉花粉抗原的免疫力以及覆蓋所有柳杉花粉 癥患者中的T細(xì)胞表位。因此，本發(fā)明的藥劑可用于新型脫敏治療和/ 或作為藥物(如治療性疫苗)。本申請(qǐng)基于2006年1月13日提交申請(qǐng)的JP-2006-005658,其內(nèi)容通 過(guò)參考并入本文中。
權(quán)利要求
1.用于由靶抗原引起的免疫疾病的預(yù)防或治療劑，其含有包括CD1d配體和目標(biāo)抗原并具有腔的藥物遞送載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的藥劑，其中所述目標(biāo)抗原為變應(yīng)原，并且所 述免疫疾病為該變應(yīng)原引起的變應(yīng)性疾病。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的藥劑，其中所述藥物遞送載體為脂質(zhì)體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的藥劑，其中所述CDld配體為a-GalCer。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的藥劑，其中所述變應(yīng)原為柳杉花粉。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2的藥劑，其中所述變應(yīng)原為Cryjl成熟蛋白和 Cryj2成熟蛋白的融合蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，其中在融合蛋白中，所述Cryjl成熟 蛋白位于Cryj2成熟蛋白的N端一側(cè)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2的藥劑，其中所述CDld配體嵌入脂質(zhì)體膜中， 所迷變應(yīng)原封裝在脂質(zhì)體腔內(nèi)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l的藥劑，其中所述目標(biāo)抗原為自身抗原。
10. 融合蛋白，其包含柳杉花粉抗原、Cryjl蛋白和Cryj2蛋白。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的融合蛋白，其中所述Cryjl蛋白為Cryjl 成熟蛋白，所述Cryj2蛋白為Cryj2成熟蛋白。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10的融合蛋白，其中所述Cryjl蛋白和Cryj2 蛋白直接連接或通過(guò)肽接頭連接。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10的融合蛋白，其中所述Cryjl蛋白位于其N(xiāo) 端側(cè)，所述Cryj2成熟蛋白位于其C端側(cè)。
14. 用于預(yù)防或治療免疫疾病的方法，所述方法包含向需要這種治 療的受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的免疫 疾病預(yù)防或治療劑的步驟。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的用于預(yù)防或治療免疫疾病的方法，其中所 述受試者為患所述免疫疾病的人患者。
全文摘要
本發(fā)明提供在NKT細(xì)胞的多種功能中選擇性地增強(qiáng)免疫抑制功能的方法、有效地在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性免疫抑制的方法以及應(yīng)用所述方法獲得的藥物。更具體地，本發(fā)明提供含有CD1d配體和靶抗原(如變應(yīng)原、自身抗原)的藥物(例如，免疫疾病如變應(yīng)性疾病和自身免疫病的預(yù)防或治療劑)。優(yōu)選地，所述藥物含有藥物遞送載體，所述載體包含CD1d配體和靶抗原，并具有腔。
文檔編號(hào)A61K45/06GK101309705SQ200780000109
公開(kāi)日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2007年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日
發(fā)明者松井有紀(jì)子, 石井保之, 野澤理咲 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所