專利名稱：：重組人干擾素樣蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請涉及具有人干擾素樣生物學活性的重組蛋白。背景在本申請中采用在^t盯e(1)中公布的干擾素(IFN)術(shù)語。人干擾素(HuIFN)由Isaacs和Linde麵nn在1957年發(fā)現(xiàn)(2)，其是一個熟知的細胞因子家族，所述細胞因子由各種真核細胞在暴露于各種不同刺激如病毒感染或者接觸促細胞分裂原后分泌。IFN可以引起細胞行為的多種變化，包括影響細胞的生長和分化以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)(3-7)。HuIFN分為6個亞型，即IFN-ot，IFN-P，IFN-y，IFN-co，IFN-e和IFN-k。HuIFN-a(白細胞衍生的干擾素)在人白細胞中產(chǎn)生，而少量HuIFN-P(成纖維細胞衍生的干擾素)在類淋巴母細胞中產(chǎn)生。HuIFN根據(jù)其化學和生物學特征進一步分為兩大類型，即類型I和類型II。類型I包括IFN-ot和IFN-P亞型以及最近發(fā)現(xiàn)的IFN-co，IFN-s和IFN-k亞型。類型II只有一個成員IFN-y(免疫干擾素)。不同的干擾素亞型具有不同的結(jié)構(gòu)和生物學特征。HuIFN-P是N-聯(lián)糖蛋白(8，9)，其已被純化至具有均一性并進行了表征。其大小是不均一的，可能是由于它的糖部分。但是，只存在一個人IFN-P基因，其編碼含166個氨基酸的蛋白質(zhì)。IFN-P與IFN-a的同源性低，共享大約30-40%的同一性。與IFN-P基因的單一性不同，HuIFN-a是由大體上14個基因的多基因家族組成的亞型。由一個或兩個氨基酸差異形成的小變體說明了復等位基因的存在(10)。除了假基因IFNAP22以外，存在13個基因，其編碼13種蛋白質(zhì)。每種蛋白質(zhì)由165-166個氨基酸組成。IFNA13基因所編碼的蛋白質(zhì)與IFNA1蛋白相同。因此，存在12種不同的千擾素-oc蛋白IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAIO、IFM14、IFNA16、IFM17和IFNA21。IFN-oc亞型之間的氨基酸序列同一性通常為80-85%(11)。成熟的IFN-co與IFN-a種類的家族顯示出60%的核苷酸序列同源性，但其C-末端長了6個氨基酸。IFN-w與干擾素-P的相關(guān)性更遠(共享大約30%的序列同源性)。人IFN-co沒有歸類到IFN-a組，這是因為它在抗原性方面與IFN-a不同，以及在其與I型IFN-ot受體的相互作用方面不同(12)。IFN-co由感染了病毒的白細胞分泌，作為人白細胞干擾素的主要組分。成熟的人IFN-e蛋白含有185個氨基酸，分別與IFN-ot2和IFN-P共享大約33%和37%的序列同源性(13,14)。IFN-s的功能和生物物理學特性還沒有得到有效的詳細表征；但是，它像I型干擾素一樣發(fā)揮作用。IFN-e也可能在生殖功能上發(fā)揮作用(15)。IFN-k是含180個氨基酸的人細胞因子，其是一種最近鑒定的I型IFN。IFN-k的編碼序列與在人中發(fā)現(xiàn)的其他I型干擾素具有~30%的同一性。IFN-k的一個區(qū)別性特征是在未誘導的細胞特別是角質(zhì)形成細胞中其轉(zhuǎn)錄物的可檢測的組成性表達。IFN-k可能通過影響先天免疫系統(tǒng)的細胞而在調(diào)節(jié)全身或局部免疫功能中發(fā)揮作用(16)。但是，IFN-k表現(xiàn)出低的抗病毒活性(17)。人I型干擾素看來似乎結(jié)合2個受體亞基，即IFMR-l和-2,它們廣泛分布在各種細胞類型的細胞表面。配基的參與誘導了分別耦聯(lián)至IFNAR-1和-2的酪氨酸激酶TYK2和JAK-1的磷酸化。一旦發(fā)生磷酸化，STAT蛋白就從受體上釋放出來并形成同源二聚體和異源二聚體(18，19)。釋放后，STATA的二聚體結(jié)合干擾素應答因子9(IRF-9)(其是一種DNA結(jié)合蛋白)，從而形成稱作IFN刺激的基因因子-3(ISGF-3)的復合物，其遷移入細胞核中。接著，ISGF-3復合物與在7所有IFN可誘導的基因的上游存在的一個DNA元件相結(jié)合。這就是所謂的"經(jīng)典的"信號轉(zhuǎn)導途徑。目前不斷發(fā)現(xiàn)了受I型IFN調(diào)控的新的作用方式和生化途徑。例如，在所述信號轉(zhuǎn)導途徑中PI3K的下游，核因子k-B(NF-kB)和PKC-d與在用IFN-P孵育的嗜中性粒細胞中觀察到的抗凋亡效應相關(guān)(20)。超過300個基因(稱作干擾素誘導的基因)對IFN處理起反應。研究最多的IFN蛋白是具有抗病毒特性的那些。例如，2,5寡腺苷酸合成酶家族的酶(OAS-1和-2)催化合成短的寡腺苷酸，其結(jié)合并活化RNAseL(為一種切割病毒和細胞RNA的酶)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。經(jīng)DsRNA活化的蛋白激酶(PKR)使翻譯抑制因子elF2a磷酸化，還可導致病毒和細胞蛋白質(zhì)合成的抑制。最近，還發(fā)現(xiàn)PKR是活化轉(zhuǎn)錄因子NF-kB所必需的，NF-kB是在炎性細胞因子誘導、免疫調(diào)節(jié)和凋亡中的中心作用物。Mx(粘病毒抗性)蛋白通過阻止細胞內(nèi)病毒顆粒的轉(zhuǎn)運或者病毒RNA的轉(zhuǎn)錄來抑制RNA病毒的復制。RNA-特異的腺苷脫氨酶(ADAR)將腺苷轉(zhuǎn)化成肌苷，從而造成病毒RNA基因組的超變(21)。HuIFN具有廣譜的生物學活性，包括抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)功能。已經(jīng)廣泛研究了人干擾素的臨床潛能，并總結(jié)在下面。在抗腫瘤應用方面，HuIFN可能通過調(diào)控免疫調(diào)節(jié)和抗血管生成應答而間接地或通過影響腫瘤細胞的增殖或細胞分化而直接地介導抗腫瘤效應(22)。干擾素療法已經(jīng)用于治療各種白血病(23)，例如多毛細胞白血病(24)、急性和慢性髓細胞白血病(25-27)、骨肉瘤(28)、基底細胞癌(29)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(30)、腎細胞癌(31)、多發(fā)性骨髓瘤(32)、黑色素瘤(33)、卡波西肉瘤(23)和何杰金氏病(34)。對于IFN-a與阿糖胞苷(ara-C)、5-FU、羥基脲(hydroxyura)以及IL-2的聯(lián)合治療進行了徹底研究，多數(shù)都表現(xiàn)出顯著好于單獨的HuIFN-a的結(jié)果(3)。聯(lián)合HuIFN和替莫唑胺來協(xié)同治療晚期癌癥也已經(jīng)被報道(35)。在抗病毒應用方面，HuIFN已經(jīng)在臨床上用于抗病毒療法，例如，治療AIDS(36)，病毒性肝炎包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎(37，38)，乳頭瘤病毒感染(39)，皰滲病毒感染(40)，病毒性腦炎(41)，以及預防鼻炎和呼吸道感染(40)。HuIFN也已經(jīng)在臨床上用于抗菌療法(42)，例如，霧化的HuIFN-Y(43)和HuIFN-oc已經(jīng)用于多藥耐性肺結(jié)核患者(44)。HuIFN-y已經(jīng)用于治療多藥耐性腦結(jié)核(45)。HuIFN也已經(jīng)在臨床上用于免疫調(diào)節(jié)療法，例如，預防移植物抗宿主的排斥反應，或減緩自身免疫疾病例如多發(fā)性硬化癥(46,47)和斯耶格倫綜合征(48)的進展。IFN-P在美國已經(jīng)被FDA批準用于治療多發(fā)性硬化癥。最近，已經(jīng)有報道指出多發(fā)性硬化癥患者的I型干擾素和白細胞介素-2的產(chǎn)生減少(49)。此外，使用HuIFN-a的免疫調(diào)節(jié)治療看起來在進行骨髓移植后復發(fā)的慢性髓細胞白血病(CML)患者中是一種有效療法(50)。在疫苗輔佐方面，HuIFN已經(jīng)作為佐劑在臨床上用于治療黑色素瘤(51)，并且也可以在許多其他疾病的預防或治療性疫苗接種中用作佐劑或協(xié)佐劑以增強或刺激免疫反應(52)。HuIFN-a2a是第一種在臨床試驗中使用的血管生成抑制劑，其對于治療危及生命的血管瘤在兒童中是有效的(53，54)。另一種臨床適應癥是骨巨細胞瘤。Kaban等人報道了下頜骨的大的、快速生長的復發(fā)性的巨細胞瘤的顯著消退(55)。雖然HuIFN有許多重要的臨床應用，但它們也表現(xiàn)出顯著的副作用和其他限制。大多數(shù)細胞因子(包括HuIFN)具有相對較短的循環(huán)半衰期，這是因為它們在體內(nèi)產(chǎn)生從而局部且短暫地發(fā)揮作用。由于它們通常作為全身性治療劑進行施用，因此需要頻繁地并且以相對較高的劑量進行施用。頻繁的腸胃外施用既不方便又痛苦。此外，與HuIFN施用相關(guān)的毒性副作用經(jīng)常很嚴重，以至于一些患者不能忍受該治療。這些副作用很可能與高劑量的全身施用相關(guān)。此外，在臨床研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些患者產(chǎn)生針對rHuIFN的抗體，該抗體中和rHuIFN的生物學活性(56)。4艮明顯，多種應用(例如，抗癌療法，以及抗病毒療法、免疫療法、抗寄生蟲療法、抗菌療法，或者任何需要干擾素活性增強和/或副作用降低的醫(yī)療狀況或情形)都迫切需要發(fā)展新的、效力增強的干擾素蛋白。總之，HuIFN很有可能在下一代新型抗腫瘤和抗病毒療法中發(fā)揮重要作用(10)。在現(xiàn)有技術(shù)中熟知，改善細胞因子藥物的藥物學性質(zhì)的最有效方式是使細胞因子蛋白本身發(fā)生突變。隨著時間變化，用于突變干擾素肽的多種策略和技術(shù)得到發(fā)展。一般來說，目前有3種策略可用于產(chǎn)生HuIFN-a突變體。第一種策略是制備IFN雜合體。一些研究者已經(jīng)利用IFN編碼序列中具有天然存在的限制性內(nèi)切酶(RE)酶切位點這一點來連接同源編碼片,史(57，58)。Horisberger和DiMarco已經(jīng)對許多雜合體IFN的產(chǎn)生進行了綜述(ll);該文章提供了構(gòu)建此類分子的過程的概覽。描述了用于構(gòu)建雜合體干擾素的方法的具體實例。一些研究者已經(jīng)利用PCR擴增來構(gòu)建突變型IFN-oc,從而產(chǎn)生有特殊需要的核苷酸片段，進而獲得將不同IFN的新片段進行連接的可能性(59)。美國專利6，685，933(60)還描述了制備人IFN雜合體的PCR擴增技術(shù)。所述干擾素雜合體可以在一種干擾素亞型中產(chǎn)生，例如美國專利5，137，720(61)和美國專利6,685,933(60)所描述的，或者在至少2種不同的干擾素類別組之間產(chǎn)生，例如美國專利6174996(62)和美國專利6，685，933(60)所描述的。此外，雜合體的親本基因可以來自一個物種(主要來自人)，例如HuIFN-oc和HuIFN-co之間的雜合體，或者來自超過一個的動物物種，例如人和鼠干擾素-oc之間的雜合體(63)。笫二種構(gòu)建干擾素突變體的策略是利用位點定向點誘變，其通過在IFN的DM分子中引入一個或多個核苷酸的變化(64)。最近，將系統(tǒng)突變和計算機方法用作蛋白質(zhì)誘變的指導(65)。第三種構(gòu)建I型HuIFN的策略是將通過RE消化、PCR擴增、化學合成或DNA酶消化獲得的IFN基因片段進行改組，隨后進行PCR以將所述片段進行隨機連接，接著進行擴增。得到的PCR產(chǎn)物事實上是重排的干擾素oc基因片段的庫，其可用于構(gòu)建DNA庫，從中可以分離出具有所需表型的DNA克隆(66)。例如，Chang等人已經(jīng)描述了一種構(gòu)建和篩選HuIFN改組文庫的方法，以鑒定在小鼠細胞中抗病毒和抗增殖活性增強的HuIFN衍生物(67)。人干擾素alfacon-l(復合干擾素(consensusinterferon))是一種重組的非天然存在的HuIFN-a，含166個氨基酸。它是通過根據(jù)已知的經(jīng)克隆的HuIFN-oc序列來評估每段相應區(qū)域中最高度保守的氨基酸而產(chǎn)生的。在氨基酸水平上，它與HuIFN-a2b具有89%的序列同源性，和其特異性抗病毒活性為大約109IU/mg。人干擾素alfacon-1已經(jīng)被批準用于治療18歲或18歲以上的代償性肝病患者的慢性HCV感染(68)。盡管現(xiàn)有技術(shù)中已知一些重組干擾素蛋白，但仍然需要生物學活性增強的新型干擾素樣蛋白和蛋白質(zhì)組合物。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，公開分離的多核苷酸，其編碼具有人干擾素樣生物學活性的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述多核苷酸包含與SEQIDNo:1至少93%同一的核苷酸序列。在其他實施方案中，所述核苷酸序列與SEQIDNo:1至少95%同一或至少98%同一。在一個實施方案中，本發(fā)明所包括的蛋白質(zhì)選自其中每個蛋白質(zhì)具有與SEQIDNo:2至少85%同一的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的組。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)不是天然存在的，并且具有與人干擾素a2b(HuIFN-oc2b)相比而言增強的抗病毒和抗增殖活性。例如，所述蛋白質(zhì)的抗病毒活性為HuIFN-oc2b的至少2倍，和抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少10倍。在特定的實施方案中，蛋白質(zhì)氨基酸序列與SEQIDNo:2至少90%同一或至少95%同一。本發(fā)明包括包含所述多核苷酸序列的重組載體以及包含所述載體的宿主細胞。本發(fā)明還包括表現(xiàn)出人干擾素樣生物學活性的多肽片段。本發(fā)明進一步包括表現(xiàn)出干擾素樣生物學活性的蛋白質(zhì)構(gòu)建體和其他組合物，例如包含所述蛋白質(zhì)和另一部分例如無機聚合物的綴合物。本發(fā)明進一步包括所述蛋白質(zhì)和所述組合物用于治療目的的方法和用途，例如作為抗病毒劑或抗癌劑。本發(fā)明還可用于治療其他對干擾素療法作出響應的病狀。附圖簡述圖1描繪了編碼本發(fā)明的新型蛋白質(zhì)的完整DM序列(SEQIDNo:1)，所述新型蛋白質(zhì)在此稱為Novaferon(A)。圖1還顯示了Novaferon的預期氨基酸序列(SEQIDNo:2)(B),以及Novaferon氨基酸序列和NovaferonDNA序列的比對(C)。成熟Novaferon蛋白的第一個氨基酸半胱氨酸被指定為殘基1。圖2顯示了Novaferon基因和HuIFN-a14基因(Genebank編號NM—002172)的核苷酸序列比對(A)，以及Novaferon蛋白和HuIFN-al4蛋白(從Genebank編號NM—002172翻譯的)的氨基酸序列比對(B)。成熟Novaferon蛋白的第一個氨基酸半胱氨酸被指定為殘基1。Novaferon與HuIFN-a14在核苷酸水平上共享大約93%的序列同一性(462/498)，和在氨基酸水平上共享大約87%的序列同一性(144/166)。不同的核苷酸用中間線中的空缺來進行標示。圖3顯示了Novaferon基因和HuIFN-ct2b基因(Genebank編號NM—000605)的核苷酸序列比對(A),以及Novaferon蛋白和HuIFN-ot2b蛋白(從Genebank編號為NM_000605的HuIFN-a2b基因翻譯出的)的氨基酸序列比對(B)。成熟Novaferon蛋白的第一個氨基酸半胱氨酸被指定為殘基l。Novaferon與HuIFN-ct2b在核苷酸水平上共享大約89%的序列同一性(445/498)，和在氨基酸水平上共享大約81%的序列同一性(135/166)。不同的核苷酸用中間線中的空缺來進行標示。12圖4的圖顯示了，與HuIFN-ot2b相比，Novaferon對于Daudi細胞的體外抗增殖抑制。圖5的圖顯示了，Novaferon和HuIFN-ot2b在具有人前列腺癌PC-3異種移植物的棵鼠中的體內(nèi)抗肺瘤效應。圖6的圖顯示了，Novaferon和HuIFN-a2b在具有人肝癌HepG2異種移植物的棵鼠中的體內(nèi)抗腫瘤效應。圖7的圖顯示了，Novaferon和HuIFN-ot2b在具有人黑色素瘤A-375異種移植物的棵鼠中的體內(nèi)抗肺瘤效應。圖8的圖顯示了，Novaferon和HuIFN-oc2b在具有結(jié)腸癌細胞LS180異種移植物的棵鼠中的體內(nèi)抗腫瘤效應。圖9的圖顯示了，Novaferon和HuIFN-a2b在具有人白血病HL60(S)異種移植物的棵鼠中的體內(nèi)抗腫瘤效應。發(fā)明詳述在以下整個說明書中，提供了具體的細節(jié)以便更徹底地了解本發(fā)明。但是，本發(fā)明的實施可以不受這些特殊說明的限制。在其他情況下，沒有顯示或詳細描述眾所周知的元素以避免不必要地使得本發(fā)明含糊不清。相應地，本說明書和附圖應當被認為具有舉例說明性的而不是限制性的意義。術(shù)語的定義在詳細描述本發(fā)明以前，應當了解本發(fā)明不限于所述的特定蛋白質(zhì)分子、方法、操作規(guī)程、細胞系、載體和試劑，因為都可以改變。還應當了解，在此使用的術(shù)語只在于描述特定的實施方案，而不希望限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求書來限定。為了更完全地了解在此描述的本發(fā)明，采用以下術(shù)語，它們的定義如下所示。應當了解，在此使用的術(shù)語只在于描述特定的實施方案，而不希望限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求書來限定。除非另外定義，在此使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。所有在此提及的出版物引入本文作為參考，以用于描述和公開在所述出版物中所報道的細胞系、載體和方法，其可用于本發(fā)明。在此沒有任何事物可被認為承認了，本發(fā)明沒有位于依據(jù)在前發(fā)明的此類公開內(nèi)容之前的權(quán)利。術(shù)語"干擾素"指由多種真核細胞在暴露于各種不同的環(huán)境刺激(包括病毒感染或者接觸促細胞分裂原)后產(chǎn)生的分泌型蛋白質(zhì)家族。除了具有抗病毒特性以外，干擾素還顯示出影響多種細胞功能。所有在此表述的干擾素單位都參考WHO國際標準，94/786(復合rHuIFN-oc(rHuIFN-ctconsensus))和95/650(rHuIFN-a2a)。術(shù)語"干擾素樣"指由已知干擾素或干擾素類似物所表現(xiàn)的功能和/或結(jié)構(gòu)特征或與其相似的功能和/或結(jié)構(gòu)特征。例如，"干擾素樣生物學活性"包括抗病毒和抗增殖活性。干擾素樣生物學活性.的其他例子在此處進行了描述，并且會被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。術(shù)語"活性"復數(shù)形式包括單數(shù)形式；即，本發(fā)明包括表現(xiàn)出至少一種干擾素樣活性的重組蛋白或其他蛋白質(zhì)構(gòu)建體或組合物。術(shù)語"復合干擾素(consensusinterferon)"指一種類型的合成干擾素，其的氨基酸序列是所有已知人ct干擾素亞型的大致平均的序列。已經(jīng)報道了，復合干擾素具有比任何天然人IFN-ot亞型更好(約5倍)的抗病毒、抗增殖和激活NK細胞的活性。在此使用的術(shù)語"分離的"指已經(jīng)離開其天然環(huán)境的分子，例如DNA或RNA。例如，根據(jù)本發(fā)明的目的，包含在載體中的重組DNA分子被認為是分離的。分離的DM分子的進一步例子包括在異源宿主細胞中維持的重組DNA分子或在溶液中的(部分或基本上)純化的DNA分子。"分離的"DNA還包括，從含有天然或人工目的DM片段的文庫中回收的DM分子以及化學合成的核酸。因此，分離的核酸可以重組產(chǎn)生。術(shù)語"核苷酸序列"指包括寡核苷酸、多核苷酸或核苷酸分子及其片段或部分的一連串核苷酸。在DNA分子的情況下，所述序列可以包含一系列脫氧核糖核苷酸，而在RNA分子的情況下，所述序列可以包含相應的一系列核糖核苷酸。寡核苷酸、多核苷酸或核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，而核苷酸序列可以代表正義鏈或反義鏈。術(shù)語"寡核苷酸片段"或"多核苷酸片段"、"部分"、或"區(qū)段"或"探針"或"引物"可互換使用，其是指長度為至少大約5個核苷酸的一連串核苷酸殘基。優(yōu)選地，所述片段可用于與靶核苷酸序列雜交。引物用作DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶所催化的核苷酸聚合的起始點。片段或區(qū)段可唯一地鑒定本發(fā)明的每種多核苷酸序列。優(yōu)選地，所述片段包含與SEQIDNO:l基本上相似的序列。術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"肽"或"寡肽"或"多肽"是指包含一連串氨基酸的天然存在的或合成的分子。術(shù)語"開放閱讀框"或ORF表示不含任何終止密碼子的一系列編碼氨基酸的核苷酸三聯(lián)體，并通常表示可翻譯成蛋白質(zhì)的序列。術(shù)語"成熟的蛋白編碼序列"指編碼不含信號序列或前導序列的蛋白質(zhì)或肽的序列。所述蛋白質(zhì)可以通過在去除任何前導/信號序列的細胞內(nèi)進行加工來產(chǎn)生。蛋白質(zhì)可以合成產(chǎn)生，或利用僅編碼成熟蛋白質(zhì)編碼序列的多核苷酸來產(chǎn)生。在此使用的術(shù)語"純化的"或"基本上純化的"表示所示的蛋白質(zhì)以基本上不存在其他生物大分子例如其他蛋白質(zhì)、多肽等等的形式存在。純化所述蛋白質(zhì)，從而其組成了所存在的所示生物大分子的至少95重量％(但水、緩沖劑和其他小分子，尤其是分子量小于1000道爾頓的分子可以存在)。術(shù)語"重組表達媒介物或載體"指用于從DNAUNA)序列表達蛋白質(zhì)的質(zhì)?；蚴删w或病毒或載體。表達媒介物可以包含轉(zhuǎn)錄單元，所述轉(zhuǎn)錄單元包括(l)在基因表達中具有調(diào)節(jié)作用的一個或多個遺傳元件，例如啟動子或增強子，(2)結(jié)構(gòu)或編碼序列，其被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成蛋白質(zhì)，以及(3)適當?shù)霓D(zhuǎn)錄起始和終止序列。希望在酵母或真核表達系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)單元優(yōu)選地包含前導序列，其使宿主細15胞能夠?qū)⒎g的蛋白質(zhì)分泌到細胞外。備選地，當重組蛋白以沒有前導或轉(zhuǎn)運序列進行表達時，其可以在氨基末端包含甲硫氨酸殘基。隨后，該殘基可以或可以不從表達的重組蛋白上切割下來從而獲得最終產(chǎn)物。術(shù)語"基本上的相似性"涉及當與其他核苷酸或其互補鏈進行最佳比對時，與另一個核酸具有高度序列同一性的核酸或其片段。序列同一性或同源性可以用序列分析軟件例如BLASTN進行測定。如果第一個核酸與第二個核酸在進行最佳比對時顯示出至少大約85-95%或更高的序列同一性，則認為兩者是基本上相似的。例如，為了測定兩個不同核酸之間的序列同一性或同源性，釆用BLASTN程序"BLAST2sequences"。該禾呈序可以通過因4爭網(wǎng)(http:〃www.ncbi.nlm.ni_h.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)從NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)獲得以供公眾使用(69)。作為非限制性實例，可以利用默認的軟件設(shè)置進行這種比較(預期=10，過濾器=缺省，開放缺口=5,延伸缺口=2罰分，缺口x降低=50)。同樣，如果第一個蛋白質(zhì)或多肽與第二個蛋白質(zhì)或多肽在用釆用默認設(shè)置的BLAST軟件(blastp)進行最佳比對和比較時顯示出至少大約85-95%或更高的序列同一性，則認為兩者是基本上相似的。作為進一步舉例說明，具有與編碼蛋白質(zhì)的參考核苷酸序列至少例如95%"同一的"核苷酸序列的多核苷酸，表示所述多核苷酸的核苷酸序列與參考序列是同一的，除了在每100個編碼所述蛋白質(zhì)的所述參考核苷酸序列的核苷酸中，所述多核苷酸序列可以包含多達5個的點突變。換言之，為得到具有與參考核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可以被刪除或用另一核苷酸置換，或者高達參考序列總核苷酸的5%的核苷酸數(shù)目可以被插入到參考序列中。在此使用的術(shù)語"互補的"或"互補性"指多核苷酸在許可的鹽和溫度條件下通過堿基配對的自然結(jié)合。例如，序列"A-G-T"結(jié)合至互補序列"T-C-A"。兩條單鏈分子之間的互補性可以是"部分的"，即其中只有一些核酸結(jié)合，或者，當單鏈分子之間存在全部互補性時，則可以是完全的。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈之間的雜交效率和強度有顯著的影響。這對于依賴于核酸鏈之間的結(jié)合的擴增反應來說特別重要。術(shù)語"轉(zhuǎn)化"表示將DNA導入生物體從而使所述DM能夠作為染色體外元件或者通過染色體整合進行復制。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"指表達栽體被合適的宿主細胞所吸收，而不管編碼序列實際上是否表達。術(shù)語"治療"及其語法上的等價詞以最廣泛的含義進行使用，包括治療性處理、阻止、預防和改善某些不希望的癥狀或病狀。在此使用的術(shù)語"生物學活性，，指在活系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)、調(diào)控、生化或其他生物學功能，例如與天然或非天然存在的分子相似或同一。在此使用的術(shù)語"抗增殖"和"抗增殖的"指減慢和/或阻止細胞的生長和分裂，導致細胞總數(shù)的減少和/或在任一細胞周期階段或所有細胞周期階段中靶細胞百分比的降低。細胞靜止在某一特定的細胞周期時相時，可以進一步分為Gl期(Gapl),S期(DNA合成)，G2期(Gap2)或M期(有絲分裂)。在此使用的術(shù)語"抗增殖活性"指蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)構(gòu)建體或組合物在體外或體內(nèi)抑制細胞增殖的活性，尤其是贅生性細胞如癌細胞的增殖。在此使用的術(shù)語"抗肺瘤"或"抗癌"指阻礙或阻止惡性腫瘤的形成。在此使用的"抗腫瘤活性"或"抗癌活性"指蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)構(gòu)建體或組合物在體外或體內(nèi)抑制細胞增殖的活性，尤其是贅生性細胞如癌細胞的增殖。術(shù)語"IC5。，，或"半最大抑制濃度"表示在體外抑制50%細胞生長所需要的抑制劑例如蛋白質(zhì)的濃度。在此使用的術(shù)語"抗病毒的，，和"抗病毒"指在體外和/或在體內(nèi)減緩和/或阻止細胞的病毒感染或者干擾細胞內(nèi)的病毒復制，導致病毒繁殖減慢或停止，或者病毒顆?？倲?shù)降低。在此使用的"抗病毒活性"表示蛋白質(zhì)、蛋白構(gòu)建體或組合物在體外或體內(nèi)抑制病毒感染或干擾病毒復制的活性。Novaferon蛋白本發(fā)明涉及制備和鑒定新型人干擾素樣蛋白，其在此稱為"Novaferon"。正如下面所詳細描述的，根據(jù)在標準體外測試中所測量的，Novaferon蛋白表現(xiàn)出相比天然存在的HuIFN-oc2b而言增強的抗病毒和抗增殖生物學活性。特別地，在相同測試系統(tǒng)中，與HuIFN-a2b相比，Novaferon蛋白顯示出當在Wish-VSV系統(tǒng)中進行測試時抗病毒活性增加至12.5倍，和Daudi細胞生長的抗增殖抑制提高至大約400倍。在一個實施方案中，Novaferon蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸由498個核苷酸組成，如SEQIDNo:1和圖1(A)所示。成熟的Novaferon蛋白由166個氨基酸組成，如SEQIDNo:2和圖1(B)所示。本發(fā)明所包括的多核苷酸和氨基酸序列及其變體在下面進一步詳細描述。為了比較，發(fā)明者對Novaferon和天然存在的HuIFN的同源性進行了研究。BLAST檢索表明，Novaferon在核苷酸和氨基酸水平上與HuIFN-ot14均具有最高的同源性。如圖2所示，編碼Novaferon的多核苷酸序列(SEQIDNo:1)與HuIFN-a14具有大約93%(462/498)的同源性，而氨基酸序列與HuIFN-al4具有大約87%(144-166)的同源性。與最廣泛使用的人干擾素產(chǎn)品HuIFN-oc2b相比，核苷酸水平上的同源性為大約89%(445/498)，而氨基酸水平上的同源性為大約81%(135/166)，如圖3所示。對于合成的IFNalfacon-1(復合干擾素)，Novaferon在核苷酸水平上具有大約91%的序列同一性(453/498)，而在氨基酸水平上具有大約84%的序列同一性(140/166)。正如下面實驗部分所詳細描述的，多核苷酸序列(SEQIDNo:1)選自I型人干擾素的DNA改組文庫。簡言之，Novaferon蛋白是通過用含有完整的SEQIDNo:1的多核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)染宿主細胞來產(chǎn)生的。純化在宿主細胞系的上清液中所含有的Novaferon蛋白，并顯示表現(xiàn)出人干擾素樣生物學活性，例如抗病毒和抗增殖功能。多核苷酸和變體本發(fā)明的新型多核苷酸序列/核酸分子由498個核苷酸組成，如在圖1(SEQIDNo:1)中所示的。利用在此提供的信息例如核苷酸序列，可以通過重組表達、化學合成或者通過使用其他標準分子生物學程序例如用于DNA誘變的那些來獲得本發(fā)明的編碼Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)的核酸分子。除了分離的核酸分子(SEQIDNo:1)之外，本發(fā)明還包括其序列不同于SEQIDNo:1中所示DNA序列的DNA分子，但由于遺傳密碼的簡并性，仍編碼與Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)相同或基本上相同的氨基酸序列。遺傳密碼和物種特異的密碼子偏愛在本領(lǐng)域中是已知的。因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說常規(guī)的是，產(chǎn)生不同于SEQIDNo:1的DNA序列的DNA序列簡并變體，以便例如對于特定宿主優(yōu)化密碼子表達(例如，將人mRNA的密碼子變成細菌宿主如大腸桿菌(f.co//)偏愛的密碼子)。本發(fā)明進一步提供了具有圖1(SEQIDNo:1)所示核苷酸序列的分離的核苷酸分子，或具有與SEQIDNo:l的核酸序列互補的序列的核酸分子。本發(fā)明還提供了相關(guān)信息，并涉及包含本發(fā)明的分離的核酸分子的重組栽體，和涉及含有所述重組載體的宿主細胞，以及涉及制備此類載體和形成表達Novaferon蛋白的宿主細胞以及利用所述宿主細胞來通過重組技術(shù)產(chǎn)生Novaferon的方法。根據(jù)本發(fā)明的核酸序列(SEQIDNo:1，圖1(A))，本發(fā)明包括與其基本上相似的核酸分子，例如，當進行最佳比對時與SEQIDNo:1具有至少大約85-95%或更高的序列同一性的核酸。例如，在一個方面，與SEQIDNo:1所示核苦酸序列具有大約93%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，無論其是否編碼具有相似于Novaferon的生物學活性的蛋白質(zhì)或多肽(此類活性包括但不限于，相比HuIFN而言增強的抗病毒、抗增殖和抗腫瘤功能)。此類核酸分子例如可用作用于檢測細胞內(nèi)的mRNA的探針，所述細胞已經(jīng)用包含本發(fā)明核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生Novaferon。換言之，這些與SEQIDNo:1所示序列至少大約93%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸序列可用作用于測定宿主細胞中異源基因的表達的標記。此外，本發(fā)明包括多核苷酸，其包含SEQIDNo:1的至少大約30個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選地至少大約50個連續(xù)核苷酸的任何部分。更一般地，本發(fā)明包括和涵蓋了，與圖1(SEQIDNo:1)所示核苷酸序列的部分序列同一的任何及所有分離的核酸分子的片段。在一個實施方案中，這些片段的長度為至少大約15個核苷酸，并可用作在此所討論的診斷探針和引物。此外，本發(fā)明包括和涵蓋了更大的片段，其長度為大約50個核苷酸或更長。除了SEQIDNo:l中所示的編碼Novaferon蛋白的核酸序列之外，本發(fā)明還包括但不限于編碼完整Novaferon蛋白的氨基酸序列以及額外的氨基酸/肽/多肽例如所添加的分泌前導序列的核酸序列。本發(fā)明還包括這樣的核酸序列，其具有SEQIDNo:1中所示的核酸序列，以及另外的非編碼序列，例如包括但不限于內(nèi)含子以及5'和3'非編碼序列例如轉(zhuǎn)錄的但不翻譯的序列(它們在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工(即剪接和多腺苷酸化信號、核糖體結(jié)合和穩(wěn)定mRNA)中發(fā)揮作用)，和編碼有或無功能的另外氨基酸的另外的編碼序列。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明核苷酸分子(SEQIDNo:1)的變體，其編碼Novaferon蛋白的部分、類似物或衍生物?？赏ㄟ^篩選干擾素改組文庫或者利用誘變技術(shù)或/和其他本領(lǐng)域中所描述的已知技術(shù)來獲得變體。如上所說明的，此類變體可包括通過核苷酸插入、缺失或置換而產(chǎn)生的那些。插入、缺失或置換可牽涉一個或多個核苷酸。這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之間的任何地方，單獨地散布在參考序列的核苷酸中，或散布在參考序列內(nèi)的一個或多個連續(xù)組中。所述變化可產(chǎn)生保守或非保守的氨基酸置換、缺失或添加。在這些之中尤其優(yōu)選的是沉默置換、添加和/或缺失，其不改變Novaferon蛋白或其部分的性質(zhì)和活性。在這方面也尤其優(yōu)選的是保守置換。本發(fā)明還提供了分離的核酸分子，其包含具有與選自下列的多核苷酸至少93%同一的，更優(yōu)選地至少大約95%、96%、97%、98%或99%同一的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQIDNo:2中的完整氨基酸序列(即SEQIDNo:2的1-166位)的Novaferon蛋白的核苷酸序列；和(b)編碼(a)的蛋白質(zhì)的生物學活性片段的核苷酸序列；和(c)與上面(a)或(b)中任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會馬上認識到，大量其序列與圖1所示核酸序列(SEQIDNo:1)至少大約93%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸分子將編碼具有與Novaferon蛋白相似或相同活性的蛋白質(zhì)。實際上，由于簡并變體都編碼相同蛋白質(zhì)，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是清楚的，即使沒有進行比較測定法。在本領(lǐng)域中將進一步認識到，對于不是簡并變體的此類核酸分子，也有相當數(shù)目將編碼具有干擾素樣生物學活性的蛋白質(zhì)。這是因為本領(lǐng)域技術(shù)人員完全知道較不可能或不可能顯著影響蛋白質(zhì)功能的氨基酸置換(例如，用另一個脂肪族氨基酸置換一個脂肪族氨基酸)，如下面所進一步描述的。例如，Bowie等人(70)提供了關(guān)于如何進行表型沉默氨基酸置換的指導，其中作者指出許多蛋白質(zhì)都耐受氨基酸置換。蛋白和多肽變體和構(gòu)建體本發(fā)明包4舌SEQIDNo:2的Novaferon蛋白以及與其基本上相似的蛋白質(zhì)或多肽，例如與SEQIDNo:2具有至少大約85-95%或更高的氨基酸序列同一性的非天然存在的蛋白質(zhì)。例如，與SEQIDNo:2所示氨基酸序列具有至少大約85%、90%、95%、96%、97%、98%21或99%序列同一性的非天然存在的蛋白質(zhì)在本發(fā)明范圍之內(nèi)。此外，為了增強其功能和性質(zhì)，本發(fā)明的Novaferon蛋白可通過將其融合至其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或其他分子來進行結(jié)構(gòu)修飾。例子包括但不限于將其融合至其他蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)片段以增加其表達或進一步穩(wěn)定Novaferon蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明的編碼Novaferon的核酸序列和/或Novaferon蛋白可利用除支架以外的標記物進行標記。此處，"經(jīng)標記的"表示核酸序列(SEQIDNo:1)或Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)的化合物已附著有至少一種元素、同位素或其他化學物質(zhì)(標記物)以使得能夠檢測所述化合物。一般而言，標記物分為三類a)同位素標記物，其可以是放射性同位素或重同位素；b)免疫標記物，其可以是抗體或抗原；和c)有色或熒光染料。標記物可以摻入到所述化合物的任何位置。一旦制得，Novaferon蛋白還可以進行共價修飾。共價修飾的一種類型包括用能夠與Novaferon蛋白的所選側(cè)鏈或者N-或C-末端殘基進4亍反應的有才;M汙生^:劑(derivatizingagent)處理Novaferon蛋白。用雙功能試劑進行衍生化可用于例如將Novaferon蛋白與水不溶性支持基質(zhì)或表面交聯(lián)，以用于純化抗Novaferon抗體或篩選測定法。通常使用的交聯(lián)劑包括1，l-雙(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯(例如，與4-疊氮基水楊酸形成的酯)，同基雙功能亞氨酸酯，包括二琥珀酰亞氨基酯例如3，3，-二硫代雙(琥珀酰亞氨基丙酸酯)，雙功能馬來酰亞胺例如二-N-馬來酰亞胺基-l，8-辛烷，以及諸如曱基-3-[(p-疊氮基苯基)聯(lián)硫基]propioimidate的試劑。Novaferon蛋白的其他#"飾包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基分別脫酰氨成谷氨酰和天冬氨酰殘基；脯氨酸和賴氨酸的羥基化；絲氨酰和蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化；賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的氨基的曱基化(71);將N-末端胺的乙?；缓蛯⑷魏蜟-末端羧基的酰胺化。本發(fā)明Novaferon蛋白的另一種類型的共價修飾包括改變所述蛋白質(zhì)的天然的糖基化模式。這例如可以通過以下方式達到(l)刪除和/或添加一個或多個在Novaferon蛋白的天然序列中發(fā)現(xiàn)的糖部分，或者(2)添加和/或刪除一個或多個在Novaferon蛋白的天然序列中不存在的糖基化位點。向Novaferon蛋白添加糖基化位點可通過改變Novaferon蛋白的氨基酸序列來完成。例如，通過在Novaferon蛋白的天然序列中添加或置換為一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來達到這種改變(對于0-聯(lián)糖基化位點)。Novaferon蛋白的氨基酸序列的改變可通過DNA水平上的變化來達到，特別是通過在預選擇的核苷酸堿基處突變編碼Novaferon蛋白的DNA序列，從而改變的密碼子可以翻譯成所需的氨基酸。增加Novaferon蛋白中糖部分的數(shù)目的另一種方式是將糖苷通過化學或酶促的方式偶聯(lián)到所述蛋白質(zhì)上。此類方法在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，例如，早在1981年，AplinJD和WristonJCJr已經(jīng)描述了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的糖綴合物的制備、性質(zhì)和應用(72)。去除Novaferon蛋白中存在的糖部分可通過化學或酶促的方式來完成，或者通過突變置換編碼用作糖基化靶標的氨基酸殘基的密碼子來完成?；瘜W去糖基化技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，并例如由EdgeAS等人(73)進行了描述。對多肽上的糖部分的酶促切割可以通過使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶來達到，如Thotakura等人所描述的(74)。此類衍生的構(gòu)建體可包括改善溶解性、吸收、穿過血腦屏障的滲透性、生物學半衰期等的部分。Novaferon蛋白的此類部分或修飾可二者擇一地清除或減弱所述蛋白質(zhì)的任何可能的不希望的副作用等等。已經(jīng)7〉開了能夠介導此類效應的部分，例如在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(75)中。Novaferon的另一種類型的共價修飾包括，例如以U.S.Pat.Nos.:4，640，835(76);4，496，689(77);4，791，192(78)或4，179，337(79)中所示的方式，將Novaferon蛋白連接至各種非蛋白質(zhì)聚合物之一上，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。此外，還可修飾本發(fā)明的Novaferon蛋白，以形成包含融合至另一個異源多肽或氨基酸序列的Novaferon蛋白的嵌合分子。在一個實施方案中，這樣的嵌合分子包含Novaferon蛋白與標簽多肽的融合化合物，所述標簽多肽提供抗標簽抗體能夠選擇性地結(jié)合的表位。該表位標簽通常位于Novaferon蛋白的氨基或羧基末端。Novaferon蛋白的此類加有表位標簽的形式的存在可以用抗該標簽多肽的抗體進行檢測。此外，表位標簽的提供使得Novaferon蛋白能夠容易地通過親和純化進行純化，所述親和純化使用抗標簽抗體或與所述表位標簽結(jié)合的另一類型的親和基質(zhì)。在一個備選的實施方案中，所述嵌合分子可包含Novaferon蛋白與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區(qū)域/片段的的融合化合物。例如，為了形成二價形式的嵌合分子，可將Novaferon蛋白融合至IgG分子的Fc區(qū)。多種標簽多肽和它們各自的抗體在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的。例子包括聚組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標簽；fluHA標簽多肽及其抗體12CA5(80);c-myc標簽及針對其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體(81);以及單純皰滲病毒糖蛋白D(gD)標簽及其抗體(82)。其他標簽多肽包括Flag-肽(83);微管蛋白表位肽(84);和T7基因IO蛋白肽標簽(85)。此外，本發(fā)明的Novaferon蛋白可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的化學合成程序來產(chǎn)生。例如，在商購可得的433A型號肽合成儀(AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity，CAUS)上可產(chǎn)生長度為高達大約80-90個氨基酸殘基的多肽。此外，高達120個殘基的更長的化學合成的肽也是商購可得的，例如，從Bio-synthesis，Inc.Lewisville,TXUSA獲得。因此，纟艮容易理解，全長的成熟Novaferon蛋白能夠合成產(chǎn)生(例如，先合成片段，然后將所述片段連接在一起)。因此，本發(fā)明的Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)包括所有具有與SEQIDNo:2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)和多肽制備物和構(gòu)建體，無論這些Novaferon蛋白和蛋白質(zhì)衍生物是否是通過化學合成程序產(chǎn)生，和/或通過重組技術(shù)從原核或真核宿主細胞或其他細胞和宿主(包括但不限于細菌、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組產(chǎn)生方法中所采用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是糖基化或非糖基化的、PEG化或非PEG化的。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可包括起始的經(jīng)修飾的甲硫氨酸殘基，在某些情況下這是宿主介導的加工的結(jié)果。因此，現(xiàn)有技術(shù)中熟知，由翻譯起始密碼子編碼的N-末端曱硫氨酸通常在所有真核細胞中于翻譯后從任何蛋白上被高效去除。在大多數(shù)原核生物中，大多數(shù)蛋白質(zhì)的N-末端甲硫氨酸也被有效去除，而對于某些蛋白質(zhì)，這種原核去除過程是無效的，這依賴于N-末端甲硫氨酸所共價連接的氨基酸的性質(zhì)。產(chǎn)生本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的DNA分子的重組栽體，用所述重組載體進行遺傳工程改造/轉(zhuǎn)染的宿主細胞，以及通過重組技術(shù)產(chǎn)生Novaferon蛋白或其片段。載體可以是，例如，質(zhì)粒、噬菌體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是能夠復制的或復制缺陷的。在后一種情況下，病毒繁殖通常只發(fā)生在補充性宿主細胞中。詳細描述Novaferon產(chǎn)生的例子如下。用于表達本發(fā)明的Novaferon蛋白的優(yōu)選載體包括但不限于，包含有效連接至待表達的多核苷酸的順式作用調(diào)控區(qū)的載體，所述順式作用調(diào)控區(qū)對于在宿主中的表達是有效的。合適的反式作用因子由宿主提供，由補充性載體提供，或在導入宿主后由所述栽體本身提供。本發(fā)明所公開的核酸序列(SEQIDNo:1)可以有效連接至合適的啟動子。此處"啟動子"表示能夠結(jié)合RNA聚合酶并起始Novaferon蛋白的編碼序列的外顯子(通常在下游(3'))轉(zhuǎn)錄從而轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何核酸序列。細菌啟動子具有通常接近編碼序列的5'末端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄起始位點。編碼代謝途徑酶的序列可提供特別有用的啟動子序列。例子包括源自糖代謝酶例如半乳糖、乳糖和麥芽糖代謝酶的啟動子序列，以及源自生物合成酶例如色氨酸合成酶的序列。還可以利用來自噬菌體的啟動子，這些啟動子在本領(lǐng)域中是已知的。此外，合成啟動子和雜合啟動子也是有用的；例如，"c啟動子是"/和7ac啟動子序列的雜合體。此外，細菌啟動子可包括天然存在的非細菌來源的啟動子，其具有結(jié)合細菌RNA聚合酶并起始轉(zhuǎn)錄的能力。優(yōu)選的細菌啟動子包括但不限于，大腸桿菌/ac/、";、；力W和/ac/啟動子，T3和T7啟動子，gpt啟動子，入PR、PL啟動子，和trp啟動子。真核啟動子具有通常接近編碼序列的5'末端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25-30個堿基對(bp)的TATA盒。TATA盒被認為指導RNA聚合酶II在正確的位點開始RNA的合成。哺乳動物的啟動子還含有上游啟動子元件(增強子元件)，其通常位于TATA盒上游100至200個堿基對以內(nèi)。上游啟動子元件決定轉(zhuǎn)錄起始的速率并能在任一方向發(fā)揮作用。特別可用作哺乳動物啟動子的是來自哺乳動物病毒基因的啟動子，因為病毒基因通常高表達并具有廣的宿主范圍。例子包括SV40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子。優(yōu)選的動物細胞啟動子包括但不限于，腺病毒主要晚期啟動子、單純皰滲病毒啟動子和CMV啟動子。在已知的真核啟動子中，適合這方面的是CMV即時早期啟動子、延伸因子loc(EF1A)啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、SV40早期和晚期啟動子、以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動子例如勞斯肉瘤病毒("RSV")的那些。用于在酵母中進行表達的優(yōu)選啟動子序列包括可誘導的GAL1/10啟動子，來自乙醇脫氫酶、烯醇化酶、葡糖激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、果糖磚酸激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶和酸性磷酸酶基因的啟動子。用于增殖和表達的載體還通常包括一個或多個選擇標記。此類標記適合于擴增，或者所述載體為此目的含有另外的標記。在這方面，表達栽體優(yōu)選地含有一個或多個選擇標記基因從而為選擇轉(zhuǎn)染的宿主細胞提供表型性狀，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員會識別到某些系統(tǒng)選擇標記可以由分開的載體提供。對于在大腸桿菌和其他細菌中進行培養(yǎng)，優(yōu)選的標記包括，例如氨千青霉素(Amp)、四環(huán)素(Tet)或潮霉素(HYG)抗性基因。酵母選擇標記包括ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7，其賦予對于衣霉素的抗性；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對于G418的抗性；以及CUP1基因，其使酵母能夠在銅離子存在的條件下生長。動物細胞選擇標記包括二氬葉酸還原酶(DHFR)基因、新霉素(neo)或潮霉素(HYG)抗性基因。此外，用于增殖和表達的載體通常含有一個或多個用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點，以及在經(jīng)轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。由構(gòu)建體表達的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選地在開始處含有翻譯起始密碼子，以及包含合適地位于待翻譯的DNA序列的末尾處的終止密碼子(UAA，UGA或UAG)。啟動子、終止子、選擇標記、栽體和其他元件的選擇是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的常規(guī)設(shè)計問題。許多此類元件在文獻中有描述并能通過商業(yè)供應商獲得。下列載體是商購可得的，并優(yōu)選地在細菌中使用來自ShanghaiSangon的pBV220(86)及其衍生物；來自Qiagen的pQE系列；來自Qiagen的pET載體；來自Stratagene的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A;以及來自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。其中優(yōu)選的真核載體為來自P函ega的pCI載體；來自Invitrogen的pcDNA載體；來自Stratagene的pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG;以及來自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。單獨列出這些栽體作為例子來證明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得許多商購可得的熟知的載體以用于通過遺傳/重組方法產(chǎn)生本發(fā)明所公開的Novaferon蛋白。在這方面的某些優(yōu)選的實施方案中，載體提供特異表達的手段。此類特異表達可以是可誘導的表達或只在某些細胞類型中的表達，或者可以是可誘導的且細胞特異的。其中特別優(yōu)選的可誘導的載體是能夠被容易操控的環(huán)境因素例如溫度和營養(yǎng)添加物誘導進行表達的栽體。多種適合于該應用的載體是熟知的并被本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)常采用，包括在原核和真核宿主中使用的組成型和誘導型表達栽體。利用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如可以將包含SEQIDNo:1所示宿主細胞中，所述宿主細胞適合于表達所需蛋白。此類合適的宿主的代表包括細菌細胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(^sc/7/ms"6〃7/s)、鏈霉菌(i7re;^0iz/7ces)細胞；酵母細胞，例如巴斯德畢赤酵母(戶/c力/apa"or/s)細胞；昆蟲細胞，例如果蟲是("roso/7力y/a)S2和灰翅夜蛾(5^oc^;^era)Sf9細胞；哺乳動物細胞，例如CH0和COS;以及植物細胞。用于各種各樣的表達構(gòu)建體的宿主是熟知的，利用本發(fā)明所公開的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地選取用于表達SEQIDNo:2所示的Novaferon蛋白的宿主。可以遺傳工程改造宿主細^^以整合編碼Novaferon的多核苷酸和表達本發(fā)明的Novaferon蛋白。例如，可利用本領(lǐng)域中已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)將編碼Novaferon的多核苷酸導入宿主細^^中。此類方法描述于許多標準實驗手冊中，例如Kingston所論述的那些(87)。編碼Novaferon的多核苷酸可以單獨地或與其他多核苷酸一起導入/轉(zhuǎn)染。這樣的其他多核苷酸可以獨立地導入，或與SEQIDNo:1所示的編碼Novaferon的多核苷酸共導入或聯(lián)合導入。例如，對于在哺乳動物細胞中的共轉(zhuǎn)染和標記的選擇，本發(fā)明的編碼Novaferon的多核苷酸可以與分開的編碼選擇標記的多核苷酸一起轉(zhuǎn)染到宿主細胞中。備選地，對于誘導宿主細胞中的增殖，編碼Novaferon的多核苷酸可以整合到含有編碼選擇標記的DM序列的載體中。用含有編碼Novaferon的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)染的、經(jīng)改造的宿主細胞可以在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基可為了激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增靶基因進行特殊的修飾。調(diào)整培養(yǎng)條件例如溫度、pH等，以適合于所選的宿主細胞表達本發(fā)明的Novaferon蛋白。為了促進翻譯的蛋白質(zhì)多肽分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔、周質(zhì)空間或細胞外環(huán)境中，可以將合適的分泌信號與Novaferon蛋白合并和共表達。純化通常根據(jù)耙蛋白的性質(zhì)并考慮其他條件例如生產(chǎn)成本、擴大生產(chǎn)是否容易、工業(yè)生產(chǎn)的規(guī)模等等，來選擇合適的宿主細胞類型用于表達重組靼蛋白。然后，選擇出以最高產(chǎn)率表達靶蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞克隆，并且將具有最佳表達的最終克隆命名為表達靶蛋白的細胞系并用于生產(chǎn)靶蛋白。表達靶蛋白的細胞系生長在含有各種營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中。為了獲得細胞的最佳生長和/或靶蛋白的最佳表達，利用多種試劑或條件來誘導選擇性啟動子，其與靶蛋白的cDNA序列一起整合在轉(zhuǎn)染載體中。如果宿主細胞類型/表達系統(tǒng)為細菌，通常通過離心從培養(yǎng)基中收獲培養(yǎng)的細胞。通過物理或化學手段來破裂收獲的細胞體，保留收獲的、含有合成的耙蛋白的粗提物，以用于所述蛋白質(zhì)的進一步純化。應用于破裂微生物細胞的方法包括但不限于冷凍-解凍循環(huán)、超聲處理、機械破裂或使用細胞裂解劑。此類方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。本發(fā)明者利用大腸桿菌這種細菌作為用于表達重組Novaferon蛋白的宿主細胞。如下所述，用含有編碼Novaferon的多核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌，并選取具有Novaferon蛋白最佳表達的一種大腸桿菌菌抹以用于生產(chǎn)Novaferon蛋白。一旦合成，所述蛋白質(zhì)可以以不溶性顆粒的形式保留在細胞質(zhì)中，或者可以以可溶形式分泌到細胞質(zhì)中。在前一種情況下，所述顆粒在裂解細胞體后回收，并用例如異硫氰酸胍或尿素變性。然后，通過下列方式獲得變性的多肽/Novaferon蛋白的重折疊用過量的稀釋溶液稀釋變性劑，或者逆尿素與還原型和氧化型谷胱甘肽組合的溶液進行透析，隨后逆緩沖鹽水溶液進行透析。在后一種情況下，所述蛋白質(zhì)能夠在破裂收獲的細胞后直接從周質(zhì)空間中以可溶的且有功能的形式回收，而無變性。通過避免變性和重折疊過程，可溶的Novaferon蛋白沒有遭到破壞并不含變形或錯誤折疊的蛋白質(zhì)分子。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌細胞系中產(chǎn)生的合成Novaferon蛋白的很大部分被分泌到細胞質(zhì)中。然后，如以下所描述的，純化該部分。活性分析和醫(yī)學用途如上所示，Novaferon蛋白與干擾素家族的許多成員顯示出序列同源性，特別是與由HuIFN-otl4的mRNA所翻譯的干擾素蛋白(圖2)。HuIFN-oc已經(jīng)顯示出寬范圍的生物學活性，包括抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性(10)。因為與HuIFN-a的同源性，預期Novaferon能表現(xiàn)出與HuIFN-oc相似的生物學功能，包括但不限于，抑制腫瘤的增殖、抗病毒活性、激活NK細胞、以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。特別重要的是不僅保留了HuIFN-ot樣功能特性，而且與HuIFN-oc相比，Novaferon蛋白的這些生物學功能的效力增強。為了驗證和確定其功能特性的效力，因而用標準的常規(guī)體外測定法來測定Novaferon蛋白的生物學活性，所述測定法i皮涉及用于檢測抗病毒和抗增殖特性。如以下實驗部分中所描述的，在一些實驗中，進一步在各種人癌癥類型的動物模型中觀察Novaferon蛋白的抗增殖特性的體內(nèi)效力，并與HuIFN-oc以及化學抗癌劑進行比較。許多用于測定HuIFN活性的合適測定法是本領(lǐng)域中熟知的。本發(fā)明者采用基于細胞的體外測定法系統(tǒng)來測定抗病毒和抗增殖活性。相同的體外測定法用于所有與本發(fā)明相關(guān)的程序和實驗，包括但不限于篩選人I型干擾素基因改組文庫，從人I型干擾素基因改組文庫的所表達的蛋白質(zhì)中選擇Novaferon,以及測定純的重組Novaferon蛋白的生物學活性。有許多通過觀察細胞對病毒的抗性程度來測量受試樣品/試劑的抗病毒活性的測定法(88)。已經(jīng)有3種主要的生物測定法用于測量HuIFN和它們的雜交體的抗病毒活性。根據(jù)用于測定病毒對于培養(yǎng)的細胞的各種不同方面的方法，將它們進行分類。用于測定病毒誘導的致細胞病變效應的抑制的測定法測量在用IFN預處理的培養(yǎng)的細胞中病毒誘導的裂解性致細胞病變效應的減少程度。該測定法可以在96孔板中進行(89),并已經(jīng)廣泛用于重組HuIFN-a，因為它為篩選大量樣品提供了一種簡1更方法。病毒噬斑形成的抑制是另一種定量HuIFN在組織培養(yǎng)物中的抗病毒活性的方法。噬斑減少測定法的結(jié)果不依賴于感染復數(shù)。此外，以高精確度可檢量到噬斑形成的50%減少。例如利用普遍存在的水泡性口膜炎病毒(VSV)來誘導噬斑形成，能夠通過篩選大量來自不同動物物種的細胞系來測定特定重組IFN的跨物種活性的特性(90)。第三種測定法基于測定病毒產(chǎn)量的減少。通常在單個細胞生長周期內(nèi)，通過釋放的病毒數(shù)量來測量病毒的產(chǎn)生。該測定法特別可用于測試IFN對于不引起致細胞病變效應的病毒或在粑細胞培養(yǎng)物中不形成噬斑的病毒的抗病毒活性。但是，在該測試中，感染復數(shù)影響由固定濃度的IFN所誘導的保護的表觀程度(91)。使用WISH細胞和水泡性口膜炎病毒(VSV)，通過標準的致細胞病變效應-抑制測定法來測量Novaferon的抗病毒活性。使用WHO國際標準的標準參考樣品95/650(rHuIFN-oc2a)和94/786(復合rHuIFN-a)，來測定并校準抗病毒活性。1個單位的抗病毒活性定義為，對于達到50%抑制VSV對培養(yǎng)的細胞的致細胞病變效應時所需要的蛋白質(zhì)量。正如下面進一步描述的，Novaferon蛋白的活性為2.5x109IU/mg，這為HuIFN-ct2b的活性的大約12.5倍。這些測試表明，與HuIFN—cc2b相比，Novaferon的抗病毒特性極大增強。Novaferon蛋白表現(xiàn)出這種增強的抗病毒效力，這為預測在人體內(nèi)的增強的抗病毒效應提供了基礎(chǔ)。基于HuIFN的性質(zhì)，預期Novaferon具有非常廣的抗病毒特性是合理的。換言之，對于寬范圍的病毒，Novaferon應當比天然的HuIFN更有效。Novaferon的增強的抗病毒效力可以轉(zhuǎn)化為在臨床情況下對于具有多種病毒疾病的患者的更好的抗病毒效應或更好的治療效應。正如上面所解釋的，IFN還通過多種機制來抑制細胞增殖和表現(xiàn)出潛在的抗腫瘤效應。利用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，已經(jīng)建立了幾種體外抗增殖測試，這在現(xiàn)有技術(shù)中進行了充分描述。在這些測定法中，可以通過下列方式來測量細胞增殖細胞計數(shù)；結(jié)晶紫生物測定法(92，93);對中性紅染料的化學敏感性(94~96);整合經(jīng)放射性標記的核苷酸(97);將5-溴-2'-脫氧尿苷整合入正在增殖的細胞的DNA中(98);使用四唑錯鹽(99，100)。人類淋巴母細胞Daudi細胞系對于HuIFN-a的抗增殖效應是非常敏感的，并且它的懸浮培養(yǎng)生長有助于定量其細胞數(shù)目(101)。該細胞系用于測量HuIFN-a和雜交體的抗增殖活性已經(jīng)有很多年了(102)。其他細胞系也可用于測試受試試劑的抗增殖活性。通過觀察由于向具有各種不同人腫瘤異種移植物的動物模型施用Novaferon而引起的肺瘤塊生長的抑制，而在體內(nèi)觀察到Novaferon蛋白的抗增殖活性。將Novaferon的體內(nèi)抗腫瘤效應與HuIFN-ct2b進行比較，并在一些異種移植模型中還與化學抗肺瘤試劑進行比較。正如下面所詳細描述的，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，用標準Daudi細胞方法測得的Novaferon的體外抗增殖活性的效力為天然HuIFN-ct2b的400倍，在所有天然HuIFN中，HuIFN-cc2b可能表現(xiàn)出最有效的抗增殖活性。Novaferon的增強的抗增殖效力是廣泛的和普遍的，因為它對于本發(fā)明者在體外所測試的所有人癌癥細胞系都表現(xiàn)出比天然HuIFN-a2b更有效或增強的抑制。這表明，Novaferon對人癌癥的有效抑制沒有選擇性。雖然Novaferon對于所有受試類型的人癌癥細胞系的增強的抗增殖活性程度不同，但它具有成為臨床情況下的廣譜抗癌劑的潛力。這是超過化學抗癌劑、單克隆抗體和其他靶特異性抗癌劑的顯著優(yōu)點。下面所描述的異種移植動物模型進一步確立了(1)與天然HuIFN-ot2b相比，Novaferon的體內(nèi)抗增殖效應極大地增強或更有效。(2)在相同的異種移植模型中，劑量低得多的Novaferon的體內(nèi)抗增殖效應比受試化學試劑5-氟尿嘧啶(5-FU)更好。(3)在異種移植模型中，Novaferon能夠達到癌癥生長的超過90%的抑制，但在受試動物中不引起體重減少、活力改變和其他消極的副作用，這與在經(jīng)5-FU治療的動物中顯著的體重減少和活力降低形成鮮明對比。這些結(jié)果表明，與天然HuIFN-oc2b相比，Novaferon的體外和體內(nèi)抗增殖特性極大增強。Novaferon的增強的抗增殖效力被轉(zhuǎn)化成小鼠動物模型中人腫瘤生長的有效抑制(>90%)，并且這種抑制似乎非常廣泛地作用于所有受試人癌癥類型，并且比傳統(tǒng)的抗癌劑5FU更好。這些結(jié)果還表明，Novaferon對于癌細胞生長的有效抑制對于所述癌細胞是非常特異的，而不針對正常細胞，其支持依據(jù)是，在經(jīng)Novaferon治療的動物中觀察到正常飲食和動作行為并且體重沒有減少。因此，Novaferon具有在所有或大部分人癌癥中發(fā)揮作用的可能性。在一個優(yōu)選的實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)分子(使用SEQIDNo:1的多核苷酸序列通過重組技術(shù)制備或化學合成)，可在人和/或非人物種中用于治療和/或預防任何和/或所有人來源或非人來源的肺瘤和癌癥。這些腫瘤例如包括但不限于，骨原性肉瘤；多發(fā)性骨髓瘤；何杰金??；結(jié)節(jié)性低分化淋巴瘤；急性淋巴細胞白血??；急性髓細胞白血??；乳腺癌；黑色素瘤；乳頭瘤；以及鼻咽癌，結(jié)腸癌，肝癌和黑色素瘤。在另一個實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)分子(使用SEQIDNo:1的多核苷酸序列通過重組技術(shù)制備或化學合成)，可在人和/或非人物種中用于治療和/或預防任何和/或所有病毒疾病。易感的病毒感染的例子包括但不限于，病毒性腦心肌炎，流行性感冒和其他呼吸道病毒感染，狂犬病和其他病毒性動物傳染病，和蟲媒病毒感染，以及單純皰滲性角膜炎，急性出血性結(jié)膜炎，水痘帶狀皰疹，和乙型和丙型肝炎，SARS和禽流感，人免疫缺陷綜合征(AIDS,HIV)。在另一個實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)分子(使用SEQIDNo:1的多核苷酸序列通過重組技術(shù)制備或化學合成)，可在人中用于治療和/或預防任何和/或所有免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥。免疫病癥的例子包括但不限于風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和斯耶格倫綜合征糖尿病。Novaferon蛋白還可以用于預防移植物抗宿主的排斥反應。在另一個實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)分子(使用SEQIDNo:1的多核苷酸序列通過重組技術(shù)制備或化學合成)，可作為免疫佐劑用于治療和/或預防任何和/或所有血管發(fā)生疾病。血管發(fā)生疾病的例子包括但不限于血管瘤、腫瘤誘導的新血管系統(tǒng)、與年齡相關(guān)的黃斑變性以及糖尿病性視網(wǎng)膜病。Novaferon蛋白可以單獨地或與任何其他蛋白質(zhì)/載體材料或其他構(gòu)建體一起，以任何藥學上可接受的制劑/配劑，通過任何施用/遞送途徑/方法，施用給人和/或非人物種，所述施用/遞送途徑/方法包括但不限于口服攝取、吸入、鼻內(nèi)噴霧、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、損傷內(nèi)或皮下注射。包含Novaferon蛋白作為活性成分的藥物學制劑/配劑可通過摻入合適的固體或液體載體來制備，其形式有液體、固體、半固體和/或任何其他臨床上可接受的形式，例如片劑、丸劑、粉末、液體溶液或懸浮液、脂質(zhì)體、栓劑、可注射溶液和可輸注溶液。含Novaferon的制劑/配劑可通過使用本領(lǐng)域中描述的或制藥工業(yè)實踐所普遍接受的常規(guī)載體、材料、方法來制備。含Novaferon的制劑/配劑還可通過使用本領(lǐng)域中還沒有描述的或制藥工業(yè)還沒有使用的非常規(guī)方法、材料來制備。例如，腸胃外配劑通常是注射液，其由藥物學和生理學上可接受的材料組成，例如水、生理鹽水、其他平衡的鹽溶液、含水葡萄糖、甘油等。此外，除了Novaferon蛋白外，注射液還可以包含其他蛋白質(zhì)，如載體，例如人血清白蛋白或血漿制品。藥物學制劑/配劑還可以包含少量無毒性的輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑和pH緩沖劑(例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯)。配制方法在現(xiàn)有技術(shù)中是熟^口的，并例J(口4苗述在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.PhamaceuticalSciences(75)中。具體的Novaferon蛋白制劑/配劑可以由所期望的臨床應用和/或使用方法來決定，并且可以由任何一個本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知技術(shù)來制備。例如，除了注射液之外，還可以采用局部和口服配劑。局部制劑可包括但不限于滴眼劑、軟膏劑和噴霧劑?？诜鋭┌ǖ幌抻谝后w形式(例如糖漿劑、溶液或懸浮液)，或固體形式(例如粉末、丸劑、片劑或膠嚢)。對于固體制劑/配劑，常規(guī)的無毒性固體載體包括但不限于制藥級別的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。制備這些制劑/配劑的實際過程和/或方法是已知的，或者對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將會顯而易見的(75)?？赏ㄟ^各種途徑將藥學上可接受的Novaferon蛋白的制劑/配劑施用給人和/或非人物種，所述途徑包括但不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)、陰道、直腸或眼內(nèi)遞送，以及在治療傷口時，直接局部用藥。根據(jù)臨床實踐，Novaferon蛋白在制劑/配劑中的濃度/數(shù)量可以為從>0至1.0M和/或從>0至100%(重量/重量)。每一個和/或所有Novaferon制劑/配劑的確切劑量、施用間隔和治療持續(xù)時間由臨床試驗、疾病狀況、患者狀態(tài)和衛(wèi)生保健提供者決定。在一個優(yōu)選的實施方案中，由于蛋白質(zhì)降解、全身與局部遞送的差異、合成新蛋白酶的速率、以及年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、藥物相互作用和病狀的嚴重性等等，可能需要調(diào)整Novaferon的施用，包括但不限于單次和/或總劑量、施用間隔、治療持續(xù)時間和必需的療程，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)實驗來確定。在一個優(yōu)選的實施方案中，在施用至人和/或非人物種的體內(nèi)后，Novaferon蛋白的循環(huán)半衰期可發(fā)生改變。這些改變包括但不限于Novaferon體內(nèi)半衰期的延長或縮短。Novaferon蛋白的體內(nèi)半衰期的延長可通過多種途徑來獲得，包括但不限于(1)Novaferon分子和單克隆抗體之間的復合物形成。此類抗體優(yōu)選地在不從本質(zhì)上削弱其治療功能的位點上與Novaferon蛋白連接(103)。(2)Novaferon與其他蛋白質(zhì)/多肽的融合復合物。Novaferon分子可以重組融合于其他蛋白質(zhì)/多肽，例如免疫球蛋白的恒定區(qū)片段(Fc)(104)。(3)Novaferon蛋白的綴合。例如，Novaferon蛋白可以綴合有非抗原性聚合物，例如聚乙二醇或相關(guān)的聚亞烷基二醇部分(105-108)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，治療性化合物可綴合至抗體，優(yōu)選抗Novaferon蛋白抗體。所述治療性化合物可以是細胞毒性試劑。在該方法中，通過經(jīng)綴合的抗體與Novaferon分子的結(jié)合，細胞毒性試劑可以被靶向肺瘤組織或細胞，從而破壞患病細胞并減少患病細胞的數(shù)目以達到癌癥癥狀的降低。細胞毒性試劑包括但不限于，細胞毒性藥物，毒素或此類毒素的活性片段，和放射性化學試劑。合適的毒素及其相應片段包括白喉毒素A鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、伊諾霉素等等。在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼Novaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQIDNo:l)的全長序列、部分序列和/或調(diào)控序列可由任何一個本領(lǐng)域技術(shù)人員用于基因療法相關(guān)的施用?；诰幋aNovaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQIDNo:1)的反義應用也可作為基因療法(即整合到基因組中)或作為反義組合物進行使用，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到的。在基因療法應用中，將基因?qū)爰毎瑥亩@得由這些基因編碼的靶蛋白的體內(nèi)合成。常規(guī)基因療法通過單次治療或重復施用治療有效的DM或mRNA來獲得持續(xù)的療效。另一方面，反義RNA和DNA還可用作治療劑，以在體內(nèi)阻斷某些基因的表達。已經(jīng)表明，可以將短的反義寡核苷酸遞送至細胞，在那里它們作為抑制劑發(fā)揮作用(109)。在一個優(yōu)選的實施方案中，全長或部分長度的編碼Novaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQIDNo:l)可用作DNA疫苗?？寐兜腄NA疫苗在本領(lǐng)域中一般是已知的(110)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知將全長或部分長度的編碼Novaferon的基因(SEQIDNo:1)作為DNA疫苗進行應用的方法，包括但不限于，將Novaferon基因或部分Novaferon基因置于啟動子的調(diào)控之下，以用于在人和/或非人物種中表達全長或部分長度的Novaferon蛋白。實施例下列實施例用于更完整地描述施用上述發(fā)明的方式，以及闡明考慮用于實現(xiàn)本發(fā)明的各種不同方面的最佳模式。應當了解，這些實施例決不限制本發(fā)明的真正范圍，而只是為了舉例說明目的而給出。所有在此引用的參考文獻作為整體引入本文作為參考。實施例1.從人白細胞cDM中PCR擴增出人IFN-a基因從人外周血白細胞中提取總mRNA。使用AdvantageRT-for-PCR試劑盒(Clontech,MountainView,CA，US)以及廠家推薦的cDNA合成引物(oligodT18)來制備cDNA。在MGPTC熱循環(huán)儀上通過PCR技術(shù)進行人IFN-cccDNA的擴增，釆用以下條件2.5m110x;/>擴增緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA,US)，0.75|a1lOmMd證，0.5)a125mMMgS(h，0.25|i1尸/"/細p尸zZM^炎合雜(2.5U/m1;Invitrogen,Carlsbad,CA，US),0.75ju1c飄，0.75m15'引物(10jaM;IFNa05:5'-TGGTGCTCAGCT(A/G)CAAGTC-3')(SEQIDNo:3)),0.75|i13'引物混合物(每個1.7MM;IF歸3-1:5LAATCATTTCCATGTTG(A/G)ACCAG-3'(SEQIDNo:4);IFNa03-2:-AATCATTTCCCGGTTGTACCAG-3'(SEQIDNo:5);IFNa03-3:5'-AATCATTTCCATGTTGAAACAG-(SEQIDNo:6);IFNa03-4:5'-AATCATTTCAAGATGAGCCCAG-3'(SEQIDNo:7);IFNa03-5:54ATGATTTTCATGTTGAACCAG-3'(SEQIDNo:8);IF歸3-6:5'-AATCATTT(C/G)(C/G)ATGTTGAACCAG-(SEQIDNo:9);IFNa03-7:5'-GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3'(SEQIDNo:10);IFNa03-8:5'-GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3'(SEQIDNo:11))。將擴增出的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，切取條帶，進行凝膠純化，并根據(jù)廠家推薦克隆入pCRII-T0P0或pCR-4-T0P0載體(Invitrogen,Carlsbad,CA，US)中。在ABI自動測序儀(PEAppliedBiosystems,CA，US)上，在PrismReadyReactionDyeTermination混合物中進行自動測序。由于在以上克隆中沒有發(fā)現(xiàn)所希望的關(guān)于IFNa6、IFNa7和IFNal6編碼序列的插入片段，所以在以上條件下再次進行PCR，除了類型特異引物外。對于特異性地擴增IFNa6，5'和3'引物分別為IFNa05:5'-TGGTGCTCAGCT(A/G)CAAGTC-3'(SEQIDNo:3)，和IFNa03-8:5'-GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3'(SEQIDNo:11)。對于特異性地擴增IFNa7,5'和引物分別為IFNa07U0:5'-ATGCCCCTGTCCTTTTCTTTAC-3'(SEQIDNo:12)，和IFNa03-5與IFNa03-6的等摩爾混合物。對于特異性地擴增IFNal6，所用5'和3'引物分別為IFNa7U0和IFNa03-7:-GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3'(SEQIDNo:10)。將擴增出的片段克隆入pCRII-TOPO或pCR-4-T0P0載體中，并如上進行測序。將所有克隆的I型人IFN-oc基因單獨地與Genebank中的那些DM序列進行比對。本文所涉及的這些基因的GeneBank核苷酸登錄號為NM—024013(IFN-ot1)，NM-000605(IFN-oc2)，NM一010504(IFN-ct4)，NM-010505(IFN-a5)，M—008335(IFN-ot6)，NM—008334(IFN-a7),NM—008336(IFN-a8),NM—002171(IFN-a10)，NM-002172(IFN-al4)，NM-002173(訓-al6)，NM-021268(IFN-a17)，NM—002175(IFN-oc21)。實施例2.構(gòu)建攜帶有I型HuIFN的質(zhì)粒的改組文庫為了構(gòu)建攜帶有I型人IFN-a之一的編碼序列的質(zhì)粒，基于成熟人I型IFN蛋白的單獨cDNA編碼區(qū)，合成了具有BamHI核EcoRI限制性酶切位點的15個堿基對的寡核苷酸(Genentech，SouthSanFrancisco,CA，US)。本文所涉及的這些蛋白質(zhì)的GeneBank核苷酸登錄號為NM—024013(IFN-al),NM_000605(IFN-a2)，NM-010504(IFN-ot4)，NM—010505(IFN-a5),NM_008335(IFN-a6)，NM—008334(IFN-a7)，NM—008336(IFN-ot8),NM—002171(IFN-a10)，NM-002172(IFN—a14)，NM一002173(IFN-ccl6)，NM—021268(IFN—a17)，NM-002175(IFN-oc21)。將在實施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒作為模板，和引物一起用于標準PCR(111)。得到的產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶(RE)BamHI和EcoRI進行酶切，并克隆入大腸桿菌表達載體pBVB中，這是pBV220的衍生表達質(zhì)粒，其在它的多克隆區(qū)域中含有BamHI位點和EcoRI位點(86)。這些最終構(gòu)建體都通過DNA序列分析進行驗證(PEAppliedBiosystems，US)。使用一對寡核苷酸BVF4:5'-AGGGCAGCATTCAAAGCAG-3'(SEQIDNo:13)和BVR3:-TCAGACCGCTTCTGCGTTCTG-3'(SEQIDNo:14)，以及使用前面構(gòu)建的攜帶有I型HuIFN的質(zhì)粒，通過PCR來擴增含有人IFNORF的DNA片段。將得到的產(chǎn)物等量混合并用DM酶I進行消化，并根據(jù)Stemmer(112)所描述的程序進行PCR組裝。組裝的PCR產(chǎn)物進一步通過一對內(nèi)部引物進行擴增BVF:5'-GAAGGCTTTGGGGTGTGTG-3'(SEQIDNo:15)和BVR:5'-AATCTTCTCTCATCCGC-3'(SEQIDNo:16)，接著用BamHI和EcoRI進行消化，并重新克隆入經(jīng)REBamHI和EcoRI酶切的大腸桿菌表達載體pBVB中。這些最終構(gòu)建體都通過DM序列分析進行驗證。將攜帶有改組的HuIFN-cc基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中。在以上所有PCR程序中，無論PCR擴增還是PCR組裝，都使用常規(guī)的DNA聚合酶(NewEnglandBiolab，MA，US),而不是高保真DNA聚合酶。實施例3.篩選改組文庫讓新轉(zhuǎn)染的大腸桿菌DH5oc細胞在LB平板上于37'C培養(yǎng)過夜。分別挑取單個菌落，并接種于在96孔板中的100p1含50|ag/ml氨千青霉素的LB培養(yǎng)基之中。菌落在30。C以250rpm搖動。在培養(yǎng)過夜后，將10|a1細菌培養(yǎng)物一式兩份地接種于在96孔板中的100|i1含50jug/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基之中。最初的平板(所謂的原種板(stockplate))暫時保存在4°C。將一式兩份的板中的細胞在30。C下培養(yǎng)，直到OD600變?yōu)?.4，然后用42。C誘導。經(jīng)4小時熱誘導后，將細菌培養(yǎng)物直接轉(zhuǎn)移到-80。C冷凍室中以開始冷凍-解凍循環(huán)。2個循環(huán)的冷凍-解凍后，將細菌懸浮液/裂解產(chǎn)物稀釋至所需濃度，并在將其暴露于Daudi細胞培養(yǎng)物以進行抗增殖測試(101)或暴露于Wish細胞培養(yǎng)物以進行抗病毒測試(113)。在每一輪篩選步驟中，將20，000個菌落進行初步篩選，并挑選出大約100個具有最高抗增殖或抗病毒活性的菌落以用于進一步的驗證性測試。將在原種板上的所挑選出的細菌培養(yǎng)物在含有50jug/ml氨千青霉素的LB平板上劃線。單個菌落在37。C下培養(yǎng)過夜，挑取之，并接種于在試管中的1ml含50jug/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基之中。試管中的細菌在3(TC下以250rpm搖動培養(yǎng)過夜。然后，將40jul經(jīng)培養(yǎng)的細菌接種在另一組試管之一中，所述試管含有l(wèi)ml具有氨千青霉素(50jug/ml)的LB。然后，按上文中關(guān)于初步篩選步驟時所描述的，讓樣品經(jīng)歷以下步驟誘導表達，收集細胞培養(yǎng)物，冷凍-解凍循環(huán)處理，和抗增殖或抗病毒測試。在每一輪篩選步驟中，在驗證性測試后挑選出大約20個具有最高抗增殖或抗病毒活性的菌落，以對質(zhì)粒及其插入片段進行自動測序。具有獨一無二的DNA序列的插入片段用一對PCR引物進一步擴增，即BVBF:5'-ACCATGAAGGTGACGCTC-3'(SEQIDNo:17);和BVR:5'-AATCTTCTCTCATCCGC-3'(SEQIDNo:16),它們分別是pBVB載體的多克隆位點上游和下游的側(cè)翼序列。擴增出的PCR產(chǎn)物用于下一輪改組文庫的構(gòu)建?；诳乖鲋郴蚩共《净钚缘脑黾?，進行5個循環(huán)的篩選步驟。實施例4.在大腸桿菌中表達并純化重組Novaferon蛋白在大腸桿菌中表達Novaferon蛋白(SEQIDNo:2)。將人工添加了起始密碼子ATG的SEQIDNo:1的閱讀框克隆入溫度可誘導的pBVB載體中從而置于入PRPL啟動子的調(diào)控之下(114)。將Novaferon表達質(zhì)粒pBVBNF轉(zhuǎn)化到DH5oc細胞中。分別挑取單個菌落，接種于2ml含50jug/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在3(TC下培養(yǎng)8小時。然后，取2ml培養(yǎng)的細菌，進一步用50ml含50iug/ml氨千青霉素的培養(yǎng)基在30。C下攪動培養(yǎng)過夜。第二天早上，將過夜培養(yǎng)的細菌按1:10~1:20的比例接種于含50jag/ml氨芐青霉素的大體積的LB培養(yǎng)基中，并于30。C攪動培養(yǎng)。當培養(yǎng)物達到生長對數(shù)中期時(A550=0.5-0.6),將培養(yǎng)溫度快速升高至42。C并維持4小時，以便誘導Novaferon的表達。經(jīng)4小時的熱誘導后，將細菌離心并用PBS(137mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04,2mMKH2P04)洗滌3次，然后保存在-8(TC直至進行純化。大多數(shù)Novaferon蛋白分子在此處描述的大腸桿菌生產(chǎn)系統(tǒng)中是可溶的，盡管它們在細胞質(zhì)中過表達。因此，通過細胞裂解緩沖液I(50mMTris-CI(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)，100mMNaCl)中的溶菌酶消化來破裂細胞。裂解產(chǎn)物進一步進行超聲處理以破裂剩余的完整細胞并剪接DNA分子。然后將裂解產(chǎn)物離心。上清液中的可溶性Novaferon蛋白分子依次通過疏水、離子交換層析和凝膠過濾進4于純化。首先，將上清液加載到PhenylSepharose6快速流動柱(GEHea1thcare，US)上并通過其。其次，將含有Novaferon蛋白的級分施加至P0R0S50D柱(AppliedBiosystem，US)上。第三，將含有Novaferon分子的級分用POROS50HS柱(AppliedBiosystems，US)進行純化。最后，將收集的Novaferon分子進一步用HiLoad26/100Superdex75pg(Amersham，US)進行純化。純的Novaferon蛋白的純度通過15%SDS-PAGE分析進行驗證。純的重組Novaferon蛋白顯示為單一的條帶，分子量(MW)為19-20KDa。質(zhì)譜法分析表明，純化的Novaferon分子的純度>98%，分子量為19313道爾頓，這與從其氨基酸序列推測的19315道爾頓的分子量相一致。實施例5.在大腸桿菌中表達并純化重組HuIFN-a2bHuIFN-a2b的表達質(zhì)粒pBV2b包含成熟HuIFN-a2b蛋白的cDM編碼區(qū)(GeneBank核苷酸登錄號NM—000605)，其處于熱可誘導的入PRPL啟動子的控制之下。HuIFN-cx2b的表達4艮據(jù)JosephS和DavidWR所描述的操作規(guī)程來進行(116)。將表達質(zhì)粒pBV2bF轉(zhuǎn)化到DH5ot細胞中。分別挑取單個菌落，接種于2ml含50jag/ml氨卡青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在30'C下培養(yǎng)8小時。然后，取2ml培養(yǎng)的細菌，進一步用50ml含50jug/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基在3(TC下攪動培養(yǎng)過夜。第二天早上，將細菌培養(yǎng)物按1:10~1:20的比例接種于含50jag/ml氨節(jié)青霉素的大體積的LB培養(yǎng)基中，并于30'C攪動培養(yǎng)。當培養(yǎng)物達到生長對數(shù)中期時(A550=0.5-0.6)，將培養(yǎng)溫度快速升高至42。C并維持4小時，以便誘導HuIFN-oc2b的表達。經(jīng)4小時的熱誘導后，將細胞離心并用PBS(137mMNaCl,2.7mMKC1，10mMNa2HP04，2mMKH2P04)洗滌3次，然后保存在-8G。C直至進行純化。HuIFN-a2b在此處描述的大腸桿菌表達系統(tǒng)中以不溶形式表達，因此根據(jù)MolecularCloning(115)所描述的操作規(guī)程來進行內(nèi)含體的回收和洗滌程序。簡言之，將收獲的細菌細胞重懸在細胞裂解緩沖液I(50mMTris-Cl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)，100mMNaCl)中，并通過溶菌酶和超聲處理來進行裂解。內(nèi)含體用冰冷的細胞裂解緩沖液II(補充有0.5%(v/v)TritonX-l00的細胞裂解緩沖液I)洗滌3次。通過在室溫下伴隨攪動在7N胍中懸浮4小時來破裂回收的內(nèi)含體。在4'C離心15分鐘后，使變性的蛋白質(zhì)在0.15MpH9.5Borex緩沖液中于4'C再折疊48小時。在最后一步再折疊時，用HC1將pH調(diào)整到7.4。然后，通過疏水、離子交換層析和凝膠過濾來純化含有經(jīng)折疊的HuIFN-a2b的溶液。首先，將溶液加載到PhenylSepharose6快速流動柱(GEHealthcare,US)上并通過其。其次，將含有HuIFN-ot2b的級分施力口至POROS50D柱(AppliedBiosystem,US)上。第三，將含有HuIFN-a2b的級分用POROS50HS柱(AppliedBiosystems,US)進行純化。最后，將收集的HuIFN-a2b分子進一步用HiLoad26/100Superdex75pg(Amersham，US)進行純化。在15。/。SDS-PAGE分析中，純的HuIFN-a2b蛋白顯示為單一的條帶，并且通過質(zhì)譜法證實其純度為>98%。實施例6.測定Novaferon的抗病毒活性使用在ArmstrongJA(113)所描述的傳統(tǒng)操作規(guī)程中的WISH-VSV系統(tǒng)來測定抗病毒活性。第一天，將WISH細胞(ATCC,目錄號CCL25)以14，000個細胞/孔的密度接種于96孔板中，并于37'C孵育。24小時后，在每孔中加入2倍系列稀釋的Novaferon、HuIFN-oc2b、WHO人IFN國際標準品或空白培養(yǎng)基，并于37。C再孵育24小時。第三天，去除培養(yǎng)基，替換成含有l(wèi)，OOOPFU的水泡性口膜炎病毒(VSV,ATCC，目錄號VR-1421)的培養(yǎng)基。細胞再次在37。C孵育24小時，接著用0.85%的NaCl洗滌以去除死細胞。然后，將培養(yǎng)板在染料固定溶液(dye-fixersolution)(0.5%結(jié)晶紫，5。/o福爾馬林(V/V),50%乙醇(V/V)，和0.85%NaCl)中浸泡1小時。接著，輕輕倒出染料固定溶液，并用自來水充分漂洗微量培養(yǎng)板并讓其干燥。用0.2ml2-甲氧基乙醇來溶解染色的細胞。對于結(jié)晶紫生物測定法，在Model0psysMR(The函Labsyst面，US)中于550nm讀取平板。所有實驗重復3次，Novaferon和HuIFN-cc2b樣品在同一塊平板中測試。對于在此制備的Novaferon和HuIFN-a2b的抗病毒活性作平行分析，參照WHO國際標準品94/786(復合rHuIFN-a)和95/650(rHuIFN-ot2a)來測定抗病毒單位(國際單位或IU)，這些WHO國際標準品可從NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl(NIBSC，USA)購得。為2.5xl09IU/mg，而HuIFN-ot2b的抗病毒活性為2.0x108IU/mg。該數(shù)據(jù)表明，Novaferon蛋白的抗病毒活性為HuIFN-cx2b的大約12.5倍。實施例7.Novaferon的抗增殖活性抗增殖活性分析基本上如Evinger和Pestka所述的來進行(101)。A.人腫瘤細胞系的細胞培養(yǎng)人腫瘤細胞系從不同機構(gòu)購買得到(下表1)，即ATCC(AmericanTypeCultureCollection,P.O.Box1549,Manassas,VA20108，USA)，DSMZ(GermanNationalResourceCentreforBiologicalMaterial,DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MascheroderWeglb，38124Braunschweig,Germany)，JCRB(JapaneseCollectionofResearchBioresources-Cel1Bank，NationalInstituteofBiomedialInnovation,7-6-8Saito-Asagi，Ibaraki-shi,Osaka567-0085，Japan)。表l.人腫瘤細胞系細胞系腫瘤代碼機構(gòu)*A-375黑色素瘤CRL1619ATCCIGR-1黑色素瘤Acc236畫ZIGR-37黑色素瘤Acc237DSMZIPC-298黑色素瘤Acc251DSMZHCT-8結(jié)腸直腸腺癌CCL-244ATCCSW1116結(jié)腸直腸腺癌CCL-233ATCCLS180結(jié)腸直腸腺癌CL-187ATCCDU)-l結(jié)腸直腸腺癌CCL-221ATCCLS174T結(jié)腸直腸腺癌CL-188ATCCHepG2肝細胞癌HB-8065ATCCHep3B肝細胞癌HB-8064ATCCHuH-7肝癌0403JCRBPLC/PRF/5肝癌CRL-8024ATCCHL60(S)淋巴細胞的0163JCRBDaudi伯基特淋巴瘤CCL-213ATCCL-428何杰金淋巴癌Acc197DSMZDU145前列腺癌HTB-81ATCCPC-3前列腺癌Acc465DSMZMKN1胃腺癌0252JCRBKYSE30食管癌0188JCRBA549肺癌CCL-185ATCCHeLa子宮頸腺癌CCL-2ATCCC-33A子宮頸癌HTB—31ATCC*DSMZ:德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen),GermanyATCC:美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，USAJCRB:JapaneseCollectionofResearchBioresources-Cel1Bank,Japan于37。C在含有5%C02的潮濕氣氛中培養(yǎng)所有用于抗增殖活性測試的細胞。細胞根據(jù)每種細胞的生長手冊，在基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基中進行生長，例如DMEM、MEM、F12K和1640或者1640加上F12(所有均來自GibcoBRL，US)，其補充有5-20%來自GibcoBRL，US的熱滅活胎牛血清FBS。每種細胞系的基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基列在下表2中。所有細胞系每天在培養(yǎng)板中用倒置顯微鏡進行檢查。在其對數(shù)生長期(通過臺盼藍染料排除法測得生存力超過90%)時，收獲細胞并用于實驗。在標準血細胞計數(shù)器中檢查細胞數(shù)和生存力。表2.人腫瘤細胞系的培養(yǎng)和測量方法細胞系培養(yǎng)基細胞/孔測量方法IGR-1DMEM5000結(jié)晶紫生物測定法IGR-37DMEM2000結(jié)晶紫生物測定法IPC-29816402000結(jié)晶紫生物測定法HCT-81640500結(jié)晶紫生物測定法LS180MEM3000結(jié)晶紫生物測定法DLD-116401500結(jié)晶紫生物測定法HepG2MEM1000結(jié)晶紫生物測定法Hep3BMEM800結(jié)晶紫生物測定法HuH-7DMEM4000結(jié)晶紫生物測定法PLC/PRF/5MEM6000結(jié)晶紫生物測定法KYSE301640+F121000結(jié)晶紫生物測定法DU145MEM1000結(jié)晶紫生物測定法PC-3MO1A549HL60(S)LS174THeLaC-33AA—375SW111616401640F12K1640MEMMEMMEMDMEM16401640164020002000400100040005001000200800400800結(jié)晶紫生物測定法結(jié)晶紫生物測定法結(jié)晶紫生物測定法結(jié)晶紫生物測定法結(jié)晶紫生物測定法結(jié)晶紫生物測定法結(jié)晶紫生物測定法結(jié)晶紫生物測定法直接細胞計數(shù)DaudiL-428直接細胞計數(shù)直接細胞計數(shù)B.抗增殖分析的程序?qū)?shù)生長期的細胞系輕輕地懸浮在溫熱的(36°C)培養(yǎng)基中，密度為2x103-6x1(T個細胞/ml(隨細胞系而變化，見表2)。在96孔板的每個孔中接種入100m1細胞懸浮液，接著在37。C孵育6-8小時。然后，一式三份地向孔中加入相同體積(lOOial)的在培養(yǎng)基中稀釋的Novaferon或HuIFN-ct2b。輕輕搖動培養(yǎng)板4-5秒以混合內(nèi)容物，并在37。C孵育6天。在同一平板中測試Novaferon和HuIFN-cc2b才羊品以^f呆i正可比性。使用兩種方法來測定細胞孔中的細胞數(shù)目，并根據(jù)細胞數(shù)目來計算Novaferon和HuIFN-cc2b的抗增殖活性。使用直接細胞計數(shù)法來測定懸浮細胞的細胞數(shù)目。培養(yǎng)6天后，用臺盼藍(終濃度0.02%)稀釋懸浮細胞培養(yǎng)物，并用血細胞計數(shù)器直接對細胞數(shù)目進行計數(shù)。結(jié)晶紫生物測定法用于測定粘著細胞的細胞數(shù)目(93)。培養(yǎng)6天后，通過在培養(yǎng)孔中吹吸PBS來去除死細胞。接著，在孔中注滿染料固定溶液以使活細胞染色1小時。染料固定溶液在蒸餾水中含有0.5%結(jié)晶紫，5%福爾馬林(V/V)，50%乙醇(V/V)，和0.85%NaCl。然后，用自來水充分漂洗微量培養(yǎng)板并讓其干燥。用0.2ml2-曱氧基乙醇來溶解染色的細胞。測量在550nm處的光密度(OD550)(ModelOpsys平板閱讀器，ThermoLabsystems,US)，并用作細月包數(shù)目的相對指標。通過以下公式計算生長抑制率抑制率。/。-(l-(E-B)/(C-B))x100,其中E為在第6天在經(jīng)Novaferon或HuIFN-oc2b處理的孔中的細胞數(shù)或OD^值；B為培養(yǎng)細胞在第0天在細胞培養(yǎng)物中的細胞數(shù)或OD"。值；C為在第6天在未處理的孔中的細胞數(shù)或ODss。值。抑制率與化合物的濃度一起表示。通過使用一系列樣品濃度來估算Novaferon或HuIFN-ot2b的IC5。。將所述數(shù)據(jù)擬合成S形曲線(117)，其具有Hill斜率方程Y=Min+(Max-Min)/(l+10A(IC5。-X)),其中X為藥物濃度的對數(shù)；Y為抑制率；Min或Max為最小或最大抑制率平臺?？梢员容^各種不同化合物對于某一特定靶的IC5。，其中I"越低表示化合物越有效。Novaferon和HuIFN-a2b的濃度和相應的對于Daudi細胞系的細胞生長抑制率在圖4中給出。根據(jù)該數(shù)據(jù)，計算得到Novaferon和HuIFN-a2b抑制Daudi細胞生長的IG。為0.0174pmol和6.9550pmol。因此，Novaferon的IC;。是HuIFN-a2b的大約1/400，這表示Novaferon的抗增殖效力為HuIFN-a2b的大約400倍。在23種腫瘤細胞系中，評估Novaferon的抗增殖活性，并與HuIFN-a2b的抗增殖活性進行比較，所述23種腫瘤細胞系包括4種源自黑色素瘤的細胞系(A-375，IGR-l,IGR-37，IPC-298)，5種結(jié)腸直腸腺癌細胞系(HCT-8，SW1116，LS180,DLD-1，LS174T)，4種肝癌細胞系(HepG2，Hep3B，HuH-7,PLC/PRF/5)，3種淋巴瘤細胞系(HL-60(S)，Daudi,L-428)，2種前列腺癌細胞系(DU145,PC-3)，2種子宮頸癌細胞系(HeLa，C-33A),1種胃腺癌細胞系(MKN1)，1種肺癌細胞系(A549)和1種食管癌細胞系(KYSE30)。針對所有受試癌細胞系，Novaferon表現(xiàn)出比HuIFN-oc2b強得多的抗增殖活性。效力的增加程度在不同的癌細胞系中有變化，從16到1134倍(下表3)。表3.Novaferon和HuIFN-a2b的ICs。值以及Novaferon相對于HuIFN-ot2b的腫瘤細月包抑制增加倍數(shù)IC5。(pmol)倍數(shù)細胞系HuIFN-cc2bNovaferon(Novaferon/HuIFN-oc2b)PLC/PRF/50.04070.002516A5494.270.220219DU1450.13190.003636HepG20.17180.00443HuH-70.14740.002658Hep3B4.39340.075858IPC-2980.05160.000770LS174T0.01650.000274IGR-370.60170.0055109PC-31.87770.0146128HeLa0.23640.0017141C-33A2.52420.0176143MKN10.2330.0011207HCT-82.94790.0139212SW11160.22780.001222DLD-10.39770.0014282HL-60(S)0.58550.0019306LS1800.75790.0022350Daudi6.9550.0174400KYSE301801340.0264683A-3751.41340.0019733IGR-16.67180.0076876L-4281727890.01521134實施例8.體內(nèi)腫瘤模型實驗A.細胞培養(yǎng)和體內(nèi)人腫瘤異種移植模型結(jié)腸癌細胞系(LS180)、黑色素瘤細胞系(A-375)和肝癌細胞系(HepG2)從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,Rockville，MD)獲得。前列腺癌細胞系(PC-3)從德意志微生物保藏中心(DSMZ,DeutscheSammlungvonMikroorganismenandZellkulturen，Germany)獲得。淋巴細胞系(HL60(S))從JapaneseCollectionofResearchBioresourcesCellBank(JCRB，Japan)購買得到。所有細胞根據(jù)它們的規(guī)程(見表1)進行培養(yǎng)。簡言之，LS180和HepG2培養(yǎng)在MEM培養(yǎng)基中。A-375培養(yǎng)在DMEM中。兩種培養(yǎng)基都補充有10%胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、10GU/ml青霉素、1GQmg/ml鏈霉素、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸鈉。PL-3和HL60(S)細胞培養(yǎng)在RPMI1640中，其補充有10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。所有細胞都于37。C維持在5%c02氣氛中。用Beverly等人描述的方法(118)建立人癌癥移植模型。從組織培養(yǎng)板上收獲對數(shù)生長的癌細胞，洗滌，并重懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH=7.5,20mM)中。在6周齡無胸腺Balb/c棵鼠的兩脅，通過皮下注射6x106個細胞/0.3ml(PC-3，HepG2)，4乂106個細胞/0.3mlUS180),2x107個細胞/0.3ml(HL60(s))或8x106個細胞/0.3ml(A-375),產(chǎn)生了皮下腫瘤移植物。對于每種體內(nèi)腫瘤模型，在腫瘤細胞接種后第6天，將攜帶有腫瘤的小鼠(腫瘤體積為大約100mm3)隨機分成7或8組，每組有相同數(shù)目的動物，并開始治療。將Novaferon和HuIFN-ct2b用PBS溶液配制。每天皮下注射單獨的PBS，各種不同劑量的Novaferon,或HuIFN-a2b，從小鼠分組當天開始，共持續(xù)30天(PC-3，HepG2，A-375)、28天(LS180)或21天(HL60(s))。對于的治療，每兩天一次靜脈內(nèi)施用30mg/kg的5-FU，共5次。組和治療劑量概括在下面組1(對照)每天PBS。組2n氐劑量Novaferon):每天1.25|jig/kg。組3(中等劑量Novaferon):每天12.5jag/kg。纟且4(高劑量Novaferon):每天125iag/kg。組5(低劑量HuIFN-ct2b):每天1.25pg/kg。組6(中等劑量HuIFN-oc2b):每天12.5mg/kg。組7(高劑量HuIFN-a2b):每天125ug/kg。組8(5-FU):30mg/kg，每2天一次靜脈內(nèi)施用，共5次。一旦開始治療，胂瘤用測徑器每周測量一次。使用以下公式計算腫瘤體積體積-O.5x寬度、長度。在治療停止當天(治療開始后第30天)，將小鼠處死。分離實體瘤，照相，并測量。使用以下公式計算生長抑制率抑制率^1-T/C]x100%，其中T為Novaferon、HuIFN-oc2b或5-FU治療組中肺瘤的平均重量；C為在治療后對照組中腫瘤的平均重量。B.人前列腺癌異種移植模型前列腺癌PC-3異種移植物通過皮下注射1.25、12.5或125ng/kgNovaferon來進行治療，持續(xù)30天。Novaferon表現(xiàn)出強的、劑量依賴性的對于PC-3腫瘤生長的抑制(代O.05)。如圖5和下面的表4中所示，與PBS治療的對照組相比，Novaferon治療組的PC-3腫瘤生長被大大抑制。例如，Novaferon治療組(125Mg/kg)中PC-3異種移才直腫瘤塊的平均重量為0.091±0.081g，這與對照組動物的1.948±0."g相比，具有非常顯著的降低(代O.001)(表4)。換言之，以125pg/kg治療30天，獲得了PC-3腫瘤生長的95.3。/。抑制(表4)。表4.用Novaferon和HuIFN-oc2b治療的人前列腺癌PC-3異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率(n=10)組劑量腫瘤重量(g)抑制率()ig/kg)(平均值土SD)(%)對照—1.948±0.567—<氐劑量Novaferon1.251.266±0.457*35.0中等劑量Novaferon12.50.759±0.574***61.0高劑量Novaferon1250.091±0.081***395)95.3低劑量HuIFN-a2b1.251.284±0.86234.1中等劑量HuIFN-cc2b12.50.790±0.391"*59.4高劑量HuIFN-a2b1250.476±0.271***75.6注*/K0.05，***/K0.001:與對照組相比；翻/KO.001:與高劑量HuIFN-ot2b組相比。在將6x106個活PC-3細胞皮下導入小鼠后，Balb/c棵鼠通過每天皮下注射Novaferon(1.25jug/kg，12.5pg/kg或125|jg/kg)來治療30天。結(jié)果表示為平均腫瘤體積(mm3)。圖5顯示，與PBS對照組相比，所有3個劑量的Novaferon都表現(xiàn)出劑量依賴性的PC-3腫瘤生長抑制(代O.05)。125jng/kg的Novaferon誘導比相同劑量的HuIFN-ct2b強得多或幾乎完全的PC-3肺瘤生長抑制(95.3%對75.6%，代O.01)(表4)。有意義的是注意到，更長時間的Novaferon或HuIFN-oc2b治療可導致在高劑量(125jag/kg)治療組中胂瘤生長抑制的更大差異。第28天，Novaferon治療組中的PC-3腫瘤塊的平均體積為107.9±68.7mm3，而HuIFN-ct2b治療組中為620.7±296.6mm3(代O.001)，第30天分別為122.1±100.7mm3和691.9±428.3mm3(代O.001)。這還發(fā)生在觀察結(jié)束后考慮平均肺瘤重量(在高劑量Novaferon組中為0.091±0.081g，而在高劑量HuIFN-a2b組中為0.476±0.271g，尸<0.OOl)時。這表明，在該異種移植才莫型中，該劑量Novaferon的更長時間治療可展現(xiàn)出更好或完全的PC-3腫瘤生長抑制。C.人肝癌異種移植模型還在肝癌HepG2異種移植模型中評價Novaferon的體內(nèi)抗腫瘤活性。與對照組相比，Novaferon表現(xiàn)出有效的、劑量依賴性的HepG2月中瘤生長抑制(代0.001)。在Novaferon治療組(每天皮下注射1.25、l2.5或125jug/kg，持續(xù)30天)中的平均腫瘤體積分別為783.2±270.0、459.3±414.3和104.6±56.5mm3，而在PBS對照組中為2125.8±743.1mm3。用125|ug/kg的Novaferon治療30天，達到了HepG2的最高抑制(96.6%)，這顯著好于125jag/kgHuIFN-a2b的抑制率(89.2%，代O.Ol)。該劑量Novaferon的更長時間治療顯示出，更加好或完全的抑制趨勢。在^見察期結(jié)束時，對于Novaferon治療組在mg/kg的情況下平均腫瘤重量為0.074±0.083g，這顯著低于125Mg/kgHuIFN—cc2b治療組的平均肺瘤重量(0.235±0.199g，戶復001)(下表5)。在將6x106個活HepG2細胞皮下導入小鼠后，Balb/c棵鼠通過每天皮下注射Novaferon(1.25mg/kg，12.5jag/kg和125/jg/kg)來治療30天。結(jié)果表示為平均胂瘤體積(腿3)。圖6顯示，與PBS對照組相比，所有3個劑量的Novaferon都表現(xiàn)出劑量依賴性的HepG2肺瘤生長抑制(代O.001)。125(ig/kg的Novaferon誘導比相同劑量的HuIFN-a2b強得多或幾乎完全的HepG2腫瘤生長抑制(96.6%對89.2%，線05)(表5)。表5.用Novaferon和HuIFN-ct2b治療的人肝癌細胞HepG2異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率(n=10)組劑量(g/kg)腫瘤重量(g)(平均值土SD)抑制率(％)對照—2.179±0.578-4氐劑量Novaferon1.250.797±0.397***63.4中等齊'J量Novaferon12.50.321±0.300***85.3高劑量Novaferon1250.074±0.083***6)96.6低劑量HuIFN-a2b1.251.070±0.587**50.9中等劑量HuIFN-cc2b12.50.531±0.287***75.6高劑量HuIFN-a2b1250.235±0.199***89.2注**/<0.01，***p<0.001:與對照組相比；Q;<0.01:與高劑量HuIFN-a2b組相比。D.人黑色素瘤異種移植模型進一步在惡性黑色素瘤A-375異種移植模型中評價Novaferon的體內(nèi)抗胂瘤活性。A-375細胞系(ATCC編號CRL-1619)來源于人惡性實體瘤。與對照組相比，Novaferon表現(xiàn)出有效的、劑量依賴性的A-375胂瘤生長抑制(代O.OOl)。在Novaferon治療組(每天皮下注射1.25、12.5或125;ag/kg,持續(xù)28天)中的抑制率分別為40.1%、75.0%和82.8%，這與PBS對照組形成對比(尸<0.001)(下表6)。用125pg/kg的Novaferon治療30天，達到了A-375的最高抑制(82.8%)，這顯著好于125mg/kgHuIFN-a2b的抑制率(69.9%，線001)。有意義的是，Novaferon表現(xiàn)出相比化療劑5-FU而言更有效的黑色素瘤細胞A-375生長抑制(表6)。例如，在第30天，在用12.5Mg/kg或125jug/kgNovaferon進行治療的組中平均腫瘤重量為0.763±0.187g(尸<0.01)和0.527±0.149g(尸<0.001)，而用30mg/kg5-FU治療的組的平均腫瘤重量為1.004±0.105g(表6)。這表明，對于治療人黑色素瘤A-375，Novaferon可能比5-FU更有效。在將8x106個A-375細胞皮下導入小鼠后，Balb/c棵鼠通過每天皮下注射Novaferon(1.25yg/kg，12.5jag/kg和125(ag/kg)來治療28天。結(jié)果表示為平均肺瘤體積(mm3)。圖7顯示，與PBS對照組相比，所有3個劑量的Novaferon都表現(xiàn)出劑量依賴性的A-375腫瘤生長抑制(尸<0.001)。125jag/kg的Novaferon誘導比相同劑量的HuIFN-a2b更強的A-375腫瘤生長抑制(82.8%對69.9%，戶<0.001)(圖7)。12.5ng/kg和125jag/kgNovaferon所顯示出的腫瘤生長抑制(分別為75.0%和82.8%)均比5-FU(67.2%,戶<0.01和尸<0.001)更好(圖7)。表6.用Novaferon和HuIFN-cc2b治療的人黑色素瘤細胞A-375異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>注***p<0.001，與對照組相比；$$$/K0,001:與中等劑量(12.5)HuIFN-ct2b相比;麵p<0.001:與高劑量(125)HuIFN-a2b組相比;&&:p<0.01，/K0.001，與5-FU組相比。E.人結(jié)腸癌異種移植模型在結(jié)腸癌LS180異種移植模型中評價Novaferon的體內(nèi)抗腫瘤活性。LS180細胞系(ATCC編號CL-187)來源于人結(jié)腸腺癌。與對照組相比，Novaferon表現(xiàn)出有效的、劑量依賴性的結(jié)腸癌LS180肺瘤生長抑制(尸<0.001)。在Novaferon治療組(每天皮下注射1.25、12.5或125jug/kg，持續(xù)28天)中的抑制率分別為75.0%、80.5%和92.5%，與PBS對照組形成對比(代O.001，下表7)。用125jag/kg的Novaferon治療28天，達到了LS180腫瘤生長的最高抑制(92.5%)，這顯著好于125jlig/kgHuIFN-cc2b的抑制率(82.3%，尸<0.001)。治療28天后，在平均腫瘤重量方面，12.5pg/kgNovaferon對LS180癌癥異種移植物生長的抑制與5-FU(30mg/kg)相似(0.815±0.221g對0.758±0.227g)。125jug/kgNovaferon對LS180月中瘤生長的抑制顯著好于30mg/kg5-FU(92.5%對81.8%,代0.001)(表7和圖8)?？紤]到5-FU在結(jié)腸癌患者的標準化療中的常規(guī)臨床應用，這些觀察結(jié)果是非常有意義的。Novaferon在動物模型中對于LS180腫瘤生長的更好的抑制表明，Novaferon具有成為在臨床情況下非常有效的抗結(jié)腸癌試劑的潛力。在將4xl()6個活LS180細胞皮下導入小鼠后，Balb/c棵鼠通過每天注射Novaferon(1.25mg/kg，12.5mg/kg和125|ag/kg)來治療28天。結(jié)果表示為平均腫瘤體積(匪3)。圖8顯示，與PBS對照組相比，所有3個劑量的Novaferon都表現(xiàn)出劑量依賴性的LS180腫瘤生長抑制(線OOl)。125mg/kg的Novaferoni秀導比相同劑量的HuIFN-a2b更強的LS180腫瘤生長抑制(92.5%對82.3%,戶<0.001)(表7)。1.25jag/kg和12.5jug/kgNovaferon都獲得與5-FU(81.8%)相似的腫瘤生長抑制(分別為75.0%和80.5%)(表7，圖8)。但是，125|ag/kgNovaferon表現(xiàn)出比5-FU好得多的LS180腫瘤生長抑制(92.5%對81.8%，代O.001)。表7.用Novaferon和HuIFN-ct2b治療的人結(jié)腸癌細胞LS180異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率(n-10)<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>注***;<0.001，與對照組相比；誦，;KO.001:與高劑量HuIFN-oc2b相比；&&&，/7<0.001，與5-FU組相比。F.人白血病異種移植模型還在HL60(s)淋巴細胞白血病異種移植模型中評價Novaferon的體內(nèi)抗腫瘤活性。與對照組相比，Novaferon表現(xiàn)出有效的、劑量依賴性的HL60(s)腫瘤生長抑制(代O.001)。在Novaferon治療組(每天皮下注射1.25、12.5或125jag/kg，持續(xù)28天)中的抑制率分別為43.8%、55.2%和80.4%,與PBS對照組形成對比(代O.001，下表8)。用125|ag/kg的Novaferon治療21天，達到了HL60(s)腫瘤生長的最高抑制(80.4%)，這顯著好于125|ag/kgHuIFN-oc2b的抑制率(69.8%，代O.05)。在將2xl(T個活HL60(s)細胞皮下導入小鼠后，Balb/c小鼠通過每天皮下注射Novaferon(1.25jag/kg,12.5|ag/kg和125jag/kg)來治療21天。結(jié)果表示為平均肺瘤體積(蘭3)。圖9顯示，與PBS對照組相比，所有3個劑量的Novaferon都表現(xiàn)出劑量依賴性的HL60(s)腫瘤生長抑制(代O.001)。125jug/kg的Novaferoni秀導比相同劑量的HuIFN-a2b更強的HL60(s)腫瘤生長抑制(80.4%對69.8%,代0.05)，和誘導與5-FU相似的抑制(圖9,表8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>G.小鼠在Novaferon治療期間的總體狀態(tài)在Novaferon、HuIFN-cc2b或5-FU治療期間，密切觀察具有各種不同的人癌癥異種移植物的小鼠。不同于在5-FU治療組中，在所有Novaferon或HuIFN-ct2b治療組中的小鼠通常正常地飲食和行為，并且沒有體重減少。經(jīng)5-FU治療的小鼠顯示出典型的飲食和行為變化，并且體重減少。這些觀察結(jié)果表明，雖然在異種移植動物模型中顯示出與5-FU相似或更好的抗癌效力，但Novaferon在關(guān)于腫瘤細胞的抑制方面可能更特異，并且對正常細胞和/或生理功能的影響少得多。這些在人的應用中可轉(zhuǎn)化成更好的耐受性和優(yōu)異的治療效果。正如依據(jù)前面的公開內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員將會清楚的，在實踐本發(fā)明中可能進行許多改變和修飾，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。因此，應根據(jù)所附權(quán)利要求書中所限定的實質(zhì)來確立本發(fā)明的范圍。參考文獻.Interferonnomenclature.Nature.980;286(5769):102.saacsAandLindenmann.，.Productionofvirialinterferingsubstance.USPatNo:369922.October17，19723.JonaschEandHaluskaFG.Interferoninoncologicalpractice:reviewofinterferonbioogy，cinicaapplications,andtoxicities.Oncologist.2001;6(":34-554.LengyelP.Biochemist^ofinterferonsandtheiractions.AnnuRevBiochem.982;5〗:25-2825.GresserIandToveyMGAntitumoreffectsofinterferon.BiochimBiophysActa.978;516(2):23-2476.SamuelCE.Antiviralactionsofinterferons.ClinMicrobioRev.2001(14(4):778-8097.Theof"opoulosAN，eta〗.Type1interferons(alpha/beta)inimmunityandautoimmunity.AnnuRevImmunol.2005;23:307-3368.UzeGetal.Alphaandbetainterferonsandtheirreceptorandtheirfriendsandrelations.JInterferonCytokineRes.995;5(1):3-269.KnightEJr.Interferon:purificationandinitialcharacterizationfromhumandiploidcells,ProcNatlAcadSciUSA.1976;73(2):520-52310.PestkaS,etal.Interferons,interferon-likecytokines^andtheirreceptors.ImmunolRev.2004;202:8-3211.HorisbergerMAandDiMarcoS.Interferon-alphahybrids.PharmacolTher.1995;66(3):507-53412.HortonKM,etal.Amitumoreffectsonnterferon~omega:invivotherapyofhumantumorxenograftsinnudemice.CancerRes.1999;59(I6):4064~406813.HardyMP,eta.Characterizationofthetype1interferonlocusandidentificationofnovelgenes.Genomics.2004j84(2):331-345.14.Chen丄etal.Humanimerferon-s:atypeIinterferon.USPatNo:6569420.May27.200315.PestkaS，etal.1nterleukin冊0加dreleatedcytokinesandreceptors.AnnuRevImmunol2004，22:929-9796.NardelliB，etal.RegulatoryeffectoflFN-kappa^anoveltypeIIFN，onc，kineproductionbycellsoftheinnateimmunesystem.J.Immunol.2002;169(9):4822-483017.LaFle.urDW,etal.Interferon-kappaanoveltypeIinterferonexpressedinhumankeratinocytes.JBiolChem.2001;276(43):39765-3977118.SubramaniamPS，JohnsonHM.TheIFNARlsubunitofthetypeIIFNreceptorcompexcontainsafunctionalnuclearlocalizationsequence.FEBSLett.2004;57S(3):207-2109.GoodbouraS，etal.Interferons:cellsignalling,immunemodulation,antiviralresponseandviruscountermeasures.JGenVirol.2000;81(Pt10):234-236420.WangK,etal.InhibitionofneutrophilapoptosisbytypeIFNdependsoncross-talkbetweenphosphoinositol3-kinase，proteinkinaseC-ddta^andNF-lcappaBsignalingpathways.JImmunol.2003;171(2):035-104121.KatzeMGInterferon,PKJF^virology,andgenomics:whatispastandwhatisnextinthenewmil)enniumJInterferonCytokineRes.2002;22(3):283-28622.Cha、v.ia-SarkarM,etal.Apoptosisandinterferons:roeofinterferon-stimulatedgenesasmediatorsofapoptosis.Apoptosis.2003;8(3):237-24923.K〗rkwoodJ.Cancerimmunotherapy:theinterfercm-alphaexperience.SeminOncol.2002;29(3Supp7):8-2624.HofrnannV，etal.Hairycellleukemia:aninterferondeficientdiseaseCancerTreatRev.1985;S叩plB:33-3725.StoneRM，eta.Recombinanthumangammainterferonadministeredbycontinuousintravenousinftisioninacutemyelogenousleukemiaandmyelodysplasticsyndromes.AmJClinOncol.1993;16(2):159-16326.TalpazM，etal.HumanleukocyteinterferontocontrolthrombocytosisinchronJcmyelogenousleukemia.AnnlntemMed.1983;99(6):789-79227.TalpazM,etal.Changesingranulocyte-monocytecoony-formingcellsamongjeukocyte-interferon-treatedchronicmyelogenousleukemiapatients.ExpHematol.1986;14(7):668-67128.StranderKetal.Long-termadjuvantinterferontreatmentofhumanosteosarcoma.Apilotstudy.ActaOncol.1995;34(6):877掘29.DoganB，etal.Intralesionalalfa-2ainterferontherapyforbasalcellcarcinoma.CancerLett.995;91(2):2〗5-21930.FetelMR>etal.Intratumoradministrationofbeta-interferoninrecurrentmalignantgliomas.AphaseIclinicalandlaboratorystudy.Cancer,1990;65(1):78-8331.MussHB.Theuseofinterferoninrenacellcarcinoma.EurJCancer.1991;27(SuppI4):S84-8732.PeestD，etal.Cytokinetherapyinmultiplemyeloma.Br.JHaematol.1996;94(3):42543233.IkicD，etal.Localinterferontherapyformelanomapatients.Int.JDermatol.995;34(2):872-87434.RybakME，etal.InterferontherapyofreapsedandrefractoryHodgkin'sdisease:CancerandLeukemiaGroupBStudy8652.JBiol.ResponseMod.1990;9(I):I435.KaufmaanR>etal.Temozolomideincombinationwithinterferon-alphaversustemozoomidealoneinpatientswithadvancedmetastaticmelanoma:arandomizedjphaseIII，multicenterstudyfromtheDermatologicCooperativeOncologyGroup.JClinOncol.2005;23(35):9001-900736.LaneHC.Theroleofalpha-interferoninpatientswithhumanimmunodeficiencyvirusinfection.SeminOncol.991;〗8(S叩p7):46-5237.WooMHandBrunakisTGInterferonalfainthetreatmentofchronicviralhepatitisBandC.Ann.Pharmacother.1997;3I(3):330-33738.GibasAL.Useofinterferoninthetreatmentofchronicviralhepatitis.Gastroemeroogist.1993;1(2):29-4239.LevineLA，etal.Treatmentofsubclinicalintraurethralhumanpapillomavirusinfectionwithinterferonafa-2b.Urology.1996;47(4):553-55740.HoM.Interferonforthetreatmentofinfections.AnnuRevMed.1987;38:51-5941.WinterserstUandBelohradskyBH.Acyclovirmonotherapyversusacyclovirplusbeta-interferoninfocalviralencephalitisinchildren.Infection.1992;20(4):207-21242.BogdanC,etal.TheroeoftypeIinterferonsinnon-viralinfections.ImmunolRev.2004;202:33-4843.CondosR>etal.Treatmentofmultidrug-resistantpulmonarytuberculosiswithinterferon-gammaviaaerosol.Lancet.1997;349(9064):I513-151544.GiosueS，etal.Aerosolizedinterferon-alphatreatmentinpatientswithmulti-drug-resistantpulmonarytuberculosis.EurCytokineNetw.2000;H():99-10445.RaadI，etal.Useofadjunctivetreatmentwithinterferon-gammainanimmunocompromisedpatientwhohadrefractorymutidrug-resistanttuberculosisofthebrain.ClinInfectDis.996;22:572—57446.FernandezO,etal.Treatmentofrelapsing-remittingmultiplesclerosiswithnaturalinterferonbeta:amulticenter,randomizedclinicaltrial.Mult.Scler.1995;Suppl:S67-69;47.FreedmanMS,etal.Randomizedstudyofonce-weeklyinterferonbeta-latherapyinrelapsingmultiplesclerosis:three-yeardatafromtheOWIMSstudy.MultScler.2005;l(l):41-4548.ShiozawaS，etal.Single-blindedcontrolledtrialoflow-doseoralIFN-alphaforthetreatmentofxerostomiainpatientswithSjogren'ssyndrome.JInterferonCytokineRes.1998;S(4):255-26249.WandingerKP,etal.Diminishedproductionoftype-Iinterferonsandinterleukin-2inpatientswithmultiplesclerosis.JNeuroSci.1997;49(1):87-9350.Steegmann幾，etal.Interferonalphaforchronicmyeloidleukemiarelapsingafterallogeneicbonemarrowtransplantation.BoneMarrowTransplant.1999;23(5):483-4885].KirkwoodJM，etal.HighdoseInterferonalfa2bsignificantlyprolongsrelapsefreesurvivalcomparedwithGM2-KLH/QS-21vaccineinpatientswithresectedstagenB-mmelanoma:ResultsoflntergroupTrialE694/S952/C50卯81.JClinOncol2001;9:2370~238052.BonncmEM.alphaInterferon:thepotentialdrugofadjuvanttherapy:pastachievementsandftjturechallenges.EurJCancer.1991;27Suppl4:S2-653.FolkmanJ.Successfultreatmentofanangiogenicdisease.NEnglJMed.989;320:12I-12]254.Clifford幾，etal.Retinoidsandinterferonsasantiangiogeniccancerdrugs.In:丁eicherBA，ed.AntiangiogenicAgentsinCancerTherapy.Totowa^NJ:HumanaPressInc;1999;355-37055.KabanLB，etal.Antiarigiogenictherapyofarecurrentgiantcelltumorofthemandiblewithinterferonalfa-2a.Pediatrics.1999;03:145-14956.SleijferS，etal.Sideeffectsofinterferon-alpliatherapy.PharmWorldSci.2005;27(6):42343157.BellLetal.StructureandpropertiesofmodifiedInterferons.USPatNo:4914033.Apri3.99058.Me〉erF.etal.HybridInterferons.USPatMo:507176.December10.l的l59.StreuliMetal.Targetcellspecificityoftwospeciesderivedfromthem.ProcNatlAcadSciUSA.98；78(5):2848-285260.ZoonK.etal.interferonalphahybrids.USPatNo:6685933.Februaiy3.200461.GangemiJD.Antiviralcombination,andmethodoftrea加em.USPatNo:537720August11,199262.JohnsonHM.etal.Hybridinterferontau/t)卩e1interferonpolypeptidesUSPatNo:6174996.January16.200163.Raj，NB,etal.Synthesis,antiviralactivity,andconformationalcharacterizationofmouse-humana-interferonhybrids.JBiolChem.1988;263(8):8943_895264.MarkDF，etal.Site-specificmutagenesisofthehumanfibroblastinterferongene.ProcNatlAcadSciUSA984;8(]8):5662-566665.Bentzien.1.etal.Recombinantinterferon-betamutants.USPatNo:6514729.February4.200366.StemmerWPC.Methodsforinvitrorecombination.USPatNo:5605793.February25.199767.ChangCC，etal.EvolutionofacytokineusingD"NAfamilyshuffling.NatBiotechnol.]999;17(8):793陽79768.BlattLM，eta.Thebiologicactivityandmolecularcharacterizationofanovelsyntheticinterferon-alphaspecies,consensusinterferon.JinterferoncytokineRes.1996;6:48949969.TatusovaTAandMadden丁L.BLAST2Sequences,anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences.FEMSMicrobiolLett.〗999;74(2):247-25070.Bo、vieJU,eta.DecipheringtheMessageinProteinSequences:TolerancetoAminoacidSubstitutions.Science1990;247(4948):306-131071.CreightonTE.Posttranslationalcova!entmodificationofpolypeptidechains.InProteins:StructureandMolecularProperties.EdbyCreightonTE.W.H.Freeman&Co.1993;pp.78-99.SanFrancisco,US72.AplinJDandWristonJCJr.Preparation,properties,andapplicationsofcarbohydrateconjugatesofproteinsandlipids.CRCCritRevBiochem.198；0(4》259-30673.EdgeAS，etal.Deglycosylationofglycoproteinsbytrifluoromethanesulfonicacid.AnalBiochem.訓；1即):131-13774.ThotakuraNPandBohlOP.Enzymaticdeglycosylationofglycoproteins.MethEnzymol.1987;138:350-35975.PeckGE,etal.Pharmaceuticalmanufacturing.InRemington:TheScienceandPracticeofPharmacy,2"ed.EditedbyUniversityoftheSciencesinPhiladelphia(USIP)，LippincottWiiamsandWilkins.2006，page:69卜094.PA,US76.ShimizuK.etal.PlasminogenactivatorderivativesUSPatNo:4640835.February3']98777.MitraGC.ovalerulyattachedcomplexofalpha-1-proteinaseinhibitor、vitha、vatersolublepolymer.USPalMo:4496689.January29.198578.MakagawaY.eta).Chemicallymodifiedproteinwithpolyethyleneglyc.olUSPatNo:47992.December13.198879.DavisF.etal.Non-immunogenicpolypeptidesUSPat"No:4179337.December18.197980.FieldJ，etal.PurificationofaRAS-responsiveadenylylcyclasecomp〗exfromSaccharomycescerevisiaebyuseofanepitopeadditionmethod.MoCellBio.1988;8(5):2592〗-2〗658.EvanGl，etal.Isolationofmonoclonalantibodiesspecificforhumanc-mycproto-oncogeneproduct.MolCellBiol.1985;5(I2):36I0-361682.PaborskyLR，etal.Mammaliancelltransientexpressionoftissuefactorfortheproductionofantigen.ProteinEng.1990;3(6):547-55383.EinhauerAandJungbauerA.TheFLAGpeptide,aversatilefusiontagforthepurificationofrecombinantproteins.JBiochemBiophysMethods.2001;49(-3):455~46584.SkinnerH,etal.UseoftheGlu-Glu-PheC-terminalepitopeforrapidpurificationofthecatalyticdomainofnormalandmutantrasGTPase-activatingproteins.JBioC.hem.1991;266(22):14163-1416685.Lutz-FreyermuthC，eta).QuantitativedeterminationthatoneoftwopotentialRNA-bindingdomainsoftheAproteincomponentoftheUlsmallnuclearribonucleoproteincomplexbindswithhighaffinitytostem-loopIIofUlRNA.Proc<image>imageseeoriginaldocumentpage63</image>101.EvingerMAndPestkaS.Assayofgrowthinhibitioninlymphoblastoidcellcultures.MethodsEnzymol.981;79(PtB):362-368102.Meister入etal.Biologicalactivitiesandreceptorbindingoftwohumanrecombinantinterferonsandtheirhybrids.JGenVirol.1986;67(Pt8):1633^4303.FrinckeJ.al.Interferonan"bodycompositionshavinganextendedserumhalf-life.USPatNo:5055289.October8.1991104.ChangTandYuL.Hybridwithinterferon-beta.andanimniunoglobulinFcjoinedbyapeptidelinker,USPatNo:.5卯S626.June1.99905.NieforthKA,etal.Useofanindirectpharmacodynamicstimulationmode]ofMXproteininductiontocompareinvivoactivityofinterferonalfa-2aandapolyethylenegiycol-modifiedderivativeinheakhysubjects.ClinPharmaco!Ther.996;59(6):636-646106.Ek、、'uribeNN.Conjugation-stabilizedtherapeuticagentcompositions,de)iveryanddiagnosticformulationscomprisingsame,andmethodofmakingandusingthesame.USPatNo:5681811.October28.199707.GilbertCWandChoM-O.Interferonpol〉雷rconjugates.USPatNo:571〗944.January".1998108.Green、valdRandGilbertCW.Interferonpo!ymerconjugatesandprocessforpreparingthesame.USPatNo:5738846.April4,199S109.LetsingerRL,etal.Cholesteryl~conjugatecioligonucleotides:synthesis,properties,andactivityasinhibitorsofreplicationofhumanimmunodeficiencyvirusincellculture.ProcNatlAcadSciUSA.1989;86(17):6553-6556110.BrowerV.NakedDNAvaccinescomeofage.NatBiotechnol.1998;16(13):304-1305H].CoenDM.Thepolymerasechainreaction.InCurrentProtocolsinMolecularBiology.EditedbyAusubelFM.2001，page:15.0卜15.7.8.JhnWiley&Sons,Inc.US112.StemmerWRDNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:invitrorecombinationformolecularevolution.ProcNatlAcadSciUSA.994;91(22):10747-10753.ArmstrongJA.Cytopathiceffectinhibitionassayforinterferon:microcultureplateassay.MethodsEnzymol.198；78(ptA):381-387114.SambrookJandRussellDW.inMolecularCloning.200Upage:15.25-15.35，ColdSpringHarborLaborat017Press,"NewYork，US15.SambrookJandRussellDW.inMolecularCloning.2001.，page:15.51-15.52，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,US116,SambrookJandRusselDW.inMolecularCloning.200；page:15，25-5.29and1549-15-53，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYor、US117.ChouTC,etal.Reversalofanticancermultidrugresistancebytheardeemins.ProcNatlAcadSciUSA.1998;95(14):8369-837418.CorbellT，eta!.invivomethodsforscreeningandpreclinicaltesting:useofrodentsolidtumorsfordrugdiscovery,inAnticancerDrugDevelopmentGuide:preclinicalscreening,clinicaltrai!s,andapproval.EditedbyTeicherBAandAndrewsPA.2004;page:79-]24.HumanaPress,NewJersey,US權(quán)利要求1.分離的多核苷酸，其編碼具有人干擾素樣生物學活性的蛋白質(zhì)，其中所述多核苷酸選自其中每個多核苷酸包含與SEQIDNo1至少93％同一的核苷酸序列的多核苷酸的組。2.權(quán)利要求l的多核苷酸，其中所述序列與SEQIDNo:1至少95%同一。3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述序列與SEQIDNo:1至少98%同一。4.權(quán)利要求1-3中任一項的多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)不是天然存在的。5.權(quán)利要求4的多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)具有相比人干擾素oc2b(HuIFN-cx2b)而言增強的抗病毒和抗增殖活性。6.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)的抗病毒活性為HuIFN-a2b的至少2倍。7.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少10倍。8.重組載體，其包含權(quán)利要求1的多核苷酸。9.宿主細胞，其包含權(quán)利要求8的重組載體。10.表現(xiàn)出人干擾素樣生物學活性的非天然存在的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)選自其中每個蛋白質(zhì)包含與SEQIDNo:2至少85%同一的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的組。11.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其中所述序列與SEQIDNo:2至少90%同一。12.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其中所述序列與SEQIDNo:2至少95%同一。13.權(quán)利要求10-12中任一項的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有相比HuIFN-ct2b而言增強的抗病毒和抗增殖活性。14.權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗病毒活性為HuIFN-ct2b的至少2倍。15.權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗病毒活性為HuIFN-a2b的至少5倍。16.權(quán)利要求15的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗病毒活性為HuIFN-a2b的至少10倍。17.權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少10倍。18.權(quán)利要求17的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗增殖活性為HuIFN-ct2b的至少50倍。19.權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗增殖活性為HuIFN-oc2b的至少100倍。20.權(quán)利要求19的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少200倍。21.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是重組的。22.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的分子量為大約19315道爾頓。23.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其可選地在N-末端包含曱硫氨酸殘基。24.包含與SEQIDNo:2具有0至25個氨基酸差異的序列的非天然存在的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)表現(xiàn)出人干擾素樣生物學活性。25.權(quán)利要求24的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有相比HuIFN-a2b而言增強的抗病毒和抗增殖活性。26.權(quán)利要求25的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗病毒活性為HuIFN-a2b的至少2倍。27.權(quán)利要求25的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少10倍。28.權(quán)利要求24的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是千擾素類似物。29.權(quán)利要求24的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是重組的。30.包含權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)的片段的多肽，其中所述片段表現(xiàn)出所述人干擾素樣生物學活性。31.蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含與另一部分偶聯(lián)的權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其中所述構(gòu)建體表現(xiàn)出所述人干擾素樣生物學活性。32.權(quán)利要求31的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述蛋白質(zhì)是糖基化的。33.權(quán)利要求31的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述部分是多肽。34.權(quán)利要求31的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述部分是非多肽。35.權(quán)利要求34的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述部分是聚合物分子。36.權(quán)利要求35的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述聚合物分子是線性或分枝的聚乙二醇。37.權(quán)利要求31的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述部分是標記分子。38.組合物，其包含權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。39.編碼權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)的多核苷酸。40.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)作為抗病毒劑的用途。41.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)作為抗增殖劑的用途。42.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)作為抗癌劑的用途。43.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)作為免疫調(diào)節(jié)劑的用途。44.治療癌癥的方法，包括向需要治療的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)。45、治療病毒疾病的方法，包括向需要治療的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)。46.權(quán)利要求44或45的方法，其中所述受試者是人類。47.權(quán)利要求44或45的方法，其中所述蛋白質(zhì)與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑一起施用。48.治療對干擾素療法作出響應的病狀的方法，包括向需要治療的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)。49.權(quán)利要求44的方法，其中所述蛋白質(zhì)就寬范圍的不同類型的癌癥來說是治療上有效的，其中所述癌癥選自黑色素瘤、結(jié)腸直腸腺癌、肝細胞癌、肝癌、淋巴瘤、前列腺癌、胃腺癌、食管癌、肺癌、子宮頸腺癌和子宮頸癌。50.表現(xiàn)出人干擾素樣生物學活性的非天然存在的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有與SEQIDNo:2至少95%同一的氨基酸序列，并且其中所述蛋白質(zhì)具有相比HuIFN-oc2b而言增強的抗病毒和抗增殖活性。51.編碼權(quán)利要求50的蛋白質(zhì)的多核苷酸。52.包含權(quán)利要求50的蛋白質(zhì)的組合物。53.具有SEQIDNo:2的氨基酸序列或其片段的蛋白質(zhì)，其表現(xiàn)出人干擾素樣生物學活性。54.編碼權(quán)利要求53的蛋白質(zhì)的多核苷酸。55.多核苷酸，其選自SEQIDNo:3-17的多核苷酸。全文摘要本申請涉及重組人干擾素樣蛋白。在一個實施方案中，描述了通過基因改組技術(shù)獲得的重組蛋白，其具有相比天然存在的人干擾素α2b(HuIFN-α2b)而言增強的抗病毒和抗增殖活性。本發(fā)明包括編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸以及含有該多核苷酸的重組載體和宿主細胞。優(yōu)選地，所述多核苷酸選自其中每個多核苷酸具有與SEQIDNo1至少93％同一的序列的多核苷酸的組，和所述蛋白質(zhì)選自其中每個蛋白質(zhì)具有與SEQIDNo2至少85％同一的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的組。所述蛋白質(zhì)和包含所述蛋白質(zhì)的組合物可用于治療對干擾素療法作出響應的病狀，例如病毒疾病和腫瘤。文檔編號A61P37/02GK101432428SQ200780000441公開日2009年5月13日申請日期2007年6月22日優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日發(fā)明者劉龍斌,瑞張,靜徐,李季枝,勇杜,毛春生,凌王,王海濤申請人:諾瓦根控股公司