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      利用rac1b抑制劑治療退行性疾病的方法

      文檔序號:1219546閱讀:490來源:國知局
      專利名稱:利用rac 1b抑制劑治療退行性疾病的方法
      利用RAC IB抑制劑治療退行性疾病的方法
      技術領域
      本發(fā)明涉及利用Rac lb抑制劑治療退行性疾病的組合物和方法。 更具體地,本發(fā)明涉及治療淀粉樣P肽-相關的疾病、尤其是阿爾茨海默 氏病(Alzheimer's disease)的方法。本發(fā)明可以在疾病的不同階段, 包括發(fā)病期,用于哺乳動物對象,尤其是人類對象。本發(fā)明還基于對 測試化合物抑制Raclb能力的確定,提供了制備、鑒定、篩選或者優(yōu) 化用于退行性疾病治療的化合物的方法。本發(fā)明還包括檢測對象中退 行性疾病的存在、階段或者性質(zhì)的方法,包括評估所述對象的樣品中 Rac lb的存在或者(相對)量。
      阿爾茨海默氏病(AD)是一種進行性神經(jīng)變性疾病,主要特征為 行為和認知缺陷。AD患者的大腦特點是胞外斑塊P-淀粉樣(A卩)肽和 胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結的積聚,所述纏結包含過度磷酸化形式的T蛋白。
      已經(jīng)提出,在疾病發(fā)展的初始階段,AP沉積和T蛋白過度磷酸化可 能作為對抗氧化應激的補償反應和下游適應作用以確保神經(jīng)元細胞的 存活。但是,在疾病進展期間,這兩種介質(zhì)的抗氧化活性發(fā)展成為代 表典型的獲得性功能轉換的促氧化活性,其能夠參與構象改變和清除 機理的削弱。
      本發(fā)明描述一種新的發(fā)現(xiàn),所述發(fā)現(xiàn)確定了一種用于治療性介入 的新靶標,以控制氧化應激并從而改進神經(jīng)元存活性以及控制AP生成 和i蛋白過度磷酸化。
      我們將DATAS用于阿爾茨海默氏病患者和對照的大腦活組織切 片。DATAS是一種獲得專利權的基因表達譜技術(美國專利 6,251,590),其允許分析在兩種病理生理情況之間差別剪接的轉錄產(chǎn)物。該分析顯示患病大腦中Rac l基因的外顯子3b剪接失調(diào)(實施例 1),導致特定剪接同工型Rac lb的過表達。Racl基因可以產(chǎn)生兩種 可變剪接的mRNA,所述mRNA編碼兩種蛋白,Racla和Raclb(圖1)。 Raclb是Racla的組成性活化形式,主要參與氧化應激級聯(lián)的活化。出 乎意料的發(fā)現(xiàn)是組成性活化的Rac lb在患病組織中過度表達,因此與 AD患者大腦中氧化應激相對于健康個體的增加相吻合。
      這表示第一次證明患有退行性疾病的患者大腦中Raclb失調(diào)和表 達增加。 ^
      為了證實這種失調(diào)的存在和關聯(lián)性,我們在大鼠皮質(zhì)細胞上使用 不同濃度的A(325-35來檢測Racl基因可變剪接中A(3-誘導的變化。(3 淀粉樣肽A卩42是AD大腦中發(fā)現(xiàn)的老年斑的主要組分。AP肽作用于 神經(jīng)元細胞以誘導氧化應激和胞內(nèi)游離l丐含量的增加,這是調(diào)節(jié)AP毒 性以及繼發(fā)興奮性毒性的必要事件。其他機理是增加T蛋白的磷酸化和 誘導基因轉錄。A(325-35是包含氨基酸25到35的A(542片段,其復制 A3 42的毒性機理。大鼠皮質(zhì)原代培養(yǎng)物對A卩中毒(intoxification)敏 感,這導致細胞活性的劑量-依賴性降低。如實施例2所示,我們的結 果出人意料地顯示Ap治療誘導劑量-依賴方式的RaclbmRNA表達。
      為了進一步證實Ap治療、氧化應激和Racl基因向Raclb同工型 的可變剪接的調(diào)節(jié)之間的聯(lián)系,我們還利用叔丁基氫過氧化物(TBH) 或者6-羥基多巴胺(6-OHDA),對SH-SY5Y成神經(jīng)細胞瘤細胞施加氧 化應激(實施例3)。我們的結果顯示,在該神經(jīng)元細胞系中,氧化應激 也以劑量-依賴的方式誘導RaclbmRNA表達。
      因為Rac lb本身誘導氧化應激途徑,在P淀粉樣肽治療后或者TBH 或6-OHDA治療后誘導其表達很可能增強對細胞的應激。這表示第一 次證明(3淀粉樣肽可能通過氧化應激能夠誘導神經(jīng)元細胞中的Rac lb 表達。本發(fā)明因此第一次證明Raclb可以被考慮為神經(jīng)變性疾病的治療 和診斷靶標。尤其是,本發(fā)明顯示Raclb抑制劑代表了新的一類用于 退行性疾病治療的分子。本發(fā)明還表明,Raclb代表了一種用于篩選或 者優(yōu)化治療退行性疾病的(新)化學實體的有價值的耙標。
      因此,本發(fā)明的一個方面涉及一種治療哺乳動物對象退行性疾病 的方法,包括向需要的對象施用有效量的Rac lb抑制劑。
      本發(fā)明還涉及Raclb抑制劑在制備治療變性疾病的藥物組合物中 的用途。
      本發(fā)明的另一個方面是一種抑制哺乳動物對象中淀粉樣P肽產(chǎn)生 的方法,包括向需要的對象施用有效量的Raclb抑制劑。
      本發(fā)明的另一個方面是一種抑制哺乳動物對象中淀粉樣(3肽產(chǎn)生 的方法,基本上不改變Notch切割或者BACE活性,包括向需要的對 象施用有效量的Rac lb抑制劑。
      本發(fā)明的另一目的涉及一種治療哺乳動物對象的退行性疾病的方 法,包括向需要的對象施用一定量的抑制核酸化合物,所述量的抑制 核酸化合物有效降低所述對象中的Raclb表達(例如,轉錄、剪接和/ 或翻譯)。
      本發(fā)明的另一目的涉及一種治療哺乳動物對象退行性疾病的方 法,包括向需要的對象施用一定量的抗體,所述量有效降低所述對象 中的Rac lb活性。
      本發(fā)明的另一目的涉及一種治療哺乳動物對象的退行性疾病的方 法,包括向需要的對象施用有效量的小藥物化合物,所述有效量有效
      6降低所述對象中的Rac lb活性。
      為了在本發(fā)明中使用,Rac lb抑制劑可以在任意藥學上可接受的 支持物或者賦形劑存在的條件下配制,它們可以單獨使用,或者任選 與任意其他活性劑或者治療方法一起組合使用。
      本發(fā)明可用于治療各種退行性疾病,尤其是淀粉樣(3肽-相關疾病, 包括阿爾茨海默氏病,在不同的疾病階段,任意哺乳動物對象中,優(yōu) 選人類對象。 -
      本發(fā)明還涉及檢測氧化應激的存在或者易感性(predisposition), 包括檢測對象樣品中Rac lb的存在或者(相對)量,Raclb的存在指 示氧化應激的存在或者易感性。
      本發(fā)明還涉及檢測對象中退行性疾病的存在、階段或者對其的易 感性的方法,包括檢測對象樣品中Rac lb的存在或者(相對)量,Raclb 的存在指示所述疾病到存在、階段或者易感性。
      本發(fā)明的另一個目的是一種制備、鑒定、篩選或者優(yōu)化候選化合 物的方法,包括一個確定候選化合物是否能夠抑制Rac lb的步驟。
      本發(fā)明還涉及一種制備、鑒定、篩選或者優(yōu)化用于退行性疾病治 療的候選化合物的方法,所述方法包括確定測試化合物是否抑制Rac lb, Raclb抑制表明測試化合物是用于退行性疾病治療的候選化合物。 利用本領域本來己知的生物學/免疫技術,可以在體外(in vitro)、離 體(ex vivo)或者體內(nèi)評估Rac lb抑制。優(yōu)選的,進一步評估所述化 合物對Notch切割的活性,優(yōu)選基本上不改變Notch切割的化合物。
      本發(fā)明還涉及特異結合Rac lb多肽的抗體,以及特異結合Rac lb 基因或者RNA的核酸分子。


      圖1 : rac 1 (NM 006908)和rac lb (NM—006908)基因的結構示意 圖。箭頭表示PCR引物,3b表示raclb中的附加外顯子3b。
      圖2 : p淀粉樣肽對Raclb的誘導。用指定劑量的A(3處理大鼠原 代皮質(zhì)細胞24小時。所示瓊脂糖凝膠代表相同細胞中rac 1和rac lb 的PCR擴增。
      圖3:不同氧化應激對Rac lb的誘導A:過氧化氫物叔丁基氫過 氧化物(TBH); B: 6-羥基多巴胺(6-OHDA)。柱狀圖表示用指定劑量的 TBH或者6-OHDA處理24小時的SH-SY5Y細胞的細胞存活性,利用 LDH分析確定。所示瓊脂糖凝膠代表相同細胞中racl和raclb的PCR擴增。
      發(fā)明具體內(nèi)容
      本發(fā)明尤其根植于以下的意外發(fā)現(xiàn),即在患有退行性疾病的對象 腦組織中,racl/raclb比例隨著Racl高度活化的變異體Raclb的出現(xiàn) 發(fā)生偏倚。因此本發(fā)明涉及利用Racl作為退行性疾病的治療或者診斷 介入以及開發(fā)活性化合物的靶標的組合物和方法。
      退行性疾病
      術語退行性疾病包括任意神經(jīng)變性疾病,尤其是淀粉樣(3肽-相關 疾病。這些包括,具體是,由淀粉樣(5肽尤其是AP40和/或AP42的 增加或者異常生成引起的或者與其有關的所有疾病。
      阿爾茨海默氏病(AD)是最常見的神經(jīng)變性疾病,特征為記憶和 認知能力的進行性喪失。AD的病理特征為存在淀粉樣斑塊、胞內(nèi)神經(jīng) 原纖維纏結和顯著細胞死亡。e-淀粉樣肽(A13 )是AD大腦中發(fā)現(xiàn) 的老年斑的主要組分。AP的42-氨基酸形式(A3 42)在大腦中的過 量生成、胞內(nèi)積聚、聚集和沉積與家族性AD的早期發(fā)病有關。此外, 胞外A3 42在體外和體內(nèi)對神經(jīng)元顯示有毒性(Selkoe, D. J.綜述
      8(2001) Physiol. Rev. 81, 741-766)。 AP通過膜整合蛋白,淀粉樣前體蛋 白(APP),通過至少兩種翻譯后途徑蛋白水解而產(chǎn)生。APP的促淀粉 狀變切割是P-分泌酶(BACE)啟動的APP順序加工,其在腔內(nèi)域或 者細胞表面內(nèi)切割APP,產(chǎn)生AP的N末端。這種切割產(chǎn)生數(shù)種膜結 合的蛋白水解C端片段(CTF),例如99殘基0 -CTF (也稱為C99),以 及分泌的APP胞外域sAPP J3 。隨后通過Y -分泌酶對CTF的膜內(nèi)切割 產(chǎn)生AP的C末端,生成AP40或者AP42。殘基40-42的切割稱為 Y-切害!J,殘基49-52的切割稱為e-切割。排除AP產(chǎn)生的APP非促淀 粉狀變切割,在被認為主要發(fā)生于質(zhì)膜上的反應中由a-分泌酶, 一種 解聚素和金屬蛋白酶10 (ADAM-10)和ADAM-17所介導。這種a-分泌 酶的蛋白水解切割發(fā)生在AP區(qū)內(nèi),產(chǎn)生可溶性APP(sAPPa),主要的 加工產(chǎn)物和殘余的膜結合10-kDaCTF(CTFa也稱為C83)。和C99相 似,C83是Y-分泌酶的底物,其切割產(chǎn)生非促淀粉狀變p3片段。APP 還是半胱天冬酶活性的底物,所述半胱天冬酶活性切割其溶質(zhì)結構域。
      因此這類淀粉樣P肽-相關疾病的實例包括選自以下疾病的任意疾 病或者病癥阿爾茨海默氏病(例如,用于幫助預防或者延遲阿爾茨 海默氏病的發(fā)病,用于幫助減緩阿爾茨海默氏病的進展,用于治療患 有輕度認知障礙(MCI)的患者和在會從MCI發(fā)展到AD的患者中防 止或者延遲阿爾茨海默氏病的發(fā)病),輕度認知障礙(MCI),唐氏綜 合癥,有荷蘭型淀粉樣變性的遺傳性腦出血,腦淀粉樣血管病和其潛 在后果(例如,單次和復發(fā)性葉出血),退行性癡呆,包括混合的血 管和退行性起源的癡呆,與帕金森氏癥有關的癡呆,與進行性核上性 麻痹有關的癡呆,與皮質(zhì)基底退化有關的癡呆,或者彌漫性露易小體 型阿爾茨海默氏病。
      治療
      在本申請的上下文中,術語"治療"包括治療性和預防性治療。 尤其是,可以在疾病非常早的階段,或者在早前發(fā)病前,或者在其顯 著進展后,使用化合物。術語"治療"尤其表明患者負擔的減輕,例如預防或者延遲疾病的發(fā)病或者疾病進展,恢復或者增加對象的認知 功能或者記憶力,降低氧化應激,延遲APP加工,等等。
      Raclb
      Racl是來自Rho家族例如Rho和Cdc42的小GTP-結合蛋白。這 些小G蛋白通過GTP/ GDP交換活化,調(diào)控多種細胞功能例如基因表 達、細胞骨架重組和小泡/分泌運輸。活化的CDC42或者Rac然后激活 PAKSer/Thr激酶家族。近來研究顯示Rho參與應激纖維的形成,而活 化的Cdc42誘導絲足的形成,所述絲足是包含肌動蛋白束的指狀延伸, Rac調(diào)控片狀偽足或者褶皺(mffles)的形成,所述片狀偽足或者褶皺 是經(jīng)常沿著細胞邊緣形成的窗簾樣延伸(綜述參見Hall, 1998, Science 279,509-514)。在大腦中,小G蛋白參與神經(jīng)元的形態(tài)改變,所述神經(jīng) 元定位于生長錐、軸突、樹突狀主干和脊柱(van Leeuwen, F.N., van Delft, S., Kain, H.E., van der Kammen, R.A.,禾。Collard, J.G. (1999) Nat. Cell Biol. 1,242-248)。在AD大腦中,與年齡匹配的對照相比,所選的 神經(jīng)元群體中神經(jīng)元Cdc42/Rac上調(diào),與致病過程和神經(jīng)元退化有關 (Zhu, X., Raina, A.K., Boux, H., Simmons, Z. L, Takeda, A.,禾口 Smith, M.A. (2000) Int. J. Dev. Neurosci. 18,433-437)。在成熟的大腦中,Racl, 而不是Rho或Cdc42,存在于神經(jīng)元膜的筏結構域(Kumanogoh, H., Miyata, S., Sokawa, Y.,禾卩Maekawa, S. (2001) Neurosci. Res. 39, 189-196)。此外,近來的無偏定量蛋白組學研究顯示Racl是筏-結合蛋 白(Foster, L. J., De Hoog, C. L.,和Mann, M. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci U S A 100, 5813)。其他研究顯示Racl的活化伴隨其快速募集到脂 筏,而Cdc42未被募集到筏,但被筏-結合部分活化,并且更重要的是, Racl,而不是Rho或Cdc42,調(diào)節(jié)高爾基體-衍生的脂筏的組裝和輸出 到細胞膜(Field, K. A" J. R. Apgar, E. Hong-Geller, R. P. Siraganian, B. Baird,禾口 D. Holowka. (2000) Mol. Biol. Cell 11, 3661 ; Rozelle, A. L., L. M. Machesl〈y, M. Yamamoto, M. H. Driessens, R. H. Insall, M. G. Roth, K. Luby-Phelps, G. Marriott, A. Hall,禾卩H. L. Yin. 2000 Curr. Biol, 10:311)。Raclb是Racl的特定剪接形式,其中保留了外顯子3b。本申請?zhí)?供Raclb的序列,以及外顯子3b的序列(參見SEQIDNO: 12的核苷 酸51-170)。這些序列在公共基因文庫中也有提供。
      在本發(fā)明的上下文中,術語Raclb RNA表示任意RNA序列,編 碼或者非編碼,成熟或者不成熟,最終導致Raclb多肽的表達。
      術語"Racl基因"表示編碼Racl多肽的任意核酸。它可以是基 因組的(gDNA)、互補的(cDNA)、合成或者半合成的DNA、 mRNA、 合成RNA等等。它可以是重組或者合成核酸,利用生物來源、可獲得 的序列或者工業(yè)材料,通過本領域技術人員已知的技術制備,例如人 工合成,擴增,酶切割,連接,重組,等等。盡管本發(fā)明可能存在不 同的形成,但Rac 1基因通常以雙鏈形式存在。Racl基因的序列在某 些數(shù)據(jù)庫已有提供,例如,特別是,RefSeq, n° NM 009007。本發(fā)明 的其他Racl基因序列可以從樣品分離,或者收集,或者可以合成。
      術語Raclb多肽尤其表示包括外顯子3b編碼的氨基酸的任意Racl 多肽。術語Raclb多肽還包括,廣義來說,上述鑒定的序列的任意生 物活性天然變異體,由例如多態(tài)性、突變,插入、等等造成。
      Rac lb抑制劑
      在本發(fā)明的上下文中,術語"Raclb抑制劑"表示降低或者阻斷 Rac lb的活性或者表達的任意化合物或處理。更優(yōu)選的Raclb抑制劑 是抑制Rac lb-依賴的細胞骨架重排的化合物。最優(yōu)選的Raclb抑制劑 是選擇性抑制劑,例如,它們能夠與Rac lb-特異性結構域結合或者反 應,尤其是外顯子3b的全部或者部分。優(yōu)選的Rac lb抑制劑基本上不 直接影響cdc42禾口/或RhoA,即,基本上不分別與cdc42和/或RhoA相 互作用。這類Raclb抑制劑的具體實例包括特異結合Rac lb或者其結構 域、尤其是外顯子3b或者其結構域的任意化合物。這類結合化合物包 括,例如,任意抑制性核酸,比如反義RNA,核酶,iRNA, siRNA, ssRNA,微小RNAs,等等,或者任意對應的DNA、 PNA等等。這類 抑制性核酸優(yōu)選包括與Racl基因的外顯子3b的全部或者部分互補的 序列,從而預防、阻斷或者降低其在細胞中的轉錄或者翻譯。這類抑 制性寡核苷酸的具體實例在本申請的下文中公開。
      這類Rac lb抑制劑的,另一個實例是結合Rac lb的抗體(或者其片 段或者衍生物)。這類抗體通常結合包括在Racl的外顯子3b編碼的 氨基酸內(nèi)的表位。抗體可以是多克隆的,或者優(yōu)選單克隆的??贵w片 段包括,例如,F(xiàn)ab片段,F(xiàn)ab'2片段,CDR區(qū),等等??贵w衍生物包 括單鏈抗體,人源化抗體,人抗體,雙功能抗體,等等。
      一種具體的Raclb抑制劑是抗體,優(yōu)選單克隆抗體(或者其衍生 物或者片段),其特異結合包括在Rac lb的外顯子3b內(nèi)(即,完全或 者部分地包括在內(nèi))的表位。甚至更優(yōu)選本發(fā)明涉及一種抗體,優(yōu)選 單克隆抗體(或者其衍生物或者片段),其特異結合包括在SEQ ID NO : 13內(nèi)的表位。
      本發(fā)明的另一個方面是一種抗體,優(yōu)選單克隆抗體(或者其衍生 物或者片段,例如CDR序列),其特異結合Raclb,該抗體通過用包 括SEQIDNO: 13的多肽免疫非人哺乳動物來制備。本發(fā)明的另一個 目的是包括SEQ ID NO: 13的多肽或者其至少5個連續(xù)氨基酸的含表位 片段。更具體地,本發(fā)明的一個目的是長度小于50氨基酸的多肽,包 括SEQ ID NO : 13或者其至少5個連續(xù)氨基酸的含表位片段。
      可以通過本領域公知的程序制備抗人Rac lb蛋白的抗體。例如, 可以將蛋白單獨或者與合適蛋白偶聯(lián)注射到非人動物中來制備多克隆 抗體。在合適時段后,對動物取血,利用本領域已知的技術回收和純化血清(參見Paul, W.E. "Fundamental Immunology" Second Ed.(基石出 免疫學,第二版)Raven press, NY, p. 176, 1989; Harlow等人"Antibodies: A laboratory Manual"(抗體:實驗室手冊),CSH Press, 1988 ; Ward等 人(Nature 341 (1989) 544)。例如,通過Kohler-Millstein的技術 (Kohler-Millstein, Galfre, G.,禾口 Milstein, C, Methods Enz. 73 p. 1 (1981)),可以制備單克隆抗體,其涉及免疫B淋巴細胞與骨髓瘤細胞 的融合。例如,可以將如上所述的抗原注射入合適的非人哺乳動物(例 如,小鼠)直至在血清中檢測到多克隆抗體反應??梢詫Σ溉閯游镌?次加強,取出脾,根據(jù)各種方法進行與骨髓瘤的融合。首先通過它們 結合免疫抗原的能力,然后通過它們從細胞免疫沉淀rac lb的能力, 可以檢測獨立個體存活雜交瘤細胞的抗Rac lb抗體分泌。
      治療用途
      本發(fā)明的一個具體目的涉及一種治療哺乳動物對象的退行性疾病 的方法,包括向需要的對象施用有效量的Rac lb抑制劑。優(yōu)選,化合 物的給藥量有效減少所述對象中的APP加工。
      本發(fā)明的另一個方面是一種抑制哺乳動物對象中淀粉樣P肽產(chǎn)生 的方法,包括向需要的對象施用一定量的Raclb抑制劑,所述量的 Raclb抑制劑有效減少所述對象中的APP加工。
      本發(fā)明的另一個方面是一種抑制哺乳動物對象中淀粉樣P肽產(chǎn)生 的方法,基本上不改變Notch切割或者BACE活性,包括向需要的對 象施用有效量的Rac lb抑制劑。
      本發(fā)明的一個具體目的涉及一種治療哺乳動物對象的阿爾茨海默 氏疾病的方法,包括向需要的對象施用一定量的Rac lb抑制劑,所述 量有效減少所述對象中的APP加工。
      本發(fā)明的另一個方面是一種抑制哺乳動物對象中淀粉樣P肽產(chǎn)生
      13的方法,基本上不改變Notch切割或者BACE活性,包括向需要的對 象施用有效量的Rac lb抑制劑。
      為了在本發(fā)明中使用,所述化合物可以采用藥物組合物的形式, 所述藥物組合物包括所述化合物中的至少一種和藥學上可接受的賦形 劑或者支持物?;衔锟梢耘渲茷楦鞣N形式,包括固態(tài)和液態(tài),例如 膠囊,片劑,凝膠,溶液,糖漿劑,懸浮液,粉劑,氣霧劑,膏劑,
      本發(fā)明的這類藥物組合物可以包含生理上可接受的稀釋劑,填充 劑,潤滑劑,賦形劑,溶劑,粘合劑,穩(wěn)定劑,等等??捎糜诮M合物 的稀釋劑包括但不限于磷酸二鈣,硫酸鈣,乳糖,纖維素,高嶺土, 甘露醇,氯化鈉,干淀粉,糖粉和用于延長釋放的片劑-羥丙基甲基纖 維素(HPMC)??捎糜诮M合物的粘合劑包括但不限于淀粉、明膠和填 充劑,例如蔗糖,葡萄糖,右旋糖和乳糖。
      可用于組合物的天然和合成膠包括但不限于海藻酸鈉,印度膠, 羧甲基纖維素,甲基纖維素,聚乙烯基吡咯垸酮和硅酸鎂鋁??捎糜?組合物的賦形劑包括但不限于微晶纖維素,硫酸鈣,磷酸氫鈣,淀粉, 硬脂酸鎂,乳糖和蔗糖??梢允褂玫姆€(wěn)定劑包括但不限于多糖例如阿 拉伯膠,瓊脂,藻酸,瓜耳豆膠和黃芪膠,兩性物質(zhì)例如明膠和合成 和半合成聚合物例如卡波姆樹脂、纖維素醚和羧甲基幾丁質(zhì)。
      可以使用的溶劑包括但不限于林格氏溶液,水,蒸餾水,溶于水 的50%二甲基亞砜,丙二醇(未攙水的或者溶于水的),磷酸鹽緩沖 鹽水,平衡的鹽溶液,乙二醇和其他常規(guī)液體。
      化合物給藥的劑量和給藥方案將根據(jù)劑型、給藥方式、待治療的
      病癥和待治療患者的詳細情況而變化。因此,最好通過常規(guī)試驗方法 在當時當?shù)卮_定最佳治療濃度。還可以腸道使用本發(fā)明的化合物??诜?,本發(fā)明的化合物合適采
      用每天每kg體重10 yg到300 mg的速度給藥。所需劑量可以以一份
      或者多份給藥。對于口服給藥,合適的形式是,例如,膠囊,片劑, 凝膠,氣霧劑,丸劑,糖衣劑,糖漿劑,懸浮液,乳液,溶液,粉劑
      和顆粒; 一種優(yōu)選的給藥方法是利用包含1 mg到大約500 mg活性物 質(zhì)的合適形式。
      本發(fā)明的化合物還可以非腸胃給藥,采用用于靜脈內(nèi)、皮下或者 肌內(nèi)輸注或者注射的溶液或者懸浮液形式。在這種情況下,本發(fā)明的 化合物通常以每天每kg體重大約10 iig到10 mg的速度給藥; 一種 優(yōu)選的給藥方法包括利用包含每ml大約O.Ol mg到1 mg活性物質(zhì)的溶 液或者懸浮液。
      本發(fā)明的化合物還可以施用于眼睛,采用用于玻璃體內(nèi)或者眼眶 后(retro-orbitary)注射的溶液或者懸浮液形式。在這種情況下,本發(fā) 明的化合物通常以每天每kg體重大約10 Wg到10 mg的速度給藥; 一種優(yōu)選的給藥方法包括利用每ml包含大約O.Ol mg到1 mg活性物質(zhì) 的溶液、懸浮液或者凝膠。
      可以釆用與治療CNS疾病的其他已知藥劑基本上相似的方式使用 所述化合物。給藥的劑量,不論是單次劑量、多次劑量或者每日劑量, 將隨著使用的具體化合物而變化,因為化合物的不同效力、選擇的給 藥途徑、接受者的大小、疾病類型和患者病癥的性質(zhì)。待給藥的劑量 不經(jīng)過明確的限定,但它通常是有效的量,或者與活性藥物代謝釋放 時給藥制劑產(chǎn)生的實現(xiàn)其所需的藥理和生理作用的藥理活性游離形式 的摩爾基礎等同。CNS疾病治療領域的有經(jīng)驗醫(yī)師或者醫(yī)生無需過度 實驗就能夠確定用于本發(fā)明化合物有效給藥的合適方案。
      所述化合物可以根據(jù)不同途徑給藥,通常通過口服途徑或者通過注射,例如局部或者全身注射。口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或者皮下給藥 是優(yōu)選的,雖然其他給藥途經(jīng)也可以使用,例如肌內(nèi),真皮內(nèi),等等。 此外,如果合適的話,可以進行重復注射。
      本發(fā)明的另--個方面涉及Rac lb抑制劑在制備抑制哺乳動物對象 中淀粉樣(3肽產(chǎn)生的藥物組合物中的用途,所述哺乳動物對象患有退行
      性疾病,尤其是阿爾茨海默氏病。
      本發(fā)明的另一個目的是Rac lb抑制劑在制備治療阿爾茨海默氏病 的藥物組合物中的用途。
      藥物篩選
      本發(fā)明第一次涉及Raclb調(diào)節(jié)APP加工和AP產(chǎn)生。因此,本發(fā) 明顯示,Rac lb代表篩選用于退行性疾病治療的藥物的有價值靶標。
      這方面,本發(fā)明的一個具體目的涉及制備、鑒定、篩選或者優(yōu)化 用于淀粉樣P肽-相關疾病治療的候選化合物的方法,所述方法包括確定 測試化合物是否抑制Rac lb, Racl抑制是測試化合物是用于淀粉樣(i 肽-相關疾病治療的候選化合物的指征。根據(jù)本領域本來已知的各種生 物分析法,可以在體外(in vitro)、離體(ex vivo)或者體內(nèi)(in vivo) 評估Raclb抑制。
      在一個具體實施方式
      中,所述方法包括將測試化合物與Rac lb(或 者其片段,通常包括外顯子3b的全部或者部分)接觸,并確定化合物 是否結合Raclb或者其片段。
      在另一個具體實施方式
      中,所述方法包括將測試化合物與Rac lb 接觸,并確定化合物是否抑制Rac lb-依賴的細胞骨架重排。
      在一個具體實施方式
      中,利用效應物PAK1下拉(pull-down)分
      16析來評估Rac lb抑制。
      更優(yōu)選地,進一步評估所述化合物對其他靶標的活性,尤其是
      Notch加工途徑(例如,Notch切割)、BACE或者其他小GTP-結合蛋白(例 如,Cdc42禾P/或RhoA)。最優(yōu)選的化合物是那些基本上不改變Notch 切割和/或基本上不直接抑制BACE、和/或基本上不直接抑制Cdc42和 /或RhoA的化合物。
      可以在體外任意合適的裝置中進行所述分析,不同的測試化合物 可以平行或者混合分析。
      診斷
      本發(fā)明還涉及檢測氧化應激的存在或者易感性的方法,包括檢測 對象樣品中Rac lb的存在或者(相對)量,Rac lb的存在表示氧化應 激的存在或者易感性。
      本發(fā)明還涉及檢測對象的退行性疾病的存在、階段或者對其易感 性的方法,包括檢測對象樣品中Rac lb的存在或者(相對)量,Rac lb 的存在表示所述疾病的存在、階段或者易感性。
      在更優(yōu)選的實施方式中,上述方法包括測量Rac la和Rac lb同工 型的比例,所述比例內(nèi)的變化提示疾病的易感性、存在或者階段。更 具體地,所述方法包括檢測包括SEQISNO: 1-8或者12中的任意一種 的核酸分子、或者其互補鏈或者對應多肽的存在。這類核酸分子和多 肽也代表本發(fā)明的特定目的,以及其任意獨特的片段或者類似物;特 異結合這類多肽的抗體和特異性核酸探針或者引物。
      可以根據(jù)本領域本來已知的技術進行檢測,例如擴增,雜交,測 序,免疫技術,等等。這方面,本發(fā)明公開了具體的寡核苷酸,其特 異區(qū)分Rac la和Rac lb,體現(xiàn)了本發(fā)明的特定目的。這類寡核苷酸優(yōu)選結合通過外顯子3b剪接或者外顯子3b保留產(chǎn)生的接合區(qū)(junction region),和/或結合外顯子3b本身。這類寡核苷酸的實例提供于SEQ ID NO: 9-11。本發(fā)明包括與Racl外顯子3b或者通過保留或者剪接所 述外顯子3b產(chǎn)生的接合區(qū)特異結合的任意寡核苷酸(優(yōu)選單鏈,包括5 至60個堿基,更優(yōu)選5-50、 5-40、 10-30、 10-25)。
      NCBI已經(jīng)提供Racl的完整人基因組序列,登錄號為AJ132695。 外顯子3b對應于所述序列的核苷酸位置18413-18530,其復制于下(SEQ ID NO: J2),從位置18361到18600 (外顯子3b采用粗體)
      18361 cagtgactta gcttctacac ctgtgactaa ccattttcat tccattctac agctttgaca 18421 attattctgc caatgttatg gtagatggaa aaccggtgaa tctgggctta tgggatacag
      18481 ctggacaaga agattatgac agattacgcc ccctatccta tccgcaaaca
      gtaaggattg
      18541 cagctgactt ttaatgtgtc ttttagagta tataattctc gagcgcttaa ttagtgcatg
      本發(fā)明的特異性寡核苷酸包括與接合區(qū)特異雜交的序列,所述接 合區(qū)位于RNA分子內(nèi)Rac lb外顯子3b和側翼序列之間。這類寡核苷 酸通常包括對外顯子3b的5'或者3'末端特異的至少5個核苷酸的結構 域,其直接地融合到至少5個核苷酸的結構域,所述結構域分別對外 顯子3b的所述5'或者3'末端的側翼序列具有特異性。本發(fā)明的其他寡 核苷酸與外顯子3b剪接產(chǎn)生的接合區(qū)特異雜交,S卩,與下列靶接頭雜 交tctacgtaag。這類寡核苷酸可以用作引物或者探針,以擴增或者檢 測樣品中Raclb的存在和/或(相對)量,并體現(xiàn)本申請的特定目的。 本發(fā)明的其他特異性寡核苷酸與包含在外顯子3b內(nèi)(即,SEQ ID NO: 12的核苷酸殘基51-170內(nèi))的序列特異雜交。
      本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點將在下面的實施例中公開,其應被認為 是說明性的,不是用于限制本申請的范圍。所有引用的出版物或者申 請在此完整引入作為參考。實施例
      實施例1 : AD大腦中Raclb DATAS標記的鑒定 用于表達譜研究的DATAS技術(DATAS專利號6251590)被用 來比較特征明確的AD患者和健康對照的前額葉皮質(zhì)中存在的可變的 RNA剪接事件。對照對象未患癡呆、年齡匹配并且死后延遲時間相似, 以篩出表達譜研究中與年齡-相關和mRNA穩(wěn)定性-相關的改變。
      —Racl改變的鑒定 鑒定的克隆中是對應于RAS-相關的C3肉毒素底物l (Racl)的 mRNA的5個片段,表明患有AD的患者大腦中Racl剪接事件的失調(diào)。
      DATAS片段是EXH-NADC4422-01 ,長度354 (SEQ ID NOl), EXH- NADC4506-01 (SEQ ID NO 2),長度344, EXH-NADC4513-01 , 長度354 (SEQ ID NO 3), EXH-NADC4524-01 ,長度354 (SEQ ID N04), EXH-NADC4531-01 , 長度 348 (SEQ ID NO 5), EXH-NADC4534-01,長度356 (SEQ ID NO 6),禾Q EXH-NADC4550-01 長度353 (SEQ ID NO 7)。這些DATAS片段組織成簇,簇13983—2 (SEQ ID NO 8)對應于RefS叫庫序列的核苷酸246到782,參照編號 NM—006908。該區(qū)域包括可變剪接的57 bp區(qū)(外顯子3b),所述57 bp 區(qū)存在于轉錄產(chǎn)物變異體Raclb中,所述Raclb在RefSeq庫序列中標 示為NM_018890 (圖1)。
      實施例2 :誘導A[3剪接Raclb
      大鼠原代皮質(zhì)細胞培養(yǎng)物對AP毒性敏感,其神經(jīng)毒性涉及不同的 機理例如鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、ROS的積聚、繼發(fā)興奮性毒性和半胱天冬酶活 化(Zhang等人,J N匿ochem 1996, 67 (4) 1595-1606)。 Ap肽溶于100% HFIP (1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇),然后干燥,重懸于100%DMSO,在不 含酚紅的DMEM/F12中重新稀釋。通過在37"C孵育72小時熟化溶液, 然后向7天培養(yǎng)物中添加AP寡聚物24小時。孵育24小時后,利用
      19Trizol處理細胞以進行RNA提取。利用下列引物使用巢式PCR方法擴 增rac lb:腿一006,一F1: ATGCAGGCCATCAAGTGTGTGG (SEQ ID NO 9), nm—006908—Rl: TGGCATTGAGTGCGAAGGC (SEQ ID NO 10), nm一006908—F2: AAAGACAAGCCGATTGCCG (SEQ ID NO 11)。利用 引物nm_006908—Fl和nm—006908一R1 ,根據(jù)下面所述的第一輪PCR 方案擴增Racl。在這些條件下,在凝膠中未檢測到rac lb,因為其單 次PCR擴增后的量較低,而在巢式PCR中利用引物nm—006908_F2和 nm一006卯8—Rl可以很容易檢測到。
      利用隨機引物p(dN)6 (Invitrogen), 1 mM dNTP混合物,1單位/ u 1 RNAse OUT核糖核酸酶抑制劑(Invitrogen)禾P 0.5單位/ u 1 Transcriptor逆轉錄酉每進行逆轉錄(Transcriptor Reverse Transcriptase, Roche)。利用Platinum Taq DNA高保真聚合酶(Invitrogen)以及0.2 mM dNTP混合物,1.5 mM MgS04, 0.25 /xM各引物(nm—006908—Fl和 nm—006908JU)禾卩0.1單位/jid Platinum 高保真Taq進行第一輪 PCR,如下進行30個循環(huán)的擴增變性94'C 30秒,退火60°C l分 鐘,延伸68°C 1分鐘。利用MicroSpinTM S-300 HR柱(Amersham Bio sciences)純化PCR擴增子,并利用PCR Master Mix (Promega)和0.2 /zM 各引物(nm—006908—F2和nm—006卯8—Rl)進行第二輪PCR,如下進行 30個循環(huán)的PCR擴增94。C變性30秒,6(TC退火1分鐘,72"延 伸1分鐘。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠分辨。
      結果
      為了檢測AP處理對rac lb的mRNA水平的影響,將皮質(zhì)細胞與 不同的A(3濃度接觸24小時,在巢式PCR方法中特異擴增rac lb,所 述巢式PCR方法順序使用引物nm—006908—Fl和nm—006908—Rl ,然后 引物nm—006908—F2和nm—006908—Rl。擴增GAPDH作為對照。在兩 個獨立培養(yǎng)物中獲得的結果表明,在11.25和22.5 uM的Ap濃度下, 觀察到raclb mRNA的劑量依賴性積聚(圖2)。這表明Ap改變 racl/raclb比例,使得racl剪接隨著摻入可變外顯子3b而偏移。因此,低水平的Ap刺激Racl的高活化變異體出現(xiàn),主要是GTP-結合的,帶
      有選擇性下游信號。
      實施例3 :誘導氧化應激對Raclb的剪接
      SKNSH亞克隆SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266)是一種被廣泛接受的 用于研究氧化應激介導的神經(jīng)毒性或者神經(jīng)保護的模型(Zuo等人. 1995)。
      有機過氧化氫物叔丁基氫過氧化物(TBH)是11202的穩(wěn)定類似物。 TBH按照以下事件順序誘導凋亡,即起始于ROS產(chǎn)生,氧化還原失衡 的喪失,線粒體細胞色素C釋放和半胱天冬酶-3的活化。
      通常用于產(chǎn)生帕金森氏癥動物模型的兒茶酚胺-特異性神經(jīng)毒素 6-羥基多巴胺(6-OHDA)是多巴胺的羥基化類似物,其導致兒茶酚胺 能細胞的凋亡。該神經(jīng)毒素誘導凋亡,其毒性與ROS生成有關??赡?涉及數(shù)種機理(1)通過自氧化產(chǎn)生活性-氧ROS, (2)單胺氧化酶 脫氨后的過氧化氫產(chǎn)生,(3)線粒體復合物I和IV的直接抑制和蛋白 降解和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活化(Youdim等人.2001)。
      為了檢驗ROS生成是否影響racl/raclb比例,將SH-SY5Y細胞 與指定濃度的不同ROS-誘導劑接觸24小時,利用LDH分析(Cytotox96, Promega)檢測細胞存活性。
      SH-SY5Y細胞接種于24孔板(ATGC, France),初始密度為3X 105 細胞/ L。 24小時后,用指定濃度的不同ROS-誘導劑處理細胞。孵育 24小時后,進行LDH分析顯示細胞存活性,并利用Trizol處理細胞以 進行RNA提取。
      結果
      為了檢驗ROS生成劑TBH和6-OHDA對racl和raclb的mRNA水平的影響,將SH-SY5Y細胞與指定濃度的不同ROS-誘導劑接觸24 小時,利用引物nmj)06卯8—Fl和nm—006卯8—Rl共擴增racl和raclb , 或者在巢式PCR方法中特異擴增raclb,所述巢式PCR方法順序利用 引物nm—006卯8—Fl和nm—006卯8—Rl,然后是引物nm—006908—F2和 nm—006卯8—Rl。擴增GAPDH作為對照。
      平行地,LDH分析監(jiān)控相同細胞的細胞存活性。結果顯示對于這 兩種毒劑,對氧化應激racl水平?jīng)]有變化(圖3)。相反,當使用TBH 和6-0HDA的亞毒性濃度時,觀察到rac lb的劑量依賴性積聚。這表 明低水平的氧化應激也改變racl/raclb比例使得racl剪接隨著可變外 顯子3b的摻入而偏移,因此刺激Racl的高活化變異體Raclb的出現(xiàn)。
      權利要求
      1. 一種治療哺乳動物對象中退行性疾病的方法,包括向需要的對象施用有效量的Rac1b抑制劑。
      2. —種抑制哺乳動物對象中淀粉樣(5肽產(chǎn)生的方法,包括向需要 的對象施用有效量的Rac lb抑制劑。
      3. 如權利要求1或者2所述的方法,其中所述化合物基本上不改 變Notch切割或者BACE活性。
      4. 如權利要求1或者2所述的方法,用于治療阿爾茨海默氏病。
      5. —種制備、鑒定、篩選或者優(yōu)化用于退行性疾病治療的候選化 合物的方法,所述方法包括確定測試化合物是否抑制Rac lb, Rac lb 抑制表明測試化合物是用于退行性疾病治療的候選化合物。
      6. 如權利要求5所述的方法,包括將測試化合物與Raclb接觸, 并確定該化合物是否結合Rac lb或者抑制Rac lb-依賴性細胞骨架重排。
      7. —種檢測氧化應激的存在或者易感性的方法,包括檢測對象樣 品中Raclb的存在或者(相對)量,Raclb的存在表明AP-相關氧化 應激的存在或者易感性。
      8. —種檢測對象中退行性疾病的存在、階段或者易感性的方法, 包括檢測對象樣品中Rac lb的存在或者(相對)量,Raclb的存在表 明所述疾病的存在、階段或者易感性。
      9. 如權利要求8所述的方法,包括測量Rac la和Rac lb同工型的比例,所述比例內(nèi)的變化表明疾病的易感性、存在或者階段。
      10. —種寡核苷酸或者一組寡核苷酸,其特異性區(qū)分Rac la和Raclb。
      11. 一種單鏈寡核苷酸,包括5至60個堿基,其特異性結合Racl 外顯子3b或者通過保留或者剪接所述外顯子3b產(chǎn)生的接合區(qū)。
      12. —種抗體,其結合包括在VGETYGKDITSRGKDKPIA( SEQ ID NO : 13)內(nèi)的表位。
      13. —種長度小于50個氨基酸的多肽,包括SEQIDNO: 13或者 其至少5個連續(xù)氨基酸的含表位片段。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及用于治療退行性疾病的組合物和方法。更具體地,本發(fā)明涉及利用Rac 1b抑制劑治療淀粉樣β肽-相關疾病尤其是阿爾茨海默氏病的方法。本發(fā)明可以在疾病的不同階段,包括發(fā)病期,用于哺乳動物受試者,尤其是人類受試者。本發(fā)明還基于對測試化合物抑制Rac1b能力的確定,提供了制備、鑒定、篩選或者優(yōu)化用于淀粉樣β肽-相關疾病治療的化合物的方法。
      文檔編號A61K31/7088GK101448508SQ200780004274
      公開日2009年6月3日 申請日期2007年1月30日 優(yōu)先權日2006年2月1日
      發(fā)明者勞倫特·德西蒙, 塞韋里內(nèi)·考塔德爾, 法比安·施魏格霍費爾, 維爾日妮·皮卡德 申請人:??松L蒯t(yī)療股份有限公司
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