專(zhuān)利名稱(chēng)：：新的病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了新的轉(zhuǎn)移載體、通過(guò)轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA的同源重組獲得的重組的桿狀病毒、以及它們的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還涉及了含有重組桿狀病毒作為活性成分的藥物(例如疫苗、用于傳染病例如瘧疾和流感的預(yù)防性或治療性藥物)。
背景技術(shù)：
：桿狀病毒在使用昆蟲(chóng)細(xì)胞對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的方法中已經(jīng)被用作載體。近年來(lái)，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)桿狀病毒不僅可以將外源基因?qū)肜ハx(chóng)細(xì)胞，而且可以導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在載體中導(dǎo)入用于治療的基因的可能性。在專(zhuān)利文件1中，公開(kāi)了具有多個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子的重組的桿狀病毒表達(dá)載體，該載體由含有在來(lái)自桿狀病毒早期基因的啟動(dòng)子中編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的基因的DNA區(qū)域、以及含有在來(lái)自晚期基因的啟動(dòng)子中編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因的DNA區(qū)域構(gòu)成。在專(zhuān)利文件2中，公開(kāi)了將非哺乳動(dòng)物DNA病毒導(dǎo)入細(xì)胞以及外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的方法，其中該DNA病毒含有受控制的啟動(dòng)子以便外源基因能夠從其中所需的外源基因已經(jīng)連接了多個(gè)獨(dú)立啟動(dòng)子的載體得到表達(dá)。此外，在專(zhuān)利文件3中，己經(jīng)公開(kāi)了使用桿狀病毒通過(guò)基因重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白的方法，并公開(kāi)了如下生產(chǎn)蛋白的方法將桿狀病毒的gp64基因與編碼所需蛋白的基因相連獲得的融合基因進(jìn)行表達(dá)、以其中所需的蛋白已經(jīng)與病毒粒子融合的形式生產(chǎn)所需的蛋白、收集與所需蛋白融合的病毒粒子、將所需的蛋白從病毒粒子上切下來(lái)收集所需的蛋白。在專(zhuān)利文件4中，對(duì)于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，公開(kāi)了重組桿狀病毒表達(dá)載體具有多個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子，包含編碼檢測(cè)標(biāo)記物的第一個(gè)核酸序列，所述標(biāo)記物以能夠使宿主細(xì)胞中具有活性而在不接受的細(xì)胞中不具有活性的第一個(gè)啟動(dòng)子起作用的方式連接，以及包含外源核酸序列的第二個(gè)核酸序列，所述外源核酸序列以能夠使在不接受的細(xì)胞中具有活性的第二個(gè)啟動(dòng)子起作用的方式連接。在專(zhuān)利文件5中，已經(jīng)公開(kāi)了與來(lái)自雞P-肌動(dòng)蛋白的CAG啟動(dòng)子相連的表達(dá)流感病毒血凝素(HA)抗原的重組桿狀病毒載體可以用作疫苗制劑，因?yàn)樵撦d體對(duì)流感病毒的感染具有預(yù)防效果。在專(zhuān)利文件6中，公開(kāi)了包含共轉(zhuǎn)染步驟的桿狀病毒載體的生產(chǎn)方法，其中編碼可以在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白的基因被分別連接到桿狀病毒啟動(dòng)子和來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子的質(zhì)粒、以及其中編碼可以在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白的基因被分別連接到兩個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的質(zhì)粒，被共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞中。在專(zhuān)利文件7中，公開(kāi)了使用其中來(lái)自流感病毒HA的cDNA已經(jīng)被整合到CAG啟動(dòng)子中的重組桿狀病毒，對(duì)流感病毒的感染的抗流感病毒活性的研究，并且公開(kāi)了不僅重組桿狀病毒而且野生型桿狀病毒也具有活性。這樣，近年來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種不同的重組桿狀病毒，并且利用重組桿狀病毒作為活性成分，已經(jīng)研究了使用它們開(kāi)發(fā)用于哺乳動(dòng)物的藥物。在相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
中，對(duì)于具有新結(jié)構(gòu)的重組桿狀病毒載體、以及使用重組桿狀病毒作為活性成分開(kāi)發(fā)對(duì)于傳染病例如瘧疾和流感或疾病例如癌癥有效的藥物制劑、特別是疫苗制劑，存在著需求。專(zhuān)利文件l:日本專(zhuān)利No.3366328，多啟動(dòng)子桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)禾口缺陷顆粒產(chǎn)品(Multiplepromoterbaculovirusexpressionsystemanddefectparticleproducts)。專(zhuān)利文件2:WO98/011243,具有修飾的外膜蛋白的非哺乳動(dòng)物DNA病毒(Non-mammalianDNAvirushavingmodifiedcoatingprotein)。專(zhuān)利文件3:JPNo.2002-235236-A，生產(chǎn)蛋白的方法(Methodsofproducingproteins)。專(zhuān)利文件4:JPNo.2003-284557-A,用于外源基因表達(dá)的新的桿狀病毒轉(zhuǎn)染載體和重組桿狀病毒(novelbaculovirus-transfectingvectorandrecombinantbaculovirusforexpressionofforeigngene)。專(zhuān)利文件5:WO02/062381,桿狀病毒載體疫苗(Baculovirusvectorvaccine)專(zhuān)利文件6:WO04/029259,桿狀病毒載體、生產(chǎn)桿狀病毒載體的方法以及導(dǎo)入基因的方法(Baculovirusvector,methodofproducingbaculovirusvectorandmethodofintroducinggene)<>專(zhuān)利文件7:JPNo.2005-15346-A，含有桿狀病毒的抗病毒劑(Baculovirus-containinganti-viralagent)。發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供新的轉(zhuǎn)移載體、通過(guò)重組轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA的同源重組獲得的重組桿狀病毒、以及它們的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用重組桿狀病毒作為活性成分的藥物，特別是疫苗制劑。解決問(wèn)題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了具有新穎結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移載體，能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞之外的脊椎動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)和魚(yú))細(xì)胞中表達(dá)具有所需免疫原性的蛋白、或具有免疫原性的部分蛋白或蛋白與細(xì)胞因子的融合蛋白，并發(fā)現(xiàn)了通過(guò)轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA的同源重組獲得的重組桿狀病毒。通過(guò)提供重組桿狀病毒，對(duì)含有重組桿狀病毒作為活性成分、對(duì)傳染病具有有效的預(yù)防性和/或治療性效果的藥物進(jìn)行了廣泛的研究。結(jié)果，本發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)了重組桿狀病毒具有作為所需藥物的效果。并且，按照本發(fā)明，具有新結(jié)構(gòu)的重組轉(zhuǎn)移載體、通過(guò)轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA的同源重組獲得的重組桿狀病毒、以及生產(chǎn)它們的方法被證實(shí)，并且證實(shí)了重組桿狀病毒本身可以在靶細(xì)胞中用作能夠表達(dá)具有所需免疫原性的蛋白的藥物，并且可用作傳染病例如瘧疾和流感的預(yù)防性藥物，因此完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了在下面的[1]到[31]中顯示的發(fā)明生產(chǎn)包含其中整合了雙啟動(dòng)芋和融合基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移載體的方法，特征在于包含至少一個(gè)編碼能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因，被連接到連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游。[l]中的方法，其中脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。[1]或[2]中的方法，其特征為編碼至少一種能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的基因是桿狀病毒gp64基因、皰疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人類(lèi)免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人類(lèi)呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一個(gè)。[1]或[2]中的方法，其中脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子選自細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、延伸因子la啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子和II類(lèi)MHC啟動(dòng)子的任何一個(gè)。[1]到[4]任何一個(gè)中的方法，其中桿狀病毒啟動(dòng)子選自多角體蛋白啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子、IE1啟動(dòng)子、IE2啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、p39啟動(dòng)子以及gp64啟動(dòng)子。[1]到[5]任何一個(gè)中的方法，其中免疫原性外源基因選自單獨(dú)的瘧疾抗原、流感抗原、結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲(chóng)抗原、錐蟲(chóng)抗原、住白細(xì)胞原蟲(chóng)抗原中的任何一個(gè)，或是從這些抗原基因組選擇的至少一個(gè)與細(xì)胞因子的融合抗原。[1]到[6]任何一個(gè)中的方法，其中轉(zhuǎn)移載體是pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-HlNl/HAl-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMAlD123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMAl-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5Nl/HAl-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-HlNl/HAl-gp64、pCAP-HlNl/HAl-gp64、pCU-HlNl/HAl-gp64、pDual-HlNl/NP-gp64、pDual-HlNl/M2-gp64、pDual-HlNl/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HAl/NC99-gp64、pCP-HlNl/HA0-gp64、pCP-HlNl/HA2-gp64、pCP-HlNl/HAl-vp39和pCP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)。生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，包括生產(chǎn)含有其中已經(jīng)整合了雙啟動(dòng)子和融合基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移載體的步驟，其特征為含有至少一個(gè)編碼能夠成為病毒粒子成分的蛋白的基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因被連接到連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游；將轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)的宿主細(xì)胞中的步驟；以及分離重組桿狀病毒的步驟。[8]中的方法，其特征為編碼至少一種能夠成為病毒粒子成分的蛋白的基因是桿狀病毒gp64基因、皰疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人類(lèi)免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人類(lèi)呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一個(gè)。[9]中的方法，其中脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子選自細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、延伸因子la啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子和II類(lèi)MHC啟動(dòng)子的任何一個(gè)。[8]到[10]任何一個(gè)中的方法，其中桿狀病毒啟動(dòng)子選自多角體蛋白啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子、IE1啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、p39啟動(dòng)子以及gp64啟動(dòng)子。[8]到[11]任何一個(gè)中的方法，其中免疫原性外源基因選自單獨(dú)的瘧疾抗原、流感抗原、結(jié)核分枝桿菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲(chóng)抗原、錐蟲(chóng)抗原、住白細(xì)胞原蟲(chóng)抗原中的任何一個(gè)，或從這些抗原基因組選擇的一個(gè)與細(xì)胞因子的融合抗原。[8]到[12]任何一個(gè)中的方法，其中的重組桿狀病毒是AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMAlD123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)。一種轉(zhuǎn)移載體，包含整合的結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中含有至少一個(gè)編碼能夠成為病毒粒子成分的蛋白的基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因被連接到連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游。[14]中的轉(zhuǎn)移載體，其包含的整合的結(jié)構(gòu)中含有編碼至少一種能夠成為病毒粒子成分的蛋白的基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因被連接到連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游。[14]或[15]中的轉(zhuǎn)移載體，其特征為編碼至少一種能夠成為病毒粒子成分的蛋白的基因是桿狀病毒gp64基因、皰疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人類(lèi)免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人類(lèi)呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何—個(gè)。[15]中的轉(zhuǎn)移載體，其中脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子選自細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、延伸因子lot啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子和II類(lèi)MHC啟動(dòng)子的任何一個(gè)。[15]到[17]任何一個(gè)中的轉(zhuǎn)移載體，其中桿狀病毒啟動(dòng)子選自多角體蛋白啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子、IE1啟動(dòng)子、IE2啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、p39啟動(dòng)子以及gp64啟動(dòng)子。，[15]到[18]任何一個(gè)中的轉(zhuǎn)移載體，其中免疫原性外源基因選自單獨(dú)的瘧疾抗原、流感抗原、結(jié)核分枝桿菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲(chóng)抗原、錐蟲(chóng)抗原、住白細(xì)胞原蟲(chóng)抗原中的任何一個(gè)，或從這些抗原基因組選擇的一個(gè)與細(xì)胞因子的融合抗原。[15]到[19]任何一個(gè)中的轉(zhuǎn)移載體，其是pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-HlNl/HAl-gp64、pDual-PbTRAMP匿gp64、pDual-PbAMAlD123-gp64、pDual-PbMSP129、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMAl-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5Nl/HAl-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-HlNl/HAl-gp64、pCAP-HlNl/HAl-gp64、pCU-HlNl/HAl-gp64、pDual-HlNl/NP-gp64、pDual-HlNl/M2-gp64、pDual匿HlNl/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HAl/NC99-gp64、pCP-HlNl/HA0-gp64、pCP-HlNl/HA2-gp64、pCP-HlNl/HAl-vp39和pCP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)。—種重組桿狀病毒，其通過(guò)[8]到[13]任何一個(gè)中的生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法生產(chǎn)。[21]中的重組桿狀病毒，其是AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMAlD123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)?！N藥物組合物，其包含[21]或[22]中的重組桿狀病毒。[24][23]中的藥物組合物，其包含AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H固/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlN固2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV扁Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)。包含[21]或[22]中的重組桿狀病毒的藥物組合物，其中所述組合物通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入給藥。—種疫苗，其包含AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-H面/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)作為活性成分。[26]中的疫苗，其中所述疫苗通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入給藥?！N用于流感病毒感染的治療性或預(yù)防性藥劑，其包含AcNPV陽(yáng)Dual國(guó)H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39、AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39作為活性成分。[28]中的用于流感病毒感染的治療性或預(yù)防性藥劑，其中所述藥劑通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入給藥?！N用于流感病毒感染的疫苗，其包含AcNPV-Dual-H腿/HAl、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl鏡、AcNPV-Dual-HlNl綠e、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV隱CP-H1N1/HAO、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)作為活性成分。[30]中的用于流感病毒感染的疫苗，其中所述藥劑通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入給藥。本發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，提供了新的轉(zhuǎn)移載體、通過(guò)轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA的同源重組獲得的重組桿狀病毒、以及它們的生產(chǎn)方法。含有本發(fā)明的重組桿狀病毒作為活性成分的藥物可以用作傳染病例如瘧疾、流感、結(jié)核和肝炎、以及癌癥和自身免疫疾病的治療性或預(yù)防性藥物，或者用作細(xì)胞藥物和疫苗制劑。附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示了重組桿狀病毒AcNPV-Dual-HlNl/HAl對(duì)流感病毒感染的預(yù)防性效果(病毒感染性滴度)的圖。圖2是顯示了重組桿狀病毒AcNPV-Dual-HlNl/HAl對(duì)流感病毒感染的預(yù)防性效果(存活期)的圖。圖3是顯示了在重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中，從轉(zhuǎn)化載體生產(chǎn)的流感病毒HA基因(HlNl/HAl)、結(jié)核分枝桿菌Hsp65基因(Hsp65)或瘧原蟲(chóng)CSP基因(PbCSP)的融合產(chǎn)物的表達(dá)的Western印跡分析的圖。第1道AcNPV-WT第2道AcNPV-Dual-HlNl/HAl第3道AcNPV-WT第4道AcNPV-Dual-Hsp65第5道AcNPV-WT第6道AcNPV-Dual-PbCSP圖4是熒光標(biāo)記染色圖，其中從脊椎動(dòng)物細(xì)胞中重組轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生的重組桿狀病毒已經(jīng)表達(dá)了結(jié)核病HSP65基因和gp64基因的融合產(chǎn)物。(A):用AcNPV-Dual-Hsp65轉(zhuǎn)導(dǎo)的HepG2細(xì)胞；(B):用AcNPV-WT轉(zhuǎn)導(dǎo)的HepG2細(xì)胞。圖5是通過(guò)免疫沉淀進(jìn)行鑒定的圖，其中從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生的重組桿狀病毒已經(jīng)表達(dá)了由流感病毒HA抗原基因和gp64基因編碼的融合蛋白。用重組桿狀病毒導(dǎo)入的HepG2細(xì)胞的免疫沉淀。HepG2細(xì)胞用AcNPV-WT(第1道)、AcNPV-CMV-HAfull(第2道)或AcNPV-Dual-HAlN(第3道)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3小時(shí)，細(xì)胞用["S]甲硫氨酸放射性標(biāo)記12小時(shí)。細(xì)胞裂解物用來(lái)自H1N1流感病毒感染的小鼠的血清進(jìn)行免疫沉淀。圖6是Western印跡分析圖，顯示了瘧原蟲(chóng)CSP基因與gp64基因從昆蟲(chóng)細(xì)胞中的重組轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生的重組桿狀病毒的病毒粒子中的融合表達(dá)。第1道AcNPV-WT第2道AcNPV-CMV國(guó)PbCSP第3道AcNPV-PbCSPsurf第4道AcNPV-Dual-PbCSP。圖7是顯示了RT-PCR結(jié)果的圖，鑒定了通過(guò)與脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子交換獲得的HA1抗原重組桿狀病毒在HeLa細(xì)胞中表達(dá)了HA1和gp64的融合產(chǎn)物。圖8是顯示了在用重組桿狀病毒接種的小鼠的血清中，特異性針對(duì)PbCSP抗原的IgG抗體產(chǎn)生的圖。圖9是顯示了在用重組桿狀病毒接種的小鼠的脾臟細(xì)胞中，對(duì)PbCSP的CTL表位具有反應(yīng)性的IFN-7產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量的圖。圖10是顯示了重組桿狀病毒AcNPV-Dual-M2e對(duì)流感病毒感染的預(yù)防性效果(病毒感染性滴度)的圖。圖11是顯示了重組桿狀病毒AcNPV-Dual-HAl/NC99對(duì)流感病毒感染的預(yù)防性效果(病毒感染性滴度)的圖。圖12是顯示了通過(guò)四種不同的途徑給藥重組桿狀病毒AcNPV-Dual-HlNl/HAl誘導(dǎo)，在血液中特異性針對(duì)流感病毒的IgG抗體的產(chǎn)生的圖。圖13是顯示了通過(guò)四種不同的途徑給藥重組桿狀病毒AcNPV-Dual-HlNl/HAl誘導(dǎo)，在鼻洗出液和肺泡洗出液中特異性針對(duì)流感病毒的IgG抗體和IgA抗體的產(chǎn)生的圖。圖14是顯示了通過(guò)四種不同的途徑給藥重組桿狀病毒AcNPV-Dual-HlNl/HAl，對(duì)鼻腔中流感病毒的預(yù)防性效果(病毒感染性滴度)的圖。圖15是顯示了通過(guò)四種不同的途徑給藥重組桿狀病毒AcNPV-Dual-HlNl/HAl，對(duì)肺內(nèi)流感病毒的預(yù)防性效果(病毒感染性滴度)的圖。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本文中表示的氨基酸、肽、堿基序列和核酸的縮寫(xiě)與Eur.J.Biochem.，138:9(1984)中IUPAC-IUB確定的IUPAC-IUB生物命名通報(bào)、"制定含有堿基序列和氨基酸序列的說(shuō)明書(shū)指南(Guidelineforpreparingspecificationscomprisingbasesequencesandaminoacidsequences)"(專(zhuān)利局)以及本
技術(shù)領(lǐng)域：
中常用的符號(hào)相一致。本文中的DNA分子不僅包含了雙鏈DNA，而且包含了單鏈DNA、包括構(gòu)成它們的有義鏈和反義鏈，不受其長(zhǎng)度的限制。因此，除非另有指出，編碼本發(fā)明的免疫原性外源基因的多核苷酸(DNA分子)包括了包括基因組DNA的雙鏈DNA和包括cDNA的單鏈DNA(有義鏈)和具有與有義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈DNA(反義鏈)，以及它們的合成的DNA片段。本文的多核苷酸或DNA分子不由功能性區(qū)域來(lái)限定，并可以包括表達(dá)抑制區(qū)、編碼區(qū)、前導(dǎo)序列、外顯子和內(nèi)含子中的至少一個(gè)。多核苷酸也包括RNA和DNA。由某些氨基酸序列構(gòu)成的多肽和由某些DNA序列構(gòu)成的多核苷酸包括其片段、同源物、衍生物和突變體。多核苷酸的突變體、例如突變的DNA，包括天然存在的等位基因突變體、非天然存在的突變體、以及具有缺失、取代、添加和插入的突變體。但是，這些突變體編碼的多肽具有與突變前多核苷酸編碼的多肽的功能基本上相同的功能。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)移載體是指用于產(chǎn)生重組桿狀病毒的質(zhì)粒，其含有的結(jié)構(gòu)中將至少一個(gè)編碼能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的基因與至少一個(gè)免疫原性的外源基因相連的融合基因已經(jīng)被整合到連接了兩個(gè)啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游，這兩個(gè)啟動(dòng)子中一個(gè)是脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子(哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、鳥(niǎo)啟動(dòng)子、魚(yú)啟動(dòng)子)，另一個(gè)是桿狀病毒啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選免疫原性外源基因位于雙啟動(dòng)子的下游和編碼能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的基因的上游。本發(fā)明的重組桿狀病毒作為藥物或疫苗的活性成分用于脊椎動(dòng)物。對(duì)于脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō)，可以例舉包括人類(lèi)的哺乳動(dòng)物，例如馬、豬、綿羊、山羊、猴、小鼠、狗和貓，鳥(niǎo)類(lèi)例如雞、鵪鶉、鵝、水禽、鵒子、火雞、珠雞和鸚鵡，魚(yú)類(lèi)例如金槍魚(yú)、成年金槍魚(yú)、海鯛、琥珀魚(yú)、竹莢魚(yú)、黃帶鰺、三線(xiàn)磯鱸、鮭魚(yú)、紅大麻哈魚(yú)、鯉魚(yú)、鯽魚(yú)、虹鱒魚(yú)、河鱒和amago鱒魚(yú)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有新結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移載體，其中含有編碼能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的病毒膜蛋白的基因和一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因，已經(jīng)被整合到雙啟動(dòng)子的控制之下，在雙啟動(dòng)子中一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子與另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子相連。通過(guò)將該轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA—起共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞中誘導(dǎo)同源重組，有可能獲得整合了融合基因的重組桿狀病毒，該融合基因在桿狀病毒啟動(dòng)子的控制之下、在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，并且能夠產(chǎn)生可以成為出芽的病毒粒子的成分的融合蛋白。在本發(fā)明中，當(dāng)將重組桿狀病毒施用于脊椎動(dòng)物時(shí)，能夠成為出芽病毒粒子的成分的蛋白與免疫原性蛋白的融合蛋白可能起到組分疫苗的作用。施用于脊椎動(dòng)物的重組桿狀病毒侵入脊椎動(dòng)物細(xì)胞，在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生了與來(lái)自病毒基因組的目標(biāo)免疫原性外源抗原的融合抗原，并起到了DNA疫苗的作用。因此，在哺乳動(dòng)物的情況下，通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的重組桿狀病毒，能夠成為病毒粒子的成分的蛋白與免疫原性蛋白的融合蛋白作為抗原被呈遞，能夠成為病毒粒子的成分的蛋白與免疫原性蛋白的融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被產(chǎn)生，并由于其免疫強(qiáng)化作用被認(rèn)為可以起到用于病毒、原生動(dòng)物和細(xì)菌感染的預(yù)防性或治療性藥劑的作用。與轉(zhuǎn)化載體共轉(zhuǎn)染的桿狀病毒DNA可以是任何野生型、突變體和重組桿狀病毒DNA。被共轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞包括，例如，來(lái)自昆蟲(chóng)例如草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的細(xì)胞。在本發(fā)明中，編碼免疫原性蛋白的氨基酸序列的基因，被稱(chēng)為免疫原性外源基因，所述免疫原性蛋白是預(yù)防或治療傳染病例如瘧疾、流感和結(jié)核病、以及自身免疫疾病和癌癥的的免疫療法包括疫苗療法的免疫原，例如，編碼蛋白例如瘧疾抗原、流感病毒抗原和結(jié)核分枝桿菌抗原的氨基酸序列。這里，"外源"基因是指從外部導(dǎo)入的基因，即便細(xì)胞中存在有同樣的基因，其也相應(yīng)于"外源基因"。在本發(fā)明中，編碼作為上述免疫原的蛋白的氨基酸序列的基因沒(méi)有特別被限制為編碼抗原性蛋白的氨基酸序列的基因，只要該基因是編碼對(duì)引起疾病例如傳染病、癌癥和自身免疫疾病的物質(zhì)具有免疫原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因就行。這些編碼具有免疫原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因的例子包括下面的基因。作為編碼瘧疾抗原的氨基酸序列的基因，可以例舉編碼下述的氨基酸序列的基因蛋白例如瘧原蟲(chóng)的子孢子體表面的表面抗原CSP(環(huán)子孢子蛋白)、裂殖孢子表面的膜蛋白MSP1(裂殖孢子表面蛋白1)、從瘧疾感染的紅細(xì)胞分泌的瘧疾S抗原、在瘧疾感染的紅細(xì)胞的瘤節(jié)中存在的PffiMPl蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白和AMA1蛋白。作為編碼流感病毒抗原的氨基酸序列的基因，可以例舉編碼蛋白例如HA抗原(血凝素抗原)、NA抗原(神經(jīng)氨酸酶抗原)、M2抗原(基質(zhì)蛋白抗原)和NP抗原(核蛋白抗原)的氨基酸序列的基因。作為編碼結(jié)核病的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因，為編碼蛋白例如HSP65(65-kDa熱休克蛋白)、a-抗原(抗原S5A、抗原85B、抗原85C)、Mtb72f、MDP-1、ESAT-6、MPB51m、Mtb8.8、Mtb9.9、Mtb32、Mtb39和Mtbll的氨基酸序列的基因。對(duì)于脊椎動(dòng)物基因來(lái)說(shuō)，作為哺乳動(dòng)物基因，可以舉例的是在人類(lèi)、牛、馬、豬、綿羊、猴、小鼠、狗和貓中編碼傳染病的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因。作為鳥(niǎo)類(lèi)基因，可以舉例的是在雞、水禽、鴿子、火雞、珠雞和鸚鵡中傳染病的抗原基因(例如禽流感S抗原)。作為魚(yú)類(lèi)基因，包括了在金槍魚(yú)、成年金槍魚(yú)、海鯛、琥珀魚(yú)、竹莢魚(yú)、黃帶參、三線(xiàn)磯艫、鮭魚(yú)、紅大麻哈魚(yú)、鯉魚(yú)、鯽魚(yú)、虹鱒魚(yú)、河鱒和amago鱒魚(yú)中傳染病的抗原基因。在上述的哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中，與傳染病的關(guān)聯(lián)已經(jīng)被報(bào)道的病原基因可以容易地從儲(chǔ)存了登記病原基因的公共數(shù)據(jù)例如GenBank的研究機(jī)構(gòu)獲得。在本發(fā)明中，對(duì)于免疫原性外源基因來(lái)說(shuō)，除了上述存在于人體外部的免疫抗原之外，例如存在于人體內(nèi)部的細(xì)胞因子基因，例如IL-12基因、IL-6基因、IL-6受體基因、IL-2基因、IL-18基因、IFN-y基因以及M-CSF基因，或通過(guò)將具有免疫原性的給定抗原與上述的抗原性蛋白通過(guò)基因重組技術(shù)融合而獲得的融合基因，在本發(fā)明中也被定義為免疫原性外源基因，只要它們是從外部導(dǎo)入的就行。在本發(fā)明中，提供具有這些免疫原性外源基因的轉(zhuǎn)移載體和通過(guò)其同源重組獲得的重組桿狀病毒，以及提供含有所述具有免疫原性外源基因的重組桿狀病毒作為活性成分的藥物組合物和由藥物組合物構(gòu)成的疫苗制劑，是可能的。用于本發(fā)明的桿狀病毒是在昆蟲(chóng)中引起感染的昆蟲(chóng)病原病毒，并且是一組具有環(huán)狀雙鏈DNA作為基因的DNA病毒(桿狀病毒科)。特別是，一組被稱(chēng)為核多角體病毒(NPV)的病毒在感染的后期在被感染的細(xì)胞中產(chǎn)生被稱(chēng)為多角體的包含體。即使待表達(dá)的外源基因被插入替換了多角體基因，病毒感染、生長(zhǎng)和產(chǎn)生大量的所需外源基因產(chǎn)物都沒(méi)有問(wèn)題。因此，在近年來(lái)它被實(shí)踐用于生產(chǎn)所需的蛋白。作為用于本發(fā)明的桿狀病毒來(lái)說(shuō)，可以舉例的是苜蓿丫紋夜蛾(AutographaCalifornica)核多角體病毒AcNPV、家蠶(Bombyxmori)核多角體病毒BmNPV、黃杉毒蛾(Orgyiapseudotsugata)核多角體病毒OpNPV和舞毒蛾(Lymantriadisper)核多角體病毒LdNPV。桿狀病毒DNA可以是任何能夠與本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行同源重組的DNA。具體來(lái)說(shuō)，能夠與本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行同源重組的桿狀病毒DNA的病毒基因有130kbp，它是巨大的，可以插入15kbp或以上的免疫原性外源基因。桿狀病毒基因本身很少在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。因此，幾乎不需要考慮它的細(xì)胞毒性，因此，認(rèn)為沒(méi)有誘導(dǎo)有害的免疫反應(yīng)。(1)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體和轉(zhuǎn)移載體的生產(chǎn)免疫原性外源基因DNA的生產(chǎn)能夠與病毒基因融合、作為桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的一個(gè)組分的免疫原性外源基因DNA，通過(guò)基于編碼具有本文公開(kāi)的目的免疫原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的多核苷酸的核酸序列信息進(jìn)行合成，可以容易地生產(chǎn)和獲得，或者基于免疫原性外源基因的核酸序列信息直接合成(化學(xué)DNA合成方法)對(duì)應(yīng)于免疫原性外源基因編碼區(qū)的核酸序列的DNA。通用的基因工程技術(shù)可以應(yīng)用于這種生產(chǎn)(例如參見(jiàn)《分子克隆第二版》MolecularCloning2dEd,ColdSpringHarborLab.Press(1989);日本生物化學(xué)學(xué)會(huì)主編的ZokuSeikagakuJikkenKouza，"IdenshiKenkyuhoI，II，III"，1986)。作為DNA的合成方法，可以舉例的是化學(xué)合成方法例如磷酸三酯方法和磷酰亞胺(phosphateamidite)方法(J.Am.Chem.Soc.，89，4801(1967);同上，91，3350(1969);Science,150,178(1968);TetrahedronLett.,22,1859(1981);同上，24,245(1983))以及這些方法的組合。更具體來(lái)說(shuō)，DNA也可以通過(guò)亞磷酰胺方法和三酯方法化學(xué)合成，并可以使用可商購(gòu)的自動(dòng)化寡聚核苷酸合成儀來(lái)合成。雙鏈片段可以通過(guò)合成互補(bǔ)鏈并將互補(bǔ)鏈與化學(xué)合成的單鏈在適當(dāng)條件下退火、或使用DNA聚合酶在化學(xué)合成的單鏈中加入具有適當(dāng)?shù)囊镄蛄械幕パa(bǔ)鏈來(lái)獲得。作為在本發(fā)明中生產(chǎn)的免疫原性外源基因DNA，可以舉例的是由編碼結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的氨基酸序列的DNA序列、編碼瘧疾抗原蛋白的氨基酸序列的DNA序列或編碼流感病毒抗原蛋白的氨基酸序列的DNA序列構(gòu)成的DNA。在本發(fā)明中使用的DNA不限于具有免疫原性的抗原性蛋白的多肽的氨基酸序列的編碼DNA序列的全長(zhǎng)DNA序列，可以是編碼部分序列的DNA序列，只要DNA序列所編碼的氨基酸序列的蛋白具有免疫原性就行。在本發(fā)明中使用的DNA可以是通過(guò)將具有抗原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的編碼DNA序列與人體內(nèi)存在的細(xì)胞因子基因進(jìn)行融合而獲得的DNA序列，所述細(xì)胞因子基因例如IL-12基因、IL-l基因、IL-6基因、IL-6受體基因、IL-2基因、IL-8基因、IFN-a基因、IFN-卩基因、IFN-y基因、TNF基因、TGF-p基因、GM-CSF基因和M-CSF基因。融合的DNA序列不限于具有抗原性的抗原性蛋白的多肽的氨基酸序列的編碼DNA序列和細(xì)胞因子基因的DNA序列的全長(zhǎng)編碼區(qū)，可以是部分DNA序列。用于本發(fā)明的免疫原性外源基因的DNA不限于具有這樣的特定DNA序列的DNA分子，也可以具有通過(guò)合并和選擇每個(gè)氨基酸殘基的任選密碼子而獲得的DNA序列。密碼子的選擇可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行。在這種情況下，例如，可以考慮在使用的宿主中密碼子的使用頻率(NucleicAcidsRes.,9,43(1981))。通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)用于本發(fā)明的免疫原性外源基因的DNA的方法，可以更具體地通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn)方法從表達(dá)免疫原性外源基因的DNA的適合的來(lái)源制備cDNA文庫(kù)、并使用適合的探針或針對(duì)免疫原性外源基因固有的表達(dá)產(chǎn)物的抗體從文庫(kù)中篩選所需的克隆來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)Proc,Natl.Acad.Sci"USA.，78，6613(1981);Science,222，778(1983))。在上述情況下，作為基因組DNA的來(lái)源，可以舉例的是從中表達(dá)免疫原性外源基因的DNA的各種不同的細(xì)胞、組織和培養(yǎng)的細(xì)胞。具體來(lái)說(shuō)，優(yōu)選使用瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞的提取物、流感病毒感染的細(xì)胞的提取物或結(jié)核分枝桿菌的提取物作為來(lái)源。從來(lái)源提取和分離總DNA和RNA，mRNA的分離和純化以及cDNA的獲取和克隆，可以按照標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)進(jìn)行。除了使用通過(guò)使用提取物作為來(lái)源，從免疫原性組織或細(xì)胞通過(guò)mRNA的提取、分離和純化獲得的每個(gè)免疫原的cDNA文庫(kù)來(lái)獲得之外，生產(chǎn)免疫原性外源基因的DNA也可以通過(guò)提取每個(gè)免疫原的mRNA、在RNA上加上多聚A、收集添加了多聚A的RNA、使用反轉(zhuǎn)錄酶生產(chǎn)cDNA、在cDNA的兩端加上限制性酶位點(diǎn)、和使用通過(guò)將cDNA整合到噬菌體中制備的噬菌體文庫(kù)來(lái)進(jìn)行。從cDNA文庫(kù)中篩選免疫原性外源基因的DNA的方法沒(méi)有特別的限制，可以按照常規(guī)的方法來(lái)進(jìn)行。作為具體的方法，可以舉例的是例如使用特異性針對(duì)cDNA產(chǎn)生的蛋白的抗體(例如抗瘧疾抗體、抗流感病毒抗體、抗結(jié)核分枝桿菌抗體)通過(guò)免疫篩選來(lái)選擇相應(yīng)的CDNA克隆的方法；使用與目的DNA序列選擇性結(jié)合的探針的噬斑雜交方法；菌落雜交方法；以及這些方法的組合。作為在雜交方法中使用的探針，常用的是基于免疫原性外源基因的DNA序列的信息化學(xué)合成的DNA片段。已經(jīng)獲得的免疫原性外源基因及其片段的DNA序列可以被有利地用作上述的探針。此外，根據(jù)免疫原性外源基因的DNA序列信息設(shè)計(jì)的有義引物和反義引物也可以用作上述篩選的探針。用作探針的DNA(核苷酸)是對(duì)應(yīng)于免疫原性外源基因的DNA序列的部分DNA(核苷酸)，其具有至少15個(gè)連續(xù)的DNA、優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)的DNA、更優(yōu)選至少30個(gè)連續(xù)的DNA。產(chǎn)生上述DNA的陽(yáng)性克隆本身也可以用作探針。當(dāng)獲得了免疫原性外源基因的DNA時(shí)，可以適當(dāng)?shù)厥褂猛ㄟ^(guò)PCR的DNA/RNA擴(kuò)增方法(Science,230，1350(1985))。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)全長(zhǎng)cDNA很難從文庫(kù)中獲得時(shí)，可以適當(dāng)?shù)厥褂肦ACE方法[cDNA末端的快速擴(kuò)增(RapidamplificationofcDNAends);JikkenIgaku12(6)，35(1994)]，具體來(lái)說(shuō)是5'-RACE方法[M.A.Frohman,等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，8,8998(1988)]。用于PCR的引物可以根據(jù)免疫原性外源基因的DNA序列信息設(shè)計(jì)，并依照標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)合成。作為該引物，正如在后面描述的實(shí)施例中所示，也可以使用添加到其中已經(jīng)整合了免疫原性外源基因的DNA的載體質(zhì)粒的兩端的DNA部分(SP6啟動(dòng)子引物和T7終止子引物)。以PCR擴(kuò)增的DNA/RNA片段的分離/純化可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法、例如凝膠電泳來(lái)進(jìn)行。對(duì)于上面獲得的免疫原性外源基因的DNA或各種不同的DNA片段來(lái)說(shuō)，它們的DNA序列可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定，例如雙脫氧方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.,74,5463(1977))或Maxam-Gilbert方法(MethodsinEnzymology，65,499(1980))，或者簡(jiǎn)單地使用可商購(gòu)的測(cè)序試劑盒。能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的編碼基因可以是任何的基因，只要它是在昆蟲(chóng)細(xì)胞中能夠表達(dá)為能夠成為病毒粒子的成分的蛋白、以及在目的細(xì)胞中表達(dá)為與免疫原性外源基因融合的融合蛋白的蛋白的編碼基因就行。作為能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的編碼基因，可以舉例的是例如gp64蛋白的基因(GenBank登記號(hào)L22858)、皰疹性口腔炎病毒糖蛋白基因(GenBank登記號(hào)M21416)、單純皰疹病毒糖蛋白基因(KOS;GenBank登記號(hào)K01760)、I型人類(lèi)免疫缺陷病毒gpl20基因(GenBank登記號(hào)U47783)、人類(lèi)呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因(GenBank登記號(hào)M86651)、A型流感病毒血凝素蛋白基因(GenBank登記號(hào)U38242)、或與桿狀病毒密切相關(guān)的病毒的外膜蛋白的基因。在本發(fā)明中，優(yōu)選的例子是在后面描述的實(shí)施例中顯示的gp64基因。能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的編碼基因的DNA，可以容易地生產(chǎn)和獲得，通過(guò)基于下述多核苷酸的核酸序列信息進(jìn)行合成，所述多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列的基因編碼能夠成為病毒粒子的成分的目標(biāo)蛋白的氨基酸，或基于能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的編碼基因的氨基酸序列信息，直接合成氨基酸序列的編碼核苷酸序列的對(duì)應(yīng)DNA(化學(xué)DNA合成方法)，與生產(chǎn)免疫原性外源基因的DNA的情況一樣。與能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的編碼核酸序列相對(duì)應(yīng)的DNA序列不限于編碼區(qū)的全長(zhǎng)，可以是由部分DNA序列構(gòu)成的DNA。與生產(chǎn)免疫原性外源基因的DNA分子的情況一樣，能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的編碼DNA可以通過(guò)普遍的基因工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)(例如參見(jiàn)分子克隆第二版》MolecularCloning2dEd，ColdSpringHarborLab.Press(1989);日本生物化學(xué)學(xué)會(huì)主編的ZokuSeikagakuJikkenKouza，"IdenshiKenkyuhoI，II，III",1986)。在本發(fā)明中，也可以使用可商購(gòu)的載體質(zhì)粒，其中控制下面描述的免疫原性外源基因的表達(dá)的啟動(dòng)子的一部分已經(jīng)被整合，并且能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的編碼基因(部分)己經(jīng)在事先被導(dǎo)入。脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子作為用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體的成分之一的脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子(能夠在脊椎動(dòng)物中起作用)，可以舉例的啟動(dòng)子是例如哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、鳥(niǎo)類(lèi)啟動(dòng)子和魚(yú)類(lèi)啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子作為用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體的成分之一的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(能夠在哺乳動(dòng)物中起作用)，可以舉例的是細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、延伸因子la啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子和II類(lèi)MHC啟動(dòng)子。鳥(niǎo)類(lèi)啟動(dòng)子作為鳥(niǎo)類(lèi)啟動(dòng)子，可以舉例的是肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、延伸因子啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子和白蛋白啟動(dòng)子。魚(yú)類(lèi)啟動(dòng)子作為魚(yú)類(lèi)啟動(dòng)子，可以舉例的是肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子和延伸因子啟動(dòng)子。桿狀病毒啟動(dòng)子作為用于本發(fā)明的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的成分之一的桿狀病毒啟動(dòng)子，可以舉例的是多角體蛋白啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子、IE1啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、p39啟動(dòng)子以及gp64啟動(dòng)子。重組轉(zhuǎn)移載體的生產(chǎn)本發(fā)明涉及了具有能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞和脊椎動(dòng)物細(xì)胞、特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將目的免疫原性外源基因表達(dá)為抗原性蛋白的結(jié)構(gòu)的新轉(zhuǎn)移載體。在本發(fā)明中，產(chǎn)生的新轉(zhuǎn)移載體的結(jié)構(gòu)特征在于所需免疫原性蛋白的氨基酸序列的編碼DNA序列和能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼DNA序列被連接在相連的啟動(dòng)子的下游，相連的啟動(dòng)子一個(gè)是脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子、特別是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，另一個(gè)是桿狀病毒啟動(dòng)子。含有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子特別是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的兩個(gè)啟動(dòng)子的DNA序列的DNA區(qū)域可以直接相連，或者在兩個(gè)啟動(dòng)子的DNA序列之間存在插入的DNA序列(但是，在這種情況下，對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子必需在昆蟲(chóng)細(xì)胞和脊椎動(dòng)物細(xì)胞、特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有活性)。被連接的脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子、特別是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子或桿狀病毒啟動(dòng)子可以與在它們的啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)的基因更接近地放置。在后面描述的實(shí)施例中，與哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子相比，桿狀病毒被放置得與被表達(dá)的基因更近。在結(jié)構(gòu)中，對(duì)于含有能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的編碼基因和所需的免疫原性外源基因的融合基因來(lái)說(shuō)，這兩個(gè)基因可以直接相連，或者在它們之間可以存在插入的DNA序列(但是DNA的放置必需不引起移碼)。優(yōu)選具有所需免疫原性的由外源基因編碼的蛋白的抗原呈遞區(qū)與能夠成為病毒粒子的成分的蛋白融合。因此，它必需以融合的形式使用，而不從能夠成為病毒粒子的成分的蛋白上切下具有所需免疫原性的由外源基因編碼的蛋白。含有這兩個(gè)基因的融合基因可以預(yù)先形成，并可以將其整合到載體中?；蛘?，先將任何一個(gè)基因整合到載體中，然后將另一個(gè)基因整合到載體中，以在載體中形成融合基因。對(duì)于上述的操作來(lái)說(shuō)，可以使用可商購(gòu)的表達(dá)載體，其中已經(jīng)具有了上述脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子特別是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子和桿狀病毒啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)，以及能夠成為病毒粒子的成分的氨基酸序列的編碼基因區(qū)，它們是本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體所需的組成部分。利用它們，所需成分的插入可以通過(guò)將其中所需的免疫原性外源基因已經(jīng)與能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的編碼氨基酸序列的基因相融合的DNA序列，通過(guò)任選用限制性酶切除來(lái)插入到載體的克隆區(qū)中，或整合到另一個(gè)載體中，或者將所需的免疫原性外源基因插入到整合在質(zhì)粒中的能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼基因的DNA區(qū)N末端一側(cè)中。對(duì)于蛋白的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，可以在DNA序列C末端一側(cè)的多聚A尾將所需免疫原性外源基因與能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼基因融合之前，加上His-tag或HVS-tag?；蛘?，為了重組融合蛋白的表達(dá)、純化和檢測(cè)，由8個(gè)氨基酸構(gòu)成的FLAG序列的編碼DNA序列可以作為肽標(biāo)簽插入到啟動(dòng)子區(qū)和其中所需免疫原性外源基因已經(jīng)與為能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼基因融合的區(qū)域之間。在本發(fā)明中，具有能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞和脊椎動(dòng)物細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將所需的免疫原性外源基因表達(dá)為抗原性蛋白的結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體，可以通過(guò)使用已經(jīng)具有其令人滿(mǎn)意的部分的結(jié)構(gòu)的可商購(gòu)的質(zhì)粒來(lái)產(chǎn)生。在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，可以插入肽的氨基酸序列以便使用酶來(lái)切割融合蛋白。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體中，用于在脊椎動(dòng)物細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中增加轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)子可以被置于兩個(gè)啟動(dòng)子的上游，或者便于宿主中表達(dá)蛋白細(xì)胞外分泌的信號(hào)肽的氨基酸序列的編碼DNA序列可以與被融合和表達(dá)的基因相連。可以設(shè)置脊椎動(dòng)物終止子區(qū)，例如在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中有效的兔(3球蛋白終止子，用于在被融合和表達(dá)的基因下游終止轉(zhuǎn)錄。如上所述，可以產(chǎn)生能夠表達(dá)在桿狀病毒粒子中能夠表現(xiàn)出所需免疫原性的免疫原性外源基因和能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼基因的融合基因的轉(zhuǎn)移載體。對(duì)于在后面描述的實(shí)施例中顯示的轉(zhuǎn)移載體及其生產(chǎn)方法的具體例子來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)移載體由整合的結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其中作為脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子特別是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的細(xì)胞肥大病毒(CMV)啟動(dòng)子、從CMV啟動(dòng)子修改而來(lái)的CAG啟動(dòng)子和與CMV增強(qiáng)子融合的泛素(UBB)啟動(dòng)子、以及作為桿狀病毒啟動(dòng)子的多角體(Polh)啟動(dòng)子已經(jīng)被連接，其中作為外源基因的流感病毒抗原基因、瘧疾抗原基因和結(jié)核分枝桿菌抗原基因以及作為能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼基因的gp64抗原基因被融合，這樣的轉(zhuǎn)移載體可以例舉pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-HlNl/HAl-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMAlD123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMAl-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5Nl/HAl-gp64和pDual-SARS/S-gp64、pCP-HlNl/HAl-gp64、pCAP-HlNl/HAl-gp64、pCU-HlNl/HAl-gp64、pDual-HlNl/NP-gp64、pDual-HlNl/M2-gp64、pDual-HlNl/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HAl/NC99-gp64、pCP墨HlNl/HA0-gp64、pCP-HlNl/HA2-gp64、pCP-HlNl/HAl-vp39、pCP-HlNl/NP-vp39。(2)重組桿狀病毒的生產(chǎn)本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，包括生產(chǎn)由下述結(jié)構(gòu)構(gòu)成的轉(zhuǎn)移載體的步驟，在該結(jié)構(gòu)中已經(jīng)整合了含有能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的至少一個(gè)編碼基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因，融合基因連接在連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游；將轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的步驟和分離重組桿狀病毒的步驟。在上述的生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法中，將所需的重組DNA(轉(zhuǎn)移載體)導(dǎo)入宿主的方法和用其進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法沒(méi)有特別的限制，各種熟知的和常用的方法都可以使用，例如可以按照常規(guī)的基因重組技術(shù)(例如Science,224,1431(1984);Biochem.Biophys.Res.Comm.,130，692(1985);Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，5990(1983))來(lái)進(jìn)行。重組DNA(轉(zhuǎn)化載體)可以參考Ohno等的"(TanpakuJikkenProtocol1Functionalanalysis,SaiboKogakuBessatuJikkenProtocolSeriesTanpakuJikken功能分析1方案，SaiboKogakuBessatuJikken方案系列)，1997,Shujunsha"來(lái)表達(dá)和生產(chǎn)。對(duì)于操作昆蟲(chóng)細(xì)胞、基因重組和共轉(zhuǎn)染的一般性技術(shù)來(lái)說(shuō)，可以使用與熟知的在昆蟲(chóng)細(xì)胞中制造重組病毒的相同技術(shù)(ZenjiMatsuura，Proteins,NucleicacidsandEnzymes(蛋白質(zhì)，核酸和酶)，37:211-222，1992;ZenjiMatsuura,Saibo33(2):30-34，2001)。獲得的重組桿狀病毒可以按照標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)培養(yǎng)，其中免疫原性外源基因的DNA和能夠成為本發(fā)明的病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼DNA已經(jīng)按照所需設(shè)計(jì)被融合的融合產(chǎn)物(表達(dá)產(chǎn)物)在細(xì)胞內(nèi)、外或細(xì)胞膜上得到了表達(dá)、生產(chǎn)(積累)和分泌。作為用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以根據(jù)使用的宿主適當(dāng)?shù)剡x擇和使用各種常用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)可以在適合宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行。生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法更具體來(lái)說(shuō)包括了制備桿狀病毒DNA用于與上面生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行同源重組的步驟和將轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到作為宿主細(xì)胞的昆蟲(chóng)細(xì)胞中的步驟，所述昆蟲(chóng)細(xì)胞例如來(lái)自草地貪夜蛾的Sf-9細(xì)胞、Sf-21細(xì)胞，來(lái)自粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的Tn5細(xì)胞(Invitrogen提供的HighFive細(xì)胞)。上面生產(chǎn)的用于與轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行同源重組的桿狀病毒DNA可以是任何野生型、突變體或重組的桿狀病毒DNA。除了其中融合了雙啟動(dòng)子區(qū)的DNA、免疫原性外源基因和能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的編碼基因的融合基因中夾有源自桿狀病毒的DNA之外，桿狀病毒DNA可以增加同源重組的可能性，只要它與來(lái)自桿狀病毒DNA的DNA具有同源的DNA結(jié)構(gòu)以便與本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生同源重組就行，所述桿狀病毒DNA位于用于轉(zhuǎn)移載體的雙啟動(dòng)子的上游。為了誘導(dǎo)同源重組，最好將轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA以大約1:1到10:1的重量比混合。在通過(guò)共轉(zhuǎn)染步驟同時(shí)導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞中和培養(yǎng)細(xì)胞之后，從培養(yǎng)上清液制造病毒的噬斑，然后懸浮在培養(yǎng)基中，然后通過(guò)渦旋振蕩將病毒從瓊脂上洗脫，產(chǎn)生含有重組病毒的溶液。在上面所述中，可以使用可商購(gòu)的桿狀病毒DNA,例如，可以使用其中的多角體基因已經(jīng)從AcNPV中移除的BacVector-1000DNA和BacVector-2000DNA(由Novagen提供)。將上面獲得的轉(zhuǎn)移載體的桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞中同源重組，可以使用上面描述的可商購(gòu)的載體轉(zhuǎn)染試劑盒(Novagen提供的BacVector轉(zhuǎn)染試劑盒)按照載體轉(zhuǎn)染試劑盒隨附的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。如上所述，上面產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移載體可以與桿狀病毒DNA—起共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞例如Sf-9細(xì)胞中，以產(chǎn)生重組桿狀病毒。在本發(fā)明中，按照上述的生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，可以使用轉(zhuǎn)移載體例如pDual墨Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-HlNl/HAl-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMAlD123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMAl-gp64、pDual-Pfs25墨gp64、pDual-H5Nl/HAl-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-HlNl/HAl-gp64、pCAP-HlNl/HAl-gp64、pCU-HlNl/HAl-gp64、pDual-HlNl/NP-gp64、pDual-HlNl/M2-gp64、pDual-HlNl/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HAl/NC99-gp64、pCP-HlNl/HA0陽(yáng)gp64、pCP-HlNl/HA2-gp64、pCP-HlNl/HAl-vp39、pCP-HlNl/NP-vp39以及桿狀病毒DNA，并共轉(zhuǎn)染到Sf-9昆蟲(chóng)細(xì)胞中以產(chǎn)生重組的桿狀病毒，例如AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMAlD123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV隱Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-H簡(jiǎn)/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HAO、AcNPV陽(yáng)CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP陽(yáng)vp39。此外，重組的桿狀病毒例如AcNPV-Dual-H5Nl/HAl和AcNPV-Dual-SARS/S也可以獲得。除了上述的生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法之外，作為另一種生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，可以使用通過(guò)對(duì)其中整合了整個(gè)桿狀病毒基因組的噬粒(桿粒)使用轉(zhuǎn)座子在大腸桿菌中有效插入外源基因的方法。按照這種方法，可以?xún)H僅通過(guò)從微生物細(xì)胞中提取帶有病毒基因的桿粒并將其轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞中來(lái)容易地生產(chǎn)和收集重組桿狀病毒。通過(guò)上述的生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法獲得的本發(fā)明的重組桿狀病毒的純化，可以使用眾所周知的病毒純化方法來(lái)進(jìn)行。為了純化重組桿狀病毒，將例如0.5到1.0mL通過(guò)上述的生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法獲得的儲(chǔ)存病毒(通常為1x10;8pfu/mL)接種到昆蟲(chóng)細(xì)胞(1x107cells/10cm平皿)例如Sf-9細(xì)胞中，在感染后幾天(4天)收集培養(yǎng)上清液，將通過(guò)離心獲得的病毒沉淀懸浮在緩沖液例如PBS中。獲得的懸浮液加到10到60%的蔗糖梯度中，然后離心(25,000rpm，60分鐘，4°C)以收集病毒帶。收集到的病毒進(jìn)一步懸浮在PBS中，然后離心(條件同上)，將獲得的純化的重組病毒沉淀儲(chǔ)存在4。C的緩沖液例如PBS中。上述獲得的純化的重組病毒的感染性滴度可以通過(guò)使用昆蟲(chóng)細(xì)胞例如Sf-9細(xì)胞基因的噬斑分析(FieldsVIROLOGY4thEdition(病毒學(xué)領(lǐng)域第四版)p29-322001)來(lái)測(cè)量。在本發(fā)明例舉的重組病毒中，桿狀病毒蛋白gp64的N末端暴露在粒子外部，它的C末端暴露在粒子內(nèi)部。因此，如果所需的免疫原性外源基因編碼的蛋白被融合到gp64的N末端，則其作為病毒粒子的成分的實(shí)體在昆蟲(chóng)細(xì)胞中將暴露在病毒蛋白粒子的外部，因此抗原更容易被呈遞，這適合于本發(fā)明的疫苗制劑的目的。(3)本發(fā)明的藥物組合物(含有本發(fā)明的重組桿狀病毒作為活性成分的藥物)在本發(fā)明的藥物組合物中作為活性成分的本發(fā)明的重組桿狀病毒可以通過(guò)在上面的(2)中顯示的基因工程技術(shù)來(lái)獲得。對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物來(lái)說(shuō)，重要的是含有通過(guò)桿狀病毒DNA和構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體的同源重組獲得的重組桿狀病毒作為活性成分，從而融合了本發(fā)明的免疫原性外源基因和能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼基因的融合蛋白能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞和脊椎動(dòng)物細(xì)胞、特別是來(lái)自哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)的細(xì)胞中表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了含有任何特定的重組桿狀病毒作為活性成分的藥物組合物，所述重組桿狀病毒例如AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual陽(yáng)H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39或AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39。在本發(fā)明的藥物組合物中作為活性成分的本發(fā)明的重組桿狀病毒，例如AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39，具有增強(qiáng)對(duì)傳染性抗原的預(yù)防感染效果和降低感染性滴度的作用，這種作用或活性可以用于與靶細(xì)胞或組織的感染有關(guān)的疾病的步驟中。這樣的受感染影響的耙細(xì)胞包括例如血細(xì)胞，以及其它耙細(xì)胞包括肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、腦細(xì)胞、肺細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。包含這些細(xì)胞的組織包括肺、肝、腎、動(dòng)脈和靜脈、胃、腸、尿道、皮膚和肌肉。藥物組合物增強(qiáng)了對(duì)傳染性抗原例如瘧疾抗原如瘧原蟲(chóng)的子孢子體表面的表面抗原CSP、裂殖孢子表面的膜蛋白MSP1、從疙疾感染的紅細(xì)胞分泌的瘧疾S抗原、在瘧疾感染的紅細(xì)胞的瘤節(jié)中存在的PffiMPl蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白和AMA1蛋白以及流感抗原例如HA抗原、NA抗原、M2抗原和NP抗原的預(yù)防感染效果，并降低了感染性滴度(例如病毒感染性滴度)。因此，施用了本發(fā)明的藥物組合物的哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)的存活期和存活率與沒(méi)有給藥相比增加了。因此，本發(fā)明的藥物組合物可以用作特別是瘧疾和流感病毒感染的預(yù)防性或治療性藥劑。本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)利用其增強(qiáng)對(duì)傳染性抗原的預(yù)防感染效果和降低感染性滴度的作用，可用作由病原體引起的傳染病以及它們的并發(fā)癥的預(yù)防性和治療性藥劑，例如由流感病毒、乳頭狀瘤病毒、皰疹病毒、AIDS病毒、丙型肝炎病毒、SARS病毒、西尼羅河熱病毒和登革熱病毒引起的病毒性疾病，由瘧原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)和利什曼原蟲(chóng)引起的寄生蟲(chóng)疾病，以及由細(xì)菌引起的細(xì)菌性疾病，例如痢疾、腸傷寒、霍亂、肺炎球菌、MRSA、VRE、奈瑟氏淋病雙球菌(Neisseriagonorrhoeae)和衣原體(Chlamydia)、梅毒和結(jié)核病。對(duì)于人類(lèi)之外的脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō)，通過(guò)在轉(zhuǎn)移載體中使用免疫原性外源基因以獲得作為本發(fā)明藥物組合物的活性成分的重組桿狀病毒，通過(guò)利用其增強(qiáng)對(duì)傳染性抗原的預(yù)防感染效果和降低感染性滴度的作用，有可能將本發(fā)明的藥物組合物用于與耙細(xì)胞和組織的感染有關(guān)的疾病的過(guò)程，例如禽流感疫苗、牛錐蟲(chóng)疫苗和日本鱒魚(yú)冷水病疫苗。本發(fā)明的藥物組合物可以制備成含有藥物有效量的重組桿狀病毒和可藥用的載體的組合物。對(duì)于本發(fā)明的重組桿狀病毒在脊椎動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的預(yù)防感染效果來(lái)說(shuō)，例如用本發(fā)明的重組桿狀病毒和能夠加入用于給藥的組分生產(chǎn)的藥物組合物，可以通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入在脊椎動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)中給藥，然后用含有本發(fā)明的重組桿狀病毒作為活性成分的藥物組合物對(duì)其進(jìn)行多次免疫。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)吸入給藥。并且，可以通過(guò)用本發(fā)明的藥物組合物多次免疫后，給脊椎動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)施用所針對(duì)的病原體，然后在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，對(duì)施用了作為本發(fā)明的藥物組合物的活性成分的重組桿狀病毒的和未施用它的脊椎動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)的存活率進(jìn)行比較，來(lái)評(píng)估對(duì)感染的預(yù)防性效果。(4)本發(fā)明的疫苗作為本發(fā)明的藥物組合物的活性成分的重組桿狀病毒，例如AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlN固2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39或AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39，作為出芽的病毒粒子從含有融合的DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物的昆蟲(chóng)細(xì)胞中被純化，該融合的DNA序列融合了能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的編碼基因和具有所需免疫原性的本發(fā)明的免疫原性外源基因，以增強(qiáng)對(duì)病原體感染的預(yù)防效果，并表現(xiàn)出減少感染性滴度的作用。然后，據(jù)認(rèn)為通過(guò)以病毒粒子的形式給脊椎動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)施用藥物組合物，成為病毒粒子的成分的外源抗原蛋白有利于獲得性免疫(體液免疫和細(xì)胞免疫)，此外作為融合DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物的抗原性蛋白在脊椎動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)中也有利于獲得性免疫(體液免疫和細(xì)胞免疫)。因此，本發(fā)明的重組桿狀病毒可用作疫苗。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了含有任何特定的重組桿狀病毒作為活性成分的疫苗，這些特定的重組桿狀病毒是例如AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-Hl麗HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV墨CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39。與上述(3)中的藥物組合物的情況相同，所述疫苗增強(qiáng)了對(duì)病原生物體例如瘧疾抗原如瘧原蟲(chóng)的子孢子體表面的表面抗原(CSP)、裂殖孢子表面的膜蛋白MSP1、從瘧疾感染的紅細(xì)胞分泌的瘧疾S抗原、在瘧疾感染的紅細(xì)胞的瘤節(jié)中存在的PffiMPl蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白和AMA1蛋白或流感病毒HA抗原、流感病毒NA抗原、流感病毒M2抗原和流感病毒NP抗原的預(yù)防感染效果，并降低了感染性滴度(例如病毒感染性滴度)。因此，通過(guò)將被感染的哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)與未施用本發(fā)明的藥物組合物者的存活期和存活率進(jìn)行比較，所述疫苗尤其可以用作瘧疾和流感病毒感染的預(yù)防性或治療性藥劑。通過(guò)利用其增強(qiáng)對(duì)傳染性抗原的預(yù)防感染效果和降低感染性滴度的作用，本發(fā)明的疫苗可用作由病原體引起的傳染病以及它們的并發(fā)癥的預(yù)防性和治療性藥劑，例如由流感病毒、乳頭狀瘤病毒、皰疹病毒、AIDS病毒、丙型肝炎病毒、SARS病毒、西尼羅河熱病毒和登革熱病毒引起的病毒性疾病，由瘧原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)和利什曼原蟲(chóng)引起的寄生蟲(chóng)疾病，以及由痢疾、腸傷寒、霍亂、肺炎球菌、MRSA、VRE、奈瑟氏淋病雙球菌和衣原體、梅毒和結(jié)核病的細(xì)菌引起的細(xì)菌性疾病。對(duì)于人類(lèi)之外的脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō)，通過(guò)在轉(zhuǎn)移載體中使用免疫原性外源基因以獲得作為本發(fā)明疫苗的活性成分的重組桿狀病毒，通過(guò)利用其增強(qiáng)對(duì)傳染性抗原的預(yù)防感染效果和降低感染性滴度的作用，有可能將本發(fā)明的藥物組合物用于與靶細(xì)胞和組織的感染有關(guān)的疾病的過(guò)程，例如禽流感疫苗、牛錐蟲(chóng)疫苗和日本鱒魚(yú)冷水病疫苗。在本發(fā)明的疫苗中作為活性成分的本發(fā)明的重組桿狀病毒，例如AcNPV陽(yáng)Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV誦CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39，具有增強(qiáng)對(duì)傳染性抗原的預(yù)防感染效果和降低感染性滴度的作用，這種作用或活性可以用于與靶細(xì)胞或組織的感染有關(guān)的疾病的程序中。這樣的受感染影響的耙細(xì)胞包括例如血細(xì)胞，以及其它靶細(xì)胞包括肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、腦細(xì)胞、肺細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。包含這些細(xì)胞的組織包括肺、肝、腎、動(dòng)脈和靜脈、胃、腸、尿道、皮膚和肌肉。本發(fā)明的疫苗與上面(3)中的藥物組合物一樣，可以制備成含有藥物有效量的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP陽(yáng)HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl脆e、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39、AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39)和可藥用的載體的組合物。可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法將疫苗制備成與上述(3)中的藥物制劑相同的藥物合格性的藥物組合物形式。載體可以包括，例如，生理可接受的溶液例如無(wú)菌鹽水和無(wú)菌緩沖鹽水。疫苗(在后文中，配方與藥物組合物中的相同)可以制備成含有重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP國(guó)HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV墨Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39、AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39)作為活性成分的脂質(zhì)體制劑，并可以與佐劑組合。本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)的具體例子可以包括脂質(zhì)體制劑。脂質(zhì)體制劑可以是其中本發(fā)明的重組桿狀病毒已經(jīng)被保留在使用酸性磷脂作為膜成分或使用中性磷脂和酸性磷脂作為膜成分的脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體制劑。用作膜成分的中性磷脂和酸性磷脂沒(méi)有具體的限制，各種通常用于脂質(zhì)體制劑的脂質(zhì)都可以單獨(dú)使用或以?xún)煞N或多種的混合物的形式使用。脂質(zhì)體膜按照標(biāo)準(zhǔn)的方法單獨(dú)使用酸性磷脂或組合使用中性磷脂和酸性磷脂來(lái)形成。在與中性磷脂組合的情況下，被組合的酸性磷脂的比率可以為脂質(zhì)體膜成分的大約O.l到lOOmol。/。，優(yōu)選l到90mol%，更優(yōu)選為大約10到50mol%。在制備上述的脂質(zhì)體時(shí)，例如，可以加入膽固醇。這可以控制磷脂的流動(dòng)性，使脂質(zhì)體的制備更容易。膽固醇添加的量一般與磷脂的量相當(dāng)，優(yōu)選它優(yōu)選以磷脂的量的0.5倍當(dāng)量的量來(lái)添加和混合。對(duì)于脂質(zhì)體制劑中活性成分和酸性磷脂的比例來(lái)說(shuō)，酸性磷脂的量相當(dāng)于活性成分的量的大約0.5到100當(dāng)量，優(yōu)選大約1到60當(dāng)量，更優(yōu)選大約1.5到20當(dāng)量。作為活性成分的本發(fā)明的重組桿狀病毒的使用量可以是幾mol%到幾十mol%，優(yōu)選大約5到10mol%，典型約5mol%。上述脂質(zhì)體制劑的生產(chǎn)、濃度和顆粒直徑控制可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行。如果需要，上面描述的各種添加劑也可以與脂質(zhì)體制劑混合。脂肪酸(例如二十二垸酸、硬脂酸、棕櫚酸、豆蔻酸、油酸)、烷基基團(tuán)、膽甾醇基團(tuán)等也可以混合到其中并使用。通過(guò)混合它們制備的脂質(zhì)體制劑的生產(chǎn)也可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)《長(zhǎng)期循環(huán)的脂質(zhì)體老藥物，新療法》LongCirculatingLiposomes:olddrugs,Newtherapeutics.,M.C.Woodle，G.Storm,主編，Springer-VerlagBerlin(1998))。本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)可以?xún)?yōu)選用作疫苗組合物。當(dāng)使用它時(shí)，為了增加抗感染(抗瘧疾或抗流感)效果，優(yōu)選將它以藥物有效量與佐劑混合。作為佐劑，任何常用于這種類(lèi)型的疫苗的佐劑都可以不受限制地使用。作為其例子，可以舉例的是弗氏完全佐劑、胞壁酰二肽、氫氧化鋁、BCG、IL-12、N-乙酰胞壁質(zhì)-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、胸腺素al和QS-21。被混合的佐劑的量可以根據(jù)皮膚的軟化、紅斑、發(fā)熱、頭痛和肌肉痛來(lái)適當(dāng)?shù)卮_定，這些可能是人類(lèi)或動(dòng)物在給藥后表現(xiàn)出的免疫反應(yīng)的一部分。本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)可以與其它公眾知道的藥物制品例如促進(jìn)免疫響應(yīng)的肽和抗細(xì)菌劑(合成的抗細(xì)菌劑)相組合。疫苗(藥物組合物)中還可以包含任選的藥物和添加劑。作為其例子，可以舉例的藥物是例如幫助本發(fā)明的重組桿狀病毒的細(xì)胞內(nèi)攝入的^離子。可以使用藥物和添加劑例如脂質(zhì)體以及例如氟碳乳化劑、螺旋形、小管、金顆粒、生物可降解微球和能夠使轉(zhuǎn)染更容易的陽(yáng)離子聚合物。在本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)(制劑)中包含的活性成分的量沒(méi)有特別的限制，可以從廣泛的范圍內(nèi)選擇，只要它是藥物有效量就行。疫苗(藥物組合物)的劑量沒(méi)有特別的限制，并可以根據(jù)所需的治療效果、給藥方法(給藥途徑)、治療持續(xù)時(shí)間、患者的年齡和性別以及其它情況在廣泛的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。當(dāng)作為本發(fā)明的疫苗(組合物)的活性成分的重組桿狀病毒施用于人類(lèi)時(shí)，對(duì)于重組病毒的PFU來(lái)說(shuō)，每個(gè)病人施用相當(dāng)于102到1012PFU、優(yōu)選105到101QPFU、更優(yōu)選106到1C)9PFU的重組桿狀病毒。作為本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)的活性成分的重組桿狀病毒(AcNPV陽(yáng)Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl脆e、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39、AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39)的劑量與導(dǎo)入到疫苗宿主中的可表達(dá)的DNA量或轉(zhuǎn)錄的RNA量一樣，可以在非常廣泛的范圍內(nèi)選擇。它們的量也依賴(lài)于用于轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)子的強(qiáng)度。本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)通過(guò)將其中載體已經(jīng)懸浮在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)或鹽水中的重組桿狀病毒懸浮液直接注射到局部位點(diǎn)中(例如肺組織、肝臟、肌肉和腦中)、通過(guò)鼻或氣道吸入、或給藥到血管中(例如動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)和門(mén)靜脈內(nèi))來(lái)進(jìn)行給藥。本發(fā)明的疫苗優(yōu)選通過(guò)吸入給藥?？蓛?yōu)選本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)不是一次給藥，而是通過(guò)觀(guān)察初次給藥后的狀態(tài)和施用附加的疫苗來(lái)進(jìn)行一次到多次給藥。這使得增強(qiáng)所需的效果成為可能。在施用疫苗(藥物組合物)后，用本發(fā)明的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual陽(yáng)PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlN固2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA固C99、AcNPV畫(huà)CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39、AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39)構(gòu)成的藥物組合物進(jìn)行額外的免疫接種是可能的。上述各種待混合的藥物的組合也具有通過(guò)施用疫苗(藥物組合物)而增加治療效果的可能性。在本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)的一個(gè)實(shí)施方案中，作為本發(fā)明的疫苗(藥物組合物)的一種活性成分的重組桿狀病毒，可以通過(guò)將轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒DNA進(jìn)行同源重組而獲得的重組桿狀病毒以能夠注射的單位劑量的形式(溶液、懸浮液或乳濁液)與可藥用的載體(即對(duì)于脊椎動(dòng)物包括人類(lèi)來(lái)說(shuō)，在待施用的劑量和濃度下沒(méi)有毒性，并且與制劑中的其它成分相容)相混合來(lái)配制，轉(zhuǎn)移載體中已經(jīng)導(dǎo)入了通過(guò)將所需的免疫原性外源基因和能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的編碼基因進(jìn)行融合而獲得的融合基因。例如，制劑中優(yōu)選不含有抗氧化劑并且沒(méi)有其它眾所周知的對(duì)重組桿狀病毒有害的化合物。載體適當(dāng)?shù)睾猩倭康奶砑觿?，例如增加等滲性質(zhì)和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)在所施用的劑量和濃度下對(duì)于哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)來(lái)說(shuō)是無(wú)毒性的，并可以包括緩沖液例如磷酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸和其它有機(jī)酸或其鹽，抗氧化劑例如抗壞血酸，低分子量(例如小于10個(gè)殘基)的多肽(例如聚精氨酸或三肽)，蛋白(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)，氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸)、單糖、二糖和其它碳水化合物(包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精)，螯合劑(例如EDTA)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，反離子(例如鈉)和/或非離子型表面活性劑(例如多聚山梨酸酯、泊洛沙姆)。典型情況下，含有重組桿狀病毒的藥物疫苗(組合物)可以作為水溶液或冷凍干燥產(chǎn)品儲(chǔ)存在單位或多劑容器中，例如密封的安瓿或小管中。含有本發(fā)明的疫苗(組合物)的藥物組合物的給藥，以切合醫(yī)療實(shí)踐規(guī)范的模式，參考了個(gè)體患者的臨床病癥(例如要預(yù)防或治療的病癥)、含有重組桿狀病毒的疫苗(組合物)的投送位點(diǎn)、靶組織、給藥方法、用藥方案和其它本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員所共知的因素后進(jìn)行。因此，本文的疫苗(組合物)的適合的劑量通過(guò)考慮上述因素來(lái)確定。實(shí)施例下面將參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。這些實(shí)施例僅僅是示例性的，不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒及其生產(chǎn)方法(1)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pTriEx-Hsp65-gp64的構(gòu)建(1.1)質(zhì)粒pBACsurf-CSP的構(gòu)建通過(guò)按照Yoshida等的方法(Yoshida,S.，等B.B.R.C.，271，107-115(2000))獲得了Nhel-Notl片段，其含有融合了柏氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumberghei)ANKA株的基因組DNA、鼠Igk分泌的信號(hào)序列和FLAG序列的序列，并將Nhel-Notl片段插入到pcDNA3.1(Invitrogen提供)的Nhel-Notl位點(diǎn)中，從而制成質(zhì)粒pcDNA-CS87。從瘧原蟲(chóng)柏氏瘧原蟲(chóng)ANKA感染的BALB/c小鼠收集血液樣品，使用QIAampDNAMidi試劑盒(Qiagen提供)提取柏氏瘧原蟲(chóng)基因組DNA。然后使用引物pbCSPl:5，-GGAGGGCTAGC4rGGJ04C4(L4C4C4CrCCrGCT^rGGGrXCH7CrGcrcrGGGrrcc4GGrrcc4crGG腦cgcggatccactgcag^4CGCCC-3(SEQIDNO:l)(新制備的Nhel位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示，鼠Igk分泌的信號(hào)序列用斜體表示，F(xiàn)LAG序列用雙下劃線(xiàn)表示)和PbCSP-Rl:TCTAACTCTTATACCAGAACC-3，(SEQIDNO:2)(新制備的Notl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，通過(guò)PCR擴(kuò)增柏氏賠原蟲(chóng)ANKA基因組DNA。PCR使用PfuDNA聚合酶(Stratagene提供)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94。C變性30秒，55。C退火l分鐘，72。C延伸2分鐘)。PCR產(chǎn)物不具有糖基化磷酯酰肌醇(GPI)錨，并且編碼與鼠Igk分泌信號(hào)序列融合的PbCSP代替其原有的信號(hào)序列。將PCR產(chǎn)物純化，用限制性酶Nhel/Notl切割，然后插入到pcDNA3.1(Invitrogen提供)的Nhel/Notl位點(diǎn)中，獲得的質(zhì)粒命名為pcDNA-CS87。pcDNA-CS87質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子、鼠Igk分泌的信號(hào)序列、PbCSP基因編碼的蛋白(對(duì)應(yīng)于21到299位氨基酸)、來(lái)自牛生長(zhǎng)激素基因的polyA信號(hào)和polyA序列。來(lái)自PbCSP的肽的21到306位氨基酸序列的編碼基因片段通過(guò)用限制性酶Pstl和Smal切開(kāi)pcDNA-CS87而獲得，將該DNA片段插入到pBACsurf(Novagen提供)的Pstl和Smal位點(diǎn)中，構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pBACsurf-CSP。(1.2)質(zhì)粒pBACsurf-Hsp65的構(gòu)建使用QIAampDNAMidi試劑盒(Qiagen提供)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株提取基因組DNA，并通過(guò)PCR克隆而獲得Hsp65基因。也就是說(shuō)，使用引物phsp65-Fl:5'-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3(SEQIDN0:3)(BglII位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和phsp65-Rl:AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3(SEQIDN0:4)(Notl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)通過(guò)PCR擴(kuò)增了從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株提取的基因組DNA。將PCR產(chǎn)物純化，用限制性酶BglII/Notl切割，連接至IJpcDNA3.1(Invitrogen提供)的BamHI/Notl位點(diǎn)中，獲得的質(zhì)粒命名為pcDNA-hsp65。pcDNA-hsp65質(zhì)粒是其中鼠Igk分泌的信號(hào)序列與hsp65基因融合的構(gòu)建體。以pcDNA-hsp65作為模板，使用引物phsp65-F2:5-CACCCCTGCAGGJCL4C4y4C04C04r04C4JGGAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3，(SEQIDNO:5)(Sse83871、EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示，F(xiàn)LAG序列用斜體表示)和phsp65-R2:5，-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3'(SEQIDNO:6)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行了PCR。得到的Hsp65基因的DNA片段(大約1660bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中，然后用Sse8387I/Cfr91切開(kāi)，插入到上面獲得的pBACsurf-CSP的Pstl/Cfr9I位點(diǎn)中(Yoshida等Virology316:161-70，2003)。上述構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pBACsurf-Hsp65。(1.3)質(zhì)粒pENTR-gp64的構(gòu)建以pBACgus-l(Novagen提供)作為模板，使用引物pPolh-F2:5，-CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3，(SEQIDNO:7)(RsrII位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和pgp64-R2:5，-GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3,(SEQIDNO:8)(Kpnl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行了PCR。得到的gp64基因的DNA片段(大約1700bp)被插入到pENTR/D-TOPO中以構(gòu)建質(zhì)粒pENTR-gp64。按照上述構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pENTR-gp64。(1.4)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-Hsp65-gp64的構(gòu)建將pDual-Hsp65-gp64用Pstl/Cfr91切開(kāi)，并將hsp65基因的DNA片段(大約1660bp)插入到pENTR-gp64的Pstl/Cfr91位點(diǎn)中，以構(gòu)建質(zhì)粒pENTR-Hsp65-gp64。此外，將pENTR-hsp65-gp64用Rsrll/Kpnl切開(kāi)，將多角體啟動(dòng)子和hsp65gp64基因構(gòu)成的DNA片段(大約3360bp)插入到TriEx-3(Novagen提供)的RsrlI/Kpnl中，以構(gòu)建了其中表達(dá)受所需的雙啟動(dòng)子控制的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pDual-Hsp65-gp64。(2)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-PbCSP-gp64的構(gòu)建將在(l.l.l)中獲得的質(zhì)粒pBACsurf-CSP用Pstl/Cfr91切開(kāi)，將PbCSP基因的DNA片段(大約890bp)插入到pDual-Hsp65-gp64的Pstl/Cfr91位點(diǎn)中，以構(gòu)建質(zhì)粒pDual-PbCSP-gp64。(3)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-HlNl/HAl-gp64的構(gòu)建使用QIAampMiniEluteVirusSpin試劑盒(QIAGEN)，從流感病毒PR8/34株感染的MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中提取RNA，并使用引物HA-f:5，-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3'(SEQIDNO:9)(Sbfl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和HA-r:5，-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3(SEQIDNO:10)(Sbfl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增。得到的全長(zhǎng)1700bp的流感病毒HA基因片段被克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen提供)中。得到的質(zhì)粒被命名為pCR-Blunt-HA。以pCR-Blunt-HA作為模板，使用引物pHA-Fl:5，-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3，(SEQIDNO:ll)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和pHA-Rl:5'-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3，(SEQIDNO:12)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，進(jìn)行了PCR。得到的H1N1/HA1基因的DNA片段(大約1000bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中，然后用EcoRI/Cfr91切開(kāi)，之后將其插入到pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr91位點(diǎn)中，從而構(gòu)建質(zhì)粒pDual-HlNl/HAl-gp64。(4)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-PbTRAMP-gp64的構(gòu)建從瘧原蟲(chóng)柏氏瘧原蟲(chóng)ANKA感染的BALB/c小鼠收集血液樣品，使用QIAampDNAMidi試劑盒(Qiagen提供)提取柏氏鼠瘧原蟲(chóng)的基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板，按照下面的方法通過(guò)PCR克隆了PbTRAMP基因。艮卩，使用引物pTRAMP-Fl:5'-CACCGAATTCAAAATTGATACGAAAAAAAATGAAG-3，(SEQIDNO:13)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和pTRAMP-Rl:CCCGGGCTTTTAATTTTGAGGAGTCTTTATTTTC-3，(SEQIDNO:14)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，進(jìn)行了PCR。得到的PbTRAMPDNA片段(800bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中，然后用EcoRI/Cfr9I切開(kāi)，之后將其插入到pBACsurf-Hsp65的EcoRI/Cfr9I位點(diǎn)中。構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pBACsurf-PbTRAMP。然后，將pBACsurf-PbTRAMP用EcoRI/Cfr9I切開(kāi)，將PbTRAMP基因的DNA片段(大約860bp)插入至ljpDual陽(yáng)Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位點(diǎn)中，以構(gòu)建質(zhì)粒pDual-PbTRAMP-gp64。(5)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-PbAMAlD123-gp64的構(gòu)建從瘧原蟲(chóng)柏氏瘧原蟲(chóng)ANKA感染的BALB/c小鼠收集血液樣品，使用QIAampDNAMidi試劑盒(Qiagen提供)提取柏氏瘧原蟲(chóng)的基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板按照下面的方法通過(guò)PCR克隆了PbAMAl基因結(jié)構(gòu)域123(D123)基因。即，使用引物pAMA-Fl:5，-CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3，(SEQIDNO:15)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和pAMA-Rl:5，-CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3，(SEQIDNO:16)(Cfr91位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行PCR。得到的PbAMAlD123DNA片段(大約1280bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中，然后用EcoRI/Cfr9I切開(kāi)，然后將其插入到pBACsurf-Hsp65的EcoRI/Cfr9I位點(diǎn)中。構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pBACsurf-PbAMA1D123。然后，將pBACsurf-PbAMAlD123用EcoRI/Cfr9I切開(kāi)，并將PbAMAlD123基因的DNA片段(大約1280bp)插入到在上面的(1.4)中獲得的pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位點(diǎn)中，以構(gòu)建質(zhì)粒pDual-PbAMA1D123-gp64。(6)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-PbMSP119-gp64的構(gòu)建從瘧原蟲(chóng)柏氏瘧原蟲(chóng)ANKA感染的BALB/c小鼠收集血液樣品，使用QIAampDNAMidi試劑盒(Qiagen提供)提取了柏氏瘧原蟲(chóng)的基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板，按照下面的方法通過(guò)PCR克隆PbMSP119基因。即，使用引物pMspl-Fl:5'-CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACATAGCCTCAATAGCTTTAAATAACTTAAATAAATCTGG-3，(SEQIDNO:17)(Pstl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和pMspl-Rl:5，-CCCGGGTTCCCATAAAGCTGGAAGAGCTACAGAATACACC-3'(SEQIDNO:18)(Cfr91位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，進(jìn)行PCR。得到的PbMSP119DNA片段(大約450bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中，然后用Pstl/Cfr91切開(kāi)，然后將其插入到pBACsurf-Hsp65的Pstl/Cfr91位點(diǎn)中。構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pBACsurf-PbMSP119。然后，將pBACsurf-PbMSP119用Pstl/Cfr91切開(kāi)，將PbMSP-119基因的DNA片段(大約450bp)插入到pDual-Hsp65-gp64的Pstl/Cfr91位點(diǎn)中，以構(gòu)建質(zhì)粒pDual-PbMSP-119-gp64。(7)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-PfCSP-gp64的構(gòu)建從瘧原蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)3D7株感染的人類(lèi)紅細(xì)胞中，使用QIAampDNAMidi試劑盒(Qiagen)提取了瘧原蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)的基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板，按照下面的方法通過(guò)PCR克隆PfCSP基因。即，使用引物pPfCSP-Fl:5，-CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3'(SEQIDNO:19)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和pPfCSP-Rl:5，-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3，(SEQIDNO:20)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，進(jìn)行了PCR。得到的PfCSPDNA片段(大約1100bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中，然后用EcoRI/Cfr9I切開(kāi)，然后將其插入到pDual-PbAMAlD123-gp64的EcoRI/Cfr91位點(diǎn)中.。構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pDual-PfCSP-gp64。(8)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-PfAMAl-gp64的構(gòu)建從惡性瘧原蟲(chóng)3D7株感染的人類(lèi)紅細(xì)胞中，使用QIAampDNAMidi試劑盒(Qiagen)提取了瘧原蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)的基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板，按照下面的方法通過(guò)PCR克隆了PfAMAl基因。艮卩，使用引物pPfAMAl-Fl:5，-CACCCTGCAGCL4C7MC4XC04脂C4JGCAGAATTATTGGGAACATCCATATCAAAATAGTGATGTG-3，(SEQIDNO:21)(Pstl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示，F(xiàn)LAG序列用斜體表示)和pPfAMAl-Rl:5，-CCCGGGCTTTCATTTTATCATAAGTTGGTTTATG-3，(SEQIDNO:22)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，進(jìn)行了PCR。得到的PfAMAlDNA片段(大約3500bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中，然后用Pstl/Cfr91切開(kāi)。然后將其插入到PbAMAlD123-gp64的Pstl/Cfr91位點(diǎn)中。構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pDual-PfAMAl-gp64。(9)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-Pfs25-gp64的構(gòu)建從惡性瘧原蟲(chóng)3D7株感染的人類(lèi)紅細(xì)胞中，使用QIAampDNAMidi試劑盒(Qiagen)提取了瘧原蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)的基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板，按照下面的方法通過(guò)PCR克隆Pfs25基因。即，使用引物pPfs25-Fl:5，-CACCGAATTCAAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3，(SEQIDNO:22)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和pPfs25-Rl:5，-CCCGGGCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTAT-3，(SEQIDNO:24)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，進(jìn)行PCR。得到的Pfs25DNA片段(大約530bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(從Invitrogen提供)中，然后用EcoRI/Cfr9I切開(kāi)，然后將其插入到PbAMAlD123-gp64的EcoRI/Cfr91位點(diǎn)中。構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pDual-Pfs25-gp64。(10)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-H5Nl/HAl-gp64的構(gòu)建從禽流感病毒H5N1合成了HA1基因，插入到pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位點(diǎn)中，構(gòu)建了質(zhì)粒pDual-H5Nl/HAl-gp64。(U)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-SARS/S-gp64的構(gòu)建合成了SARS病毒的S基因，插入到pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr91位點(diǎn)中，構(gòu)建了質(zhì)粒pDual-SARS/S-gp64。(12)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pCP-HlNl/HAl-gp64的構(gòu)建以pCR-Blunt-HA作為模板，使用引物Polh-fRsrll(5,-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3，:SEQIDNO:25)(RsrII位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和GP64-rDraIII(5，-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3':SEQIDNO:26)(DraIII位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，進(jìn)行PCR。將得到的2700bp的DNA片段連接到用限制性酶Rsrll和Dralll消化pDual-HlNl/HAl-gp64獲得的載體中，構(gòu)建了pCP-HlNl/HAl-gp64。(13)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pCAP-HlNl/HAl-gp64的構(gòu)建將用限制性酶RsrII和DraIII切開(kāi)pCP-HlNl/HAl-gp64獲得的HA1與gp64基因片段插入到用限制性酶RsrII和DraIII切開(kāi)pTriEx-l.l(Novagen提供)得到的載體中，構(gòu)建了質(zhì)粒pCAP-HlNl/HAl-gp64。(14)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pCU-HlNl/HAl-gp64的構(gòu)建以pTr正x3.1作為模板，使用CMVenh-fFsel(5，-GGGGGCCGGCCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC國(guó)3，:SEQIDNO:27)(Fsel位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和CMVenh-rKpnl(5，-GGGGGTACCCATGGTAATAGCGATGACTAATACG-3,:SEQIDNO:28)(Kpnl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增CMV增強(qiáng)子區(qū)域。此外，以人類(lèi)基因組DNA為模板，使用UBBp-fKpnl(5，-GGGGGTACCTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTC-3，:SEQIDNO:29)(Kpnl位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和UBBp-rRsrII(5，-GGGCGGTCCGGACCTAGTTTAAAAGTAAAACATAAG-3':SEQIDNO:30)(RsrII位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增UBB啟動(dòng)子區(qū)域。將得到的兩個(gè)片段連接到用限制性酶Fsel和RsrII消化的pCP-HlNl/HAl-gp64獲得的載體中，構(gòu)建了pCU-HlNl/HAl-gp64。(15)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-HlNl/NP-gp64的構(gòu)建以來(lái)自流感病毒PR8/34株的基因組RNA作為模板，使用NP-fEcoRI(5，-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3，:SEQIDNO:31)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和NP-rCfr91(5，-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3，:SEQIDNO:32)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行RT-PCR。將得到的片段用限制性酶EcoRI和Cfr91消化，插入到用限制性酶EcoRI和Cfr91消化的pCP-HlNl/HAl-gp64中，制造了pDual曙HlNl/NAe-gp64。(16)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-HlNl/M2-gp64的構(gòu)建以來(lái)自流感病毒PR8/34株的基因組RNA作為模板，使用M2-fEcoRI(5，-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3，:SEQIDNO:33)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和M2-rCfr91(5，-GATCCCGGGCCTCCAGCTCTATGCTGAC-3、SEQIDNO:34)(Cfr91位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行了RT-PCR。將得到的片段用限制性酶EcoRI和Cfr91消化，插入到用限制性酶EcoRI和Cfr91消化的pCP-HlNl/HAl-gp64中，制造了pDual-HlNl/M2-gp64。(17)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-HlNl/NAe-gp64的構(gòu)建以來(lái)自流感病毒PR8/34株的基因組RNA作為模板，使用NAe-fEcoRI(5，-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3，SEQIDNO:35)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和NAe-rCfr91(5，-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3，:SEQIDNO:36)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行了RT-PCR。將得到的片段用限制性酶EcoRI和Cfr91消化，插入到用限制性酶EcoRI和Cfr91消化的pCP-HlNl/HAl-gp64中，制造了pDual-HlNl/NAe-gp64。(18)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pDual-M2e-gp64的構(gòu)建以pDual-HlNl/M2-gp64作為模板，使用M2-fEcoRI(5，-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3、SEQIDNO:37)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和M2e-rCfr91(5，-GATCCCGGGCATCACTTGAACCGTTGCA-3，:SEQIDNO:38)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行PCR。將得到的片段用限制性酶EcoRI和Cfr91消化，插入到用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化的pCP-HlNl/HAl-gp64中，制造了pDual-M2e-gp64。(19)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pCP-HAl/NC99-gp64的構(gòu)建從冷凍保存的流感病毒NewCaledonia99/20(NC99)中使用QIAampMiniEluteVirusSpin試劑盒(QIAGEN)提取了RNA，使用引物HAl-fEcoRI(5，-GATGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACC-3，:SEQIDNO:39)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和HAl-rCFr9I(NC99)(5，-GATCCCGGGCTCTGGATTGAATGGATGGGATG-3，:SEQIDNO:40)(Cfr9I位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行了RT-PCR，以擴(kuò)增HA1基因片段。將得到的片段和pCP-HlNl/HAl-gp64用限制性酶EcoRI和Cfr9I處理，用來(lái)將來(lái)自NC99的HA1基因片段新插入到pCP-HlNl/HAl-gp64的HA1導(dǎo)入?yún)^(qū)中。得到的質(zhì)粒被命名為pCP-HAl/NC99-gp64。(20)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pCP-HlNl/HA0-gp64的構(gòu)建以pCR-Blunt-HA為模板，使用HAO-fEcoRI(5'-GGGGAATTCATGAAGGCAAACCTACTGG-3':SEQIDNO:41)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和HA2-rCfr9I(5，-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3，SEQIDNO:42)(Cfr91位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增全長(zhǎng)HA基因。將得到的片段與pCP-HlNl/HAl-gp64用限制性酶EcoRI和Cfr9I處理，用于將HAO基因片段新插入到pCP-HlNl/HAl-gp64的HA1導(dǎo)入?yún)^(qū)中。得到的質(zhì)粒被命名為pCP-HlNl/HA0-gp64。(21)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pCP-H1N1/HA2-gp64的構(gòu)建以pCR-Blunt-HA為模板，使用HA2-fEcoRI(5，-GATGAATTCATATTTGGAGCCATTGCCG-3，SEQIDNO:43)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和HA2-rCfr91(5'-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3，SEQIDNO:44)(Cfr91位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增全長(zhǎng)HA基因。將得到的片段與pCP-HlNl/HAl-gp64用限制性酶EcoRI和Cfr91處理，用于將HA2基因片段新插入到pCP-HlNl/HAl-gp64的HA1導(dǎo)入?yún)^(qū)中。得到的質(zhì)粒被命名為pCP-HlNl/HA2-gp64。(22)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pCP-HlNl/HAl-vp39的構(gòu)建以BacVector-2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Novagen)隨附的桿狀病毒DNA作為模板，使用vp39-f(5'-CTTACTAGTATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGAATT￡GGCGGCGGCGGCTCGGCGCTAGTGCCCGTGGGT-3':SEQIDNO:45)(Spel位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示，EcoRI位點(diǎn)用雙下劃線(xiàn)表示)和vp39-r(5，-CTTCACTTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGCCCGGGGCTTTAAAGCTTGACGGCTATTCCTCCACC-3':SEQIDNO:46)(DraIII位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示，Smal位點(diǎn)用雙下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增vp39基因區(qū)。將擴(kuò)增的片段和pDual-HlNl/HAl-gp64用限制性酶Spel和DraIII切開(kāi)，互相連接以構(gòu)建pDual-vp39。此外，以pDual-HlNl/HAl-gp64為模板，使用Polh-Sl(5，GCTAACCATGTTCATGCC-3，SEQIDNO:47)和HAl誦rEcoRI(5,-GGGGAATTCACCTCTGGATTGGATGGAC-3，:SEQIDNO:48)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)進(jìn)行PCR。將得到的片段用EcoRI消化，制備了HA1基因。將得到的片段插入到用EcoRI消化的pDual-vp39中，構(gòu)建了pCP-HlNl/HAl-vp39。(23)本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pCP-HlNl/NP-vp39的構(gòu)建以pDual-HlNl/NP-gp64為模板，使用NP-f5EcoRI(5，-ACGGAATTCATGGCGTCCCAAGGCACC-3，:SEQIDNO:49)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)和NP-rEcoRI(5'-ACGGAATTCATTGTCGTACTCCTCTGCATTG-3，:SEQIDNO:50)(EcoRI位點(diǎn)用下劃線(xiàn)表示)，進(jìn)行PCR。將得到的片段用EcoRI消化。將得到的片段插入到用EcoRI消化的pDual-vp39中，構(gòu)建了pCPl-HlNl/NP-vp39。pBACgus-CMV-PbCSP的構(gòu)建(1.1)pcDNA-GL3(luc)的構(gòu)建將pGL3-增強(qiáng)子(Promega)用限制性酶HindlII/Xbal切開(kāi)，將熒光素酶基因DNA片段(大約1690bp)連接到pcDNA3.1(Invitrogen提供)的HindlII/Xbal位點(diǎn)中，得到的質(zhì)粒被命名為pcDNA-GL3(luc)。(1.2)pBACgus-CMV-IgHsp65的構(gòu)建將在上面的實(shí)施例1(1.2)中獲得的pcDNA-hsp65用限制性酶BamHI/Notl切開(kāi)，插入到BamHI/Notl位點(diǎn)中產(chǎn)生pcDNA-Ighsp65。得到的質(zhì)粒被命名為pcDNA-IgHsp65。然后，將pcDNA-IgHsp65用BglII/Sphl切開(kāi)，將CMV啟動(dòng)子、帶有鼠Igk信號(hào)序列的Hsp65基因以及來(lái)自牛生長(zhǎng)激素的polyA信號(hào)構(gòu)成的基因盒(大約2850bp)插入到pBACgus-l(Novagen)的BglII/Sphl位點(diǎn)中。構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pBACgus-CMV-Hsp65。(1.3)pBACgus-CMV-GL3的構(gòu)建將上面獲得的質(zhì)粒pcDNA-GL3(luc)用限制性酶Nhel/Xbal切開(kāi)，將熒光素酶基因DNA片段(大約1690bp)插入到質(zhì)粒pBACgus-CMV-Hsp65的Nhel/Xbal位點(diǎn)中，得到的質(zhì)粒被命名為pBACgus-CMV-GL3。(1.4)pBACgus-CMV-PbCSP的構(gòu)建用限制性酶Pstl和Smal切開(kāi)質(zhì)粒pBACsurf-CSP，產(chǎn)生了對(duì)應(yīng)PbCSP肽的21到306位氨基酸序列的編碼基因的片段，將該DNA片段(大約858bp)插入到上面獲得的pBACgus-CMV-GL3的Pstl和Smal位點(diǎn)中，得到的質(zhì)粒被命名為pBACgus-CMV-PbCSP。(1.5)pBACgus-CMV-HA-full的構(gòu)建將pCR-Blunt-HA用BamHI/Sse83871切開(kāi)，將HA基因的DNA片段(大約1750bp)插入到pBluescriptII(KS-)的BamHI/Pstl位點(diǎn)中，構(gòu)建了質(zhì)粒pBluescript-HA。此夕卜，將pBluescript-HA用HindlII/Xbal切開(kāi)，將HA基因的DNA片段(大約1800bp)插入到在(1.3)中獲得的pBACgus-CMV-GL3的HindlII/Xbal位點(diǎn)中，構(gòu)建了質(zhì)粒pBACgus-CMV-HA-full。本發(fā)明的重組桿狀病毒及其生產(chǎn)方法(1)使用制備重組桿狀病毒的試劑盒(Novagen的BacVector-2000轉(zhuǎn)染試劑盒)，通過(guò)將BacVector-2000DNA與上述實(shí)施例1中構(gòu)建的每種轉(zhuǎn)移載體pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-HlNl/HAl-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMAlD123-gp64、pDual-PbMSP-119-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMAl-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pCP-HlNl/HAl-gp64、pCAP-HlNl/HAl-gp64、pCU-HlNl/HAl-gp64、pDual陽(yáng)HlNl/NP-gp64、pDual-HlNl/M2-gp64、pDual-HlNl/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HAl/NC99-gp64、pCP-HlNl/HA0-gp64、pCP-HlNl/HA2-gp64、pCP-HlNl/HAl-vp39、pCP-HlNl/NP-vp39以及在參比實(shí)施例1中獲得的質(zhì)粒pBACgus-CMV-PbCSP和pBACgus-CMV-HA-full共轉(zhuǎn)染到Sf-9細(xì)胞中，制備了重組桿狀病毒。制備的重組桿狀病毒被分別命名為AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMAlD123、AcNPV-Dual-PbMSP-119、AcNPV-CMV-PbCSP、AcNPV-CMV-HA-full、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39。培養(yǎng)Sf-9細(xì)胞，使得每個(gè)150mm培養(yǎng)平板(AkitaSumitomoBakeliteCo"Ltd.提供的sumilon)為2x107個(gè)細(xì)胞，每種上述的桿狀病毒以大約5的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染。在5到6天后，將培養(yǎng)基在4°C以1O，OOOxg離心25分鐘以收集上清液，使用Beckman超速離心機(jī)(SW28搖擺轉(zhuǎn)頭)將其在4。C以25,000rpm繼續(xù)離心90分鐘以獲得病毒粒子。(2)使用制備重組桿狀病毒的試劑盒(Novagen提供的BacVector-2000轉(zhuǎn)染試劑盒)，通過(guò)將BacVector-2000DNA與上述實(shí)施例1中構(gòu)建的每種轉(zhuǎn)移載體pDual-H5Nl/HAl-gp64和pDual-SARS/S-gp64共轉(zhuǎn)染到Sf-9細(xì)胞中，制備了重組桿狀病毒。制備的重組桿狀病毒分別被命名為AcNPV-H5Nl/HAl和AcNPV-Dual-SARS/S。培養(yǎng)Sf-9細(xì)胞，使得每個(gè)150mm培養(yǎng)平板(AkitaSumitomoBakeliteCo.,Ltd.提供的sumilon)為2x107個(gè)細(xì)胞，每種上述的桿狀病毒以大約5的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染。在5到6天后，將培養(yǎng)基在4。C以10,000xg離心25分鐘以收集上清液，使用Beckman超速離心機(jī)(SW28搖擺轉(zhuǎn)頭)將其在4。C以25，000rpm繼續(xù)離心90分鐘以獲得病毒粒子。本發(fā)明的重組桿狀病毒的藥理作用(作為瘧疾疫苗的藥理作用)(瘧疾感染預(yù)防測(cè)試)3.實(shí)驗(yàn)方法3.1疫苗接種用作疫苗的重組病毒溶液以三周的間期接種BALB/c雌性小鼠三次。在注射到大腿肌肉內(nèi)的情況下，用量為0.2mL/只，病毒溶液被制備成病毒量為5x106pfu/只。3.2用瘧疾感染小鼠在第三次疫苗接種后3周，對(duì)每個(gè)組的小鼠用麻醉小鼠的溶液進(jìn)行麻醉，用感染了柏氏瘧原蟲(chóng)ANKA2.34克隆的斯氏按蚊(Anophelesstephensi)SDA500種系叮咬小鼠使其感染瘧疾。3.3每個(gè)組中小鼠存活率的計(jì)算在感染瘧疾后，計(jì)數(shù)每個(gè)組中的死亡病例，并計(jì)算出每個(gè)組中小鼠的存活率。3.4對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物作為疫苗的瘧疾感染預(yù)防效果來(lái)說(shuō)，藥理作用測(cè)試的結(jié)果顯示在表1中。每個(gè)組中的存活率顯示在表1右邊的列中。如表1所示，所有在外周血中鑒定到了瘧疾感染的紅細(xì)胞的小鼠，在感染后38天之內(nèi)都死亡了。在其中插入了子孢子體期的抗原(CSP)基因的重組病毒中，在其中通過(guò)肌肉內(nèi)接種了在實(shí)施例2中獲得的含有轉(zhuǎn)移載體AcNPV-Dual-PbCSP的重組桿狀病毒(實(shí)施例1(2))的組(4號(hào)組)中，觀(guān)察到了100%的感染預(yù)防效果。在野生型桿狀病毒(2號(hào)組)中，沒(méi)有觀(guān)察到與對(duì)照組(l號(hào)組)的差別。在包含了實(shí)施例2中使用哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子獲得的重組桿狀病毒(AcNPV-CMV-PbCSP，包含了參比實(shí)施例1中的載體)的組(3號(hào)組)中，與對(duì)照組相比觀(guān)察到了略高的存活率，表明了盡管弱但仍表現(xiàn)出了病毒接種的效果的可能性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>[實(shí)施例4]本發(fā)明的重組桿狀病毒的藥理作用測(cè)試(作為流感疫苗的藥理作用測(cè)試)(流感病毒感染預(yù)防測(cè)試)4.實(shí)驗(yàn)方法4.1疫苗用作疫苗的病毒溶液以2周的間隔接種兩次。疫苗病毒以106'5PFU/小鼠用注射胰島素的26G注射器注射到大腿肌肉中。4.2用于攻擊的病毒溶液的制備在用流感病毒感染的當(dāng)天，將流感病毒A/PR/8/34株的儲(chǔ)存病毒溶液在室溫自然融化。將融化的儲(chǔ)存病毒溶液用含有10%的無(wú)菌牛血清白蛋白BSA的Dulbecco，s磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS)稀釋到1000TCID5。/0.05mL用于下呼吸道感染的激惹病毒溶液和稀釋到1000TCID5。/0.005mL用于上呼吸道感染，以制備攻擊用病毒溶液。4.3病毒溶液的鼻內(nèi)接種在第二次疫苗接種后2周，通過(guò)肌肉給藥0.05mL用于小鼠的麻醉溶液將小鼠麻醉。在4.2中制作的流感病毒溶液接種到小鼠的鼻子中，上呼吸道感染使用0.005mL，下呼吸道感染使用0.05mL。4.4.肺部取樣接種病毒后3天，對(duì)每個(gè)組的4只小鼠每只小鼠肌肉內(nèi)給藥用于小鼠的麻醉溶液O.lmL,在麻醉情況下通過(guò)從腹主動(dòng)脈放血進(jìn)行安樂(lè)死。然后將小鼠解剖，無(wú)菌取出肺臟。4.5接種流感病毒后小鼠的存活率記錄直到接種流感病毒后11天，每天證實(shí)并記錄一次小鼠的存活率。4.6肺臟勻漿液和稀釋溶液的制備通過(guò)加入3mL0.1%BSA、10mMHEPES、含有抗生素的最低基本培養(yǎng)基(MEM，GIBCO)并使用polytron勻漿器進(jìn)行勻漿，獲得了肺臟勻漿液。將肺臟勻漿液分配到冷凍管中，儲(chǔ)存在超低溫冰箱中。使用其中加入了上述的抗生素和胰蛋白酶(SIGMA,T-4549,2mg/mL)的MEM培養(yǎng)基，制備了一系列10倍或10°'5倍的稀釋液。4.7用于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的制備通過(guò)在500mLMEM中加入50mL胎牛血清FBS，制備了用于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基(MEM+10%FBS)，并儲(chǔ)存在冰箱中直到使用。4.8來(lái)自犬腎的MDCK(Madin-Darby犬腎)的培養(yǎng)將冷凍保存的MDCK細(xì)胞在溫水中快速融化，然后懸浮在10mL用于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，通過(guò)離心(1000rpm，5分鐘，4°C)除去上清液。將通過(guò)離心收集的細(xì)胞沉淀懸浮在用于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，在溫箱中在5%C02和37。C條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)開(kāi)始后，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)，就在MDCK細(xì)胞恰要變?yōu)閰R合之前，將細(xì)胞用D-PBS(-)清洗，用胰蛋白酶處理使細(xì)胞分散，然后將細(xì)胞懸浮在用于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸浮液接種到培養(yǎng)瓶中，加入用于細(xì)胞生長(zhǎng)的新鮮培養(yǎng)基，使細(xì)胞傳代。4.9用于病毒生長(zhǎng)的培養(yǎng)基(維持培養(yǎng)基)的制備在500mLMEM(加入了10mMHEPES緩沖液)中加入0.1%BSA的培養(yǎng)基被用作病毒生長(zhǎng)的培養(yǎng)基(MEM+0.1%BSA)，并在制備后儲(chǔ)存在冰箱中直到使用。抗生素在使用時(shí)加入。4.10病毒感染性滴度的測(cè)量(細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng)，CPE方法)恰在培養(yǎng)瓶中的MDCK細(xì)胞變得要匯合之前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理以分散細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用維持培養(yǎng)基制備6x105細(xì)胞/mL的MDCK細(xì)胞懸浮液。將0.05mL該懸浮液分配到96孔板的每個(gè)孔中，在C02培養(yǎng)箱中在5%<:02和37。C下培養(yǎng)過(guò)夜。在第二天，證實(shí)了細(xì)胞的吸附，將以前制備的每種肺臟勻漿稀釋液分配到96孔板的6個(gè)孔的每個(gè)孔中0.05mL，然后在002培養(yǎng)箱中在5%C02和37°C下培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)的第三天，證實(shí)了孔中的細(xì)胞己經(jīng)變性，然后將含有30%福爾馬林的結(jié)晶紫溶液分配到96孔板的每個(gè)孔中0.05mL以固定和染色細(xì)胞，并通過(guò)Reed-Miinch方法計(jì)算肺臟中病毒的感染性滴度。4.11每個(gè)疫苗組對(duì)小鼠體內(nèi)病毒感染性滴度的影響比較了對(duì)照組(用AcNPV接種)和測(cè)試組(用重組桿狀病毒[包含了在實(shí)施例1(3)中獲得的轉(zhuǎn)移載體AcNPV-Dual-HlNl/HAl]和重組桿狀病毒[包含了在參比實(shí)施例1中獲得的載體AcNPV-CMV-HlNl/HAfull]接種)中鼠肺臟勻漿液中的感染性滴度。將每個(gè)病毒感染性滴度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)。通過(guò)Tukey測(cè)試(Release8.1，SASInstituteJapanLtd)考慮其感染復(fù)數(shù)分析組間的治療效果。結(jié)果顯示在圖1中。每種疫苗對(duì)感染流感病毒后的存活期的影響。使用對(duì)數(shù)級(jí)測(cè)試比較了對(duì)照組(用AcNPV接種)和疫苗組(用AcNPV-Dual-HlNl/HAl或AcNPV-CMV-HlNl/HAfull接種)的存活期，結(jié)果顯示在圖2中。使用SAS系統(tǒng)(SASInstituteJapan，R.8.1)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。顯著性水平是5%。4.12肺臟中病毒的感染性滴度與對(duì)照組(用AcNPV接種)相比，在肌肉內(nèi)接種AcNPV-Dual-HlNl/HAl的組中，在感染后第6天肺臟中病毒的感染性滴度被明顯抑制(p=0.0009)。同時(shí)，與接種了AcNPV-CMV-HlNl/HAfull的組相比，在肌肉內(nèi)接種AcNPV-Dual-HlNl/HAl的組中，感染后第6天肺臟中病毒的感染性滴度被明顯抑制(p=0.0094)。4.13存活期與對(duì)照組(用AcNPV接種)相比，在肌肉內(nèi)接種AcNPV-Dual-HlNl/HAl的組中，存活期明顯延長(zhǎng)(p=0.0031)。同時(shí)，在接種了AcNPV-CMV-HlNl/HAftill的組中，存活期與對(duì)照組(用AcNPV接種)中的存活期沒(méi)有顯著的差別(p=0.7851)。與接種了AcNPV-CMV-HlNl/HAfull的組相比，在肌肉內(nèi)接種了AcNPV-Dual-HlNl/HAl的組中的存活期被顯著延長(zhǎng)了(p=0.0031)。在該評(píng)估體系中，小鼠發(fā)生了流感病毒性肺炎并死亡。因此，可以推斷，通過(guò)肌肉內(nèi)接種AcNPV-Dual-HlNl/HAl抑制了肺臟中病毒的生長(zhǎng)，從而減少了死于肺炎的小鼠。來(lái)自本發(fā)明的重組桿狀病毒的疫苗抗原在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)試驗(yàn)將Sf-9細(xì)胞以每個(gè)孔3x106個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)在12孔板中，在實(shí)施例2中獲得的桿狀病毒粒子AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-HSP65或AcNPV-Dual-HlNl/HAl或作為對(duì)照的野生型桿狀病毒AcNPV-WT以大約5的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染。3到4天后，去除培養(yǎng)上清液，將板用PBS洗3次，然后在每個(gè)孔中加入0.2mL含有2。/。2-巰基乙醇的Leamuli溶液(Tris-鹽酸pH6.8，2%SDS，10%甘油，0.1%溴酚藍(lán))以完全裂解細(xì)胞。將樣品在95。C煮沸5分鐘，在SDS-PAGE上電泳。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore提供的Immobilon-P)，通過(guò)將膜浸泡在blockace(DaiNipponPharmaceuticalCo.，Ltd.提供)中在4°C阻斷12小時(shí)。通過(guò)下列程序進(jìn)行Western印跡。將轉(zhuǎn)移有來(lái)自每種桿狀病毒感染的Sf-9細(xì)胞的蛋白的膜，與作為第一抗體的小鼠抗FLAG單克隆抗體(Sigma提供)進(jìn)行孵育，然后與作為第二抗體的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Vector提供)一起孵育。然后，加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(GIBCO-BRL提供)，使用NBT/BCIP(GIBCO-BRL提供)顯色以檢測(cè)蛋白的條帶。結(jié)果顯示在圖3中。圖3顯示了Western印跡分析，顯示了重組桿狀病毒中來(lái)自重組轉(zhuǎn)移載體的流感病毒HA基因、結(jié)核分枝桿菌的Hsp65基因和瘧原蟲(chóng)的CSP基因的融合抗原在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)。在圖中，第l道顯示了來(lái)自野生型桿狀病毒(AcNPV-WT)的條帶，第2道顯示了流感病毒HA基因被插入到本發(fā)明的雙啟動(dòng)子之下的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HlNl/HAl)的條帶，第3道顯示了來(lái)自野生型桿狀病毒(AcNPV-WT)的條帶，第4道顯示了結(jié)核分枝桿菌Hsp65基因被插入到本發(fā)明的雙啟動(dòng)子之下的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-Hsp65)的條帶，第5道顯示了來(lái)自野生型桿狀病毒(AcNPV-WT)的條帶，第6道顯示了瘧原蟲(chóng)CSP基因被插入到本發(fā)明的雙啟動(dòng)子之下的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-PbCSP)的條帶。正如在圖中的第2、4和6道中顯示的那樣，在每個(gè)抗原基因與gp64基因融合并在本發(fā)明的雙啟動(dòng)子之下表達(dá)的重組桿狀病毒中，觀(guān)察到了對(duì)應(yīng)于免疫原性外源抗原基因與gp64基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的條帶。因此，鑒定了免疫原性外源抗原基因與gp64基因可以融合并在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)。來(lái)自本發(fā)明的重組桿狀病毒的疫苗抗原在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)測(cè)試以大約1的感染復(fù)數(shù)將HepG2細(xì)胞用AcNPV-Dual-Hsp65或作為對(duì)照的AcNPV-WT進(jìn)行感染。24小時(shí)后，除去培養(yǎng)上清液，將板用PBS洗3次，然后加入在-20。C冷卻的丙酮乙醇溶液(7:3)，將細(xì)胞在-20。C固定5分鐘。加入5%正常山羊血清(Sigma提供)在室溫進(jìn)行阻斷。然后，加入作為第一抗體的小鼠抗Hsp65抗體(Yoshida等，Vaccine2005)，然后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體并孵育。反應(yīng)過(guò)的細(xì)胞在熒光顯微鏡下檢測(cè)。HepG2細(xì)胞也培養(yǎng)為每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)用的100mm平板1x107個(gè)細(xì)胞，以大約5的感染復(fù)數(shù)用桿狀病毒粒子AcNPV-Dual-HlNl/HAl或AcNPV-CMV-HlNl/HAfull或作為對(duì)照的AcNPV-WT進(jìn)行感染。2小時(shí)后，除去培養(yǎng)上清液，將板用PBS洗3次，然后將細(xì)胞在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基在Dulbecco's修飾的Eagle培養(yǎng)基中(Invitrogen)加入了用PBS透析的10%FBS)中培養(yǎng)3小時(shí)。加入同位素標(biāo)記的甲硫氨酸和半胱氨酸溶液(TRANS35S-LABELMPBiomedicals,Inc.)至終濃度為5/iCi/mL。12小時(shí)后，除去培養(yǎng)上清液，將板用PBS洗3次，然后將細(xì)胞用0.5mLRIPA緩沖液(1%脫氧膽酸鈉，1%TritonX-100，0.1%SDS，10mMTris-HCl[pH7.5〗)裂解以制備樣品。將樣品加到事先已經(jīng)吸附了來(lái)自流感病毒感染的小鼠的血清的蛋白A-SepharoseCL-4B(Pharmacia)載體上，在冰上孵育2小時(shí)。載體用RIPA緩沖液洗5次，加入含有2%2-巰基乙醇的Leamuli溶液，將樣品在95。C煮沸5分鐘，在6%的SDS-PAGE上進(jìn)行電泳。電泳后，將凝膠干燥，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)與抗體反應(yīng)的蛋白。結(jié)果顯示在圖4和5中。圖4(A)顯示了用熒光標(biāo)記的抗體染色的細(xì)胞，顯示出重組桿狀病毒中結(jié)核分枝桿菌Hsp65基因在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。圖4(B)顯示了野生型桿狀病毒被加入到HepG2細(xì)胞中的情況。正如在圖(A)中顯示的那樣，發(fā)現(xiàn)使用帶有本發(fā)明雙啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)移載體的重組桿狀病毒能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)目的抗原。這表明當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)時(shí)，從本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生的重組桿狀病毒侵入了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，運(yùn)轉(zhuǎn)哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，目的外源抗原基因與gp64基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中融合，以誘導(dǎo)獲得性免疫。圖5顯示了流感病毒HA抗原基因被整合到雙啟動(dòng)子之下的重組桿狀病毒中融合抗原在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)的免疫沉淀分析。在圖中，第1道顯示了野生型桿狀病毒(AcNPV-WT)，第2道顯示了流感病毒HA抗原基因被整合到CMV啟動(dòng)子之下的重組桿狀病毒(AcNPV-CMV-HlNl/HAfull)，第3道顯示了流感病毒HA抗原基因被整合以便與gp64基因融合并在雙啟動(dòng)子之下表達(dá)的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HlNl/HAl)。在流感病毒HA抗原基因整合到CMV啟動(dòng)子之下的重組桿狀病毒(AcNPV-CMV-HlNl/HAfull)和流感病毒HA抗原基因被整合以便與gp64基因融合并在雙啟動(dòng)子之下表達(dá)的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HlNl/HAl)中，顯然與流感病毒感染的血清特異性反應(yīng)的蛋白、即包括HA抗原的蛋白在HepG2細(xì)胞中是新合成的。因此，據(jù)認(rèn)為本發(fā)明的重組桿狀病毒即使是在哺乳動(dòng)物中也表達(dá)了所需的免疫原性外源抗原基因編碼的抗原蛋白，并且當(dāng)重組病毒被施用于哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)時(shí)，隨著融合抗原在人類(lèi)細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)了特異性針對(duì)抗原的獲得性免疫。在本發(fā)明的重組桿狀病毒的病毒粒子(毒粒)上呈遞的疫苗抗原中融合抗原的鑒定試驗(yàn)在通過(guò)超速離心收集的每種桿狀病毒粒子AcNPV-WT、AcNPV-CMV-PbCSP、AcNPV-PbCSPsurf或AcNPV-Dual-PbCSP的病毒濃縮溶液0,005mL中，加入0.005mLLeamuli溶液(2x)，然后在95°C煮沸5分鐘，在6%的SDS-PAGE上進(jìn)行電泳。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore提供的Immobilon-P)，通過(guò)將膜浸泡在blockace(DaiNipponPharmaceuticalCo.，Ltd提供)中在4°C下阻斷12小時(shí)。通過(guò)下面的程序進(jìn)行Western印跡。將轉(zhuǎn)移有病毒粒子蛋白的膜，與作為第一抗體的小鼠抗FLAG單克隆抗體(Sigma提供)進(jìn)行孵育，然后與作為第二抗體的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(從Vector提供)一起孵育。然后，加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(GIBCO-BRL提供)，使用NBT/BCIP(GIBCO-BRL提供)顯色以檢測(cè)蛋白的條帶。結(jié)果顯示在圖6中。圖6顯示了Western印跡分析，顯示了從重組轉(zhuǎn)移載體制造的重組桿狀病毒的病毒粒子中瘧疾CSP基因(PbCSP)的表達(dá)。在圖中，第1道顯示了野生型桿狀病毒，第2道顯示了從PbCSP抗原基因被插入到哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子控制之下的轉(zhuǎn)移載體制造的重組桿狀病毒，第3道顯示了從PbCSP抗原基因被插入以與gp64融合并在桿狀病毒多角體啟動(dòng)子控制之下表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體制造的重組桿狀病毒，第4道顯示了從PbCSP抗原基因被插入以與gp64融合并在雙啟動(dòng)子控制之下表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體制造的重組桿狀病毒。桿狀病毒被電泳，融合的PbCSP基因和gp64基因的表達(dá)產(chǎn)物被鑒定。正如在第3和4道中顯示的那樣，對(duì)于AcNPV-PbCSPsurf和AcNPV-Dual-PbCSP來(lái)說(shuō)，在重組病毒離子中鑒定到了表明融合抗原存在的強(qiáng)條帶。因此，從實(shí)施例7中，發(fā)現(xiàn)了在從本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生的重組桿狀病毒中，融合了gp64基因和所需的免疫原性外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可以存在于重組病毒粒子中。實(shí)施例8:通過(guò)替換啟動(dòng)子的持續(xù)基因表達(dá)1)通過(guò)替換啟動(dòng)子的持續(xù)的基因表達(dá)為了鑒定重組病毒是否能在培養(yǎng)細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)抗原，用AcNPV-CP-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl或AcNPV-CU-HlNl/HAl感染HeLa細(xì)胞，并鑒定抗原的表達(dá)。將細(xì)胞以1.0x104細(xì)胞/孔接種到24孔板中，然后以MOI-IO、20、100用病毒進(jìn)行感染，粘附進(jìn)行1小時(shí)。然后從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中除去病毒，將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照時(shí)間收集細(xì)胞并提取RNA。以提取的RNA作為模板，使用引物HAl一FOl(5'-GAGCTGAGGGAGCAATTGAG-3，)(序列SEQIDNO:51)和引物HA1—ROl(5，-GGGTGATGAATACCCCACAG-3，)(序列SEQIDNO:52)進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增的DNA在電泳上分析。結(jié)果，在所有3種類(lèi)型中都鑒定到了表達(dá)，證實(shí)了CMV啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明的重組桿狀病毒來(lái)說(shuō)可以被轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€(gè)真核啟動(dòng)子。圖7顯示了在HeLa細(xì)胞中通過(guò)RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)的結(jié)果。M表示電泳的DNA標(biāo)記物。樣品如下I.野生型病毒以MOI-IO感染的細(xì)胞的RNA;2.野生型病毒以MO^20感染的細(xì)胞的RNA;3.野生型病毒以MOI-100感染的細(xì)胞的RNA;4.AcNPV-CP-HlNl/HAl以MOI=10感染的細(xì)胞的RNA;5.AcNPV-CP-H1N1/HA1以MOI=20感染的細(xì)胞的RNA;6.AcNPV-CP-HlNl/HAl以MOI=100感染的細(xì)胞的RNA;7.AcNPV-CU-HlNl/HAl以MOI=10感染的細(xì)胞的RNA;8.AcNPV-CU-HlNl/HAl以MOI-20感染的細(xì)胞的RNA;9.AcNPV-CU-HlNl/HAl以MOI=100感染的細(xì)胞的RNA;10.AcNPV-CAP-HlNl/HAl以MOI=10感染的細(xì)胞的RNA;11.AcNPV-CAP-HlNl/HAl以MOI=20感染的細(xì)胞的RNA;以及12.AcNPV-CAP-HlNl/HAl以MOI=100感染的細(xì)胞的RNA.在感染后O時(shí)、1天、4天和7天時(shí)收集樣品，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的DNA進(jìn)行電泳。實(shí)施例9:PbCSP抗原重組病毒誘導(dǎo)的抗體滴度和細(xì)胞免疫1.疫苗接種用于免疫接種的重組病毒溶液以三周的間隔接種BALB/c雌性小鼠三次。在肌肉內(nèi)注射到大腿肌肉的情況下，接種劑量準(zhǔn)備為0.2mL/只，相當(dāng)于1x108pfu/只的病毒量。野生型病毒(AcNPV-WT)、AcNPV陽(yáng)PbCSPsurf(Yoshida等，Virology316:161-70，2003)或AcNPV-Dual-PbCSP作為疫苗被注射。2.小鼠的解剖最后一次接種后3周，將小鼠安樂(lè)死，從小鼠中取出血清和脾臟。血清用于測(cè)量特異性抗體滴度，脾臟用于ELISPOT分析。3.抗體滴度的測(cè)量使用固定了在大腸桿菌中強(qiáng)制表達(dá)并純化/回收的PbCSP重組蛋白的板，通過(guò)ELISA測(cè)量了抗體的滴度。ELISA按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。結(jié)果，盡管在沒(méi)有接種病毒或接種了野生型病毒的組中沒(méi)有鑒定到抗體滴度的增加，但是在接種了AcNPV-PbCSPsurf的組和接種了AcNPV-Dual-PbCSP的組中鑒定到了特異性抗體滴度的增加。在圖8中，顯示了在沒(méi)有接種的組、野生型病毒接種組、AcNPV-PbCSPsurf接種組和AcNPV-Dual-PbCSP接種組中特異性針對(duì)PbCSP的IgG抗體的滴度。4.使用ELISPOT分析評(píng)估細(xì)胞免疫使用來(lái)自免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT分析。制備來(lái)自小鼠的脾細(xì)胞，將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞加到MultiScreen-IP(Millipore)中。在其中加入已知是PbCSP的CD8表位的肽(氨基酸序列SYIPSAEKISEQIDNO:53)，然后培養(yǎng)過(guò)夜。然后使用ELISPOT小鼠IFN-7ELISPOT套裝(BDSciences)進(jìn)行反應(yīng)，使用AEC底物套裝(BDSciences)顯色。通過(guò)測(cè)量有色的斑點(diǎn)鑒定對(duì)抗原有特異性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果，在沒(méi)有接種病毒、接種了野生型病毒或AcNPV-PbCSPsurf的組中沒(méi)有鑒定到抗原特異性的細(xì)胞，但是在接種了AcNPV-Dual-PbCSP的組中鑒定到了每106個(gè)脾細(xì)胞中大約350個(gè)反應(yīng)細(xì)胞。這證實(shí)了AcNPV-Dual-PbCSP能夠比AcNPV-PbCSPsurf更顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。在圖9中顯示了在沒(méi)有接種組、野生型病毒接種組、AcNPV-PbCSPsurf接種組和AcNPV-Dual-PbCSP接種組中特異性針對(duì)PbCSP的CTL表位的IFN-Y-產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)施例10、證實(shí)含有重組桿狀病毒作為活性成分的疫苗的抗病毒效果的試驗(yàn)(證實(shí)M2e重組桿狀病毒效果的試驗(yàn))以2周的時(shí)間間隔在大腿肌肉給每只小鼠兩次接種3.4x108PFU的量的M2e重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-M2e)。在最后一次疫苗接種后2周，將小鼠用流感病毒A/PR8/34進(jìn)行感染，感染通過(guò)鼻內(nèi)接種0.005mL含有1000TCID5()的病毒的溶液來(lái)進(jìn)行。在感染后6天，將小鼠安樂(lè)死，取出肺臟，使用MDCK細(xì)胞檢測(cè)肺臟中的病毒量。結(jié)果，在所有用AcNPV-Dual-M2e接種的小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到流感病毒。同時(shí)，在大腿肌肉中接種了HA1重組桿狀病毒疫苗(AcNPV-Dual-HlNl/HAl)(每只小鼠1.0x107PFU)的組中效果也相同。在圖10中，顯示了PBS組、AeNPV-Dual-M2e接種組和AcNPV-Dual-HlNl/HAl接種組在流感病毒感染6天后肺內(nèi)的病毒量。實(shí)施例11、鑒定含有HA1/NC99重組桿狀病毒作為活性成分的藥物的預(yù)防效果的研究以?xún)芍艿拈g隔，將HA1/NC99重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HAl/NC99)以每只小鼠1.0x108PFU接種到大腿肌肉中兩次。最后一次接種后2周，用流感病毒A/NewCaledonia/20/99感染小鼠，感染通過(guò)鼻腔內(nèi)接種0.05mL含有1000TCID5。的病毒的溶液來(lái)進(jìn)行。在感染后3天，將小鼠安樂(lè)死，取出肺臟，使用MDCK細(xì)胞檢測(cè)肺臟中的病毒量。結(jié)果，在用AcNPV-Dual-H1N1/NC99接種的4只小鼠中有3只沒(méi)有檢測(cè)到流感病毒。在圖11中，顯示了在PBS組、野生型病毒(AcNPV-WT)接種組和AcNPV-Dual-HAl/NC99接種組在流感病毒感染3天后肺內(nèi)的病毒且里。SEQIDNOS:25和26表示了用于鑒定AcNPV-CP-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl和AcNPV-CU-HlNl/HAl的表達(dá)的引物。SEQIDNO:27表示已知作為PbCSP的CD8表位的肽。實(shí)施例12、鑒定依賴(lài)于含有重組桿狀病毒作為活性成分的藥物組合物的給藥途徑的特異性抗體的研究以?xún)芍艿拈g隔將HA1重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HlNl/HAl)以每只小鼠2.0x107PFU接種兩次，通過(guò)在雙側(cè)鼻中(滴鼻)接種0.005mL病毒溶液，從鼻(鼻粘膜接種)接種0.05mL病毒溶液，從呼吸道(通過(guò)呼吸道)接種0.05mL病毒溶液，和在大腿肌肉中(肌肉注射)接種0.05mL病毒溶液。最后一次接種后2周，收集洗鼻液、肺泡清洗液和血清，鑒定了特異性針對(duì)流感病毒的抗體的表達(dá)。使用固定了流感病毒A/PR/8/341感染的MDCK細(xì)胞提取物的板，通過(guò)ELISA測(cè)量抗體的滴度。ELISA按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。結(jié)果，在來(lái)自鼻粘膜接種組、氣管內(nèi)接種組和肌肉內(nèi)接種組的血液中鑒定到了特異性IgG抗體。具體來(lái)說(shuō)，在氣管內(nèi)接種組中鑒定到了強(qiáng)烈誘導(dǎo)的抗體。同樣，在洗鼻液和肺泡清洗液中也鑒定到了抗原特異性IgG抗體，具體來(lái)說(shuō)，在氣管內(nèi)接種組中抗體被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。此外，在氣管內(nèi)接種組中，在肺泡清洗液中還鑒定到了抗原特異性IgA抗體的產(chǎn)生。在圖12中，顯示了在滴鼻組、鼻粘膜接種組、氣管內(nèi)接種組和肌肉內(nèi)接種組中的血液中測(cè)量特異性針對(duì)流感病毒的IgG抗體的ELISA結(jié)果。在圖13中，顯示了在滴鼻組、鼻粘膜接種組、氣管內(nèi)接種組和肌肉內(nèi)接種組中，洗鼻液和肺泡清洗液中測(cè)量特異性針對(duì)流感病毒的IgG和IgA抗體的ELISA結(jié)果。實(shí)施例13、鑒定依賴(lài)于含有重組桿狀病毒作為活性成分的藥物組合物的給藥途徑的效果的研究以?xún)芍艿拈g隔，將HA1重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-HlNl/HAl)以每只小鼠l.Ox1(^PFU通過(guò)滴鼻、鼻粘膜接種、通過(guò)呼吸道或肌肉注射的給藥途徑接種兩次。最后一次接種后2周，用流感病毒A/PR/8/34感染小鼠，感染通過(guò)鼻腔內(nèi)接種0.005mL含有l(wèi)OOOTCIDso的病毒的溶液來(lái)進(jìn)行。在感染后3天，收集洗鼻液，在感染后6天，取出肺臟，使用MDCK細(xì)胞檢測(cè)肺臟中的病毒量。結(jié)果，在鼻粘膜接種組和氣管內(nèi)接種組中，感染后3天鼻腔中的病毒量顯著減少了。此外，在氣管內(nèi)接種組中與肌肉內(nèi)接種的組中一樣，在感染后6天肺臟中病毒的量降低到了檢測(cè)限或以下。在圖14中，顯示了在滴鼻組、鼻粘膜接種組、氣管內(nèi)接種組和肌肉內(nèi)接種組中用流感病毒感染后3天洗鼻液中的病毒量。在圖15中，顯示了在滴鼻組、鼻粘膜接種組、氣管內(nèi)接種組和肌肉內(nèi)接種組中在用流感病毒感染后6天肺臟中的病毒量。序列表自由文本SEQIDNO:1和2是對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)ANKA株基因組DNA進(jìn)行PCR的引物PbCSP-F和PbCSP-Rl的序列；SEQIDNO:3和4是對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA進(jìn)行PCR的引物phsp65-Fl和phsp65-Rl的序列；SEQIDNO:5和6是以pcDNA為模板進(jìn)行PCR的引物phsp65-F2和phsp65-R2的序列；SEQIDNO:7和8是以pBACgus-1(Novagen提供)為模板用于獲得gp64基因DNA片段的PCR的引物pPolh-F2和pgp64-R2的序列；SEQIDNO:9和10是對(duì)產(chǎn)生流感病毒HA基因片段進(jìn)行PCR的引物HA-f和HA-r的序列；以及SEQIDNO:11和12是以pCR-Blunt-HA作為模板進(jìn)行PCR的引物pHA-Fl和pHA-Rl的序列。SEQIDNO:13和14是對(duì)PbTRAMP基因的PCR進(jìn)行引物pTRAMP-Fl和pTRAMP-Rl的序列。SEQIDNO:15和16是對(duì)PbAMAl基因結(jié)構(gòu)域123(D123)進(jìn)行PCR的引物pAMA-Fl和pAMA-Rl的引物的序列。SEQIDNO:17和18是對(duì)PbMSP119基因進(jìn)行PCR的引物pMsp-Fl和pMsp-Rl的序列。SEQIDNO:19和20是對(duì)PfCSP基因進(jìn)行PCR的引物pPfCSP-Fl和pPfCSP-Rl的序列。SEQIDNOS:21和22是對(duì)瘧原蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)3D7株的PfCSP基因進(jìn)行PCR的引物pPfAMAl-Fl和pPfAMAl-Rl的序列。SEQIDNO:23和24是對(duì)癥原蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)3D7的PfCSP基因進(jìn)行PCR的引物pPfs25-Fl和pPfs25-Rl的序列。SEQIDNO:25和26是以pCR-Blunt-HA為模板進(jìn)行的PCR的引物Polh-fRsrII和GP64-rDraIII的序列。SEQIDNO:27和28是對(duì)CMV增強(qiáng)子區(qū)進(jìn)行PCR的引物CMVenh-fFsel和CMVenh-rKpnl的序列。SEQIDNO:29和30是對(duì)UBB啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR的引物UBBp-fKpnl和UBBp-rRsrII的序列。SEQIDNO:31和32是對(duì)流感病毒PR8/34株的基因組RNA進(jìn)行RT-PCR的引物NP-fEcoRI和NP-rCfr9I的序列。SEQIDNO:33和34是對(duì)流感病毒PR8/34株的基因組RNA進(jìn)行RT-PCR的引物M2-fEcoRI和M2-rCfr9I的序列。SEQIDNO:35和36是對(duì)流感病毒PR8/34株的基因組RNA進(jìn)行RT-PCR的引物NAe-fEcoRI和NAe-rCfr9I的序列；SEQIDNO:37和38是以pDual-HlNl/M2-gp64為模板進(jìn)行PCR的引物M2-fEcoRI和M2e-rCfr9I的序列；SEQIDNO:39和40是對(duì)NewCaledonia99/20(NC99)的基因組RNA進(jìn)行RT-PCR的引物HAl-fEcoRI和HAl-rCFr9I(NC99)的序列；SEQIDNO:41和42是以pCR-Blunt-HA為模板進(jìn)行PCR的引物HAO-fEcoRI和HA2-rCfr9I的序列；SEQIDNO:43和44是以pCR-Blunt-HA為模板進(jìn)行PCR的引物HA2-fEcoRI和HA2-rCfr9I的序列；SEQIDNO:45和46是對(duì)vp39基因區(qū)進(jìn)行PCR的引物vp39-f和vp39-r的序列；SEQIDNO:47和48是對(duì)HA1基因片段進(jìn)行PCR的引物Polh-Sl和HAl-r的序列；SEQIDNO:49和50是以pDual-HlNl/NP-gp64為引物進(jìn)行PCR的引物NP-f5EcoRI和NP-rEcoRI的序列；SEQIDNO:51和52是檢觀(guān)UAcNPV-CP-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl和AcNPV-CU-HlNl/HAl的表達(dá)的引物的序列。SEQIDNO:53是已知的PbCSP的CD8表位的多肽。權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)移載體的方法，所述轉(zhuǎn)移載體含有其中整合了雙啟動(dòng)子和融合基因的結(jié)構(gòu)，其特征在于含有能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的至少一個(gè)編碼基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因被連接到連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游。2.權(quán)利要求l中的方法，其中所述脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。3.權(quán)利要求1中的方法，其特征在于能夠成為病毒粒子的成分的至少一種蛋白的編碼基因是桿狀病毒gp64基因、皰疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人類(lèi)免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人類(lèi)呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一個(gè)。4.權(quán)利要求1中的方法，其中所述脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子選自細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、延伸因子la啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子和II類(lèi)MHC啟動(dòng)子的任何一個(gè)。5.權(quán)利要求l中的方法，其中所述桿狀病毒啟動(dòng)子選自多角體蛋白啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子、IE1啟動(dòng)子、IE2啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、p39啟動(dòng)子以及gp64啟動(dòng)子。6.權(quán)利要求1中的方法，其中所述免疫原性外源基因選自單獨(dú)的瘧疾抗原、流感抗原、結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲(chóng)抗原、錐蟲(chóng)抗原、住白細(xì)胞原蟲(chóng)抗原中的任何一個(gè)，或選自這些抗原基因中的至少一個(gè)與細(xì)胞因子的融合抗原。7.權(quán)利要求1中的方法，其中所述轉(zhuǎn)移載體是pDual-Hsp65-gp64、pDual國(guó)PbCSP-gp64、pDual-HlNl/HAl-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMAlD123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMAl-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5Nl/HAl-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-HlNl/HAl-gp64、pCAP-HlNl/HAl-gp64、pCU-HlNl/HAl-gp64、pDual-HlNl/NP-gp64、pDual-HlNl/M2-gp64、pDual-HlNl/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HAl/NC99-gp64、pCP-HlNl/HA0-gp64、pCP-HlNl/HA2-gp64、pCP-HlNl/HAl陽(yáng)vp39和pCP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)。8.生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，包括生產(chǎn)含有已經(jīng)整合了雙啟動(dòng)子和融合基因的結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移載體的步驟，其特征在于含有能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的至少一個(gè)編碼基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因被連接到連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游；將轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)的宿主細(xì)胞中的步驟；以及分離重組桿狀病毒的步驟。9.權(quán)利要求8中的方法，其特征在于能夠成為病毒粒子的成分的至少一種蛋白的編碼基因是桿狀病毒gp64基因、皰疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人類(lèi)免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人類(lèi)呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一個(gè)。10.權(quán)利要求9中的方法，其中所述脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子選自細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、延伸因子la啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子和II類(lèi)MHC啟動(dòng)子的任何一個(gè)。11.權(quán)利要求8中的方法，其中所述桿狀病毒啟動(dòng)子選自多角體蛋白啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子、IE1啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、p39啟動(dòng)子以及gp64啟動(dòng)子。12.權(quán)利要求8中的方法，其中所述免疫原性外源基因選自單獨(dú)的瘧疾抗原、流感抗原、結(jié)核分枝桿菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲(chóng)抗原、錐蟲(chóng)抗原、住白細(xì)胞原蟲(chóng)抗原中的任何一個(gè)，或選自這些抗原基因中的一個(gè)與細(xì)胞因子的融合抗原。13.權(quán)利要求8中的方法，其中所述重組桿狀病毒是AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual陽(yáng)PbCSP、AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMAlD123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)。14.一種轉(zhuǎn)移載體，其含有整合的結(jié)構(gòu)，在所述結(jié)構(gòu)中含有能夠成為病毒粒子的成分的蛋白的至少一個(gè)編碼基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因被連接到連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游。15.權(quán)利要求14中的轉(zhuǎn)移載體，其含有整合的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)中含有能夠成為病毒粒子的成分的至少一種蛋白的編碼基因和至少一個(gè)免疫原性外源基因的融合基因被連接到連有一個(gè)脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子和另一個(gè)桿狀病毒啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的下游。16.權(quán)利要求14中的轉(zhuǎn)移載體，其特征在于能夠成為病毒粒子的成分的至少一種蛋白的編碼基因是桿狀病毒gp64基因、皰疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人類(lèi)免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人類(lèi)呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、單純皰疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一個(gè)。17.權(quán)利要求15中的轉(zhuǎn)移載體，其中所述脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子選自細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、延伸因子la啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子和II類(lèi)MHC啟動(dòng)子的任何一個(gè)。18.權(quán)利要求15中的轉(zhuǎn)移載體，其中所述桿狀病毒啟動(dòng)子選自多角體蛋白啟動(dòng)子、p10啟動(dòng)子、IE1啟動(dòng)子、IE2啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、p39啟動(dòng)子以及gp64啟動(dòng)子。19.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)移載體，其中所述免疫原性外源基因選自單獨(dú)的疙疾抗原、流感抗原、結(jié)核分枝桿菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲(chóng)抗原、錐蟲(chóng)抗原、住白細(xì)胞原蟲(chóng)抗原中的任何一個(gè)，或選自這些抗原基因中的一個(gè)與細(xì)胞因子的融合抗原。20.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)移載體，其是pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-HlNl/HAl-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMAlD123-gp64、pDual國(guó)PbMSP129、pDual-PfCSP-gp64、pDual陽(yáng)PfAMAl-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual隱H5Nl/HAl-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-HlNl/HAl-gp64、pCAP-HlNl/HAl墨gp64、pCU-HlNl/HAl-gp64、pDual-HlNl/NP-gp64、pDual-HlNl/M2-gp64、pDual-HlNl/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HAl/NC99-gp64、pCP陽(yáng)HlNl/HA0-gp64、pCP-HlNl/HA2-gp64、pCP-HlNl/HAl-vp39和pCP-HlNl/NP-vp39的任何一個(gè)。21.—種重組桿狀病毒，通過(guò)權(quán)利要求8到13任何一個(gè)中的生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法生產(chǎn)。22.權(quán)利要求21中的重組桿狀病毒，其是AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMAlD123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV畫(huà)Dual-H5Nl/HAl、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlN固2、AcNPV-Dual-HlNl織e、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)。23.—種藥物組合物，其含有權(quán)利要求21或22中的重組桿狀病毒。24.權(quán)利要求23中的藥物組合物，含有AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV匿HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)。25.—種含有權(quán)利要求21或22中的重組桿狀病毒的藥物組合物，其中所述組合物通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入給藥。26.—種疫苗，其含有AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-H薩/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HAl/NC99、AcNPV-CP-HlNl/HAO、AcNPV-CP-HlNl/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)作為活性成分。27.權(quán)利要求26中的疫苗，其中所述疫苗通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入給藥。28.—種用于流感病毒感染的治療性或預(yù)防性藥劑，其含有AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMAl、AcNPV誦Dual-Pfs25、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl證、AcNPV-Dual-HlNl鏡、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP墨HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HAO、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39、AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39作為活性成分。29.權(quán)利要求28中的用于流感病毒感染的治療性或預(yù)防性藥劑，其中所述藥劑通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入給藥。30.—種用于流感病毒感染的疫苗，其含有AcNPV-Dual-HlNl/HAl、AcNPV-HlNl/HAl、AcNPV-CAP-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual陽(yáng)PfAMAl、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-HlNl/HAl、AcNPV-Dual-HlNl/NP、AcNPV-Dual-HlNl/M2、AcNPV-Dual-HlNl/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-HlNl/HAl-vp39和AcNPV-CP-HlNl/NP-vp39中的任何一個(gè)作為活性成分。31.權(quán)利要求30中的用于流感病毒感染的疫苗，其中所述藥劑通過(guò)肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或吸入給藥。全文摘要本發(fā)明提供了在雙啟動(dòng)子控制之下能夠表達(dá)與病毒基因融合的外源基因的重組轉(zhuǎn)移載體和重組桿狀病毒，及其生產(chǎn)方法，以及含有重組桿狀病毒作為活性成分的藥物。文檔編號(hào)A61P31/12GK101384714SQ20078000516公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2007年2月8日優(yōu)先權(quán)日2006年2月9日發(fā)明者吉田榮人,后藤義博,大庭義郎,川崎昌則,播口德充,松本真,水腰真己申請(qǐng)人:學(xué)校法人自治醫(yī)科大學(xué);大塚制藥株式會(huì)社