專利名稱：使用Helipyrone A的單線態(tài)氧淬滅劑、皮膚老化改善劑、皺紋改善劑、松弛改善劑、皮膚含 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及Helipyrone A，并證明其具有新型的淬滅單線態(tài)氧、改善皮膚老化、改善皺紋劑、改善松弛、改善皮膚含水量、美白、抑制黑素、清除一氧化氮或抗氧化的作用效果，本發(fā)明還可提供有效利用上述作用的各種新型制劑、醫(yī)藥、食品、化妝品。



圖1表示皺紋分數(shù) 圖2表示皮膚含水量 圖3表示皮膚硬度 圖4表示羰基蛋白的量(相對值) 圖5表示皮膚組織中8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy 2′-deoxy guanosine)的量(相對值) 圖6表示皮膚組織中的過氧化脂質量 圖7表示通過ESR法測定的清除一氧化氮的能力 圖8表示通過比色法(Griess法)測定的清除一氧化氮的能力 圖9表示通過比色法測定的清除過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)的能力 圖10表示增殖細胞核抗原[Proliferation Cell Nuclear Antigen(PCNA)]的增加抑制能力 圖11表示兜甲蛋白的抑制能力 圖12表示角蛋白1的抑制能力
具體實施例方式 Helipyrone A如以下通式(1)所示。
[化3]
通式(1) 認識到此Helipyrone A具有抑制皺紋效果、改善皮膚老化、光老化、美白劑、黑素、抗氧化、淬滅單線態(tài)氧、清除一氧化氮等的新作用?；诖诵抡J識，Helipyrone A可作為化妝料組合物、食品添加材料、醫(yī)藥材料使用。
作為化妝料、食品時，可期待其具有抑制皺紋效果、改善皮膚老化、光老化、美白劑、黑素、抗氧化、單線態(tài)氧淬滅作用，可作為皮膚老化改善劑、光老化抑制劑、美白劑、黑素生成抑制劑、抗氧化劑、單線態(tài)氧淬滅劑、一氧化氮清除劑使用。
本發(fā)明的含有Helipyrone A的化妝料(包括醫(yī)藥保健品)，可為用于面部或用于手、腳、身體的保濕化妝料，可為化妝水、乳液、霜劑、發(fā)膠、多層型化妝料等。此外，還可作為口紅、粉底霜等的化妝用化妝料、洗面奶、洗手液、浴液等的洗滌劑、洗發(fā)水、護發(fā)素、鋦油膏(treatment)、生發(fā)精等用于頭發(fā)的化妝料。
本發(fā)明的含有Helipyrone A的化妝料(包括醫(yī)藥部外品)中，除可使用Helipyrone A以外，還可使用作為化妝料的組合物一般可使用的材料。例如，可配合烴油、酯油、脂肪酸、高級醇、硅膠、固醇、神經(jīng)酰胺等的油劑，多元醇、糖、吡咯烷酮羧酸、氨基酸、甜菜堿等的保濕劑，非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、半極性表面活性劑、卵磷脂等的表面活性劑，高分子乳化劑、水溶性高分子、糊精棕櫚酸酯等的增稠劑，無機粉體、有機粉體、抗菌劑、殺菌劑、pH調節(jié)劑、螯合劑、著色劑、香料、植物提取物等。
本發(fā)明的含有Helipyrone A的食品，可將Helipyrone A直接或添加各種營養(yǎng)成分作為食品使用，也可配合在所需的食品中。例如，可在添加淀粉、乳糖、麥芽糖、植物油脂粉末、可可脂末、硬脂酸等適合的輔助劑后，使用常用的方法，制成適合食用的形態(tài)例如顆粒狀、粒狀、片劑、膠囊、糊狀等作為健康食品、保健功能食品等。也可添加到各種食品例如火腿、香腸等的肉食加工食品中，魚糕、圓筒狀魚糕等的水產(chǎn)加工食品中，面包、點心、黃油、奶粉、發(fā)酵乳制品中，還可添加到水、果汁、牛乳、清涼飲料等的飲料中使用。
本發(fā)明的含有Helipyrone A的醫(yī)藥，可與適合經(jīng)口給藥、經(jīng)皮給藥、直腸內給藥、注射等給藥方法的固體或液體的醫(yī)藥用無毒性載體混合，以常用的醫(yī)藥制劑的形態(tài)給藥。
此種制劑，例如可為片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等的固形劑，溶液劑、懸浮劑、乳劑等的液劑，冷凍干燥制劑等，這些制劑可通過制劑上的常用方法制備。
上述醫(yī)藥用無毒性載體，例如可為葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明膠、白蛋白、水、生理鹽水等。此外，根據(jù)需要，還可適當添加穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、粘合劑、等滲調節(jié)劑等的常用的添加劑。
[Helipyrone A的化學合成] 關于Helipyrone A的化學合成已在非專利文獻2(Esahak Ali，et al.，Phytochemistry，1982，21，243-244)中公開。
例如，本發(fā)明如下合成。
使用400mL己烷溶劑，在四氯化鈦的存在下，使172g化合物1二乙基酮[3-戊酮(3-pentanone)]與1,000g化合物2四氫-1，4-噁嗪(嗎啉)[tetrahydro-1，4-oxazine(morpholine)]在4℃下反應3小時，用蒸餾處理精制，得到503.57g化合物3(N-異丙烯酯)-四氫-1，4-噁嗪((N-isopropenyl)-tetrahydro-1，4-oxazine)(收率81.1％)。
使用200mL甲苯溶劑，使167g化合物3(N-異丙烯酯)-四氫-1，4-噁嗪[(N-isopropenyl)-tetrahydro-1，4-oxazine)]與81g化合物4乙基丙二酰氯(ethyl malonyl chloride)在甲醇冰冷卻(-17℃～-11℃)條件下反應，合成通式2所表示的化合物5。
[化4]
通式(2) 用2N鹽酸使化合物3與化合物4的反應終止，在氯仿提取后進行硫酸鎂干燥處理。然后，在反應溶液中依次加入200mL甲苯和400mL 25％鹽酸，通過液-液分配回收甲苯層。將甲苯層用400mL 0.1N鹽酸洗滌，硫酸鎂干燥處理后，將甲苯用真空蒸發(fā)器除去，得到橙色油狀溶液。在此溶液中加入1kg PPA(聚磷酸)，110℃～118℃下環(huán)化合成化合物5。化合物5在室溫下冷卻，用氯仿提取回收，在硫酸鎂干燥處理后用真空蒸發(fā)器除去氯仿。將固形物用硅膠柱色譜法[氯仿:甲醇＝50:1(v/v)]獲得45.7g橙色固體化合物5。本反應的收率為18.3％。
通過使此化合物5在1N鹽酸的存在下與甲醛聚合反應，化學合成化合物6 Helipyrone A。將45.7g化合物5溶解于460mL乙醇中，在2.5mL濃鹽酸存在下，使其與247.81g甲醛(37％)在79℃下進行回流反應，析出結晶。將此結晶用300mL乙醇洗滌，獲得34.01g Helipyrone A白色結晶。本反應的收率為71.6％。
所得到的Helipyrone A的物性值如下所示。
外觀白色結晶 NMR光譜(400MHz，溶劑；CDCl3) 1H-NMR δ＝a1.231、b1.969、c2.554、d3.616、e11.199 13CNMR(400MHz、溶劑；CDCl3) δ＝I→169.335(t)H→168.499(m)，G→160.160(m)，F(xiàn)→108.709(m)，E→101.592(t)，D→24.368(qt)，C→19.176(t)，B→11.689(qt)，A→9.476(q) [化5]
[化6]
分子量320.341g/mol(質譜分析) 分子式C17H20O6(質譜分析) 熔點218-220℃ [抗氧化能力評價] 對Helipyrone A進行單線態(tài)氧淬滅作用的評價。評價方法為，將2，2，6，6-四甲基-4-哌啶醇(2，2，6，6-tetramethyl-4-piperidinol)(4-OH TEMP)作為自旋捕捉劑通過ESR自旋捕捉法測定。在市售的平底96孔微孔板中，混合0.1mL以任意濃度配制的Helipyrone A的40％(v/v)N，N-二甲基甲酰胺水溶液、0.02mL蒸餾水、0.04mL100mM的4-OH TEMP水溶液、和0.04mL0.1mM的玫瑰紅水溶液，制成0.2mL的混合液。作為光敏反應的光源，從微孔板的背面對混合液用最大波長530nm的發(fā)光二極管(綠色LED)照射20分鐘，以產(chǎn)生單線態(tài)氧。將此混合液移入ESR用扁平水溶液樣品管中，測定ESR光譜。由ESR光譜強度求出單線態(tài)氧淬滅率，將其對應濃度制圖，求出半數(shù)抑制濃度IC50值。此外，作為比較，同時求出已有的多酚化合物[水飛薊賓、3，4-二羥基苯基乙醇、(-)-兒茶素、(-)-表兒茶素沒食子酸酯、槲皮酮、迷迭香酸、鼠尾草酸、咖啡酸、曲酸、β-胡蘿卜素]的IC50值。其結果如表1所示。
由上述結果可證實，與其他多酚化合物相比，Helipyrone A可以更低濃度淬滅單線態(tài)氧。即可說明Helipyrone A顯示出優(yōu)異的單線態(tài)氧淬滅作用。
表1 [黑素生成抑制試驗] 在市售的6孔培養(yǎng)板中，分別使小鼠B16黑色素瘤細胞在5％CO2、37℃條件下使用培養(yǎng)液即含有10％FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)到細胞匯合。添加黑素生成刺激劑100nMα MSH，同時添加0.0001％HelipyroneA，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。溶劑條件為含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，但考慮到Helipyrone A的溶解度，使全部的孔中含有0.2％乙腈。培養(yǎng)終止后，回收細胞組分，用0.1N NaOH堿處理使黑素色素溶解，測定405nm的吸光度(ABS)。
黑素生成抑制率用下式計算 黑素生成抑制率[％]＝100×{1-(ABS[Sample])/(ABS[Control])} 對照(Control)含有0.2％乙腈的DMEM培養(yǎng)基 樣品(Sample)含有0.2％乙腈、添加0.0001％Helipyrone A(DMEM培養(yǎng)基) 其結果，添加0.0001％ Helipyrone A時，22.1％±8.4(S.D.)的黑素生成受到抑制。
[由紫外線照射形成的皺紋的抑制試驗] 對無毛小鼠長時間持續(xù)實施微弱的紫外線照射，因此形成皮膚老化現(xiàn)象的皺紋·松弛。用該無毛小鼠為動物模型，分析此時將Helipyrone A混料給藥時的影響。
I.實驗動物 ·種·系統(tǒng)·性別 種小鼠，系統(tǒng)HosHR1(無毛小鼠)，性別雌性 ·飼養(yǎng)開始的周齡 從5周齡開始飼養(yǎng)，同時開始混料給藥 II.飼養(yǎng)環(huán)境 設定溫濕度24±1℃，相對濕度55±5％ 空調設備全空氣方式(all fresh) 照明時間12小時自動開燈·關燈的方式 飼養(yǎng)設備塑料制籠5只/籠 飼料自由攝取粉末滅菌飼料MF-1[Oriental酵母工業(yè)株式會社 (Oriental Yeast Co.，Ltd)]，或在MF-1中分別以0.01％(w/w)、0.05％(w/w)、0.1％(w/w)混合Helipyrone A或以0.01％(w/w)、0.05％(w/w)混合抗氧化效果優(yōu)異的β胡蘿卜素。
III.試驗日程 紫外線照射條件使用紫外線燈，隔日(間隔一日)、無束縛應激地照射UV-A波14J/cm2(照射時間約1分鐘)、UV-B波20mJ/cm2(照射時間約50分鐘)10星期。10星期(35次)的總照射量為UV-A波490J/cm2、UV-B波700mJ/cm2。
對于持續(xù)照射紫外線的組，在解剖前24小時實施最后的紫外線照射，從解剖前18小時開始絕食。在解剖前通過非侵襲的方法使用簡易型水分計測定皮膚含水量(Moisture CheckerTM、Scalar制)。
進行戊巴比妥鈉麻醉，對外觀進行拍照攝影。然后取皮膚背部的復制品。解剖摘出肝臟，回收全血，回收背部及腹部的皮膚。
迅速冷凍保存臟器，離心分離(3,000G，20min，室溫)全血，回收血漿(plasma)冷凍保存。皮膚是將背部的一定面積進行Bouin固定，除用于組織染色外，還進行冷凍保存。
對于外觀上的皮膚狀態(tài)，著眼于頸部松弛(Sagging)、背部皺紋(Wrinkle)的形成狀況，根據(jù)Bissett DL等的定義([Photochem Photobiol.(1987)Vol.46，No.3，pp367-pp78]進行評分。即根據(jù)下述定義進行數(shù)值化，將判斷困難的檢體作為中間值評為0.5。將皺紋分數(shù)的數(shù)據(jù)制圖，如圖1所示。
分數(shù)0 完全沒有皺紋。
靜止狀態(tài)下未看出相對于脊椎方向的垂直線條，稍微看出一些時，其線條也隨個體運動消失。
分數(shù)1 明顯看出有輕微的皺紋產(chǎn)生。
可看出相對于脊椎方向的垂直線條，其線條隨個體運動消失。
分數(shù)2 明顯看出有中等程度的皺紋產(chǎn)生。
可明顯看出相對于脊椎方向的線條，且其線條不隨個體運動消失，為永久性。
分數(shù)3 明顯看出有深皺紋產(chǎn)生。
可明顯看出相對于脊椎方向的線條，可看出其線條的影子，且其線條不隨個體運動消失，為永久性。
皺紋分數(shù)，紫外線照射10星期的MF-1(對照)食組為2.4，相對于此，紫外線照射10星期的配合0.1％ Helipyrone A的MF-1食組為0.1，紫外線照射10星期的配合0.05％ Helipyrone A的MF-1食組為0.2，紫外線照射10星期的配合0.01％ Helipyrone A的MF-1食組為0.6，其皺紋生成顯著得到了抑制。不經(jīng)過紫外線照射而經(jīng)過10星期的MF-1(對照)食組的皺紋分數(shù)為0.2，通過攝取將Helipyrone A以0.05～0.1配合的食物，可使由紫外線照射引起的皺紋完全得到抑制。
從皮膚所觀察的結果，證實Helipyrone A有顯著的抑制皺紋效果。Helipyrone A向小鼠的給藥，小鼠一日的攝食量為4g，使用體表面積換算式y(tǒng)＝(3√x)2換算為對人的給藥量時，自由攝取0.1％的混食時，約相當于520mg/日/60kg體重，自由攝取0.01％的混食時，約相當于52mg/日/60kg體重，作為食品時，為不需勉強即可攝取的量。
此外，具有抗氧化作用的β-胡蘿卜素攝食組不顯示皺紋抑制效果。
紫外線照射10星期、配合0.05％β-胡蘿卜素的MF-1食組的皺紋分數(shù)為2.0，紫外線照射10星期、配合0.01％β-胡蘿卜素的MF-1食組的皺紋分數(shù)為2.3。
[紫外線照射所引起的皮膚干燥的抑制] 解剖之前通過非侵襲的方法使用簡易型水分計(Moisture CheckerTM、Scalar制)測定皮膚含水量，每只測定5次，比較各組的平均測定值。皮膚含水量的測定結果如圖2所示。
紫外線照射10星期+MF-1(對照)食組的皮膚含水量降低而呈干燥狀態(tài)(皮膚含水量為31.4％)，相對于此，紫外線照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食組中配合0.1％ Helipyrone A的皮膚含水量為41.3％，配合0.05％的皮膚含水量為40.2％，配合0.01％的皮膚含水量為38.2％，保持了40％左右顯著高的皮膚含水量。與不經(jīng)紫外線照射而經(jīng)過10星期的MF-1(對照)食組中的皮膚含水量35.5％相比，Helipyrone A配合食組的皮膚含水量顯示出非常高的值。
[紫外線照射所引起的皮膚硬化的抑制] 使用彈簧型硬度計(JIS C形)皮膚粘彈性測定裝置(VesmeterE-100S/WaveCyber制)，對從背部的尾根向頸部2cm、腰椎右側0.5cm處測定3次，求出平均硬度。皮膚硬度的測定結果如圖3所示。
作為皮膚粘彈性的指標而已知的硬度，一般已知其數(shù)值越高皮膚老化越嚴重，皮膚的彈性越低。
紫外線照射10星期+MF-1(對照)食組中皮膚硬化非常顯著(度數(shù)15.4)，相對于此，紫外線照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食組中配合0.1％ Helipyrone A的硬度的度數(shù)為8.1，配合0.05％的硬度的度數(shù)為9.1，配合0.01％的硬度的度數(shù)為9.1，與不經(jīng)過紫外線照射而經(jīng)過10星期的MF-1(對照)食組中硬度的度數(shù)7.2相比，硬化被抑制到了硬化稍微增加的程度。
[紫外線照射所引起的皮膚組織中羰基蛋白生成的抑制] 氧化蛋白質之一的羰基蛋白使用OxyblotTM(CHEMICON公司)評價。具體方法如下。秤量濕重約200mg的小鼠皮膚，4℃下加入含有蛋白酶抑制劑混合物(Protease inhibitor cocktail)的裂解緩沖液(Lisys buffer)(pH＝7.4)0.2ml進行均質，12,000g×20分鐘離心，使用經(jīng)過濾器過濾其上清后的部分，將蛋白濃度根據(jù)Bradford方法測定。對各個蛋白樣品20μg，使羰基與DNPH反應。蛋白質通過SDS-PAGE分離，使用蛋白質轉印裝置轉印到PVDF膜上。轉印后的膜在常溫下30分鐘，在含有5％脫脂奶的PBS(-)溶液中封閉，將脫脂奶用PBS(-)洗滌后，與抗DNPH抗體在4℃下反應過夜，洗滌后，與生物素化抗小鼠IgG反應1小時。洗滌后，用熒光檢測試劑盒(ECL PLUS)使PVDF膜感光，用醫(yī)療用自動顯像裝置轉印圖像。結果如圖4所示。
其結果，紫外線照射10星期+MF-1(對照)食組中羰基蛋白的量的相對值為259.4，相對于此，紫外線照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食組中配合0.1％ Helipyrone A的羰基蛋白的量的相對值為25.3，配合0.05％的羰基蛋白的量的相對值為35.6，配合0.01％的羰基蛋白的量的相對值為57.7，羰基蛋白的生成被抑制到1/10～1/5。不經(jīng)過紫外線照射而經(jīng)過了10星期的MF-1(對照)食組中羰基蛋白的量的相對值為23.7，與0.1％ Helipyrone A配合食組的羰基蛋白的量的相對值25.7為同等程度。因此，Helipyrone A顯著抑制紫外線照射所引起的羰基蛋白的生成。
具有抗氧化作用的β-胡蘿卜素攝食組基本沒有抑制羰基蛋白生成的效果。
紫外線照射10星期、配合0.05％ β-胡蘿卜素的MF-1食組的羰基蛋白的量的相對值為153.1，紫外線照射10星期、配合0.01％ β-胡蘿卜素的MF-1食組的羰基蛋白的量的相對值為190.7。
[紫外線照射所引起的皮膚組織中8-羥基鳥苷(8-Hydroxy-2′-deoxyguanosine(8-OHdG))的生成抑制] 8-OH dG使用免疫組織化學的方法測定。解剖動物時，取皮膚組織背部尾根開始向頸部2cm、腰椎右側0.5cm處的皮膚1cm2，進行Bouin固定及石蠟包埋以保存皮膚組織。制備3μm厚的切片，脫石蠟、親水化可根據(jù)公知方法實施?？乖x活在0.01M檸檬酸緩沖液(pH＝6.0)中實施5分鐘微波處理。冷卻到室溫后，在常溫下在含有0.3％過氧化氫的甲醇中反應20分鐘，以抑制內源性過氧化物酶。水洗，10mMPBS(-)洗滌后，用兔血清75倍10mMPBS(-)稀釋溶液實施5分鐘微波處理進行封閉，清除血清，將5μg/ml第一抗體(N45.1NIKKEN SEIL Co.，Ltd制)通過20分鐘微波處理使抗體反應。用10mMPBS(-)洗滌2次，將生物素化第二抗體(生物素化兔免疫球蛋白M；DAKO制)稀釋300倍后用微波處理5分鐘使抗體反應。用10mMPBS(-)洗滌2次，使ABC試劑(ABC-HRP；Vectastain制)通過5分鐘微波處理進行反應。顯色試劑使用DAB(3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽DAKO制)，在常溫下反應3分30秒。水洗后，根據(jù)公知方法進行脫水、封閉處理。在顯微鏡下觀察皮膚組織的染色狀況，使用AdobePhotoshop導入圖像，將圖像中一定面積中的染色處用NIH Imaging數(shù)值化。結果如圖5所示。
其結果，紫外線照射10星期+MF-1(對照)食組中8-OH dG的相對值為5.89，相對于此，紫外線照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食組中配合0.1％ Helipyrone A的8-OH dG量的相對值為0.87，配合0.05％的8-OH dG量的相對值為0.91，配合0.01％的8-OH dG的相對值為1.10，8-OHdG量的生成被抑制到15/100～19/100。與不經(jīng)過紫外線照射而經(jīng)過10星期的MF-1(對照)食組的8-OH dG量的相對值1.00相比，紫外線照射0.05％Helipyrone A配合食組、0.1％配合食組的8-OH dG量的相對值為更低的值。因此，Helipyrone A顯著抑制了紫外線照射所引起的8-OH dG的生成。
此外，具有抗氧化作用的β-胡蘿卜素攝食組未顯示8-OH dG的生成抑制效果。
紫外線照射10星期、配合0.05％β-胡蘿卜素的MF-1食組的8-OH dG量的相對值為5.2，紫外線照射10星期、配合0.01％β-胡蘿卜素的MF-1食組的8-OH dG量的相對值為6.3。
[紫外線照射所引起的皮膚組織中過氧化脂質的生成抑制] 將皮膚組織中的TBARS[硫代巴比妥酸反應生成物、nmol/g濕重(wetweight)]用熒光分析測定。秤量濕重約200mg的各組織，用1ml1.15％KCl均質后，依次添加4ml 1/12N硫酸、0.5ml10％鎢磷酸，進行3,000rpm10min離心分離。除去上清的夾雜物，添加TBA試劑(硫代巴比妥酸/醋酸緩沖液)，在沸騰水浴中加熱反應1小時。為進行TBARS的定量，用另外加入1，1，3，3-四乙氧基丙烷的樣品進行TBA反應，制成標準曲線。結果如圖6所示。
加熱反應結束后，冰冷卻到室溫，加入5ml正丁醇，攪拌后用3,000rpm10min的條件離心分離，回收上層的正丁醇層，用于熒光分析(Ex 515nm、Em553nm)。熒光強度計使用HITACHI F-2000。
其結果，紫外線照射10星期+MF-1(對照)食組中的組織中過氧化脂質量為50.8nmol/mg，相對于此，紫外線照射10星期+配合Helipyrone A的MF-1食組中配合0.1％ HelipyroneA的組織中過氧化脂質量為30.9nmol/mg，配合0.05％的組織中過氧化脂質量為33.7nmol/mg，配合0.01％的組織中過氧化脂質量為44.8nmol/mg，過氧化脂質的生成被抑制到6/10～9/10。紫外線照射10星期+Helipyrone A 0.1％配合食組及0.05％配合食組的過氧化脂質量，與不經(jīng)過紫外線照射而經(jīng)過10星期的MF-1(對照)食組中的組織中過氧化脂質量30.2nmol/mg為同等程度。因此，HelipyroneA顯著抑制了紫外線照射所引起的過氧化脂質的生成。
具有抗氧化作用的β-胡蘿卜素攝食組基本沒有過氧化脂質的生成抑制效果。
紫外線照射10星期、配合0.05％β-胡蘿卜素的MF-1食組的過氧化脂質量為46.9nmol/mg，紫外線照射10星期、配合0.01％β-胡蘿卜素的MF-1食組的過氧化脂質量為51.1nmol/mg。
[用ESR法測定一氧化氮清除能力的評價] 相對于100μM的SNAP[S-亞硝基-N-乙?；?DL-青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)同仁化學制]，比較Helipyrone A和作為抗氧化劑而已知的(-)兒茶素(Sigma制)的一氧化氮清除能力。
自旋捕捉劑中，使用混合N-甲基-D-葡萄糖胺-二硫代氨基甲酸鹽(N—methyl_D—Glucosamine Diflliocarbammte)[以下稱MGD。從Labotec株式會社(Labotec Co.，Ltd)購入]和硫酸鉄(II)水溶液后制備的(MGD)2-Fe2+復合物。因此復合物通過與一氧化氮反應形成(MGD)2-Fe2+-NO的復合物而產(chǎn)生ESR光譜強度，所以通過測定一氧化氮清除劑在各濃度下的ESR光譜來測定一氧化氮的清除能力。
將50mM硫酸鉄(II)·2水合物溶劑蒸餾水100μL(最終濃度5mM)、50mM MGD溶劑PBS(pH7.4)100μL(最終濃度5mM)、被測物質溶劑10％乙腈100μL、100mM磷酸緩沖液699μL、100mM SNAP溶劑0.1M氫氧化鈉1μL(最終濃度100μM)依次加入到1.5ml容量的微型離心管(eppendorf tube)中，從SNAP添加時開始，25℃下進行攪拌反應10分鐘， 在25℃下10分鐘的反應中從SNAP釋放出一氧化氮，由(MGD)2-Fe2+-NO的信號強度比＝1:1:1的3個峰構成。根據(jù)此信號強度因被測物質不同而增減了多少來評價一氧化氮清除能力。具體地說，以不添加被測物質的對照的信號強度(C)為標準，從添加被測物質時的信號強度(S)通過下式求出一氧化氮清除率，如圖7所示。
一氧化氮清除率＝(1-S/C)×100(％) 其結果，Helipyrone A在25μM～200μM的范圍內一氧化氮清除率的提高為濃度依賴性(25Mm 32.4％，50μM時為52.6％，100μM時為63.6％，200μM時為80.1％)，IC50濃度為51.4μM，相對于此，(-)兒茶素在50μM、100μM時一氧化氮清除率分別不超過5.6％、11.7％，250μM時為31.4％，500μM時為47.4％的一氧化氮清除率。IC50濃度計算為547μM。
此次使用的機器及機器的條件設定如下所示。
機器JEOL JES TE200、X-band ESR裝置(100KHz、日本電子公司制) 機器的條件設定 中心磁場(center field)335.0±5.0mT、 微波功率(microwave power)4mW、 調幅(modulation amplitude)0.1mT、 增益(gain)500、 時間常數(shù)(time constant)0.1秒、 掃描時間(scanning time)1分鐘 [用比色法(Griess法)測定的一氧化氮清除能力] 溶液中存在的一氧化氮在水溶液中極不穩(wěn)定，所以，除ESR法以外，通過 測定一氧化氮的氧化物亞硝酸離子，間接評價一氧化氮量。對已知的抗氧化物質(-)兒茶素、麥芽酚、p-香豆酸進行評價，與Helipyrone A比較。通過Griess法的測定，使用NO2/NO3 AssayKit-CII(Colorimetric)(同仁化學制)。
作為一氧化氮發(fā)生劑，使用NOC-5(1-羥基-2-氧代-3-(3-氨基丙基)-3-異丙 基-1-三氮烯)(同仁化學公司制)，到使用之前，在0.1N氫氧化鈉堿溶液中-20℃下冷凍保存。用Kit中的緩沖液(pH＝7.6，以下“緩沖液”)稀釋10000倍，通過調整到100μM的濃度，使其產(chǎn)生一氧化氮。作為一氧化氮供體開發(fā)的NOC-5在堿溶液中穩(wěn)定，但在中性及酸性條件下是生成一氧化氮的不穩(wěn)定的化合物(25度、pH7.4條件下，半衰期為25分鐘)。
在市售的平底96孔培養(yǎng)板中，添加被測物質溶劑含有1％乙腈的緩沖液(pH＝7.6)40μL，使被測物質的濃度改變。其后，添加緩沖液(pH＝7.6)20μL，添加100μM的NOC-5溶液40μL，25℃下反應2小時。反應終止后，添加Kit中的Griess試劑A50μL，放置5分鐘，然后將Griess試劑B以每50μL單位添加，放置10分鐘進行顯色反應。用multiplate reader測定540nm的吸光度。將添加各被測物質濃度的吸光度作為S540，不含被測物質的對照的吸光度作為C540，不含被測物質及NOC-5的空白的吸光度作為B540，用下式計算一氧化氮清除率(％)，如表2、圖8所示。
一氧化氮清除率(％)＝100×(1-(S540-B540)/(C540-B540) 代替NOC-5溶液，用亞硝酸鈉溶液0～100μM的濃度區(qū)域設定的檢體的吸光度制作標準曲線，求出溶液中的亞硝酸離子濃度。由此亞硝酸離子濃度，可求出由NOC-5溶液產(chǎn)生的一氧化氮濃度。一氧化氮清除能力的強弱，在本試驗系統(tǒng)中用半數(shù)清除濃度(IC50、μM)比較。
從100μM的NOC-5溶液中，47.0μM的一氧化氮作為亞硝酸離子生成。此時，可看出由于添加被測物質而使吸光度降低，即可看出一氧化氮的清除活性。
表2
可看出Helipyrone A在50μM～400μM的范圍內一氧化氮的清除能力具有濃度依賴性，IC50濃度為36.7μM。另一方面，(-)兒茶素、麥芽酚、p-香豆酸的IC50濃度為190.0μM、94.0μM、187.4μM。證明HelipyroneA具有優(yōu)異的一氧化氮清除能力。
由以上結果可知，本發(fā)明的Helipyrone A可清除一氧化氮，作為血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的藥劑有效。此Helipyrone A清除生物體內存在的過量的一氧化氮，具有使一氧化氮達到正常濃度的作用、及在預測到一氧化氮過量發(fā)生時預先給藥從而防止生物體內過量一氧化氮發(fā)生的作用。即本說明書中Helipyrone A的一氧化氮清除能力不是將生物體內存在的所有的一氧化氮完全清除，而是清除生物體內存在的過量的一氧化氮，調節(jié)到維持生物體的適合的量。
[用比色法測定的過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)清除能力] Helipyrone A的過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)清除能力通過Griess法使用NO2/NO3AssayKit-CII(Colorimetric)(同仁化學制)測定。
對已知的抗氧化物質(-)兒茶素、麥芽酚、p-香豆酸進行評價，與Helipyrone A比較。
在市售的平底96孔培養(yǎng)板中添加被測物質溶劑含有1％乙腈的緩沖液(pH＝7.6)40μL，使被測物質的濃度改變。其后，在各個孔中，添加Kit中的還原酶10μL、及輔酶10μL。
作為過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)發(fā)生劑，添加40μLSIN-1(3-(4-Morpholinyl)sydnonimin，hydrochlolide)50μM，37℃下反應2小時。反應終止后，添加50μL Kit中的Griess試劑A，放置5分鐘，然后將Griess試劑B以每50μL單位添加，放置10分鐘進行顯色反應。用Multiplate Reader測定540nm的吸光度。將被測物質的吸光度作為S540，不含被測物質的對照的吸光度作為C540，不含被測物質及SIN-1的空白的吸光度作為B540，用下式計算過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)清除率(％)，如表3、圖9所示。
過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)清除率(％) ＝100×(1-(S540-B540)/C540-B540) 標準曲線，代替SIN-1溶液，用硝酸鈉溶液0～100μM的濃度區(qū)域設定的檢體的吸光度制作，求出溶液中的硝酸離子濃度。由此硝酸離子濃度可求出SIN-1溶液產(chǎn)生的過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)濃度。
過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)清除能力的強弱，用本試驗系統(tǒng)半數(shù)清除濃度(IC50、μM)進行比較。
其結果，對照中，由50μM的SIN-1產(chǎn)生8.18μM過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)，清除50％該過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)的IC50濃度，Helipyrone A為24.04μM，麥芽酚為31.84μM，p-香豆酸為31.49μM，(-)兒茶素為705.6μM，Helipyrone A顯示出優(yōu)異的過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)清除能力。
表3
過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)是在生物體內一氧化氮與超氧陰離子的反應中產(chǎn)生的，可引起強氧化作用及生物體損傷、炎癥。顯示過氧亞硝基陰離子(Peroxynitrite)清除活性的Helipyrone A是抗氧化劑，發(fā)揮抑制生物體的炎癥，保護生物體成分的功能。
[酪氨酸酶活性抑制作用的測定] 在平底96孔培養(yǎng)板中添加被測物質溶液100μL，加入600units/ml的來自蘑菇的酪氨酸酶溶液10μL，30℃下培養(yǎng)10分鐘。然后，加入預先在30℃下加溫的6mML-DOPA(L-β-(3，4-二羥基苯基)丙氨酸)溶液100μL，30℃下振蕩40分鐘，同時進行培養(yǎng)。被測物質的溶劑使用含有1％乙腈的100mM琥珀酸緩沖液(pH5.5)，酪氨酸酶、L-DOPA的溶劑使用100mM琥珀酸緩沖液(pH5.5)。振蕩后，作為黑素量的指標在475nm波長下測定吸光度，將該值作為S475。將不添加被測物質時作為對照(C)，將該吸光度作為C475，將不添加L-DOPA時作為樣品空白(SB)，將該吸光度作為SB475，將不添加樣品和L-DOPA時作為對照空白(CB)，將該吸光度作為CB475，通過式2計算出酪氨酸酶抑制率。陽性對照使用熊果苷[東京化成工業(yè)株式會社制]。
酪氨酸酶活性抑制率％＝100×{1-(S475-SB475)/(C475-CB475)} 其結果，添加濃度為1mM時Helipyrone A和熊果苷的酪氨酸酶抑制率，Helipyrone A為36.34％，熊果苷為25.77％，所以，Helipyrone A具有比熊果苷優(yōu)異的抑制酪氨酸酶活性，Helipyrone A顯示美白作用。
[小鼠皮膚中的酪氨酸酶基因的表達分析] 讓小鼠攝食Helipyrone A時，編碼酪氨酸酶的基因的表達用小鼠皮膚測定。
I.實驗動物 I-1.種·系統(tǒng)·性別種小鼠，系統(tǒng)HosHR1(無毛小鼠)，性別雌性 I-2.飼養(yǎng)開始周齡5周齡(飼養(yǎng)1星期后，從6周齡開始進行紫外線照射試驗) I-3.微生物等級SPF I-4.飼養(yǎng)者清水實驗材料株式會社 II.飼養(yǎng)環(huán)境 設定溫濕度24±1℃，相對濕度55±5％ 空調設備全空氣方式 照明時間12小時自動開燈·關燈方式 飼養(yǎng)設備塑料制籠5只/籠 飼料自由攝取粉末滅菌飼料MF-1[Oriental酵母工業(yè)株式會社 (Oriental Yeast Co.，Ltd)]，另外制備在MF-1中混合0.1重量％Helipyrone A的飼料。
試驗對象物的給藥使其自由攝取粉末混料。解剖前18小時開始絕食。
給水自由攝取滅菌后的自來水 IV-3解剖 對從解剖前18小時開始絕食的個體進行體重測定、皮膚含水量測定后，通 過戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)腹腔內給藥導入麻醉。
切開腹部，從心臟進行肝素采血。然后，對臟器進行肉眼觀察后，摘出肝臟、從后頭部到臀部的背部全部皮膚。關于背部皮膚，是切取皮膚組織背側尾根開始到頸部2cm、腰椎右側0.5cm處的皮膚1cm2，進行Bouin固定及石蠟包埋，以保存皮膚組織。其他的背部皮膚迅速放入鋁箔，用液氮急速冷凍，-80℃下長期保存。
[關于基因表達分析的試驗] 選擇各組2只的背部皮膚，提取基因表達分析用Total RNA樣品。將背部皮膚在液氮存在下細切粉碎，分別將濕重每數(shù)十mg注入1.5ml容量微型離心管中。Total RNA提取使用RNase easy mini kit(QIAGEN制)，根據(jù)通常的使用說明進行。
提取的Total RNA使用Affymetrix公司推薦的使用說明處理后，通過DNA微陣列法分析皮膚組織中的表達模式。具體地說，從提取的total RNA中，使用“SUPERSCRIPT choice system for cDNA synthesis”(商品名，Invitrogen公司制)合成cDNA，以此cDNA為模板，使用“Bio Array HighYield RNA Transcript Labeling Kit”(商品名，Enzo Diagnostics公司制)，在試管內合成生物素標記的cRNA。且將此cRNA切成片段后，用DNA微陣列[商品名“GeneChipMouse Expression Array 430A”(Affymetrix公司制)]和“雜交爐”(商品名，Affymetrix公司制)進行雜交，將與R-藻紅蛋白鏈霉親和素(R-phycoerythrin streptavidin)的反應及洗滌操作使用“全自動洗滌工作站(Fluidics station)”(商品名、Affymetrix公司制)進行后，用“基因芯片掃描儀(Gene Array Scanner)”(商品名、Affymetrix公司制)測定熒光強度，進行相關基因表達量的分析。且上述DNA微陣列的檢測靈敏度為1:100,000，其可通過在小鼠total RNA樣品中添加檢測來自小鼠cDNA克隆的標記后轉印產(chǎn)物進行測定。對于本試驗中使用的來自小鼠皮膚的total RNA，檢測出22，690基因，用于基因表達增減的分析。其中，酪氨酸酶用ProbeID1448821_at編碼，由其熒光強度求出基因表達強度的比率。
試驗組和對照組的組合如下所示。
試驗組含有0.1％Helipyrone A的MF-1食10星期飼養(yǎng)(16周齡) 對照組MF-1食10星期(16周齡) 表4 表4中的“登錄號”是各基因基因庫(GenBank)(NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫)中的識別編號，探針組序列號(Probe Set ID)是Affymetrix公司制GeneChip Expression Array固有的識別編號。
由表4可知，小鼠皮膚組織中酪氨酸酶的基因表達被Helipyrone A抑制，酪氨酸酶在皮膚中的超表達被抑制，酪氨酸酶引起的黑素形成被Helipyrone A抑制。
[皮膚組織中增殖細胞核抗原(Proliferation Cell Nuclear Antigen)的測定] 增殖細胞核抗原(Proliferation CellNuclear Antigen)(PCNA)使用免疫組織化學的方法測定。
石蠟包埋后的小鼠皮膚組織中，根據(jù)常規(guī)方法進行脫石蠟處理，抗原賦活是在0.01M檸檬酸緩沖液(pH6.0)中實施5分鐘微波處理。冷卻到室溫后，常溫下在含有0.3％過氧化氫的甲醇中反應20分鐘，以抑制內源性過氧化物酶。水洗，10mM PBS(-)洗滌后，用兔血清75倍10mMPBS(—)稀釋溶液實施5分鐘微波處理進行封閉，封閉結束后，清除兔血清，添加將第一抗體(PC10DAKO制)稀釋500倍后的物質，通過20分鐘微波處理使抗體反應。用10mMPBS(-)洗滌2次，添加將生物素化第二抗體(生物素化兔免疫球蛋白M；DAKO制)稀釋300倍后的物質，微波處理5分鐘使抗體反應。用10mMPBS(-)洗滌2次，添加ABC試劑(ABC-HRP；Vectastain制)，通過微波處理5分鐘進行反應。使用顯色試劑DAB(3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽DAKO制)，在常溫下反應3分30秒。水洗后，根據(jù)公知方法進行脫水、封閉處理。在顯微鏡下觀察皮膚組織的染色狀況。紫外線照射10星期的檢體，由于PCNA的增加表皮細胞中主要是細胞核部分顯色，使用Adobe Photoshop導入圖像，將圖像中一定面積中的染色處用NIHImaging進行數(shù)值化。
求出各組數(shù)值的平均值±S.D.。2組間的顯著性差異檢驗以UV(-)組為標準值1，對各組平均值進行補正后，實施student t檢驗(student’s t-test)(顯著水平p<0.05)。測定的樣品如表5所示，結果如圖10所示。
攝取Helipyrone A的小鼠的皮膚組織中PCNA未增加。已知PCNA作為因DNA的氧化、切割及增殖性皮膚病而為人所知干癬的生物標記物而表達上升，本試驗中，由于Helipyrone A攝食對DNA的抗氧化作用、紫外線損傷的緩和作用，而使紫外線照射小鼠皮膚時表達上升的PCNA恢復到正常水平。
表5 [皮膚組織中兜甲蛋白的測定] 兜甲蛋白使用免疫組織化學的手法測定。
石蠟包埋后的小鼠皮膚組織根據(jù)常規(guī)方法進行脫石蠟處理，抗原賦活在0.01M檸檬酸緩沖液(pH6.0)中實施5分鐘微波處理。冷卻到室溫后，常溫下在含有0.3％過氧化氫的甲醇中反應20分鐘，以抑制內源性過氧化物酶。水洗，10mM PBS(-)洗滌后，用山羊血清75倍10mMPBS(—)稀釋溶液實施5分鐘微波處理進行封閉，封閉結束后，清除山羊血清，添加將第一抗體[兜甲蛋白多克隆抗體，純品(Loricrin Polyclonal Antibody，Purified)Sigma制]稀釋500倍的物質，通過20分鐘微波處理使抗體反應。用10mMPBS(-)洗滌2次，添加將生物素化第二抗體(生物素化山羊免疫球蛋白M；DAKO制)稀釋300倍的物質，微波處理5分鐘使抗體反應。用10mMPBS(-)洗滌2次，添加ABC試劑(ABC-HRP；Vectastain制)，通過5分鐘微波處理進行反應。顯色試劑使用DAB(3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽DAKO制)，常溫下反應4分30秒。之后，用蘇木素對細胞核、組織全體像進行染色處理，水洗后，根據(jù)公知方法進行脫水、封閉處理。在顯微鏡下觀察皮膚組織的染色狀況。紫外線照射10星期的檢體由于兜甲蛋白增加，表皮細胞中主要是細胞核部分顯色。使用Adobe Photoshop導入圖像，將圖像中一定面積中的染色處用MH Imaging數(shù)值化。測定的樣品如表6所示，結果如圖11所示。
求出各組數(shù)值的平均值±S.D.。2組間的顯著性差異檢驗以UV(-)組為標準值1，對各組平均值進行補正后，實施student t檢驗(student’s t-test)(顯著水平p<0.05)。
攝取Helipyrone A的小鼠皮膚組織，兜甲蛋白未增加。兜甲蛋白作為皮膚終末分化的標記物而為人所知，通過Helipyrone A攝取，證明其具有抑制皮膚的老化現(xiàn)象，保持正常的皮膚分化狀態(tài)的作用。
表6 [皮膚組織中角蛋白1的測定] 角蛋白1使用免疫組織化學的方法測定。
石蠟包埋后的小鼠皮膚組織根據(jù)常規(guī)方法進行脫石蠟處理，抗原賦活在0.01M檸檬酸緩沖液(pH6.0)中實施5分鐘微波處理。冷卻到室溫后，常溫下在含有0.3％過氧化氫的甲醇中反應20分鐘，以抑制內源性過氧化物酶。水洗，10mM PBS(-)洗滌后，用山羊血清75倍10mMPBS(—)稀釋溶液實施5分鐘微波處理進行封閉，封閉結束后，清除山羊血清，添加將第一抗體[小鼠角蛋白1(AF109)多克隆抗體，純品(MouseKeratinl(AF109)PolyclonalAntibody，Purified)COVANCE制]稀釋500倍的物質通過20分鐘微波處理使抗體反應。用10mMPBS(-)洗滌2次，添加將生物素化第二抗體(生物素化山羊免疫球蛋白M；DAKO制)稀釋300倍的物質，微波處理5分鐘使抗體反應。用10mMPBS(-)洗滌2次，添加ABC試劑(ABC-HRP；Vectastain制)，通過微波處理5分鐘使其反應。顯色試劑使用DAB(3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽DAKO制)，常溫下反應3分30秒。然后，用蘇木素對細胞核、組織全體像進行染色處理，水洗后，根據(jù)公知方法進行脫水、封閉處理。在顯微鏡下觀察皮膚組織的染色狀況。紫外線照射10星期的檢體由于角蛋白1的增加，其表皮細胞主要是細胞核顯色。使用Adobe Photoshop導入圖像，將圖像中一定面積中的染色處用NIH Imaging數(shù)值化。測定的樣品如表7，結果如圖12所示。
求出各組數(shù)值的平均值±S.D.。2組間的顯著性差異檢驗以UV(-)組為標準值1，對各組的平均值進行補正后，實施student t檢驗(student’s t-test)(顯著水平p<0.05)。
攝取Helipyrone A的小鼠的皮膚組織中角蛋白1未增加。角蛋白1作為皮膚的終末分化的標記物而為人所知，通過攝取Helipyrone A，可抑制皮膚的老化現(xiàn)象，具有保持正常皮膚分化狀態(tài)的作用。
表7 處方例以下所示。
[處方例1膠囊劑] 混合下述成分，充填到混合明膠及甘油的膠囊基質中。獲得軟膠囊。
(組成)(配合量；mg) Helipyrone A 70 生育三烯酚 30 蜂蠟 10 葡萄籽油 110 [處方例2片劑] 混合下述成分，壓片，制成片劑。
(組成)(配合量；mg) Helipyrone A 75 纖維素 40 淀粉 20 蔗糖脂肪酸酯 2 [處方例3片劑] 混合下述成分，壓片，制成片劑。
(組成) (配合量；mg) Helipyrone A 75 纖維素40 淀粉 20 蔗糖脂肪酸酯 2 [處方例4果汁] (組成) (配合量；質量％) 果糖葡萄糖液糖5.00 檸檬酸10.40 L—抗壞血酸 0.20 香料 0.02 色素 0.10 Helipyrone A 0.05 水84.33 [處方例5霜劑] 將下述成分(1)～(10)在80℃下加熱溶解成油相。將成分(11)～(13)在70℃加熱溶解成水相。在油相中緩緩加入水相乳化，攪拌的同時冷卻到40℃，進一步攪拌冷卻到30℃，獲得霜劑。
(1)硬脂醇 6.0 (2)硬脂酸 2.0 (3)氫化羊毛脂 4.0 (4)角鯊烷 9.0 (5)辛基十二烷醇10.0 (6)POE(25)十六醇醚 3.0 (7)單硬脂酸甘油酯 2.0 (8)Helipyrone A 0.9 (9)防腐劑 適量 (10)香料 適量 (11)1，3丁二醇 6.0 (12)PEG 1500 4.0 (13)精制水 剩余
權利要求
1.含有通式(1)表示的Helipyrone A的單線態(tài)氧淬滅劑、皮膚老化改善劑、皺紋改善劑、松弛改善劑、皮膚含水量改善劑、美白劑、抑制黑素劑、一氧化氮清除劑或抗氧化劑。
[化1]
通式(1)
2.口服組合物，其含有權利要求1中所述的任何一種藥劑。
3.皮膚外用組合物，其含有權利要求1中所述的任何一種藥劑。
4.食品，其含有權利要求1中所述的任何一種藥劑。
5.醫(yī)藥，其含有權利要求1中所述的任何一種藥劑。
6.化妝料，其含有權利要求1中所述的任何一種藥劑。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了有關Helipyrone A的新型作用，提供作為其有效利用的含有Helipyrone A的單線態(tài)氧淬滅劑、皮膚老化改善劑、皺紋改善劑、松弛改善劑、皮膚含水量改善劑、美白劑、抑制黑素劑、一氧化氮清除劑或抗氧化劑。
文檔編號A61P43/00GK101389327SQ20078000657
公開日2009年3月18日 申請日期2007年4月20日 優(yōu)先權日2006年4月25日
發(fā)明者金辰也 申請人:株式會社芳珂