專利名稱：：用于預防或治療fxr介導的疾病或狀態(tài)的作為fxr配體的膽汁酸衍生物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及可用于治療膽汁淤積疾病的法尼酯X受體(FarnesoidXreceptors,FXR)調(diào)節(jié)劑，尤其涉及膽汁酸中的(324羧基轉(zhuǎn)化為酰氨基、脲基或疏脲基的膽汁酸衍生物。
背景技術：
：法尼酯X受體(FXR)是最初從大鼠肝的cDNA文庫中鑒定得到的孤兒核受體(BM.Forman等，Ce〃81:687-693(1995))，其與昆蟲蛻皮激素受體最為密切相關。FXR為包括類固醇、類維生素A及曱狀腺激素類受體的配體活化轉(zhuǎn)錄因子的細胞核受體家族中的一員(D丄Mangelsdorf等，CW/83:841-850(1995))。RNA印跡及原位分析表明，F(xiàn)XR在肝、腸、腎及腎上腺最大量地表達(BM.Forman等，CW/81:687-693(1995)和W.Seol等，嵐五油cn'畫/.9:72-85(1995))。FXR和9-順式視黃酸受體(RXR)—起作為異源二聚體結合DNA。FXR/RXR異源二聚體優(yōu)先地結合由具有共有序列AG(G/T)TCA的兩個細胞核受體半位點組成的應答元件，其中兩個共有序列構成反向重復并被單一核苷酸分隔(IR-1基序)(BM.Forman等，Ce〃81:687_693(l"5))。一份早期的報告表明，大鼠FXR被樣i摩爾濃度的法尼酯類如法尼醇和保幼激素激活(BM.Forman等，CW/81:687-693(1995))。然而，這些化合物不能激活小鼠及人類FXR，這使得內(nèi)源性的FXR配體的性質(zhì)仍然不清楚。一些天然存在的膽汁酸在生理濃度下結合并激活FXR(PCTW000/37077，(2000年06月29日出版))。在其中討論的作為FXR配體的膽汁酸包括鵝脫氧膽酸(CDCA)、脫氧膽酸(DCA)、石膽酸(LCA)及這些月旦汁酸的牛磺酸、甘氨酸偶聯(lián)物。膽汁酸為膽固醇代謝物，其形成于肝并分泌到腸的十二指腸中，在十二指腸中對于飲食中的脂質(zhì)與維生素的溶解與吸收發(fā)揮重要的作用。大部分膽汁酸(~95%)隨后在回腸,皮再吸收并通過腸肝循環(huán)系統(tǒng)返回到肝臟。肝臟中膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化受反饋調(diào)節(jié)膽汁酸下調(diào)細胞色素P4507a(CYP7a)基因的轉(zhuǎn)錄，CYP7a基因編碼催化膽汁酸生物合成中的限速步驟的酶。有數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)XR參與膽汁酸對CYP7a表達的抑制，雖然確切的機制還不清楚(DW.Russell，CW/97:539-542(1999))。在回腸，膽汁酸誘導腸膽汁酸結合蛋白(IBABP)的表達，IBABP為一種以高親和力結合膽汁酸并可能參與它們的細胞攝取與運輸?shù)陌麧{蛋白?，F(xiàn)已有兩個小組證明，膽汁酸通過FXR的激活調(diào)節(jié)它們對于IBABP表達的作用，F(xiàn)XR結合在人、大鼠及小鼠的IBABP基因啟動子(14;17)中保守的IR-1型應答元件。因此，F(xiàn)XR參與涉及膽汁酸與膽固醇的體內(nèi)平衡的靶基因的刺激(IBABP)和抑制(CYP7a)。EP1392714公開了作為FXR激動劑的3"，70-二羥基-60^乙基-5(3-膽烷-24-酸(下文也稱為6-乙基-鵝脫氧膽酸，6-EDAC)及其溶劑合物和氨基酸偶聯(lián)物，它們可用于制備預防或治療FXR介導的疾病或狀態(tài)的藥物。EP1568796公開了作為FXR激動劑的6-乙基-熊去氧膽酸(6-EUDCA)衍生物及其在預防或治療FXR介導的疾病或狀態(tài)的用途。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了通式(I)的化合物及其藥物可接受的鹽、溶劑合物或氨基酸偶聯(lián)物:其中，R,為氬或烷基；R2為氫或卣素、硝基、烷氧基、氨基或羧基；Y為亞曱基、氧或硫；n為l-4的整數(shù)。另一方面，本發(fā)明提供了式(I)的化合物，其中，R^及R2為氬，Y為氧，n為l(式Ia)。另一方面，本發(fā)明提供了一種預防或治療哺乳動物的FXR介導的疾病或狀態(tài)的方法，該方法包括給患FXR介導的疾病或狀態(tài)的哺乳動物施用治療有效量的式(I)或(Ia)的化合物。本發(fā)明還提供了式(I)或(Ia)的化合物用于制備預防或治療FXR介導的疾病或狀態(tài)的藥物的用途。在某些實施方式中，F(xiàn)XR介導的疾病或狀態(tài)為肝病或狀態(tài)、胃腸疾病或狀態(tài)、腎病或狀態(tài)、心血管疾病或狀態(tài)或代謝疾病或狀態(tài)。在某些實施方式中，肝病或狀態(tài)為原發(fā)性膽汁肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、藥物誘發(fā)的膽汁淤積、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、腸胃外營養(yǎng)相關性膽汁淤積(PNAC)、細菌過度生長或敗血癥相關的膽汁淤積、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、移植物抗宿主病、移植肝再生、先天性肝纖維化、膽總管結石病、肉芽腫肝病、肝內(nèi)或肝外惡性腫瘤、干燥綜合癥、結節(jié)病、肝豆狀核變性病、葡糖腦苷脂沉積病、血色素沉著病或a廣抗胰蛋白酶缺乏癥。在某些實施方式中，胃腸疾病或狀態(tài)為炎癥性腸病(IBD)(包括局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎)、腸易激綜合征(IBS)、細菌過度生長、吸收障石爭、放射后結腸炎或顯微鏡性結腸炎。在某些實施方式中，腎病或狀態(tài)為糖尿病性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)、高血壓性腎硬化、慢性腎小球腎炎、慢性移植腎小球病、慢性間質(zhì)性腎炎或多嚢腎病。在某些實施方式中，心血管疾病或狀態(tài)為動脈粥樣硬化、動脈硬化、血脂異常、高膽固醇血癥或高甘油三酯血癥。在某些實施方式中，代謝疾病或狀態(tài)為胰島素抵抗、糖尿病或肥胖。另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物制劑，包含式(I)或(Ia)的化合物，及藥物可接受的載體或稀釋劑。本發(fā)明還提供了包含與藥物可接受的載體和/或稀釋劑混合的式(I)或(Ia)的化合物的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供了放射標記的式(I)或(Ia)的化合物。在另一實施方式中，式(I)或(Ia)的化合物為用氚標記的。附圖簡要說明圖l顯示了化合物Ia對于選擇的基因的作用效果。人類肝細胞林HepG2用于這些研究。細胞與IO(iM的CDCA、6-ECDCA及化合物(Ia)接觸18小時，并通過qRT-PCR測量CYP7Al、SHP、BSEP、SREPB-1C及FAS的表達。本圖報告了顯示出同樣模式的4個實驗中的1個的結果。發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及通式(I)的化合物及其藥物可接受的鹽、溶劑合物或氨基酸偶聯(lián)物其中，R,為氬或烷基；R2為氫或卣素、硝基、烷氧基、氨基或羧基；Y為亞甲基、氧或硫；n為l-4的整數(shù)。本申請的目的中，"烷基"意味著含有l(wèi)-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基鏈，"卣素"意味著選自氟、氯、溴和碘的鹵素原子。本發(fā)明的合適的藥物可接受的鹽可由本領域技術人員容易地確定，且包括，例如堿鹽，如由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉及鋅制成的金屬鹽，或由N,N'-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡曱胺(N-甲基葡萄糖胺)及普魯卡因制成的有機鹽。式(I)化合物的這些鹽可以用常規(guī)技術由式(I)的化合物來制備，例如將式(I)的化合物與適當?shù)膲A反應。當用于藥物時，式(I)化合物的鹽應該是藥物可接受的，但是藥物不可接受的鹽可以便利地用于制備相應的游離堿或其藥物可接受的鹽。這里所用的術語"溶劑合物"為包含式(I)化合物或其藥物可接受的鹽及化學計算量的或非化學計算量的溶劑的結晶形式。溶劑，舉例來說，包括水、甲醇、乙醇或乙酸。在下文，提及式(I)的化合物，是指該化合物的任何物理形態(tài)，除非特別指明為其特定的形態(tài)、鹽或'溶劑合物。這里所用的術語"氨基酸偶聯(lián)物"，是指式(I)化合物與任何合適的氨基酸的偶聯(lián)物。優(yōu)選地，這種合適的式(I)化合物的氨基酸偶聯(lián)物具有額外的增加在膽汁或腸液中的穩(wěn)定性的優(yōu)勢。合適的氨基酸包括但不限于甘氨酸和?；撬帷１景l(fā)明的化合物能夠通過有機合成領域所熟知的方法制備得到。其中Y為亞曱基的式(I)的化合物可通過將鵝脫氧膽酸(II)的C24羧基轉(zhuǎn)化為氨基，然后將此氨基衍生物與活化的式(III)羧酸反應制備得到，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中，x為羧基活化基團。其中Y為氧或硫的式(I)的化合物可通過將鵝脫氧膽酸(II)的C24羧基轉(zhuǎn)化為異氰酸酯基，然后將此異氰酸酯衍生物與合適的式(IV)的醇或硫醇反應制備得到，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中，Y為氧或碌"該合成途徑下文簡要地概述，并以式(Ia)的化合物(其中，R,及R2為氫，Y為氧，及n為l)的反應路線l來圖示說明，這是本發(fā)明最優(yōu)選的實施方式。3a，7oc-二甲?；?鵝脫氧膽酸(CDCA)(V)按照Goto,J.等CA綴尸/z畫.M/.1979,27，1402-141l報道的方法獲得，通過先用乙二酰氯、再用疊氮化鈉水溶液處理而經(jīng)由酰氯中間體轉(zhuǎn)化為相應的酰基疊氮化合物。粗的酰基疊氮混合物然后通過庫爾提斯重排反應轉(zhuǎn)化為相應的異氰酸酯(VI)。中間體(VI)然后與肉桂醇(或另一種合適的醇IV)反應，得到3a，7a-雙保護的CDCA氨基甲酸酯類似物，其經(jīng)堿水解后，給出預期的化合物(Ia)。反應路線l如在實驗部分所詳細解釋的，在無細胞試驗中及利用人肝細胞抹測試化合物(Ia)。該化合物(Ia)顯示，在激活FXR方面比鵝脫氧膽酸(CDCA)強大約20倍，并且產(chǎn)生FXR調(diào)控的基因及膽汁酸轉(zhuǎn)運子一BSEP(膽鹽輸出泵)一13倍的誘導。與如CDCA的天然的FXR配體相反，化合物(Ia)并不會誘導'j、異源二聚體伴侶(SHP，缺乏DNA結合功能域的非典型核受體)，且對于SREPB-lc及脂肪酸合酶(FAS)沒有作用，因而表明本發(fā)明的化合物引起的FXR的激活使得能夠選"t奪性地調(diào)節(jié)參與膽汁酸分泌的基因，而對于涉及脂質(zhì)、膽固醇及葡萄糖代謝的基因無作用。因此，式(I)化合物作為膽汁酸轉(zhuǎn)運子BSEP的選擇性調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用，且在沒有誘導SHP的情況下增加肝臟中膽汁酸的流量；由于這個原因，它們能夠用于預防或治療FXR介導的疾病或狀態(tài)，包括肝病或狀態(tài)(涉及膽汁淤積、脂肪變性、炎癥、纖維化及肝硬化中的一種或多種)、胃腸疾病或狀態(tài)、腎病或狀態(tài)、心血管疾病或狀態(tài)及4戈i射疾病或狀態(tài)。可以使用式(I)的化合物預防或治療的肝病或狀態(tài)包括但不限于原發(fā)性膽汁肝硬化(PBC),原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC),藥物誘發(fā)的膽汁淤積，妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥，腸胃外營養(yǎng)相關性膽汁淤積(PNAC),細菌過度生長或敗血癥相關的膽汁淤積，自身免疫性肝炎，病毒性肝炎，酒精性肝病，非酒精性脂肪肝病(NAFLD),非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，移植物抗宿主病，移植肝再生，先天性肝纖維化，膽總管結石病，肉芽腫肝病，肝內(nèi)或肝外惡性腫瘤，干燥綜合癥，結節(jié)病，肝豆狀核變性病，葡糖腦普脂沉積病，血色素沉著病及a,-抗胰蛋白酶缺乏癥?？梢証f吏用式(I)的化合物預防或治療的胃腸疾病或狀態(tài)包括但不限于炎癥性腸病(IBD)(包括局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎)、腸易激綜合征(IBS)、細菌過度生長、吸收障礙、放射后結腸炎及顯微鏡性結腸炎?？梢阅虿⌒阅I病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)、高血壓性腎硬化、慢性腎小球腎炎、慢性移植腎小球病、慢性間質(zhì)性腎炎及多嚢腎病。可以使用式(I)的化合物預防或治療的心血管疾病或狀態(tài)包括但不限于動脈粥樣硬化、動脈硬化、血脂異常、高膽固醇血癥及高甘油三酯血癥?？梢允褂檬?I)的化合物預防或治療的代謝疾病或狀態(tài)包括但不限于胰島素抵抗、糖尿病及肥胖。本發(fā)明的方法包括施用治療有效量的式(I)化合物的步驟。這里所用的術語"治療有效量"，是指足夠產(chǎn)生規(guī)定效果的式(I)化合物的量。因此，用于預防或治療FXR介導的疾病或狀態(tài)的方法中的式(I)化合物的治療有效量，是足夠預防或治療FXR介導的疾病或狀態(tài)的量。所以，例如，用于預防或治療膽汁淤積肝病或增加膽汁流量的方法中的式(I)化合物的治療有效量，是足夠增加膽汁向腸的流量的量。產(chǎn)生預期的生物效應所需的式(I)化合物的量取決于諸如預期的用途、施用方法和接受者的許多因素，且最終由負責的醫(yī)師或獸醫(yī)來判斷。一般地，治療FXR介導的疾病和狀態(tài)的典型日劑量可以預期為在例如大約0.01-大約100mg/kg的范圍內(nèi)。這個劑量可以以單一的單位劑量或幾個獨立的單位劑量或者通過連續(xù)輸注施用。所以，另外一方面，本發(fā)明提供了包括作為活性成分的式(I)化合物及至少一種藥用的載體或稀釋劑，和/或式(I)的化合物與至少一種藥用的載體或稀釋劑混合的藥物組合物。這些藥物組合物可用于預防和治療前述的疾病或狀態(tài)。載體必須是藥物可接受的，而且必須與組合物中的其他成分相容，即對于組合物中的其他成分不具有有害作用。載體可以為固體或液體，且優(yōu)選配制成單位劑量制劑，例如，可能含有0.05-95重量%的活性成分的片劑。如果需要，其它生理活性成分也可以加入本發(fā)明的藥物組合物中?？赡艿闹苿┌切┻m于口服、舌下、口腔、腸胃外(例如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))、直腸、包括經(jīng)皮的局部給藥、鼻內(nèi)和吸入施用的制劑。對于一個特定的病人，最適合的施用方式將取決于需治療疾病或狀態(tài)的性質(zhì)和嚴重程度或所用治療方法的性質(zhì)及取決于活性化合物的性質(zhì)，但是可能的話，口服給藥對于預防和治療FXR介導的疾病和狀態(tài)是優(yōu)選的。適于口服給藥的制劑可以形成非連續(xù)的單元，如各含有預定量的活性化合物的片劑、膠嚢劑、扁嚢劑、錠劑，形成粉劑或顆粒劑，形成水性的或非水性液體的溶液或懸浮液，或形成水包油或油包水型乳液。適于舌下或口腔給藥的制劑包括，含有活性化合物及通常含有如糖、阿拉伯膠或黃耆膠的調(diào)味基質(zhì)的錠劑，和在如明膠和甘油或蔗糖阿拉伯膠的惰性基質(zhì)中含有活性化合物的軟錠劑。適于腸胃外給藥的制劑通常包括含有預定濃度的活性化合物的無菌水溶液，該溶液優(yōu)選與預定接受者的血液等滲。適于腸胃外給藥的其它制劑包括含有生理上適合的助溶劑和/或絡合劑(如表面活性劑和環(huán)糊精)的制劑。水包油型乳液也是適于腸胃外給藥的制劑。盡管這些溶液優(yōu)選靜脈給藥，它們也可以通過皮下或肌內(nèi)注射給藥。適于直腸給藥的制劑優(yōu)選形成為在一個或多個形成栓劑基質(zhì)的固體載體(如可可脂)中含有活性成分的單位劑量的栓劑。適于局部或鼻內(nèi)給藥的制劑包括軟膏劑、乳劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑和油劑。適于這些制劑的載體包括凡士林油、羊毛脂、聚乙二醇、醇類及其組合。本發(fā)明的制劑可通過任何合適的方法制備，典型地通過按所需的比例將活性化合物與液體或細碎的固體載體或與這二者均一地、密切地混合，然后，如果需要的話，將產(chǎn)生的混合物形成所需的形狀。例如，片劑可以通過壓制含有活性成分的粉末或顆粒及一種或多種任選的如粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑或表面活性分散劑的成分的密切混合物，或模制粉狀活性成分和惰性液體稀釋劑的密切混合物獲得。適于吸入給藥的制劑包括可由各種類型的定量的加壓按鈕式噴霧器、霧化器或吹入器產(chǎn)生的細小顆粒粉塵或噴霧。對于通過口腔的肺部給藥來說，粉末或小滴的粒徑范圍典型地在0.5-10[im，優(yōu)選l-5|am,以確保藥物輸送到支氣管樹。對于鼻內(nèi)給藥來說，粒徑范圍優(yōu)選10-500]Lim，以確保藥物保留在鼻腔中。定量吸入器為典型地在液化推進劑中含有活性成分的懸浮液或溶液制劑的加壓噴霧器。在使用時，這些設備通過適于輸送定量體積(通常為10-150^1)的閥釋放制劑，以產(chǎn)生含有活性成分的微粒噴霧。合適的推進劑包括某些氯氟烴化合物，如二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷及其混合物。制劑還可以含有一種或多種助溶劑(例如乙醇)，表面活性劑(如油酸或脫水山梨糖醇三油酸酯)，抗氧化劑及合適的調(diào)味劑。霧化器為可商購的設備，其通過使壓縮氣體(典型地為空氣或氧氣)經(jīng)窄的文氏噴管加速或通過超聲攪拌將活性成分的溶液或懸浮液轉(zhuǎn)化為治療的氣溶膠薄霧。適用于霧化器的制劑由分散于液體載體中且占到制劑的最多40重量％,優(yōu)選低于20重量％的活性成分組成。載體典型地為水或稀釋的含水醇溶液，優(yōu)選通過加入例如氯化鈉使而其與體液等滲。任選的添加劑包括如羥基苯曱酸曱酯的防腐劑(如果制劑不是無菌制備的)、抗氧化劑、調(diào)味劑、揮發(fā)油、緩沖劑及表面活性劑。適于通過吹入法給藥的制劑包括可以通過吹入器輸送或以鼻吸入的方式進入鼻腔的細細粉碎的粉末。在吹入器中，粉末包含于典型地由明膠或塑料制成的嚢或藥筒中，嚢或藥筒在原位穿通或打開，且粉末通過吸入時吸？I流過裝置的空氣輸送或借助于手動泵輸送。吹入器所用的粉末或者由單獨的活性成分組成，或由含有活性成分、適當?shù)娜缛樘堑姆勰┫♂寗┘叭芜x的表面活性劑的粉末混合物組成。活性成分典型地占制劑的0.1-100w/w。除上面特別提到的成分之外，本發(fā)明的制劑可能包括藥學領域的技術人員已知的其它試劑，與涉及的制劑的類型有關。例如，適于口服給藥的制劑可能包括調(diào)味劑，而適于鼻內(nèi)給藥的制劑可能包括香料。因而，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了式(I)的化合物在制備預防或治療FXR介導的疾病或狀態(tài)的藥物中的用途。本發(fā)明的方法一般用于哺乳動物的治療，一般且尤其用于人類。下文的實驗部分將更詳細地舉例說明本發(fā)明。實施例化學性質(zhì)熔點使用Buchi535電熱裝置測定，且不進4亍才交正。使用BrukerAC200MHz或400MHz光譜儀測定NMR譜，化學位移以百萬分率(ppm)表示。所用的縮寫如下s,單峰；bs,寬單峰；d，雙峰；dd,雙雙峰；m,多重峰。用JascoDip-360數(shù)字旋光儀測定比旋光度。使用Merck硅膠60(0.040-0.063mm)進行快速柱層析。使用以硅膠60F-254(Merck)預涂覆的薄層層析板進行薄層層析。通過使用磷鉬酸鹽試劑(5%乙醇溶液)染色和加熱來目測斑點。所有反應在氮氣氛中進行。3a，7ot-二甲酰氧基-5卩-膽烷-24-酸(V)的合成將CDCA(II)(15.0g,38.27mmol)溶于83ml四氫呋喃，并用18滴70%HC104處理。然后在40分鐘內(nèi)逐滴加入曱酸(50ml)，獲得的混合物在54。C反應8小時。然后在真空下濃縮混合物，并將殘余物放于水中。過濾白色沉淀物，用水洗幾遍，于5。C在水中研磨20分鐘，并于高真空下干燥獲得16.5g(36.83mmol,96%)純化合物(V)。'H-NMR(CDC13)5:0.54(s,3H,18-CH3),0.80-0.84(6H,19-CH3和21-CH3)，2.24-2.57(m,2H，23-CH2),4.52-4.76(m,1H，3畫CH),4.91(m,1H,7-CH)，7.92(s，1H，CHO),7.97(s，1H,CHO)。化合物(VI)的合成用乙二酰氯(7.0ml)處理3a,7a-二曱酰氧基-5(3-膽烷-24-酸(V)(6.0g，13.37mmol),并于35。C在氮氣氛中反應3小時。通過蒸發(fā)去除乙二酰氯產(chǎn)生相應的酰氯，它可溶于無水丙酮(50ml)。將NaN3(5.2g，80.25mmol)溶于水(25ml)的溶液在0-5。C加入上述溶液中，產(chǎn)生的反應混合物在同樣的溫度下再攪拌3小時。去除溶劑，將殘余物倒入冷水(100ml)中，并用乙醚(3x100ml)萃取。將合并的有機相用無水Na2S04干燥，濃縮得到相應的酰疊氮化合物(IR:2134和2267cm—。。然后將產(chǎn)生的酰疊氮化合物中間體在無水甲苯(60ml)中回流5小時。在真空下濃縮混合物，產(chǎn)生5.1g異氰酸酯衍生物3(11.37mmol,85%，IR:2271cm"),該產(chǎn)物不經(jīng)純化用于下一步。23-N-肉桂氧羰基-3a,7a-二羥基-5P-降膽烷胺(Ia)的合成異氰酸酯(VI)(5.0g,11.25ml)溶于無水曱苯(25ml)，然后于卯。C在氮氣氛下與肉桂醇(1.2當量)反應。用薄層色譜(TLC)檢測反應終點。然后將反應混合物倒入水(50ml)中，分離有機相，并用乙酸乙酯(3x25ml)萃取水相。將合并的有機相用鹽水洗，干燥(Na2S04)，過濾并真空濃縮。然后將粗的23-:^羧基-3a，7ot-二甲酰氧基-5p-降膽烷胺衍生物用飽和的K2C03曱醇溶液(25ml)在室溫下處理過夜。蒸發(fā)溶劑后，殘余物溶于水(35ml),用2NHC1酸化，并用二氯曱烷(3x25ml)萃取。將合并的有機萃取物用無水Na2S04干燥，過濾，真空濃縮，并以二氯曱烷/甲醇混合物作為洗脫劑，經(jīng)硅膠快速色譜純化，以好的收率(72%)產(chǎn)生預期化合物(Ia)。mp:79-84。C。'H畫NMR(CDC13)S:0.67(s，3H，18-CH3)，0.92(s，3H，19-CH3)，0.98-0.99(d，3H,21-CH3),3.09-3,22(m,1H，23-CH2),3.23-3.31(m,1H,23-CH2),3.46-3.57(m,1H,3-CH)，3.86(s，1H,7-CH)，4.73-4.74(d，2H,-OC//2CH),6.28-6.35(m,1H,-OCH2C//)，6.63-6.68(d，1H,-C//Ph),7.25-7.41(m,5H,Ph).13C-NMR(CDC13)S:11,64，18.52,20.46，22.66,23.58，28.24，30.50,32.73，33.67，34.47,34.94,35.21，36.08,38.59,39.30，39.51，39.70，41.36，42.62,50.34，55.91,65.20，68.41,71.92,123.96,126.49,127.83，128.46，133.47，136.28,153.43.生物活性首先，進行試驗證明與鵝脫氧膽酸(CDCA)相比，化合物(la)是否調(diào)節(jié)FXR調(diào)控的基因。CDCA為作為法尼酯X受體(FXR;NR1H4)的內(nèi)源性配體發(fā)揮作用主要膽汁酸。首先使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術經(jīng)體外試驗測試化合物(la)對于FXR活性的生物活性。該技術(無細胞試驗)在PellicciariR.等，JMedChem.200215;45:3569-72中有描述。在使用FRET的無細胞試驗中，在化合物(la)的濃度幾乎低于天然的FXR配體CDCA所需的濃度20倍時，F(xiàn)XR的一種共激活因子Scr-l的募集出現(xiàn)。表l使用FRET測量的化合物(la)對于人類FXR的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>1SCR1肽對FXR的相對募集率，其中，CDCA=100%。所有數(shù)據(jù)為均值士標準誤，n=4。另外，以使用人肝細胞林(HepG2)的細胞試驗來判斷化合物Ia)是否調(diào)節(jié)FXR調(diào)控的基因。在使用HepG2細胞抹的細胞轉(zhuǎn)染試驗中，化合物(Ia)證明是一種有效的FXR配體。接觸lnM化合物(la)的HepG2細胞反式激活FXR。在使用以攜帶FXR基因的病毒構建體或其它克隆到熒光素酶基因上游的細胞核受體轉(zhuǎn)染的肝細胞的其它試驗中，發(fā)現(xiàn)化合物(Ia)在小鼠、大鼠及人類肝細胞中作為一種選擇性的FXR配體發(fā)揮作用。對于這些方法的詳細描述見于以下文獻FiomcciS.等Gastroenterology2004。在HepG2細胞中化合物(Ia)對于FXR靶基因表達的調(diào)控為了確定化合物(Ia)是否為FXR調(diào)節(jié)劑并表現(xiàn)出有差別的活性，用人HepG2細胞接觸化合物(Ia)，CDCA(天然的FXR配體)及其6-乙基衍生物6-ECDCA,其為有效的FXR配體。然后用定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)測定這些配體對于FXR響應基因的作用。盡管與這些配體中的任何一個接觸都沒有觀察到直接的細胞毒性，但是，HepG2細胞接觸CDCA及其6-ECDCA衍生物產(chǎn)生了2-3倍SHP(一種FXR調(diào)控的基因)誘導。相反，盡管化合物(Ia)為FXR配體(見上)，但它未刺激SHP的表達。所有測試的FXR配體，即CDCA、6-ECDCA和化合物(Ia)，對于CYP7ocl產(chǎn)生了相同的作用(所有的試劑導致CYP7cdmRNA的表達減少60-700/0)。另夕卜，接觸化合物(Ia)對于BSEPmRNA的表達產(chǎn)生了有效的誘導(大約13倍誘導)?；衔?Ia)的這種效應明顯要比其它FXR配體顯著得多。而且，同與其它配體類似，與化合物(Ia)的接觸使得對于SREPB-ic及FASmRNA的表達產(chǎn)生了類似的抑制活性?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，化合物(Ia)為作為有效的FXR配體發(fā)揮作用的FXR調(diào)節(jié)劑，且出乎意料地改變了FXR調(diào)控的基因，從而引起膽汁酸轉(zhuǎn)運子(如BSEP)的明顯誘導，而沒有誘導SHP。另外，化合物(Ia)抑制了Cyp7al(—種重要地參與從膽固醇合成膽汁酸的過程的基因)的表達。這些FXR耙基因的調(diào)控證明化合物(Ia)為一種基因選擇性的FXR配體，它可以抑制通過經(jīng)典途徑的膽汁酸的生物合成，同時增加肝細胞分泌膽汁酸，而沒有介入SHP的表達。這種效應是令人滿意的，因為它使得這些FXR配體的藥理活性變窄，且可以阻止通常與SHP誘導相關的代謝活化。這些試驗的結果總結于表2，且圖示于圖l中。表2化合物(Ia)的體外藥理學研究<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權利要求1.式(I)化合物及其藥物可接受的鹽、溶劑合物或氨基酸偶聯(lián)物，其中R1為氫或烷基；R2為氫或鹵素、硝基、烷氧基、氨基或羧基；Y為CH2、氧或硫；及n為1-4的整數(shù)。2.式(I)的化合物，其中，R,及R2為氫，Y為氧，及n為l。3.預防或治療哺乳動物的FXR介導的疾病或狀態(tài)的方法，包括給患FXR介導的疾病或狀態(tài)的哺乳動物施用治療有效量的權利要求1或2的化合物。4.按照權利要求3的方法，其中，所述FXR介導的疾病或狀態(tài)選自肝病或狀態(tài)、胃腸疾病或狀態(tài)、腎病或狀態(tài)、心血管疾病或狀態(tài)及代謝疾病或狀態(tài)。5.按照權利要求4的方法，其中，所述肝病或狀態(tài)選自原發(fā)性膽汁肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、藥物誘發(fā)的膽汁淤積、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、腸胃外營養(yǎng)相關性膽汁淤積(PNAC)、細菌過度生長或敗血癥相關的膽汁淤積、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、移植物抗宿主病、移植肝再生、先天性肝纖維化、膽總管結石病、肉芽腫肝病、肝內(nèi)或肝外惡性腫瘤、干燥綜合癥、結節(jié)病、肝豆狀核變性病、葡糖腦苷脂沉積病、血色素沉著病和a廠抗胰蛋白酶缺乏癥。6.按照權利要求4的方法，其中，所述胃腸疾病或狀態(tài)選自炎癥性腸病(IBD)、腸易激綜合征(IBS)、細菌過度生長、吸收障礙、放射后結腸炎及顯微鏡性結腸炎。7.按照權利要求4的方法，其中，所述腎病或狀態(tài)選自糖尿病性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)、高血壓性腎硬化、慢性腎小球腎炎、慢性移植腎小球病、慢性間質(zhì)性腎炎及多嚢腎病。8.按照權利要求4的方法，其中，所述心血管疾病或狀態(tài)選自動脈粥樣硬化、動脈硬化、血脂異常、高膽固醇血癥及高甘油三酯血癥。9.按照權利要求4的方法，其中，所述代謝疾病或狀態(tài)選自胰島素抵抗、糖尿病及肥胖。10.—種藥物制劑，包含權利要求1或2的化合物及藥物可接受的載體或稀釋劑。11.權利要求1或2的化合物，其中，所述的化合物為放射標記的。12.權利要求ll的化合物，其中，所述的化合物為用氚標記的。13.權利要求1或2的化合物用于制備預防或治療FXR介導的疾病或狀態(tài)的藥物組合物的用途。14.權利要求1或2的化合物用于制備預防或治療FXR介導的疾病的藥物組合物的用途，所述FXR介導的疾病選自肝病或狀態(tài)、胃腸疾病或狀態(tài)、腎病或狀態(tài)、心血管疾病或狀態(tài)及^j射疾病或狀態(tài)。15.權利要求1或2的化合物用于制備預防或治療肝病或狀態(tài)的藥物組合物的用途，所述肝病或狀態(tài)選自原發(fā)性膽汁肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、藥物誘發(fā)的膽汁淤積、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、腸胃外營養(yǎng)相關性膽汁淤積(PNAC)、細菌過度生長或敗血癥相關的膽汁淤積、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、移植物抗宿主病、移植肝再生、先天性肝纖維化、膽總管結石病、肉芽肺肝病、肝內(nèi)或肝外惡性胂瘤、千燥綜合癥、結節(jié)病、肝豆狀核變性病、葡糖腦苷脂沉積病、血色素沉著病及a,-抗胰蛋白酶缺乏癥。16.權利要求1或2的化合物用于制備預防或治療胃腸疾病或狀態(tài)的藥物組合物的用途，所述胃腸疾病或狀態(tài)選自炎癥性腸病(IBD)、腸易激綜合征(IBS)、細菌過度生長、吸收障礙、放射后結腸炎及顯微鏡性結腸炎。17.權利要求1或2的化合物用于制備預防或治療腎病或狀態(tài)的藥物組合物的用途，所述腎病或狀態(tài)選自糖尿病性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)、高血壓性腎硬化、慢性腎小球腎炎、慢性移植腎小球病、慢性間質(zhì)性腎炎及多嚢腎病。18.權利要求1或2的化合物用于制備預防或治療心血管疾病或狀態(tài)的藥物組合物的用途，所述心血管疾病或狀態(tài)選自動脈粥樣硬化、動脈硬化、血脂異常、高膽固醇血癥及高甘油三酯血癥。19.權利要求1或2的化合物用于制備預防或治療代謝疾病或狀態(tài)的藥物組合物的用途，所述代謝疾病或狀態(tài)選自胰島素抵抗、糖尿病及肥胖。20.含有與藥物可接受的載體和/或稀釋劑混合的權利要求1或2的化合物的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療FXR介導的疾病或狀態(tài)的式(I)化合物及其藥物可接受的鹽、溶劑合物或氨基酸偶聯(lián)物，其中，R₁為氫或烷基；R₂為氫或鹵素、硝基、烷氧基、氨基或羧基；Y為CH₂、氧或硫；n為1-4的整數(shù)。文檔編號A61K31/56GK101395170SQ200780007338公開日2009年3月25日申請日期2007年2月14日優(yōu)先權日2006年2月14日發(fā)明者M·普魯贊斯基,R·佩爾利克西亞里,S·菲奧魯西申請人:英特塞普特藥品公司