專利名稱：用丹參酮抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及炎癥治療。更具體地，本發(fā)明涉及丹參酮和丹參 酮衍生物抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的用途。
(2) 相關(guān)技術(shù)描述
"重癥膿毒癥，，是一種以器官功能失調(diào)為征兆定義的綜合征，所 述征兆包括體溫、心率、呼吸頻率和白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常。盡管目前在抗 生素療法和重癥監(jiān)護(hù)方面的進(jìn)步，膿毒癥仍然是重癥監(jiān)護(hù)病房中最常 見的死亡原因，聲稱每年僅美國約有225000名受害者。膿毒癥的發(fā)病 機(jī)理至少部分歸因于失調(diào)的全身性炎癥反應(yīng)，其特征在于各種促炎介 質(zhì)例如腫瘤壞死因子(TNF) (Tracey等人 1987)、白介素
(IL)-l (Dinarello和Thompson 1991)、干擾素(IFN)-y (Heinzel 1990)、 一氧化氮(Dinapoli等人1996)和巨噬遷移抑制因子
(MIF) (Calandra等人2000; Hotchkiss和Kar 1 2003; Riedemann等 人2003b)的過度積累。
一種遍在蛋白，高遷移組盒1 (HMGB1)由活化的巨噬細(xì)胞/單核細(xì)
胞釋放(Chen等人2004; Rendon-Mitchell等人2003; Tang等人 2006; Wang等人1999)，并作為致死性內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的晚期介 質(zhì)發(fā)揮作用(Wang等人1999; Wang等人2004b; Wang等人2004c; Yang等人2004)。在內(nèi)毒素血癥和膿毒癥小鼠(Wang等人1999; Yang 等人2004)和患有膿毒癥的病人(Wang等人1999)體內(nèi)循環(huán)的HMGB1 水平以延遲的方式升高(16-32小時(shí)后)。給小鼠施用重組的HMGBl后 扼要再現(xiàn)了膿毒癥的許多臨床征兆，包括發(fā)燒(O'Connor等人2003)、 腸道屏障功能擾亂(Sappington等人2002)、組織損害(Abraham等人 2000)、和多器官衰竭(Wang等人1999)。施用抗-HMGBl抗體或抑制 劑(例如，丙酮酸乙酯、尼古丁或硬脂酰基溶血磷脂酰膽堿)顯著地保 護(hù)小鼠免于LPS-誘導(dǎo)的急性組織損傷(Abraham等人2000; Ueno等人 2004)，和致死性內(nèi)毒素血癥(Chen等人2005; Wang等人1999; Wang 等人2004b; Wang等人2004a)。特別地，甚至在膿毒癥發(fā)作后24小 時(shí)首次給藥時(shí)這些抗-HMGB1試劑仍能挽救致死性試驗(yàn)性膿毒癥的小 鼠(Qin等人2006; Ulloa等人2002; Wang等人2004b; Yang等人 2004),表明HMGBl-靶向的治療方案具有較寬的時(shí)間窗。因此，那些 已經(jīng)證實(shí)為臨床安全、并還能減弱HMGB1釋放的試劑可能在預(yù)防和治 療炎癥疾病方面具有潛力。
貫穿人類歷史，草藥已經(jīng)形成各種炎性疾病民間藥物的基礎(chǔ)。在 公元前第5世紀(jì)希臘醫(yī)生(希波克拉底)記載了使用柳樹皮提取物來減 輕疼痛和發(fā)熱，隨后水楊酸作為減輕疼痛/發(fā)熱的活性成分的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致 了第一個(gè)合成的非-甾族抗炎藥(NSAID)—阿司匹林，以及制藥工業(yè)的 產(chǎn)生。在數(shù)千種中草藥中，只有少數(shù)命名為"參"[例如，人參(ginsen)、 丹參(Salvia miltiorrhiza)]。丹參指一種草藥(稱為"參")，其包
含具有主要醫(yī)學(xué)價(jià)值的物質(zhì)(稱為"丹"，朱砂)，并且在中國被廣泛 用于心血管障礙的患者(Ji等人2000)。其有益作用歸因于幾種紅顏 料，包括丹參酮1、11、IV和隱丹參酮(Wu等人1993; Yagi等人1994), 它們表現(xiàn)出不同的抗炎性質(zhì)(Jang等人2003; Kang等人2000; Kim 等人2002)。
幾個(gè)方面的證據(jù)表明許多丹參成分(例如丹參酮I、 II和iv)具有 一些抗炎活性(Jang等人2003; Kang等人2000; Kim等人2002; Li 和Tang 19"; Shilin等人l987)。因此，需要進(jìn)一步表征這些化合 物或其衍生物對炎癥和炎癥介質(zhì)(特別是"晚期"炎癥介質(zhì))釋放的 影響。本發(fā)明解決了這些需要。
發(fā)明概述
因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)丹參酮在預(yù)防和治療促炎細(xì)胞因子引起的炎 癥中是有效的。
因此，本發(fā)明涉及減弱促炎細(xì)胞因子從哺乳動物細(xì)胞釋放的方 法。所述方法包括使所述細(xì)胞與有效減弱促炎細(xì)胞因子從所述細(xì)胞釋 放的量的水溶性丹參酮接觸。
本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物中炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的方法。所述方 法包括用有效抑制炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的量的水溶性丹參酮治療所迷哺 乳動物。在這些方法中，所述哺乳動物患有炎性細(xì)胞因子級聯(lián)介導(dǎo)的
病o
此外，本發(fā)明涉及治療哺乳動物中炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的方法。所 述方法包括用有效抑制炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的量的丹參酮治療所述哺乳 動物。在這些方法中，所述哺乳動物患有炎性細(xì)胞因子級聯(lián)介導(dǎo)的病 癥。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療遭受膿毒癥、敗血病、休克和/或內(nèi)毒素 性休克風(fēng)險(xiǎn)中的哺乳動物的方法。所述方法包括，以有效減少或防止
內(nèi)毒素性休克生理效應(yīng)的方式用丹參酮IIA磺酸鈉治療所述哺乳動 物。
本發(fā)明進(jìn)一 步涉及治療遭受膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克 的哺乳動物的方法。所述方法包括以有效減少或防止膿毒癥、敗血病、 和/或內(nèi)毒素性休克生理效應(yīng)的方式，給所述哺乳動物施用純化的丹參酮。
本發(fā)明還涉及治療遭受膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克的哺
乳動物的其他方法。所述方法包括以有效減少或防止膿毒癥生理效應(yīng) 的方式，用包含丹參或其提取物的組合物治療所述哺乳動物。在這些
方法中，所述組合物不包含降香(lig麵dalbergiae odoriferae)。 本發(fā)明還涉及減弱N0從哺乳動物細(xì)胞釋放的方法。所述方法包 括使所述細(xì)胞與有效減弱NO從所述細(xì)胞釋放的量的水溶性丹參酮接 觸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及減弱哺乳動物中N0產(chǎn)生的方法，所述哺乳動 物處于由過量NO產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙的風(fēng)險(xiǎn)中。所述方法包括給所迷哺乳 動物施用有效減弱哺乳動物中NO產(chǎn)生的量的水溶性丹參酮。
此外，本發(fā)明涉及減弱哺乳動物中的NO產(chǎn)生的方法，所述哺乳 動物患有由過量NO產(chǎn)生而介導(dǎo)的障礙。所述方法包括給所述哺乳動物 施用有效減弱哺乳動物中NO產(chǎn)生的量的純化丹參酮。


圖1為圖片、蛋白印跡的照片和化學(xué)結(jié)構(gòu)，其顯示丹參提取物 的(圖A)和成分(丹參酮I、 IIA和隱丹參酮，圖B， C)減弱內(nèi)毒素 -誘導(dǎo)的HMGB1釋放。在不存在或存在草藥提取物(圖A)、丹參酮I (TSN 1)、丹參酮IIA(TSN IIA)或隱丹參酮(C-TSN)(圖B， C)下，用LPS刺 激小鼠巨噬細(xì)胞樣RAW 264. 7細(xì)胞16小時(shí)，通過蛋白印跡分析確定 培養(yǎng)基中服GB1的水平。在圖A和C下面的圖是具有類似結(jié)果的三個(gè) 獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性蛋白印跡照片。*， P < 0. 05與對照(僅+LPS)。圖D 顯示TSNIIA-SS制劑的HPLC圖鐠。
圖2是圖片和蛋白印跡的照片，其顯示TSNIIA-SS特異性地阻斷 內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGB1釋放。在不存在或存在指定濃度的TSNIIA-SS 下，用LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞樣RAW 264. 7細(xì)胞、原代小鼠腹膜巨噬 細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞。在LPS刺激后16小時(shí)，分別通過蛋白印 跡分析(圖A， B)、 Griess反應(yīng)(圖A) 、 ELISA(圖B)或細(xì)胞因子陣列 (圖C)測定培養(yǎng)基中HMGB1(圖A， B)、 一氧化氮(圖A)或TNF(圖B， C)的水平。注意在完全阻斷LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放的濃度下，TSNIIA-SS不完全阻斷LPS-誘導(dǎo)的一氧化氮(圖A)、TNF(圖B) 、 IL-1 ct、 PF-4、 IL-12(p70)和MCP-5(圖C)的釋放。在圖C中顯示具有 類似結(jié)果的兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的代表性細(xì)胞因子陣列。
圖3是圖片和蛋白印跡的照片，其顯示TSNIIA-SS的延遲施用仍 顯著地減弱內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的服GB1釋放。用LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞類 RAW 264. 7細(xì)胞，并且在LPS刺激后0、 2、 6和12小時(shí)加入TSNIIA-SS (25 juM或50juM)。在LPS刺激后16小時(shí)確定培養(yǎng)基中HMGB1的水平，并 表示為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(N = 2)的平均值土S.D.(以任意單位，AU)。每 個(gè)圖片下面是代表性蛋白印跡。*， P < 0.05與對照(僅+ LPS)。
圖4是顯微圖和蛋白印跡的照片，其顯示TSNIIA-SS阻斷內(nèi)毒素 -誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)HMGB1遷移。在不存在或存在TSNIIA-SS下，用LPS 刺激巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物，并在LPS刺激后16小時(shí)通過免疫組織化學(xué)(圖 A)或細(xì)胞分級分離/蛋白印跡(圖B)測試HMGB1細(xì)胞質(zhì)遷移。注意 HMGB1主要定位在未刺激的巨噬細(xì)胞的核區(qū)域("對照"，圖A，左 圖)、LPS-刺激的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核區(qū)域中(圖A，中圖)。 TSNIIA-SS(100iiM)將HMGB1保留在核區(qū)域中(圖A，右圖)。LPS刺 激后，分離細(xì)胞質(zhì)("C")和核("N，，)級分，并通過蛋白印跡分析測 定HMGB1、細(xì)胞核(PCNA)或細(xì)胞質(zhì)(P-肌動蛋白)蛋白的水平。通過 具有細(xì)胞質(zhì)(P -肌動蛋白)或細(xì)胞核(PCNA)蛋白標(biāo)記的級分的蛋白印 跡分析確認(rèn)樣品的等量裝載。印跡代表具有類似結(jié)果的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖5是化學(xué)結(jié)構(gòu)、蛋白印跡的照片和圖片，其顯示TSNIIA-SS使 用糖皮質(zhì)激素受體非依賴性機(jī)理減弱LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放。在不存 在或存在單獨(dú)的地塞米松、可的松或TSNIIA-SS，或地塞米松、可的 松或TSNIIA-SS與糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486組合下，用LPS刺激 小鼠巨噬細(xì)胞樣RAW 264.7細(xì)胞。刺激后16小時(shí)，分別通過蛋白印 跡分析和ELISA確定培養(yǎng)基中HMGB1(圖B)或TNF(圖C)的水平。圖 B是具有類似結(jié)果的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性蛋白印跡。*， P < 0.05 與單獨(dú)的LPS; #， P < 0.05與 "+LPS + Dex"。
圖6是顯示TSNIIA-SS劑量依賴性地保護(hù)小鼠對抗致死性內(nèi)毒素
血癥(圖A)和致死性膿毒癥(圖B)的圖片。使Balb/C小鼠遭受致死 性內(nèi)毒素血癥(LPS， l5 mg/kg， i.p.)或膿毒癥(由CLP誘導(dǎo))。在內(nèi) 毒素血癥發(fā)作后+0.5、 +24、 +48和+72小時(shí)，或在膿毒癥發(fā)作后+24、 +48、 +72、 +96小時(shí)，腹膜內(nèi)給動物施用鹽水(0.2 ml/小鼠)，或 TSNIIA-SS (0.2 ml/小鼠，以指定劑量)，監(jiān)測動物存活為期兩周。使 用Kaplan-Meier方法來比較組之間死亡率的差異。*， P < 0. 05與鹽 水。
圖7是圖片、蛋白印跡的照片和顯微圖，其顯示TSNIIA-SS減 弱膿毒癥-誘導(dǎo)的全身性HMGB1累積(圖A)和肝損傷(圖B)。通過 CLP使Balb/C小鼠遭受致死性膿毒癥，在CLP后的+24、 +48小時(shí)腹 膜內(nèi)施用對照鹽水(O. 2 ml/小鼠)或TSNIIA-SS(以指定劑量)。膿毒癥 發(fā)作后52小時(shí)，確定血清HMGB1水平(圖A)，并表示為平均值土SD(n =10)。 *， P < 0. 05(AN0VA， Tukey檢驗(yàn))。在平行實(shí)驗(yàn)中，CLP后 48小時(shí)處死動物，并對各種組織切片，用蘇木精和曙紅染色(圖B)。 左顯微圖，具有壞死損傷的膿毒癥小鼠的肝("CLP，，)(用空心箭頭標(biāo) 記)，如細(xì)胞的損失和肝腺泡的結(jié)構(gòu)所示。右顯微圖，用TSNIIA-SS(15 mg/kg)治療的膿毒癥小鼠的肝臟顯示中心靜脈(實(shí)心箭頭)并在正常肝 細(xì)胞周圍。
圖8是顯示TSNIIA-SS預(yù)防膿毒癥-誘導(dǎo)的心血管功能失調(diào)的圖 片。通過CLP ^f吏雄性Sprague-Dawley大鼠(290-310 g)遭受致死性 膿毒癥，在CLP后5小時(shí)使用Harvard泵(Harvard Apparatus, Holliston， MA)經(jīng)由股靜脈導(dǎo)管施用TSNIIA-SS。如前所述(Yang等 人2002b) ， CLP或假手術(shù)后20小時(shí)，使用放射性微粒確定總外周阻 力("TPR")、心博量("SV")和心輸出量("CO")。數(shù)據(jù)表示為平均 值士S. D. (n = 6 /組)并通過單因素方差分析(one-way ANOVA)和 Tukey檢驗(yàn)比較。*， P < 0.05相對進(jìn)行假手術(shù)的動物("-");#， P < 0. 05相對用載體處理的CLP動物("+ CLP")。
發(fā)明詳述
因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)丹參酮在預(yù)防和治療促炎細(xì)胞因子引起的炎 癥中是有效的。參見實(shí)施例。
因此，本發(fā)明涉及減弱促炎細(xì)胞因子從哺乳動物細(xì)胞釋放的方 法。所述方法包括使所述細(xì)胞與有效減弱促炎細(xì)胞因子從所述細(xì)胞釋 放的量的水溶性丹參酮接觸。
如本文所述，丹參酮是具有氫-菲并[l， 2-b]呋喃-10， 11-二酮的 四環(huán)結(jié)構(gòu)化合物，顯示于圖1B中，其能抑制HMGB1從巨噬細(xì)胞釋放。 實(shí)例包括天然存在的丹參酮1(1，6-二甲基-6，7，8，9-四氫-菲并 [1, 2-b]呋喃-10， ll-二酮)、隱丹參酮(1， 6， 6-三甲基-l， 2， 6， 7， 8， 9-六氫-菲并[1， 2-b]呋喃-10， ll-二酮)和丹參酮IIA(l， 6， 6-三甲基 -6，7，8，9-四氫-菲并[l,2-b]呋喃-10，ll-二酮)(圖1B)。水溶性丹參 酮的極性部分使其比圖1B中的三種天然存在的丹參酮溶解性更好。所 述極性部分的非限制性實(shí)例包括磺酸基、氨基、硝基、羧基和磷酸基。 所述極性部分可以在五元環(huán)上如丹參酮IIA磺酸鈉(圖1B)或在丹參 酮任何其他部分上，只要所述化合物仍具有抑制HMGB1釋放的活性。 優(yōu)選地，所述水溶性丹參酮是天然存在的丹參酮的磺酸鈉衍生物，最 優(yōu)選地是丹參酮IIA磺酸鈉。
這些方法對產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的任何細(xì)胞是有效的。優(yōu)選地，所 述細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
如下述實(shí)施例1和2所示，丹參酮抑制促炎細(xì)胞因子TNF- ot (TNF) 和HMGB1之一或兩者的釋放，TNF-cc (TNF)和HMGB1為優(yōu)選的受本發(fā) 明方法影響的促炎細(xì)胞因子。這些方法還能用于抑制一個(gè)或多個(gè)其他 促炎細(xì)胞因子例如白介素(IL) -1 、干擾素-Y和巨噬移動抑制因子(MIF) 的釋放。
用于這些方法的細(xì)胞可以在哺乳細(xì)胞中，所述哺乳動物處于促炎 細(xì)胞因子介導(dǎo)的病癥的風(fēng)險(xiǎn)或患有促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的病癥。所述方 法不限制于任何具體的哺乳動物，且可以用于居住在動物園或野外的 哺乳動物(例如，鹿、熊、非人靈長類等)，寵物哺乳動物(例如，狗、 貓、倉鼠、豚鼠、雪貂等)，家畜(例如，牛、豬、馬等)，試驗(yàn)動物(大
鼠、小鼠等)，或優(yōu)選人。
當(dāng)治療動物時(shí)，丹參酮應(yīng)該在藥學(xué)可接受的賦形劑中。關(guān)于"藥
學(xué)可接受的"指這樣一種材料，(i)其與所述組合物的其他組分相容， 而不產(chǎn)生不適合預(yù)期目的的組合物，并且(ii)如本文所提供的其適用 于受試者而沒有過度不利副作用(例如毒性、發(fā)炎和過敏反應(yīng))。當(dāng)其 危險(xiǎn)超過所述組合物提供的益處時(shí)，副作用是"過度的"。藥學(xué)可接受 載體的非限制性實(shí)例包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)載體，例如磷酸緩 沖鹽溶液、水、乳液如水包油乳液、微乳液等。
無需過度實(shí)驗(yàn)可以配制上述化合物，以根據(jù)特定應(yīng)用的需要施用 于哺乳動物(包括人)。此外，無需過度實(shí)驗(yàn)通過標(biāo)準(zhǔn)劑量-響應(yīng)方案可 以確定所述組合物的適當(dāng)劑量。
因此，無需過度實(shí)驗(yàn)通過本領(lǐng)域已知的方式可以制備設(shè)計(jì)用于口 服、舌、舌下、頰和頰內(nèi)施用的所述組合物，例如用惰性稀釋劑或用 可食用載體。所述組合物可以被封裝入膠囊或壓成片劑。出于口服治 療施用的目的，本發(fā)明的藥物組合物可以與賦形劑混合并以片劑、錠 劑、膠嚢、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙嚢劑、口香糖等的形式使用。
片劑、丸劑、膠嚢、錠劑等還可以包含結(jié)合劑、賦形劑、崩解劑、 潤滑劑、甜味劑和調(diào)味劑。 一些結(jié)合劑的實(shí)例包括微晶纖維素、黃蓍 膠或明膠。賦形劑的實(shí)例包括淀粉或乳糖。 一些崩解劑的實(shí)例包括海 藻酸、玉米淀粉等。潤滑劑的實(shí)例包括硬脂酸鎂或硬脂酸鉀。助流劑 的實(shí)例是二氧化硅膠體。 一些甜味劑的實(shí)例包括蔗糖、糖精等。調(diào)味 劑的實(shí)例包括胡椒薄荷、水楊酸甲酯、橙味劑(orange flavoring) 等。用于制備所述各種組合物的材料在所使用的量下應(yīng)該是藥學(xué)純和 無毒的。
所述化合物可以容易地通過腸胃外施用，例如，通過靜脈內(nèi)、肌 肉內(nèi)、鞘內(nèi)或皮下注射。通過將所述化合物摻入溶液或懸浮液中來實(shí) 現(xiàn)腸胃外施用。所述溶液或懸浮液還可以包括無菌稀釋劑例如注射用 水、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑。 腸胃外制劑還可以包括抗菌劑，例如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯，抗氧
化劑例如抗壞血酸或亞石克酸氳鈉，以及螯合劑例如EDTA。還可以加入 緩沖溶液例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)滲透壓的試劑 例如氯化鈉或葡萄糖。可將腸胃外制劑裝入安瓿瓶、 一次性注射器或 由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。
直腸施用包括將藥物組合物中的化合物施用到直腸或大腸中。 這可以通過使用栓劑或灌腸劑實(shí)現(xiàn)。通過本領(lǐng)域已知的方法可以容易
地制備栓劑。例如，栓劑可以通過將甘油加熱到約120x:來制備，將 組合物溶于甘油中，混合加熱的甘油后加入純凈水，將熱的混合倒入
栓劑模具中。
經(jīng)皮施用包括組合物通過皮膚的經(jīng)皮吸收。透皮制劑包括貼劑 (例如熟知的尼古丁貼劑)、軟骨、霜劑、凝膠、油骨等。
本發(fā)明包括鼻內(nèi)給所述哺乳動物施用治療有效量的所述化合物。 如本文所述，鼻內(nèi)施用包括將化合物施用給患者的鼻通道或鼻腔的粘 膜。如本文所述，用于化合物鼻內(nèi)施用的組合物包括治療有效量的由 熟知方法制備的化合物，其例如作為鼻噴霧、滴鼻劑、懸浮劑、凝膠、
軟膏、霜劑或粉劑施用。化合物的施用還可以使用鼻塞或鼻海綿(nasal sponge )進(jìn)行。
當(dāng)所述化合物外周施用使其必須經(jīng)過血腦屏障時(shí)，所迷化合物優(yōu) 選制成藥物組合物，所述藥物組合物提高化合物穿過哺乳動物血腦屏 障的能力。所述制劑在本領(lǐng)域中是已知的并包括親脂化合物以促進(jìn)吸 收。通過與親脂物質(zhì)的組合可以增強(qiáng)非親脂化合物的攝取。能增強(qiáng)化 合物通過鼻粘液的遞送的親脂物質(zhì)包括但不限于脂肪酸類(例如，棕櫚 酸)、神經(jīng)節(jié)苷脂類(例如，GM-1)、磷脂類(例如，磚脂酰絲氨酸)和乳 化劑(例如，聚山梨糖醇酯80)、膽汁鹽例如，脫氧膽酸鈉和去污劑樣 的物質(zhì)包括，例如聚山梨糖醇酯80例如TweenTM、辛苯昔醇例如 Triton X-IOO、和tauro-24， 25-二氫夫西地酸(dihydrofusidate ) 鈉(STDHF)。參見Lee等人，Biopharm. ， 1988年4月3037期。
在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述化合物與由親脂性物質(zhì)組成的微 膠粒組合。所述微膠粒能改變鼻膜滲透性以增強(qiáng)化合物的吸收。合適
的親脂性微膠粒包括但不限于神經(jīng)節(jié)苷脂類(例如GM-1神經(jīng)節(jié)香脂) 和磷脂(例如，磷脂酰絲氨酸)。微膠粒制劑中還包括膽汁鹽及其衍生 物和去污劑樣的物質(zhì)。所述化合物可以與 一或幾種類型微膠粒組合， 并且還包含在微膠粒內(nèi)或與它們的表面結(jié)合。
或者，所述化合物可以與脂質(zhì)體組合(脂囊泡)以增強(qiáng)吸收。所述 化合物可以包含或溶解在脂質(zhì)體內(nèi)和/或與其表面結(jié)合。合適的脂質(zhì)體 包括磷脂(例如，磷脂酰絲氨酸)和/或神經(jīng)節(jié)苷脂類(例如，GM-1)。 關(guān)于制備磷脂囊泡的方法，參見例如Roberts等人的美國專利 4'921， 706和Yiournas等人的美國專利4, 895, 452。脂質(zhì)體制劑中還 可以包括膽汁鹽及其衍生物和去污劑樣的物質(zhì)。
由促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的并能用本發(fā)明方法有效治療的病癥的實(shí) 例為闌尾炎、胃潰瘍、胃或十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、潰瘍 性結(jié)腸炎、假膜性結(jié)腸炎、急性或缺血性結(jié)腸炎、憩室炎、會厭炎、 弛緩不能、膽管炎、膽囊炎、肝炎、克羅恩氏病、腸梗阻、腸炎、惠 普耳氏病(Whipple's disease)、哞喘、變態(tài)反應(yīng)、過敏性休克、免 疫復(fù)合疾病、器官缺血、再灌注損傷、器官壞死、花粉熱、膿毒癥、 敗血病、內(nèi)毒素性休克、惡病質(zhì)、高熱、嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫、肉芽腫 病、結(jié)節(jié)病、膿毒性流產(chǎn)、附睪炎、陰道炎、前列腺炎、尿道炎、支 氣管炎、氣腫、鼻炎、嚢性纖維化、肺炎、矽肺病 (pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis )、 肺泡炎
(alvealitis)、細(xì)支氣管炎、咽炎、胸膜炎、竇炎、流行性感冒、 呼吸道合胞體病毒感染、皰疹感染、HIV感染、乙型肝炎病毒感染、 丙型肝炎病毒感染、彌漫性菌血癥、登革熱、念珠菌病、瘧疾、絲蟲 病、阿米巴病、包蟲嚢腫(hydatid cysts)、燒傷、皮炎、皮肌炎、 曬傷、蕁麻疹、疣、風(fēng)疹塊、血管炎(vasulitis)、脈管炎、心內(nèi)膜 炎、動脈炎、動脈硬化癥、血栓性靜脈炎、心包炎、心肌炎、心肌缺 血、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、風(fēng)濕熱、阿爾茨海默癥、乳糜泄、充血性心 力衰竭、成人呼吸窘迫綜合征、腦膜炎、腦炎、多發(fā)性硬化、腦梗塞、 腦松塞、Guillame-Barre綜合征、神經(jīng)炎、神經(jīng)痛、脊髓損傷、癱瘓、
葡萄膜炎、關(guān)節(jié)炎滲、關(guān)節(jié)痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病、痛風(fēng)、 牙周病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、重癥肌無力、甲狀腺炎
(thryoiditis)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、古德帕斯徹氏綜合征、白塞氏綜 合征、同種異體移植物排異反應(yīng)、移植物抗宿主疾病、I型糖尿病、 強(qiáng)直性脊柱炎、貝格爾氏病、Retier氏綜合征或何杰金氏病。優(yōu)選地， 所述病癥是闌尾炎、胃潰瘍、胃或十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、 潰瘍性結(jié)腸炎、假膜性結(jié)腸炎、急性或缺血性結(jié)腸炎、肝炎、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、過敏性休克、器官缺血、再 灌注損傷、器官壞死、花粉熱、膿毒癥、敗血病、內(nèi)毒素性休克、惡 病質(zhì)、膿毒性流產(chǎn)、彌漫性菌血癥、燒傷、阿爾茨海默癥、腹部疾病、 充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫綜合征、腦梗塞、腦栓塞、脊髓損傷、 癱瘓、同種異體移植物排異反應(yīng)和移植物抗宿主疾病。在最優(yōu)選的實(shí) 施例中，所述病癥是膿毒癥、敗血病、和/或內(nèi)毒素性休克。
本方法還進(jìn)一步包括給所述哺乳動物施用第二種消炎藥。非限制 性的實(shí)例包括NSAID、細(xì)胞因子抑制劑、水楊酸酯、C0X抑制劑、C0X-2 抑制劑或甾族化合物。在特別優(yōu)選的方法中，所述病癥是膿毒癥、敗 血病和/或內(nèi)毒素性休克，并且第二種治療是施用毒蕈堿激動劑、腎上 腺髓質(zhì)素、腎上腺髓質(zhì)素結(jié)合蛋白、乳脂肪球表皮生長因子VIII、激 活蛋白C或ot2「腎上腺素能拮抗劑。
本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物中炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的方法。所述方 法包括以有效抑制炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的量的水溶性丹參酮治療所述哺 乳動物。在這些方法中，所述哺乳動物患有炎性細(xì)胞因子級聯(lián)介導(dǎo)的
病癥o
如上面的方法所述，所述水溶性丹參酮優(yōu)選為天然存在的丹參酮
的磺酸鈉f汴生物，最優(yōu)選為丹參酮IIA磺酸鈉。這些方法的受試者可 以是任何哺乳動物。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
最優(yōu)選地，所述病癥是膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克，所 述哺乳動物是人并且所述丹參酮是丹參酮IIA磺酸鈉。
此外，本發(fā)明涉及治療哺乳動物中炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的方法。所
述方法包括以有效抑制炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的量的丹參酮治療所述哺乳 動物。在這些方法中，所述哺乳動物患有炎性細(xì)胞因子級聯(lián)介導(dǎo)的病癥。
優(yōu)選地，丹參酮是水溶性丹參酮，更優(yōu)選地是天然存在丹參酮的
磺酸鈉衍生物，最優(yōu)選地是丹參酮IIA磺酸鈉。這些方法的受試者可 以是任何哺乳動物。最優(yōu)選地，所述病癥為膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒 素性休克，所述的哺乳動物是人并且所述丹參酮是丹參酮11A磺酸鈉。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療哺乳動物的方法，所述哺乳動物處于膿毒 癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克的風(fēng)險(xiǎn)中。所述方法包括以有效減少或 防止內(nèi)毒素性休克生理效應(yīng)的方式，采用丹參酮IIA磺酸鈉治療所述 哺乳動物。可以測量內(nèi)毒素性休克的任何生理效應(yīng)來確定治療功效。 本文中優(yōu)選的生理效應(yīng)是HMGB1釋放、TNF釋放、 一氧化氮(N0)釋放 或致死性膿毒癥。最優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療哺乳動物的方法，所述哺乳動物遭受膿毒 癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。所述方法包括以有效減少或防止膿毒 癥、敗血病、和/或內(nèi)毒素性休克生理效應(yīng)的方式，給所述哺乳動物施 用純化的丹參酮。這些方法中有效的丹參酮包括丹參酮1、丹參酮IIA、 或隱丹參酮。更優(yōu)選的丹參酮是水溶性丹參酮，最優(yōu)選地是丹參酮IIA
可以測量內(nèi)毒素性休克的任何生理效應(yīng)來確定治療功效。本文優(yōu) 選的生理效應(yīng)是HMGB1釋放、TNF釋放、 一氧化氮(N0)釋放或致死性 膿毒癥。最優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
本發(fā)明還涉及治療哺乳動物的其他方法，所迷哺乳動物遭受膿毒 癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。所述方法包括以有效減少或防止膿 毒癥生理效應(yīng)的方式，釆用包含丹參或其提取物的組合物來治療所述 哺乳動物。在這些方法中，所述組合物不包含降香。所述組合物可以 包含丹參或優(yōu)選地丹參的提取物(參見實(shí)施例)。優(yōu)選的提取物包含有 機(jī)成分，其中至少5wt。/。的有機(jī)成分是丹參酮。更優(yōu)選地，至少10wt%， 甚至更優(yōu)選地至少25wt%,仍更優(yōu)選地至少50wt%或至少80wt%的
有機(jī)成分是丹參酮。最優(yōu)選地，至少95wt%的有機(jī)成分是丹參酮。 可以測量內(nèi)毒素性休克的任何生理效應(yīng)來確定治療功效。本文優(yōu)
選的生理效應(yīng)是HMGB1釋放、TNF釋放、 一氧化氮(N0)釋放或致死性
膿毒癥。最優(yōu)選地，所迷哺乳動物是人。
本發(fā)明還涉及減弱N0從哺乳動物細(xì)胞釋放的方法。所述方法包
括使所述細(xì)胞與有效減弱NO從所述細(xì)胞釋放的量的水溶性丹參酮接
觸o
如上面的方法所述，優(yōu)選的水溶性丹參酮是天然存在的丹參酮的
磺酸鈉衍生物，最優(yōu)選地是丹參酮IIA磺酸鈉。優(yōu)選地，至少80%的 丹參酮制劑是磺化的。
所述細(xì)胞優(yōu)選是活的哺乳動物的部分，所述哺乳動物處于由過量 N0生產(chǎn)介導(dǎo)的障礙的風(fēng)險(xiǎn)中，或患有由過量NO生產(chǎn)介導(dǎo)的障礙。所 述障礙的非限制性實(shí)例是休克、回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、 *喘、支氣管炎、氧化劑誘導(dǎo)的肺損傷、慢性阻塞性氣道疾病、角膜 營養(yǎng)不良、高眼壓癥、沙眼、盤尾絲蟲病、視網(wǎng)膜炎、葡萄膜炎、交
感性眼炎、眼內(nèi)炎、牙周炎、關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核病、麻風(fēng)病、腎小球性腎炎肉狀瘤、腎變病、硬 化性皮炎、曬傷、牛皮癬、濕疹、肌萎縮側(cè)索硬化、硬化癥，癡呆(包 括AIDS相關(guān)的神經(jīng)退化的、阿爾茨海默病、腦脊髓炎、病毒或自體免 疫腦炎)、免疫復(fù)合血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、缺血性心臟病、心力 衰竭、心肌病、腎上腺機(jī)能不全、高膽固醇血癥、動脈硬化癥、骨質(zhì) 疏松癥、先兆子癇、子癇、尿毒癥并發(fā)癥、慢性肝功能衰竭、中風(fēng)、 腦缺血、嚢性纖維化、結(jié)核病、惡病質(zhì)、缺血/再灌注、血液透析有關(guān) 病癥、腎小球性腎炎、再狹窄、病毒感染的炎性后遺癥、低氧癥、高 壓氧驚厥及中毒、癡呆、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、 帕金森氏病、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、 癲癇、科爾薩科夫氏病、腦血管障礙相關(guān)的低能、N0介導(dǎo)的腦外傷及 相關(guān)后遺癥、缺血性腦水腫(中風(fēng))、疼痛、偏頭痛、嘔吐、免疫復(fù) 合疾病，如免疫抑制劑、急性同種異體移植物排異反應(yīng)或癌癥。本文
最優(yōu)選的障礙是膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。最優(yōu)選地所述哺 乳動物是人。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及減弱哺乳動物中N0產(chǎn)生的方法，所述哺乳動 物處于由過量NO產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙的風(fēng)險(xiǎn)中。所述方法包括給所述哺乳 動物施用有效減弱哺乳動物中NO產(chǎn)生的量的水溶性丹參酮。優(yōu)選地， 所述水溶性丹參酮是天然存在的丹參酮的磺酸鈉衍生物，最優(yōu)選地是 丹參酮IIA磺酸鈉。
對于這些方法，優(yōu)選的障礙是休克、回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克 羅恩氏病、哮喘、支氣管炎、氧化劑誘導(dǎo)的肺損傷、慢性阻塞性氣道 疾病、角膜營養(yǎng)不良、高眼壓癥、沙眼、盤尾絲蟲病、視網(wǎng)膜炎、葡 萄膜炎、交感性眼炎、眼內(nèi)炎、牙周炎、關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨 關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核病、麻風(fēng)病、腎小球性腎炎肉狀瘤、 腎變病、硬化性皮炎、曬傷、牛皮癬、濕疹、肌萎縮側(cè)索硬化、硬化 癥，癡呆(包括AIDS相關(guān)的神經(jīng)退化的、阿爾茨海默病、腦脊髓炎、 病毒或自體免疫腦炎)、免疫復(fù)合血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、缺血性 心臟病、心力衰竭、心肌病、腎上腺機(jī)能不全、高膽固醇血癥、動脈 硬化癥、骨質(zhì)疏松癥、先兆子癇、子癇、尿毒癥并發(fā)癥、慢性肝功能 衰竭、中風(fēng)、腦缺血、嚢性纖維化、結(jié)核病、惡病質(zhì)、缺血/再灌注、 血液透析有關(guān)病癥、腎小球性腎炎、再狹窄、病毒感染的炎性后遺癥、 低氧癥、高壓氧驚厥及中毒、癡呆、西登哈姆氏舞蹈病、帕金森氏病、 亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、癲癇、科爾 薩科夫氏病、腦血管障礙相關(guān)的低能、NO介導(dǎo)的腦外傷及相關(guān)后遺癥、 缺血性腦水腫(中風(fēng))、疼痛、偏頭痛、嘔吐、免疫復(fù)合疾病，如免 疫抑制劑、急性同種異體移植物排異反應(yīng)或癌癥。最優(yōu)選地，所述障 礙是膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。所述哺乳動物優(yōu)選是人。
此外，本發(fā)明涉及減弱哺乳動物中N0產(chǎn)生的方法，所述哺乳動 物患有由過量N0產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙。所述方法包括給所述哺乳動物施用 有效減弱哺乳動物中N0產(chǎn)生的量的純化丹參酮。優(yōu)選地，所述丹參酮 是丹參酮I、丹參酮IIA或隱丹參酮，更優(yōu)選地是水溶性丹參酮，最
優(yōu)選地是丹參酮IIA磺酸鈉。
對于這些方法，優(yōu)選的障礙是休克、回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克 羅恩氏病、哮喘、支氣管炎、氧化劑誘導(dǎo)的肺損傷、慢性阻塞性氣道 疾病、角膜營養(yǎng)不良、高眼壓癥、沙眼、盤尾絲蟲病、視網(wǎng)膜炎、葡 萄膜炎、交感性眼炎、眼內(nèi)炎、牙周炎、關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨 關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核病、麻風(fēng)病、腎小球性腎炎肉狀瘤、 腎變病、硬化性皮炎、曬傷、牛皮癬、濕滲、肌萎縮側(cè)索硬化、硬化 癥，癡呆(包括AIDS相關(guān)的神經(jīng)退化的、阿爾茨海默病、腦脊髓炎、 病毒或自體免疫腦炎)、免疫復(fù)合血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、缺血性 心臟病、心力衰竭、心肌病、腎上腺機(jī)能不全、高膽固醇血癥、動脈 硬化癥、骨質(zhì)疏松癥、先兆子癇、子癇、尿毒癥并發(fā)癥、慢性肝功能 衰竭、中風(fēng)、腦缺血、嚢性纖維化、結(jié)核病、惡病質(zhì)、缺血/再灌注、 血液透析有關(guān)病癥、腎小球性腎炎、再狹窄、病毒感染的炎性后遺癥、 低氧癥、高壓氧驚厥及中毒、癡呆、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、帕金森氏病、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、 多發(fā)性硬化、癲癇、科爾薩科夫氏病、腦血管障礙相關(guān)的低能、N0介 導(dǎo)的腦外傷及相關(guān)后遺癥、缺血性腦水腫(中風(fēng))、疼痛、偏頭痛、 嘔吐、免疫復(fù)合疾病，如免疫抑制劑、急性同種異體移植物排異反應(yīng) 或癌癥。最優(yōu)選地，所述障礙是膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。 所述哺乳動物優(yōu)選是人類。
在下述實(shí)施例中描述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。考慮到本文公開的 說明書或?qū)嵺`，在本文權(quán)利要求范圍內(nèi)的其他實(shí)施方案對本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的。認(rèn)為本說明書與實(shí)施例只是示例性的，本發(fā) 明的范圍和意圖由實(shí)施例后面的權(quán)利要求表示。
實(shí)施例
心血管藥物通過選擇性減弱晚期作用的促炎介質(zhì)HMGB1來挽救患有致
死性膿毒癥的小鼠
實(shí)施例概述
膿毒癥的發(fā)病機(jī)理部分由細(xì)菌內(nèi)毒素介導(dǎo)，所迷細(xì)菌內(nèi)毒素刺激
巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞連續(xù)釋放早期促炎細(xì)胞因子(例如，TNF、 IL-1和 IFN-□)和晚期促炎細(xì)胞因子(例如，HMGB1)。 HMGB1作為致死性膿毒 癥的晚期介質(zhì)的近期發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了開發(fā)新實(shí)驗(yàn)療法的研究。發(fā)現(xiàn)很多齒 族(例如地塞米松和可的松)和非甾族抗炎藥(例如阿司匹林、布洛芬、 和吲哚美辛)甚至在超藥理學(xué)濃度時(shí)(高達(dá)10-25口M)不能影響內(nèi)毒素 -誘導(dǎo)的HMGB1釋放。然而， 一種常見的中藥(丹參)的幾種齒族樣 色素(丹參酮I、丹參酮IIA和隱丹參酮)劑量依賴性地減弱內(nèi)毒素-誘 導(dǎo)的HMGB1在巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞培養(yǎng)物中釋放。水溶性丹參酮IIA 衍生物(磺酸鈉)，即TSNIIA-SS,作為中藥已經(jīng)被廣泛地用于心血管 障礙的患者，其以糖皮質(zhì)激素受體-非依賴性方式選擇性地阻斷內(nèi)毒素 -誘導(dǎo)的HMGB1細(xì)胞質(zhì)遷移和釋放。TSNIIA-SS的施用顯著地保護(hù)小鼠 對抗致死性內(nèi)毒素血癥，并甚至在膿毒癥發(fā)作后24小時(shí)首次給藥挽救 患有致死性膿毒癥的小鼠。治療作用部分歸因于1)減弱HMGB1的全 身性累積(但不減弱TNF和一氧化氮)；2)防止肝損傷；并且3)改 善膿毒癥動物的心血管生理參數(shù)(例如，總外周血管阻力降低和心搏量 增加)?？傊?，這些數(shù)據(jù)加強(qiáng)了 HMGB1在致死性膿毒癥中的致病作用， 并支持TSNIIA-SS在人膿毒癥治療中的治療潛力。
介紹
如上面證實(shí)的，丹參提取物以及幾種成分(丹參酮I、丹參酮IIA 和隱丹參酮)顯著地減弱服GB1從細(xì)菌內(nèi)毒素-刺激的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物 中釋放。用水溶性丹參酮IIA衍生物(丹參酮IIA磺酸鈉)治療動物顯 著減弱HMGB1在內(nèi)毒素血癥和膿毒癥中的全身性累積，并賦予劑量依 賴性保護(hù)來對抗致死性內(nèi)毒素血癥和膿毒癥，甚至當(dāng)膿毒癥發(fā)作后24 小時(shí)首次給予丹參酮IIA磺酸鈉。 材料和方法
細(xì)胞培養(yǎng)物如前所述(Chen等人2004; Rendon-Mitchel 1等人 2003)，小鼠巨噬細(xì)胞樣RAW 264. 7細(xì)胞獲自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC，
Rockville， MD)，且原代腹膜巨噬細(xì)胞分離自腹膜內(nèi)注射2 ml疏乙醇 酸鹽肉湯(4%)后2-3天的Balb/C小鼠(雄性，7-8周，20-25g)。在 RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco BRL， Grand Island, NY)中預(yù)培養(yǎng)小鼠巨 噬細(xì)胞，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)和2 mmol/L谷氨酰 胺。如前所述(Rendon-Mitchell 等人 2003)， 通過 Ficoll (Ficol卜Paque PLUS, Pharmacia, Piscataway， NJ)經(jīng)密度梯 度離心，將人外周血單核細(xì)胞(HuPBMCs)從健康供體的血(Long Island Blood Bank, Melville, NY)中分離，并培養(yǎng)在補(bǔ)充有10°/。熱滅活人 血清/0. 2 mM L-谷酰胺的RPMI 1640中。
LPS刺激如前所述(Chen等人2004; Rendon-Mitchel 1等人 2003; Wang等人1999)，輕輕的用無血清OPTI-MEM I培養(yǎng)基洗滌粘 連的巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞，并將其培養(yǎng)在無血清OPTI-MEM I培養(yǎng)基 中兩個(gè)小時(shí)，然后用細(xì)菌內(nèi)毒素刺激(脂多糖、LPS、大腸桿菌0111: B4， Sigraa-Aldrich)。在LPS刺激后16小時(shí)，測定所述培養(yǎng)基中HMGB1 的水平。
草藥提取物的制備各種中草藥獲自NY-Tongrentang， Inc. (Flushing, New York, USA)，并在水中萃取4個(gè)小時(shí)(85'C)。 通過離心(3300 g, 20min， 4C)連續(xù)除去水溶性級分并過濾(通過0. 2 lim濾片)，并檢查過濾級分的HMGBl-抑制活性。
化學(xué)藥物來源和原液地塞米松、可的松和RU486獲自Sigma (St. Louis, MO),并在100%乙醇中制備10 mM原液。阿司匹林(Cat. No. A0819)、布洛芬(Cat. No. 10481)、吲哚美辛(Cat. No. 15315)獲自 LKT Laboratories Inc. (St. Paul, MN， USA)，并在水中制備10 mM 原液(20 raM)。丹參酮I (Cat. No. T0153, 98.6% HPLC純度)，丹參 酮IIA(Cat. No. T0154, 93. 0% HPLC純度)，和隱丹參酮(Cat. No. C7097, 98.8% HPLC純度)獲自LKT Laboratories Inc.,并在二甲 亞砜(DMSO)中配制20 mM的原液。丹參酮IIA磺酸鈉(TSNIIA-SS)獲 自上海第一生化藥業(yè)公司，LTD(上海，中國)，并通過使用Nova-pak C18柱(3.9 x 150 mm)以及0.065%三氟乙酸(TFA， v/v，在水中)作
為流動相的HPLC確定其純度。樣品在l.O ml/min的流速下用0-59% 乙腈(v/v，在O. 065。/。TFA中)的線性梯度洗脫12分鐘，并在452. 2 nm 波長處監(jiān)測。使用液相色i瞽-質(zhì)鐠聯(lián)用(LC-MS， LCQ DECA XPPLUS， Thermo Electron Corporation)分析每個(gè)HPLC峰。主峰(保留時(shí)間8. 3 min)占>80%的HPLC峰下總面積(圖1D)，并含有m/z = 373. 07 (100. 0%)的紅顏料，對應(yīng)于C19H1706S-(丹參酮IIA磺酸鹽) 的經(jīng)驗(yàn)式。
內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的動物模型本研究獲得批準(zhǔn)并依據(jù)紐約曼 哈塞特Feinstein醫(yī)學(xué)研究所的實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)和使用指南進(jìn)行。如前 所述(Chen等人2005; Wang等人1999; Wang等人2006),通過腹膜 內(nèi)注射細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS， 15mg/kg)在Balb/C小鼠(雄性，7-8周)中 誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥。如前所述(Wang等人2006; Yang等人2002b)，通 過盲腸結(jié)扎和穿孔(CLP)在雄性Balb/C小鼠(7-8周，20-25 g)或 Sprague-Dawley大鼠(290-310 g)中誘導(dǎo)膿毒癥。以指定的劑量和時(shí) 間點(diǎn)給小鼠腹膜內(nèi)施用草藥成分，監(jiān)測小鼠存活為期兩周。在平行實(shí) 驗(yàn)中，內(nèi)毒素血癥后28小時(shí)(在-O. 5和+24 h的兩劑草藥成分后) 和在CLP后52小時(shí)(在+24和+48h的兩劑草藥成分后)安樂處死小鼠 以收集血液。
TNF ELISA如前所述(Chen等人2004; Rendon-MUchel 1等人 2003; Wang等人2006)，使用商購酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒 (Catalog no. MTA00, R&D Systems, Minneapolis, MN)確定培養(yǎng) 基或血清中TNF水平，并參考不同稀釋度下純化重組的TNF的標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
一氧化氮測試通過基于Gr iess反應(yīng)的比色測定測量NO2—產(chǎn)生來 間接確定一氧化氮在培養(yǎng)基中的水平(Rendon-Mitchell等人200"。 NO2-濃度參照不同稀釋度下得到的硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定N02—濃度。
HMGBl蛋白印跡分析如前所述(Chen等人 2004; Rendon-Mitchell等人2003; Wang等人1999)，通過蛋白印跡分析 確定培養(yǎng)基或血清中HMGBl水平。使用NIH image 1. 59軟件定量相對
譜帶強(qiáng)度以確定HMGB1水平，參照用純化HMGB1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
細(xì)胞因子抗體陣列根據(jù)制造商的說明使用小鼠細(xì)胞因子抗體陣 列(Cat. No. M0308003, RayBiotech Inc.， Norcross， GA， USA)來 測定培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的性質(zhì)，所述小鼠細(xì)胞因子抗體陣列在一個(gè)膜 上檢測62個(gè)細(xì)胞因子。簡言之，所述膜依次用等體積的細(xì)胞條件培養(yǎng) 基、第一生物素偶聯(lián)抗體和辣根過氧物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素溫育。 暴露于X射線膠片后，參照膜上陽性對照釆用NIH image 1. 59軟件確 定相對信號強(qiáng)度。
免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞分級分離/蛋白印跡如前所述(Chen等人 2004; Rendon-Mitchell等人2003) ， LPS刺激后16小時(shí)，用抗-HMGBl 多克隆抗體免疫染色細(xì)胞HMGB1，使用熒光顯微鏡獲得圖象(Carl Zeiss Microimaging, Inc., Thornwood, NY)。 或者如前所述(Tang 等人2006)，通過細(xì)胞分級分離/蛋白印跡技術(shù)確定HMGBl的定位。細(xì) 胞分級分離基于非離子去污劑(NP-40)對血漿和細(xì)胞核膜的分化溶解。 簡言之，質(zhì)膜在低鹽緩沖溶液(IO mM HEPES， pH 7. 9; 10 mM KC1; 0.1 mM EDTA; 0.1 mM EGTA; 1 mM DTT; 0.5 mM PMSF， 1% NP-40)中選擇 性溶解后，通過快速離心步驟(7， 000 g， 1 min， 4C)收集完整的細(xì)胞 核，將細(xì)胞質(zhì)級分留在上清液中。將所述細(xì)胞核沉淀重新懸浮在NP-40 高鹽緩沖溶液中UO mM HEPES， pH 7.9; 0. 4 M NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM DTT; 1 mM PMSF， 1°/。 NP-40),并簡單地超聲處理以 生成細(xì)胞核級分。分級分離后，由Bradford方法確定不同級分的蛋 白含量，并通過蛋白印跡分析使用對服GB1、細(xì)胞質(zhì)蛋白(P-肌動蛋 白，Santa Cruz Biotechnology)和細(xì)胞核蛋白(PCNA， BD Biosciences) 特異性的一抗測試每個(gè)級分的各種蛋白質(zhì)水平。
細(xì)胞存活率的測定如前所述(Rendon-Mitchell等人2003)，通 過臺盼藍(lán)拒染法估計(jì)細(xì)胞活力。簡言之，將終濃度為0. 08%的臺盼藍(lán) 添加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。在251C溫育5分鐘后，通過在五個(gè)40倍鏡 下不染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)估計(jì)細(xì)胞存活率。
組織組織學(xué)在CLP后48小時(shí)，將小鼠在C02箱中安樂處死，并
立即用磷酸緩沖鹽溶液和4%多聚甲醛灌注(經(jīng)心)。收獲各種組織，切 片，并用蘇木精和曙紅染色以用于形態(tài)學(xué)評價(jià)。
測量心輸出量如前所述(Yang等人20G2b),在CLP或假手術(shù)后 20小時(shí)使用放射性標(biāo)記微球技術(shù)測量心輸出量。簡言之，將"力e-標(biāo) 記微球(4. 0 jLiCi， DuPont NEN， Boston, MA)快速注射到左心室，在 左心室中其與氧合血在主動脈根部均勻混合，然后經(jīng)由主動脈血流分 配到每個(gè)器官中的毛細(xì)血管床。參照血樣品用泵(Harvard Apparatus, Holliston， MA)從股動脈導(dǎo)管(以0. 7 ml/min的速率)抽取，之后手 工輸注等滲氯化鈉溶液來替代損失的血液體積。在CLP后20小時(shí)，處 死動物以收獲各種器官，用自動y計(jì)數(shù)器(1470 Wizard; Wallac， Gaithersburg， MD)測量放射性。根據(jù)下述等式計(jì)算心輸出量和器官血 流量心輸出量=[(RBF x CT)/Cr] x 1/100和器官血流量= [(RBF x Ct)/Cr] x 1/100,其中RBF是參考血樣的回流速率(0. 7 ml/min)， CT是每分鐘總注射劑量的計(jì)數(shù)，Ct是每分鐘每克組織的計(jì) 數(shù)，且Cr是每分鐘在參考血液樣品中的計(jì)數(shù)。如前所述(Yang等人 2002b)，計(jì)算心博量(SV)和總外周阻力(TPR)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)表示為一式三份的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SD(n = 2)。使用單因素方差分析比較所有不同組。當(dāng)ANOVA顯著時(shí)， 使用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的事后檢驗(yàn)(post-hoc testing)。使用 Kaplan-Meier方法比較組間死亡率的差異。認(rèn)為P值小于0. 05是統(tǒng) 計(jì)學(xué)上顯著的。 結(jié)果
丹參提取物和成分減弱內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGB1釋放成功鑒定水 楊酸為柳樹皮降低熱和疼痛的活性成分導(dǎo)致了第 一個(gè)合成的非甾族消 炎藥(NSAID)-阿司匹林。許多NSAIDs (例如阿司匹林、布洛芬和吲哚 美辛)能抑制環(huán)氧合酶，但不能保護(hù)動物對抗致死性膿毒癥 (Hasselgren等人1985; Noronha-Blob等人1993; Villa等人 1995)。所測試的環(huán)氧合酶抑制劑(例如，阿司匹林、布洛芬和吲哚美 辛)不能顯著地影響LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放，甚至在超藥理學(xué)濃度時(shí)
(l-"jiM，數(shù)據(jù)沒有顯示)。還測試了25種藥草。丹參提取物劑量依 賴性地減弱內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGB1釋放(圖1A)。
為了確定丹參的活性成分，檢查其抗炎成分的HMGB1-抑制活性。 一種潛在的抗炎成分，阿魏酸有效減弱LPS-誘導(dǎo)的一氧化氮產(chǎn)生，但 不影響LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放(Wang等人2006)。丹參還含有充足的 紅顏料(稱為丹參酮I、丹參酮IIA和隱丹參酮)(圖1B)，為一組對心 血管異常的患者具有藥用價(jià)值的物質(zhì)(Ji等人2000)。所有三種丹參 酮(I、 IIA和隱丹參酮)有效減弱LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放，估計(jì)的IC5。 〈25jaM(圖1C)。
水溶性丹參酮IIA磺酸鈉(TSNIIA-SS)選擇性減弱內(nèi)毒素-誘導(dǎo) 的HMGB1釋放大多數(shù)丹參酮在生理溫度下幾乎不溶于水，這種差的 水溶性不利地影響其在體內(nèi)的生物利用度。因此檢測了水溶性丹參酮
IIA衍生物、TSNIIA-SS(圖1B)對于HMGB1的抑制活性。TSNIIA-SS是 廣泛用于心血管障礙患者的中藥(Ji等人2000)，獲自上海第一生化 藥業(yè)公司，LTD。 HPLC分析(圖1D)揭示主峰(〉80。/。， 8. 3分鐘的保留 時(shí)間)含有m/z - 373. 07的紅顏料，對應(yīng)于C19H1706S-(丹參酮IIA 磺酸鹽)的經(jīng)驗(yàn)式。小的HPLC峰(〈20y。，6. 8分鐘的保留時(shí)間)含有m/z =389. ll的紅顏料，對應(yīng)于C19H1707S-(丹參酮IIA磺酸鹽的未知類 似物)的經(jīng)驗(yàn)式。高度純化的TSNIIA-SS(通過HPLC>99. 0%)劑量依 賴性抑制HMGB1釋放，估計(jì)的IC5。 〈5pM(圖2A)。類似地，其有效抑 制原代人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)物(圖2B)和小鼠腹膜巨噬細(xì)胞(數(shù)據(jù)未 顯示)中LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放。
為了進(jìn)一步評價(jià)其抗炎性質(zhì)，根據(jù)LPS-誘導(dǎo)的其它促炎介質(zhì)的 釋放來確定其潛在作用。在完全阻斷LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放的濃度 (100jiM)下，TSNIIA-SS不完全阻斷LPS-誘導(dǎo)的一氧化氮(圖2A，下 圖)或TNF(圖2B，下圖)的釋放。此外，當(dāng)用LPS在高濃度O200 ng/ml) 下刺激巨噬細(xì)胞時(shí)，其對TNF(但不對HMGB1)釋放的抑制作用常常喪 失，表明對HMGB1抑制的選擇性。為了評價(jià)該特異性，使用細(xì)胞因子 蛋白陣列確定其對62個(gè)細(xì)胞因子釋放的影響。在完全阻斷LPS-誘導(dǎo)
的服GB1釋放的濃度(l00 iaM，數(shù)據(jù)未顯示)下，TSNIIA-SS不抑制RAW 264. 7細(xì)胞(圖2C，上排)或原代腹膜巨噬細(xì)胞(圖2C，下排)中大多數(shù)細(xì) 胞因子的釋放，所述細(xì)胞因子包括IL-6、 IL-12p40/p70、 KC、 MCP-1、 MIP-1 a 、MIP-1 y 、MIP-2和TNF。與先前的報(bào)導(dǎo)一致(Kang等人2000)， 僅TSNIIA-SS部分減弱LPS-誘導(dǎo)的IL-12p70 (45 ± 5°/。)與一些其它細(xì) 胞因子的釋放，例如IL-lot (50士7%)、血小板因子4(PF-4， 35 ± 6%) 和MCP-5(25±5%)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明與其它促炎細(xì)胞因子相反， TSNIIA-SS選擇性減弱LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放。
TSNIIA-SS的延遲施用顯著減弱內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGB1釋放與 早期促炎細(xì)胞因子(例如TNF)相比，HMGB1在內(nèi)毒素刺激后以延遲的方 式釋放。感興趣的是，如果在LPS刺激后添加TSNIIA-SS是否能抑制 HMGB1釋放。而同時(shí)施用TSNIIA-SS和LPS在抑制HMGB1釋放是最有 效的，當(dāng)在LPS后2 - 6小時(shí)加入TSNIIA-SS能保持顯著的抑制(圖3)。 因此通過以延遲方式策略性地施用TSNIIIA-SS使得藥理學(xué)上減弱晚 期作用的促炎介質(zhì)(例如HMGB1)是可行的。
TSNIIA-SS通過阻斷其細(xì)胞質(zhì)遷移抑制內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGB1釋 逸為了研究丹參酮-介導(dǎo)的抑制HMGBl釋放的機(jī)制，根據(jù)內(nèi)毒素-誘導(dǎo) 的HMGB1細(xì)胞質(zhì)遷移(HMGB1釋放的基本步驟)確定其作用(Chen等人 2004; Gardella等人2002; Rendon-Mitchel 1等人2003)。與先前 的報(bào)導(dǎo)一致(Chen等人2004)，靜態(tài)巨噬細(xì)胞組成性地表達(dá)HMGB1并 主要在細(xì)胞核內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)HMGB1 "池(pool)"(圖4A，左顯微 圖)。在LPS刺激后16小時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)嚢泡中觀察到顯著的HMGB1染 色(圖4A，中間顯^:圖)，證實(shí)LPS刺激巨噬細(xì)胞積極地將核HMGB1遷 移至細(xì)胞質(zhì)中，然后將其釋放到胞外環(huán)境中。盡管TSNIIA-SS不影響 HMGB1在靜息細(xì)胞中的核定位(數(shù)據(jù)未顯示)，其幾乎完全阻斷大多數(shù) 內(nèi)毒素-刺激細(xì)胞中LPS-誘導(dǎo)的HMGB1細(xì)胞質(zhì)遷移(圖4A，右顯微 圖)，表明TSNIIA-SS通過干擾其細(xì)胞質(zhì)遷移來減弱HMGBl釋放。
為了進(jìn)一步證實(shí)上述假設(shè)，分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核級分，并用分別 對HMGB1、 PCNA(核蛋白)或p-肌動蛋白(細(xì)胞質(zhì)蛋白)特異性的抗體免
疫印記。 一致的是，細(xì)胞質(zhì)級分中的HMGB1水平在LPS刺激后顯著增 加(數(shù)據(jù)未顯示)，但TSNIIA-SS處理后顯著降低(圖4B)，證實(shí) TSNIIA-SS通過干擾細(xì)胞質(zhì)遷移來減弱HMGB1釋放。
TSNIIA-SS以糖皮質(zhì)激素受體非依賴性機(jī)制抑制內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的 HMGB1釋放根據(jù)丹參酮和齒族消炎藥之間的結(jié)構(gòu)相似(即，四稠合環(huán) 結(jié)構(gòu)的存在)(圖5A)，評價(jià)l)是否皮質(zhì)甾類類似地減弱LPS-誘導(dǎo)的 HMGB1釋放；并且2) TSNIIA-SS是否以糖皮質(zhì)激素受體依賴型機(jī)制 阻斷HMGB1釋放。甚至在高至10liM的濃度，地塞米松和可的松不能 降低LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放(圖5B)，盡管它們有效地減弱LPS-介導(dǎo) 的TNF分泌(圖5C)。齒族消炎藥通過結(jié)合細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體來抑 制細(xì)胞因子(Waage等人1990)，其能被特異性糖皮質(zhì)激素拮抗劑(例 如RU486)抵消。確實(shí)，RU486幾乎完全阻斷地塞米松-介導(dǎo)的TNF分 泌的抑制(圖5C)，但不影響TSNIIA-SS-介導(dǎo)的TNF (圖5C)或HMGB1 釋放(數(shù)據(jù)未顯示)的抑制。總之，這些數(shù)據(jù)表明TSNIIA-SS和地塞米 松利用不同機(jī)制抑制內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放。
TSNIIA-SS對抗致死性內(nèi)毒素血癥的保護(hù)作用根據(jù)TSNIIA-SS 減弱LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放的能力，在致死性內(nèi)毒素血癥的動物模型 中評價(jià)其功效。在L. D.75劑量的LPS之后30分鐘施用單一劑量的 TSNIIA-SS沒有顯著地改善動物存活率(接受鹽水的對照為25%，n-20 小鼠/組；相對接受15 mg/kg的TSNIIA-SS的實(shí)驗(yàn)組為37.5%， N = 20 小鼠/組；P>0.05)。通過用三個(gè)附加劑量的TSNIIA-SS(+24， +48和 72hr)治療動物，在存活動物中觀察到劑量依賴性改善(從20%到80%, 圖6A)。此外，施用TSNIIA-SS劑量依賴性地減弱循環(huán)的HMGB1水平 (140 ± 20 ng/ml， LPS +載體；相對40 ± 25 ng/ml; n = 10， p < 0. 01)， 表明TSNIIA-SS部分通過減弱全身性HMGB1積累來保護(hù)動物對抗致死 性內(nèi)毒素血癥。
TSNIIA-SS挽救患有致死性膿毒癥的小鼠盡管內(nèi)毒素血癥對于 研究復(fù)雜的細(xì)胞因子級聯(lián)是有用的，但需要更多臨床相關(guān)的動物模型 來研究用于治療人膿毒癥的治療劑。 一個(gè)很好表征的、標(biāo)準(zhǔn)的膿毒癥
動物模型由CLP誘導(dǎo)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)摱景Y中HMGB1積累的晚期和延長動 力學(xué)(Yang等人2004)，理論認(rèn)為甚至在膿毒癥發(fā)作后施用TSNIIA-SS 也可能挽救患有膿毒癥的小鼠。在膿毒癥發(fā)作后24小時(shí)給予第一劑量 的TSNIIA-SS,在該時(shí)間點(diǎn)小鼠表現(xiàn)明顯膿毒癥征兆(包括瞌睡、腹渴 豎毛)。在膿毒癥發(fā)作后24小時(shí)，腹膜內(nèi)施用單一劑量的TSNIIA-SS 不能改善存活率(接受鹽水的對照為33%， n = 24小鼠/組；相對接受 15 mg/kg的TSNIIA-SS的實(shí)驗(yàn)組為50%， n= 24小鼠/組，P >0. 05)。 然而，在膿毒癥發(fā)作后24小時(shí)開始重復(fù)施用TSNIIA-SS(接下來在膿 毒癥后48、 72和96小時(shí)施用附加劑量)，賦予對抗致死性膿毒癥的劑 量依賴性保護(hù)(N- 30小鼠/組，圖6B)，顯著增加了動物存活率從33% 到73% (P <0. 05)。
TSNIIA-SS減弱膿毒癥-誘導(dǎo)的全身性HMGB1積累和肝損傷為了 了解其保護(hù)機(jī)制，評價(jià)了 TSNIIA-SS對TNF、 一氧化氮和HMGB1的全 身性積累的影響。與早期報(bào)導(dǎo)一致(Villa等人1995)，全身性TNF僅 在膿毒癥晚期能檢測到。在膿毒癥發(fā)作后52小時(shí)的延遲施用 TSNIIA-SS沒有減弱循環(huán)TNF水平(TNF - 65 +15 ng/L，載體對照組， N = 10小鼠/組；相對TNF = 85 + 23 ng/L， TSNIIA-SS組，N- 10 小鼠/組；P >0. 05)。類似地，在膿毒癥發(fā)作后52小時(shí)的延遲施用 TSNIIA-SS沒有減弱循環(huán)一氧化氮水平(l8. 0 士 4. 5 ja mol/L，載體對照 組；相對15. 5 ± 3. 3 jamol/L， TSNIIA-SS; n = 3， P >0. 05)。相反， 重復(fù)施用TSNIIA-SS劑量依賴性地、和顯著地減弱膿毒癥小鼠中循環(huán) HMGB1水平(圖7A， P <0. 05)，表明TSNIIA-SS部分通過減弱全身性 HMGB1積累來賦予對抗致死性膿毒癥的保護(hù)作用。
為了確定全身性HMGB1積累的減弱是否通過對抗膿毒癥-誘導(dǎo)的 組織損傷的保護(hù)作用實(shí)現(xiàn)，進(jìn)行驗(yàn)尸，其中在膿毒癥發(fā)作后48小時(shí)通 過組織學(xué)檢查組織。與先前報(bào)導(dǎo)一致(Zhou等人1998)，在心、腎、
腸和大腦中沒有顯著的組織學(xué)變化(數(shù)據(jù)未顯示)，證實(shí)了這個(gè)想法 膿毒癥與這些組織中的任何病理特征變化無關(guān)(Hotchkiss and Karl 2003)。然而，與先前的報(bào)導(dǎo)一致(Ayala等人2000; Qin等人2006)，總共12個(gè))存活動物中發(fā)現(xiàn)肝壞死病灶(圖 7B)。值得注意的是，在對照組的3個(gè)(總共15個(gè))動物中不能評價(jià)肝 損傷，所述三個(gè)動物死于早期(CLP后36-48小時(shí))，在接下來的器官 損傷評估中排除這3只死亡的動物可能導(dǎo)致低估TNSIIA-SS-介導(dǎo)的保 護(hù)作用。相反，在15個(gè)實(shí)驗(yàn)組存活動物中沒有觀察到這些肝壞死的征 兆(TSNIIA-SS， 15 mg/kg，圖7B)。
TSNIIA-SS對抗膿毒癥-誘導(dǎo)的心功能不全的保護(hù)作用因?yàn)?TSNIIA-SS已經(jīng)成功地用于心血管障礙的患者(Ji等人2000)，我們 還評價(jià)了其是否能改善膿毒癥動物的心血管功能。盡管沒有心肌損傷 (Zhou等人1998),在心血管功能上有心力不足的變化，體現(xiàn)在晚期 階段(例如，膿毒癥發(fā)作后20小時(shí))心輸出量的顯著降低(Yang等人 2002b)。施用TSNIIA-SS沒有顯著影響平均動樂K血壓(106. 1 ± 4. 7mmHg, CLP組；相對96. 4 ± 8. 7 mm Hg; n- 6， p >0. 05)，但輕微 降低了心率(378. 3 土 25. 1心跳/分鐘，CLP組;相對334. 1 士25. 8心跳 /分鐘，CLP + TSNIIA-SS， 15 mg/kg， n - 6， p <0. 05)。更重要地， 其劑量依賴性地降地總外周血管阻力(圖8A),并仍然顯著增加心臟心 博量(圖8B)和心輸出量(圖8C)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明TSNIIA-SS (在 中國用于心血管障礙患者的一種有效藥物)似乎在對抗膿毒癥動物模 型中的膿毒癥-誘導(dǎo)的心血管功能障礙具有保護(hù)作用。 討論
致死性膿毒癥的病因仍不清楚，但與異常調(diào)節(jié)的炎性反應(yīng)、組織 損傷和多器官功能失調(diào)有關(guān)。炎癥反應(yīng)部分由細(xì)菌內(nèi)毒素介導(dǎo)(Ayala 等人2000)，其刺激巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞連續(xù)釋放早期促炎細(xì)胞因子 (例如，TNF和IL-1)和晚期促炎細(xì)胞因子(例如，HMGB1)。盡管早期 細(xì)胞因子在對抗感染方面具有保護(hù)作用(Eskandari等人1992)，由晚 期作用的介質(zhì)(例如服GB1)維持的異常調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)可能促進(jìn)在致 死性膿毒癥晚期形成組織損傷和器官功能失調(diào)。因此，能選擇性減弱 全身性HMGB1累積的試劑可能具有治療致死性膿毒癥的潛力。
許多非甾族消炎藥(NSAIDs，例如，阿司匹林、布洛芬和吲哚美
辛)不能抵御致死性膿毒癥(Villa等人1995),同樣不能顯著抑制 LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放(Hasselgren等人1985; Noronha-Blob等人 1993)。另一方面，中草藥丹參包含藥學(xué)物質(zhì)(例如丹參酮I、丹參酮 IIA和隱丹參酮)，所述藥學(xué)物質(zhì)能有效減弱巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞培養(yǎng) 物中內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGBl釋放。然而，由于差的溶解性和生物利用 度，丹參酮I和丹參酮IIA不能挽救患致死性膿毒癥的小鼠，甚至在 膿毒癥發(fā)作后24、 48、 72、和96小時(shí)重復(fù)施用后(存活率- 50%，對 照載體組；相對存活率=57%, TSN I組，12 mg/kg;存活率- 61%， TSN IIA組，12 mg/kg; N = 14小鼠/組，p >0. 05),這迫使我們?nèi)パ芯?作為潛在治療劑的其它水溶性衍生物。
用于心血管障礙患者的臨床批準(zhǔn)藥物TSNIIA-SS完全阻斷巨噬 細(xì)胞/單核細(xì)胞培養(yǎng)物中內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGB1釋放。TSNIIA-SS抑制 內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGB1釋放的機(jī)理仍不清楚，但部分歸因于其干擾 LPS-誘導(dǎo)的HMGB1細(xì)胞質(zhì)遷移的能力。盡管包含與糖皮質(zhì)激素類似的 骨架化學(xué)結(jié)構(gòu)，因?yàn)樘禺愋蕴瞧べ|(zhì)激素受體拮抗劑RU486不能消除 TSNIIA-SS-介導(dǎo)的HMGB1釋放的抑制，所以TSNIIA-SS似乎不使用糖 皮質(zhì)激素受體來抑制HMGB1釋放。有意思的是，丹參酮I能抑制磷酸 脂酶A2(Kim等人2002)，磷酸脂酶A2為一種通過產(chǎn)生溶血磷脂酰膽 堿來增強(qiáng)內(nèi)毒素-誘導(dǎo)的HMGBl釋放的酶(Chen等人2005)。類似地， 隱丹參酮能抑制乙酰膽堿酯酶(Gardella等人2002),乙酰膽堿酯酶 為消除HMGB-1-抑制的神經(jīng)遞質(zhì)、乙酰膽堿的酶(Borovikova等人 2000; Ren等人2004; Wang等人2004b)。因此，在未來研究中確定 TSNIIA-SS是否通過抑制sPLA2或乙酰膽堿而抑制服GB1釋放是重要 的。
在完全阻斷LPS-誘導(dǎo)的HMGB1釋放的濃度下，TSNIIA-SS不影 響大多數(shù)(62個(gè)中的58個(gè))其它細(xì)胞因子的釋放，表明在大多數(shù)其它 細(xì)胞因子中對抑制服GB1具有選擇性。甚至當(dāng)在LPS刺激后幾個(gè)小時(shí) 給藥，TSNIIA-SS在阻斷HMGB1釋放方面仍是有效地，使其與所有先 前已知的HMGB1抑制劑不同(包括丙酮酸乙酯、尼古丁和硬脂?；苎?br> 磷脂酰膽堿)(Chen等人2005; Ulloa等人2002; Wang等人2004b)。 這些獨(dú)特的性質(zhì)使我們能以延遲的方式策略性地施用TSNIIA-SS以 選擇性的減弱在膿毒癥晚期的全身性HMGB1累積。確實(shí)，在CLP后24 小時(shí)開始延遲施用TSNIIA-SS，在該時(shí)間點(diǎn)所有小鼠出現(xiàn)明顯的膿毒 癥征兆(一些小鼠開始死亡)，顯著地挽救患有膿毒癥的小鼠。
TSNIIA-SS不能減弱全身性一氧化氮累積，并且不能增加膿毒癥 晚期的平均動脈壓力的觀察與一氧化氮依賴性保護(hù)機(jī)制有爭議。盡管 TSNIIA-SS有時(shí)能降低單核細(xì)胞中LPS-誘導(dǎo)的TNF分泌(但在巨噬細(xì) 胞中不能)，其TNF-抑制活性不能說明其對抗致死性膿毒癥的保護(hù)作 用。首先，CLP后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)TNF全身性地積累(Villa等人1995)， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于策略性延遲施用TSNIIA-SS (CLP后24小時(shí))。同樣地，我們 觀察到延遲施用TSNIIA-SS沒有顯著減弱在膿毒癥晚期的TNF全身性 積累。其次，TNF可能在膿毒癥中具有保護(hù)作用，因?yàn)橛弥泻涂贵w來 抑制TNF活性沒有改善，實(shí)際上反而惡化膿毒癥動物模型中的存活 (Eskandari等人1992)。然而，仍需要確定TSNIIA-SS的TNF抑制 活性是否歸因于其對抗致死性內(nèi)毒素血癥的保護(hù)作用。
形成強(qiáng)對比的是，延遲施用TSNIIA-SS顯著減弱全身性HMGB1累 積，表明TSNIIA-SS部分通過減弱晚期作用的促炎介質(zhì)的全身性累積 來挽救致死性膿毒癥小鼠。然而，本研究不能消除這個(gè)可能性 TSNIIA-SS通過其它機(jī)理賦予對抗致死性內(nèi)毒素血癥或膿毒癥(例如 抑制HMGBl-介導(dǎo)的炎癥反應(yīng))的保護(hù)作用。確實(shí)，我們初步的實(shí)驗(yàn)數(shù) 據(jù)表明TNSIIA-SS在高達(dá)lOOpM的濃度下有效減弱小鼠巨噬細(xì)胞培 養(yǎng)物中HMGBl-誘導(dǎo)的TNF (50-60%)和一氧化氮(90-95%)的釋放，表明 TSNIIA-SS可以通過抑制HMGBl釋放和細(xì)胞因子活性來改善動物存活。
重復(fù)施用TSNIIA-SS阻斷在膿毒癥晚期形成肝損傷。值得注意的 是，評估主要發(fā)生在膿毒癥晚期(而不是早期)的器官損傷毫無疑問 是有問題的。例如，肝損傷不能在死于早期(CLP后36-48小時(shí))的3 只(總共15只)動物中評價(jià)，盡管這些動物在死亡前可能類似遭受肝 損傷。所以，在隨后的器官損傷評估中排除死亡的動物會導(dǎo)致低估
TNSIIA-SS-介導(dǎo)的對抗肝損傷的保護(hù)作用，特別是根據(jù)觀察HMGB1-特異性單克隆抗體類似地改善肝損傷(Qin等人2006)。
為了應(yīng)答膿毒癥損傷，嚙齒動物發(fā)展了早期增強(qiáng)的心血管應(yīng)答， 其特征在于CLP后5小時(shí)心輸出量的增加和總外周阻力的降低，之后 為一個(gè)晚期衰弱的心血管應(yīng)答，其表現(xiàn)為CLP后20 - 24小時(shí)心輸出量 的降低和總外周阻力的增加(Yang等人2002a)。作為用于中國心血管 障礙患者的有效藥劑，TSNIIA-SS顯著降低膿毒癥動物中總外周血管 阻力，但顯著增加心博量和心輸出量。臨床上， 一些重癥膿毒癥患者 具有正?；蚋叩男妮敵隽?，這引起了一個(gè)關(guān)于提高重癥膿毒癥患者心 輸出量(改善氧的遞送)和降低全身血管阻力(改善組織氧合作用)的 必要性的持續(xù)爭議，(Sharma and Dellinger 2003; Vincent 2003)。
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綜上所述，將發(fā)現(xiàn)獲得了本發(fā)明的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)和其他附帶的優(yōu)點(diǎn)。 由于在不背離本發(fā)明范圍內(nèi)可以對上述方法和組合物進(jìn)行各種改
變，意圖將包含在上述描述中和顯示于附圖中的所有內(nèi)容理解為是說 明性的而不是限制性的。
本說明書中引用的所有文獻(xiàn)通過參考并入本文。本文參考文獻(xiàn)的 討論只是意圖總結(jié)作者所作的插入，并不承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成現(xiàn)有 技術(shù)。申請人保留挑戰(zhàn)所引用的參考的準(zhǔn)確性和相關(guān)性的權(quán)利。
權(quán)利要求
1. 減弱促炎細(xì)胞因子從哺乳動物細(xì)胞釋放的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效減弱促炎細(xì)胞因子從該細(xì)胞釋放的量的水溶性丹參酮接觸。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所迷水溶性丹參酮是天然存在的丹 參酮的磺酸鈉衍生物。
3. 權(quán)利要求l的方法酸鈉
4. 權(quán)利要求l的方法;
5. 權(quán)利要求l的方法:
6. 權(quán)利要求l的方法:
7. 權(quán)利要求1的方法:其中所迷水溶性丹參酮是丹參酮IIA磺其中所述細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。其中所述促炎細(xì)胞因子是HMGB1。 其中所述促炎細(xì)胞因子是TNF。 其中所述細(xì)胞在哺乳動物中，所述哺乳的病癥。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述哺乳動物是人。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所迷病癥是闌尾炎、胃潰瘍、胃或 十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、潰瘍性結(jié)腸炎、假膜性結(jié)腸炎、急 性或缺血性結(jié)腸炎、憩室炎、會厭炎、弛緩不能、膽管炎、膽囊炎、 肝炎、克羅恩氏病、腸梗阻、腸炎、惠普耳氏病、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、 過敏性休克、免疫復(fù)合疾病、器官缺血、再灌注損傷、器官壞死、花 粉熱、膿毒癥、敗血病、內(nèi)毒素性休克、惡病質(zhì)、高熱、嗜曙紅細(xì)胞 肉芽腫、結(jié)節(jié)病、肉狀瘤病、膿毒性流產(chǎn)、附睪炎、陰道炎、前列腺 炎、尿道炎、支氣管炎、氣腫、鼻炎、嚢性纖維化、肺炎、矽肺病、 肺泡炎、細(xì)支氣管炎、咽炎、胸膜炎、竇炎、流行性感冒、呼吸道合 胞體病毒感染、皰疹感染、HIV感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎 病毒感染、彌漫性菌血癥、登革熱、念珠菌病、瘧疾、絲蟲病、阿米 巴病、包蟲嚢腫、燒傷、皮炎、皮肌炎、曬傷、蕁麻疹、疣、風(fēng)疹塊、 血管炎、脈管炎、心內(nèi)膜炎、動脈炎、動脈硬化癥、血栓性靜脈炎、 心包炎、心肌炎、心肌缺血、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、風(fēng)濕熱、阿爾茨海 默癥、腹部疾病、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫綜合征、腦膜炎、腦炎、多發(fā)性硬化、腦梗塞、腦栓塞、Guillame-Barre綜合征、神經(jīng) 炎、神經(jīng)痛、脊髓損傷、癱瘓、葡萄膜炎滲、關(guān)節(jié)炎滲、關(guān)節(jié)痛、骨 髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病、痛風(fēng)、牙周病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、滑膜 炎、重癥肌無力、甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼齊、古德帕斯徹氏綜合征、 白塞氏綜合征、同種異體移植物排異反應(yīng)、移植物抗宿主疾病、I型 糖尿病、強(qiáng)直性脊柱炎、貝格爾氏病、Retier氏綜合征或何杰金氏病。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中所述病癥是闌尾炎、胃潰瘍、胃 或十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、潰瘍性結(jié)腸炎、假膜性結(jié)腸炎、 急性或缺血性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝炎、克羅恩氏病、哮喘、 變態(tài)反應(yīng)、過敏性休克、器官缺血、再灌注損傷、器官壞死、花粉熱、 膿毒癥、敗血病、內(nèi)毒素性休克、惡病質(zhì)、膿毒性流產(chǎn)、彌漫性菌血 癥、燒傷、阿爾茨海默癥、腹部疾病、充血性心力衰竭、成人呼吸窘 迫綜合征、腦梗塞、腦栓塞、脊髓損傷、癱瘓、同種異體移植物排異 反應(yīng)和移植物抗宿主疾病。
11. 權(quán)利要求7的方法，其中所述病癥是膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。
12. 權(quán)利要求7的方法，進(jìn)一步包括給所述哺乳動物施用第二種抗炎藥。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所迷第二種抗炎藥是NSAID、水 楊酸酯、C0X抑制劑、C0X-2抑制劑或甾族化合物。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述病癥是膿毒癥、敗血病和/ 或內(nèi)毒素性休克，并且第二種治療是施用毒蕈堿激動劑、腎上腺髓質(zhì) 素、腎上腺髓質(zhì)素結(jié)合蛋白、乳脂肪球表皮生長因子VIII、激活蛋白 C或a 2A-腎上腺素能拮抗劑。
15. 抑制哺乳動物中炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的方法，所述方法包括 用有效抑制炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的量的水溶性丹參酮治療所述哺乳動 物，其中所述哺乳動物患有由炎性細(xì)胞因子級聯(lián)介導(dǎo)的病癥。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述水溶性丹參酮是天然存在的 丹參酮的磺酸鈉衍生物。
17. 權(quán)利要求l5的方法，其中所述水溶性丹參酮是丹參酮IIA 磺酸鈉。
18. 權(quán)利要求15的方法，其中所述哺乳動物是人。
19. 權(quán)利要求15的方法，其中所述病癥是膿毒癥、敗血病和/ 或內(nèi)毒素性休克，所述哺乳動物是人并且所述丹參酮是丹參酮IIA磺
20. 治療哺乳動物中炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的方法，所述方法包括 用有效抑制炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的量的丹參酮治療所述哺乳動物，其中 所述哺乳動物患有由炎性細(xì)胞因子級聯(lián)介導(dǎo)的病癥。
21. 權(quán)利要求21的方法，其中所述丹參酮是水溶性丹參酮。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述水溶性丹參酮是天然存在的 丹參酮的磺酸鈉衍生物。
23. 權(quán)利要求21的方法，其中所述水溶性丹參酮是丹參酮IIA 磺酸鈉。
24. 權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是膿毒癥、敗血病和/ 或內(nèi)毒素性休克，所述哺乳動物是人并且所述丹參酮是丹參酮IIA磺
25. 治療處于膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克風(fēng)險(xiǎn)中的哺乳 動物的方法，所述方法包括以有效減少或防止內(nèi)毒素性休克生理效應(yīng)的方式，用丹參酮IIA磺酸鈉治療所述哺乳動物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述生理效應(yīng)是HMGB1釋放。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述生理效應(yīng)是TNF釋放。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述生理效應(yīng)是N0釋放。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述生理效應(yīng)是致死性膿毒癥。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述哺乳動物是人。
31.治療遭受膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克的哺乳動物的方法，所述方法包括以有效減少或防止膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性 休克生理效應(yīng)的方式，給所述哺乳動物施用純化丹參酮。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述丹參酮是丹參酮I、丹參酮IIA或隱丹參酮。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述丹參酮是水溶性丹參酮。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述水溶性丹參酮是丹參酮IIA磺酸鈉。
35.權(quán)利要求31的方法，其中所述生理效應(yīng)是HMGB1釋放。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述生理效應(yīng)是TNF釋放。
37.權(quán)利要求31的方法，其中所述生理效應(yīng)是N0釋放。
38.權(quán)利要求31的方法，其中所述生理效應(yīng)是致死性膿毒癥。
39.權(quán)利要求31的方法，其中所述哺乳動物是人。
40.治療遭受膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克的哺乳動物的方法，所述方法包括以有效減少或防止膿毒癥生理效應(yīng)的方式，用包 含丹參或其提取物的組合物治療所述哺乳動物，其中所述組合物不包含降香。
41. 權(quán)利要求40的方法，其中所述組合物包含丹參。
42. 權(quán)利要求40的方法，其中所述組合物包含丹參的提取物。
43. 權(quán)利要求40的方法，其中所述提取物包含有機(jī)組分，其中 至少5wt。/。的有4幾組分是丹參酮。
44. 權(quán)利要求43的方法，其中至少10wt%的有機(jī)組分是丹參酮。
45. 權(quán)利要求43的方法，其中至少2SwtW的有機(jī)組分是丹參酮。
46. 權(quán)利要求43的方法，其中至少5Ow0。的有機(jī)組分是丹參酮。
47. 權(quán)利要求43的方法，其中至少80w"的有機(jī)組分是丹參酮。
48. 權(quán)利要求43的方法，其中至少95wt%的有機(jī)組分是丹參酮。
49，權(quán)利要求40的方法，其中所述生理效應(yīng)是HMGB1釋放。
50. 權(quán)利要求40的方法，其中所述生理效應(yīng)是TNF釋放。
51. 權(quán)利要求40的方法，其中所述生理效應(yīng)是NO釋放。
52. 權(quán)利要求40的方法，其中所述生理效應(yīng)是致死性膿毒癥。
53. 權(quán)利要求40的方法，其中所述哺乳動物是人。
54. 減弱NO從哺乳動物細(xì)胞釋放的方法，所述方法包括使所述 細(xì)胞與有效減弱NO從所述細(xì)胞釋放的量的水溶性丹參酮接觸。
55. 權(quán)利要求54的方法，其中所述水溶性丹參酮是天然存在的 丹參酮的磺酸鈉衍生物。
56. 權(quán)利要求54的方法，其中所述水溶性丹參酮是丹參酮IIA 磺酸鈉。
57. 權(quán)利要求54的方法，其中所述細(xì)胞是活的哺乳動物的部 分，所述哺乳動物處于由過量NO產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙的風(fēng)險(xiǎn)中或患有由過 量NO產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙。
58. 權(quán)利要求57的方法，其中所述障礙是休克、回腸炎、潰瘍 性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、譯喘、支氣管炎、氧化劑誘導(dǎo)的肺損傷、慢 性阻塞性氣道疾病、角膜營養(yǎng)不良、高眼壓癥、沙眼、盤尾絲蟲病、 視網(wǎng)膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼內(nèi)炎、牙周炎、關(guān)節(jié)炎、膿毒 性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核病、麻風(fēng)病、腎小球性 腎炎肉狀瘤、腎病、硬化性皮炎、曬傷、牛皮癬、濕疹、肌萎縮側(cè)索 硬化、硬化癥、癡呆(包括AIDS相關(guān)的神經(jīng)變性、阿爾茨海默病、腦 脊髓炎、病毒或自體免疫腦炎)、免疫復(fù)合血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 缺血性心臟病、心力衰竭、心肌病、腎上腺機(jī)能不全、高膽固醇血癥、 動脈硬化癥、骨質(zhì)疏松癥、先兆子癇、子癇、尿毒癥并發(fā)癥、慢性肝 功能衰竭、中風(fēng)、腦缺血、囊性纖維化、結(jié)核病、惡病質(zhì)、缺血/再灌 注、血液透析有關(guān)病癥、腎小球性腎炎、再狹窄、病毒感染的炎性后 遺癥、低氧癥、高壓氧驚厥及中毒、癡呆、西登哈姆氏舞蹈病、帕金 森氏病、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、癲 癇、科爾薩科夫氏精神病、腦血管障礙相關(guān)的低能、NO介導(dǎo)的腦外傷 及相關(guān)后遺癥、缺血性腦水腫(中風(fēng))、疼痛、偏頭痛、嘔吐、免疫 復(fù)合疾病，如免疫抑制劑、急性同種異體移植物排異反應(yīng)或癌癥。
59. 權(quán)利要求57的方法，其中所述障礙是膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。
60. 權(quán)利要求57的方法，其中所述哺乳動物是人。
61. 減弱哺乳動物中NO產(chǎn)生的方法，所述哺乳動物處于由過量 NO產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙的風(fēng)險(xiǎn)中，所述方法包括給所述哺乳動物施用有效 減弱所述哺乳動物中NO產(chǎn)生的量的水溶性丹參酮。
62. 權(quán)利要求61的方法，其中所述水溶性丹參酮是天然存在的 丹參酮的磺酸鈉衍生物。
63. 權(quán)利要求61的方法，其中所述水溶性丹參酮是丹參酮IIA
64. 權(quán)利要求61的方法，其中所述障礙是休克、回腸炎、潰瘍 性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、哮喘、支氣管炎、氧化劑誘導(dǎo)的肺損傷、慢 性阻塞性氣道疾病、角膜營養(yǎng)不良、高眼壓癥、沙眼、盤尾絲蟲病、 視網(wǎng)膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼內(nèi)炎、牙周炎、關(guān)節(jié)炎、膿毒 性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核病、麻風(fēng)病、腎小球性 腎炎肉狀瘤、腎病、硬化性皮炎、曬傷、牛皮癬、濕疹、肌萎縮側(cè)索 硬化、硬化癥、癡呆(包括AIDS相關(guān)的神經(jīng)變性、阿爾茨海默病、腦 脊髓炎、病毒或自體免疫腦炎)、免疫復(fù)合血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 缺血性心臟病、心力衰竭、心肌病、腎上腺機(jī)能不全、高膽固醇血癥、 動脈硬化癥、骨質(zhì)疏松癥、先兆子癇、子癇、尿毒癥并發(fā)癥、慢性肝 功能衰竭、中風(fēng)、腦缺血、嚢性纖維化、結(jié)核病、惡病質(zhì)、缺血/再灌 注、血液透析有關(guān)病癥、腎小球性腎炎、再狹窄、病毒感染的炎性后 遺癥、低氧癥、高壓氧驚厥及中毒、癡呆、西登哈姆氏舞蹈病、帕金 森氏病、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、癲 癇、科爾薩科夫氏精神病、腦血管障礙相關(guān)的低能、N0介導(dǎo)的腦外傷 及相關(guān)后遺癥、缺血性腦水腫(中風(fēng))、疼痛、偏頭痛、嘔吐、免疫 復(fù)合疾病，如免疫抑制劑、急性同種異體移植物排異反應(yīng)或癌癥。
65. 權(quán)利要求61的方法，其中所述障礙是膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。
66. 權(quán)利要求61的方法，其中所述哺乳動物是人。
67. 減弱哺乳動物中NO產(chǎn)生的方法，所述哺乳動物患有由過量 NO產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙，所述方法包括給所述哺乳動物施用有效減弱所述 哺乳動物中NO產(chǎn)生的量的純化丹參酮。
68. 權(quán)利要求67的方法，其中所述丹參酮是丹參酮I、丹參酮 IIA或隱丹參酮。
69. 權(quán)利要求67的方法，其中所述丹參酮是水溶性丹參酮。
70. 權(quán)利要求67的方法，其中所述水溶性丹參酮是丹參酮IIA 磺酸鈉。
71. 權(quán)利要求67的方法，其中所述障礙是休克、回腸炎、潰瘍 性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、哮喘、支氣管炎、氧化劑誘導(dǎo)的肺損傷、慢 性阻塞性氣道疾病、角膜營養(yǎng)不良、高眼壓癥、沙眼、盤尾絲蟲病、 視網(wǎng)膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼內(nèi)炎、牙周炎、關(guān)節(jié)炎、膿毒 性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核病、麻風(fēng)病、腎小球性 腎炎肉狀瘤、腎病、硬化性皮炎、曬傷、牛皮癬、濕疹、肌萎縮側(cè)索 硬化、硬化癥、癡呆(包括AIDS相關(guān)的神經(jīng)變性、阿爾茨海默病、腦 脊髓炎、病毒或自體免疫腦炎)、免疫復(fù)合血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 缺血性心臟病、心力衰竭、心肌病、腎上腺機(jī)能不全、高膽固醇血癥、 動脈硬化癥、骨質(zhì)疏松癥、先兆子癇、子癇、尿毒癥并發(fā)癥、慢性肝 功能衰竭、中風(fēng)、腦缺血、囊性纖維化、結(jié)核病、惡病質(zhì)、缺血/再灌 注、血液透析有關(guān)病癥、腎小球性腎炎、再狹窄、病毒感染的炎性后 遺癥、低氧癥、高壓氧驚厥及中毒、癡呆、西登哈姆氏舞蹈病、帕金 森氏病、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化、癲 癇、科爾薩科夫氏精神病、腦血管障礙相關(guān)的低能、N0介導(dǎo)的腦外傷 及相關(guān)后遺癥、缺血性腦水腫(中風(fēng))、疼痛、偏頭痛、嘔吐、免疫 復(fù)合疾病，如免疫抑制劑、急性同種異體移植物排異反應(yīng)或癌癥。
72. 權(quán)利要求67的方法，其中所述障礙是膿毒癥、敗血病和/ 或內(nèi)毒素性休克。
73. 權(quán)利要求67的方法，其中所述哺乳動物是人。
全文摘要
提供減弱促炎細(xì)胞因子從哺乳動物細(xì)胞釋放的方法。還提供抑制或治療哺乳動物中炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的方法。進(jìn)一步提供治療哺乳動物的方法，所述哺乳動物處于膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克的風(fēng)險(xiǎn)中或遭受膿毒癥、敗血病和/或內(nèi)毒素性休克。還提供減弱NO從哺乳動物細(xì)胞釋放的方法。還提供減弱哺乳動物中NO產(chǎn)生的方法，所述哺乳動物處于由過量NO產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙的風(fēng)險(xiǎn)中或患有由過量NO產(chǎn)生介導(dǎo)的障礙。
文檔編號A61K31/12GK101394860SQ200780007383
公開日2009年3月25日 申請日期2007年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日
發(fā)明者A·E·薩瑪, 王海潮, 陳大志 申請人:范斯坦醫(yī)藥研究院