專利名稱：分枝桿菌SecA2突變體的制作方法
分枝桿菌SecA2突變體 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交互參考
本申請(qǐng)要求于2006年1月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/758， 944的;^又益。
關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開(kāi)發(fā)的聲明
如資金No. R01 AI54540, AI26170, AI063537和AI57158的條款 所規(guī)定的，美國(guó)政府在本發(fā)明中具有已全部?jī)敻兜脑S可和在有限情況 下要求專利權(quán)人以合理?xiàng)l件許可他人的權(quán)利，上述所有資金都是由國(guó) 立衛(wèi)生院授予的。
背景技術(shù)：
(1) 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明總地涉及分枝桿菌疫苗。更加具體地，本發(fā)明涉及包含 SecA2突變的分枝桿菌組合物及其在誘導(dǎo)對(duì)分枝桿菌和抗原的免疫性 中的用途。
(2) 相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的說(shuō)明
結(jié)核分枝桿菌f妙co6s"er/咖MercWosisJ -結(jié)核病的病原， 導(dǎo)致每年比任何其它單一病原體更多的死亡(Corbett等，2003)。結(jié) 核分枝桿菌耐藥菌林的出現(xiàn)和HIV共感染導(dǎo)致這種疾病的影響越來(lái)越 惡化。該病原體顯示出非凡的破壞和抵抗其感染宿主的殺菌反應(yīng)的能 力。結(jié)核分枝桿菌毒力與其最初通過(guò)以許多不同方式規(guī)避宿主反應(yīng)而 在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活有關(guān)。結(jié)核桿菌存留在內(nèi)吞泡中(Armstrong和 Hart， 1975; Clemens和Horwitz， 1995)，后者由于結(jié)核分枝桿菌 介導(dǎo)宿主蛋白質(zhì)TACO滯留在這些泡的膜上而不能與溶酶體融合 (Gatfield和Pieters， 2000)。類(lèi)似地，結(jié)核分枝桿菌可以下調(diào) MHC-II (Noss等，2001)和共刺激分子(Stenger等，1998; Wadee等， 1995)的表達(dá)，調(diào)節(jié)其附近的細(xì)胞因子環(huán)境(VanHeyningen等，1997)
并抑制宿主細(xì)胞的凋亡(Keane等，1997)。盡管結(jié)核分枝桿菌規(guī)避i午 多宿主反應(yīng)以便在可居住的環(huán)境中維持自身，仍需要闡明介導(dǎo)這些效 應(yīng)的細(xì)菌效應(yīng)物。侵入宿主細(xì)胞后，在結(jié)核桿菌的膜和細(xì)胞壁外形成 了嚢樣的結(jié)構(gòu)(Daffe和Etienne， 1999),這一界面包含重要的參與 發(fā)病機(jī)制和對(duì)TB的免疫應(yīng)答的表面蛋白質(zhì)。位于分枝桿菌與其真核宿 主之間的界面上的分泌的和細(xì)胞被膜結(jié)合的蛋白質(zhì)介導(dǎo)宿主-病原體 相互作用。所以，這些蛋白質(zhì)是候選的毒力因子，值得進(jìn)一步研究 (Finlay和Falkow， 1997)。
有人提出結(jié)核分枝桿菌輸出型和分泌型蛋白質(zhì)在毒力方面發(fā)揮作 用，并且事實(shí)上導(dǎo)致對(duì)TB的免疫應(yīng)答(Abou-Zeid等，1988; Johansen 等，1996; Nagai等，1991; Zhang等，1992)。對(duì)幾種細(xì)菌病原體的 研究揭示大多數(shù)毒力因子是分泌型的(Finlay和Falkow, 1997)。研 究還強(qiáng)調(diào)了結(jié)核分枝桿菌的分泌型和輸出型蛋白質(zhì)對(duì)產(chǎn)生保護(hù)性免疫 應(yīng)答的重要性。這一特性最顯著的實(shí)證來(lái)自以下實(shí)驗(yàn)，其中將小鼠或 豚鼠用胞外蛋白質(zhì)免疫，引發(fā)出顯著的保護(hù)性免疫(Andersen, 1994; Hubbard等，1992; Pal and Horwitz， 1992; Roberts等，1995)。 近來(lái)，輸出型ERP(輸出型重復(fù)蛋白質(zhì))蛋白質(zhì)被顯示出促成結(jié)核分枝
桿菌的毒力(Berthet等，1998)。同樣地，超氧化物歧化酶(SOD)--
種培養(yǎng)物濾液組分，被顯示出通過(guò)干擾宿主凋亡而與毒力相關(guān)聯(lián) (Edwards等，2001)。盡管已經(jīng)研究了許多分泌型蛋白質(zhì)，但由于分 離膜蛋白樣品的技術(shù)限制，仍然缺乏對(duì)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的研究。
宿主細(xì)胞凋亡參與分枝桿菌屬的毒力和保護(hù)性免疫(例如， Alemdn等，2002; Balcewicz-Sablinska等，1998; Ciaramella等， 2000; Duan等，2001， 2002; Duarte等，1997; Eddine等，2005; Grode等，2005; Keane等，2000; Kornfeld等，1999; L6pez等， 2003; Protales-P6rez等，2002; Sly等，2003; Spira等，2003)。 但是，需要更多關(guān)于影響宿主細(xì)胞凋亡的分枝桿菌宿主基因的信息。 本發(fā)明正是致力于這種需要。
發(fā)明概述
相應(yīng)地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SecA2蛋白阻止宿主細(xì)胞凋亡。發(fā)明人還發(fā) 現(xiàn)不表達(dá)SecA2的分枝桿菌突變體提高了分枝桿菌誘導(dǎo)針對(duì)毒性分 枝桿菌或由分枝桿菌表達(dá)的重組抗原的免疫應(yīng)答的能力。
因而，本發(fā)明涉及分枝桿菌，其包含(a)不在&"2基因中的突變， 其中當(dāng)與無(wú)該突變的野生型分枝桿菌相比時(shí)，包含該突變的野生型分 枝桿菌在哺乳動(dòng)物中顯示減弱的毒力；和(b)在Sed2基因中的突變， 其中所述突變消除SecA2活性。
本發(fā)明還涉及包含在&"2基因中的突變的分枝桿菌，其中所述 突變消除SecA2活性。這些分枝桿菌不是結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿 菌況s/z/eg邁a 〃s入
此外，本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。該方法包括 對(duì)該哺乳動(dòng)物接種任何上述分枝桿菌。
本發(fā)明 還涉及在人中誘導(dǎo)針對(duì)致病性分枝桿菌的免疫應(yīng)答的方 法。該方法包括用分枝桿菌疫苗接種人。所述分枝桿菌疫苗包含含有 在5^"2基因中的突變的分枝桿菌，其中所述突變消除SecA2活性。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是顯示結(jié)核分枝桿菌A/ /W誘導(dǎo)THP-l細(xì)胞凋亡的前向光散 射和TUNEL測(cè)定的圖。
圖2是顯示結(jié)核分枝桿菌A/2/W和Ase"2細(xì)胞誘導(dǎo)THP-l細(xì)胞 凋亡的前向光散射和TUNEL測(cè)定的圖。
圖3是顯示恢復(fù)Asec^ 突變體分泌SodA逆轉(zhuǎn)"^^缺失對(duì)宿主 細(xì)胞凋亡的效應(yīng)的圖表和TUNEL測(cè)定圖。圖A是通過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的
基因在△ 結(jié)核分枝桿菌中恢復(fù)SodA分泌的策略的圖表。圖
B是顯示△ se"2結(jié)核分枝桿菌(而非△ se"2- oc SodA結(jié)核分枝桿菌) 誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的TUNEL測(cè)定的圖。
圖4是用來(lái)評(píng)估各種轉(zhuǎn)基因分枝桿菌在暴露于巨噬細(xì)胞后由誘 導(dǎo)0T-1細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-Y (IFNy)的能力的策略的圖表。用結(jié)核分枝 桿菌抗原與卵白蛋白抗原SIINFEKL的融合蛋白轉(zhuǎn)染分枝桿菌。來(lái)自凋
亡的轉(zhuǎn)基因分枝桿菌的融合蛋白將呈遞在巨噬細(xì)胞上，其中SIINFEKL 表位將被0T-1細(xì)胞識(shí)別，誘導(dǎo)0T-1細(xì)胞產(chǎn)生IFN y 。
圖5是顯示受感染的骨髓衍生巨噬細(xì)胞對(duì)SIINFEKL肽(OVA)的體 外交叉呈遞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的圖。A/2/W-19k-0VA和厶5^"2-19k-0VA的 IFN y產(chǎn)生表明△ /7/W和△ 突變體是凋亡性的。
圖6是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的圖，其顯示使用對(duì)在小鼠靜脈內(nèi)感染后第7天 收獲的脾細(xì)胞的特異性IFN Y ELISPOT分析，表達(dá)OVA (SIINFEKL)的 結(jié)核分枝桿菌突變體在體內(nèi)對(duì)CD8 T細(xì)胞的致敏。A/3/"-19k-OVA和 A5^d^l9k-0VA的IFN y產(chǎn)生表明△/ /"和△ SecJ2突變體是凋亡性 的。
圖7是顯示用于測(cè)定分枝桿菌感染對(duì)羧基焚光素二醋酸酯，琥珀 酰亞胺酯(CFSE)-標(biāo)記的0T-1脾細(xì)胞的增殖的影響的策略的圖表。
圖8是顯示誘導(dǎo)凋亡的結(jié)核分枝桿菌突變體厶/2/W-19k-OVA和 △ Se"2-19k-0VA活化幼稚CD8+ T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。
圖9是顯示測(cè)定分枝桿菌在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL免疫應(yīng)答的能力的策略 的圖表。
圖10是顯示結(jié)核分枝桿菌突變體△ / 7aJ-19k-OVA和A ^d2-19k-0VA誘導(dǎo)針對(duì)呈遞19k-OVA抗原的細(xì)胞的CTL應(yīng)答的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果的圖。
圖ll是顯示"d2突變體在鼠骨髓巨噬細(xì)胞中的生長(zhǎng)缺陷的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果的圖。骨髓衍生巨噬細(xì)胞獲自C57BL/6小鼠，將2xl()5個(gè)巨喧細(xì) 胞接種到腔式栽玻片上的孔中，隨后用結(jié)核分枝桿菌以1. 0的感染復(fù) 數(shù)(MOI)將巨噬細(xì)胞感染4小時(shí)。4小時(shí)后，洗滌巨噬細(xì)胞單層并加入 新鮮培養(yǎng)基。通過(guò)裂解所述單層并將連續(xù)稀釋的裂解物鋪平板來(lái)測(cè)定 CFU。顯示的菌林是H37Rv(方塊)和se"2突變體(圓圏)。該圖給出了 8次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的土SEM。
圖12是顯示"d2突變體引發(fā)更多來(lái)自INF-y處理的巨噬細(xì)胞 的活性氮中間體(RNI)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。通過(guò)用100U/ml鼠INF-y預(yù) 處理24小時(shí)激活來(lái)自C57B1/6小鼠的骨髓衍生巨噬細(xì)胞。以MOI 10
感染巨噬細(xì)胞。在整個(gè)4小時(shí)的細(xì)菌攝取期維持INF-y。攝取后，洗 滌單層并加入新鮮培養(yǎng)基。感染后24小時(shí)使用Griess試劑測(cè)量RNI。 該圖給出5次實(shí)驗(yàn)的平均值土SEM。
圖13是顯示""2突變體引發(fā)更多來(lái)自INF-y處理的THP-1細(xì) 胞的HLA-DR信使的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。在人INF- y存在的情況下以MOI 10 感染PMA分化的THP-1細(xì)胞24小時(shí)。使用TRIzol從受感染細(xì)胞中分 離總RNA。通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定HLA-DR表達(dá)。將HLA-DR表達(dá)相 對(duì)于18S核糖體RNA的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。該圖給出了 4次實(shí)驗(yàn)的平均值 之SEM。
圖14是顯示結(jié)核分枝桿菌A""2突變體在低劑量噴霧感染 C57BL/6小鼠中減毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。將免疫活性C57BL/6小鼠在整 體氣溶膠室中暴露于結(jié)核分枝桿菌H37Rv(畫(huà))或Ai ed2突變體(0)， 每只小鼠接受大約200 CFU(菌落形成單位)/肺。圖A:在感染后不同 時(shí)間點(diǎn)處死小鼠并通過(guò)鋪平板由肺勻漿測(cè)定CFU來(lái)評(píng)估菌林的生長(zhǎng)。 結(jié)果代表兩次實(shí)驗(yàn)。豐與A"a^突變體相比的p值為p < 0.005 (Student氏t檢驗(yàn))。圖B:監(jiān)測(cè)用各菌林感染的4只小鼠的組的存 活情況。
圖15是顯示結(jié)核分枝桿菌Asec^ 突變體在未活化的鼠骨髓衍生 巨噬細(xì)胞中減毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。以M0I-1用(圖A)結(jié)核分枝桿菌 H37Rv (■)或Ased2突變體(O)和(圖B) Asec^突變體(O)或Asec^ 補(bǔ)足突變體(A"^么attB:: secA2) (A)感染來(lái)自C57BL/6小鼠的未 活化的鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞。在感染后不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)將巨噬細(xì)胞裂 解物鋪平板來(lái)測(cè)定CFU。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)每個(gè)菌林以一式三份孔進(jìn)行感 染，誤差條代表對(duì)于一式三份孔的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯示的數(shù)據(jù)代 表對(duì)野生型和A""2突變體的超過(guò)20次實(shí)驗(yàn)，和對(duì)于補(bǔ)足菌林的5 次實(shí)驗(yàn)。豐與Asec^相比的p值是p < 0. 05 (Student氏t檢驗(yàn))。
圖16是顯示Ai ed2突變體在IFN- y處理的鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞 中的存活的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。在平行實(shí)驗(yàn)中在來(lái)自C57BL/6小鼠的(圖 A)活化的和(圖B)未活化的鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞中檢查Asec^突變體
和H37Rv的存活和生長(zhǎng)。通過(guò)用10 ng/ml rmINF-y預(yù)處理24小時(shí)來(lái) 活化巨噬細(xì)胞。如所述用H37Rv(B)或Ased^突變體(0)以M0I-1感 染巨噬細(xì)胞。圖中顯示了 5次實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。承與AsecA2突變體 相比的p值為p < 0. 05 ( Student氏t檢驗(yàn))。
圖17是顯示A""2突變體在來(lái)自小鼠的骨髓衍生巨噬細(xì)胞中減 毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，所述小鼠為吞噬細(xì)胞氧化酶組分缺陷型(phox—〃)。 用結(jié)核分枝桿菌H37Rv(在C57BL/6巨噬細(xì)胞中- ■;在phox+巨噬細(xì) 胞中□)和A"c^突變體(在C57BL/6巨噬細(xì)胞中-"在phox+巨 噬細(xì)胞中O)以M0I-1平行感染來(lái)自C57BL/6小鼠和來(lái)自(A) p47ph°x+ 或(B) gp9rh°x +的未活化的骨髓衍生巨噬細(xì)胞。圖中顯示多次實(shí)驗(yàn)(六 次p47—-/-，三次gp91—x+)的平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。 * 與Asec爿2相比的p值為p < 0. 05 ( Student氏t檢驗(yàn))。
圖18是顯示受感染的骨髓衍生巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果的圖。 <吏用Cytometric Bead Array試劑盒(BD Biosciences)須'J 量細(xì)胞因子。 一式三份以M0I=1感染來(lái)自C57BL/6小鼠的骨髓衍生巨 噬細(xì)胞。感染后24小時(shí)收集上清液并測(cè)定細(xì)胞因子。圖中顯示了未感 染的巨噬細(xì)胞(黑條)，或感染了 H37Rv(灰條)、Asec^突變體(白條)， 或A"d2補(bǔ)足菌林(陰影線條)的巨噬細(xì)胞中的(圖A)TNF-a或(圖 B)IL-6的細(xì)胞因子水平，誤差條描述了一式三份樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD)。顯示的數(shù)據(jù)代表八次實(shí)驗(yàn)。,與AsecA2突變體相比的p值為p < 0. 05 ( Student氏t檢驗(yàn))。
圖19是顯示由受感染的骨髓衍生巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氮中間體 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。使用Griess試劑測(cè)量RNI。以MOI-10進(jìn)行感染并 在感染后72小時(shí)收集樣品的未活化巨噬細(xì)胞(圖A)并在感染后24小 時(shí)收集IFN-Y活化的巨噬細(xì)胞(圖B)。條柱顯示未感染細(xì)胞(黑條)， 或感染H37Rv的細(xì)胞(灰條)，感染A"d2突變體的細(xì)胞(白條)，或感 染A""2補(bǔ)足菌林的細(xì)胞(陰影線條)的一式三份樣品的平均值，誤差 條表示一式三份樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。顯示的數(shù)據(jù)代表三次實(shí)驗(yàn)。* 與AsecA2突變體相比的p值為p < 0. 05 (Student氏t檢驗(yàn))。圖20是顯示Ased2突變體在來(lái)自小鼠的骨髓衍生巨噬細(xì)胞中減 毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，所述小鼠為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(N0S2)缺陷型。 如上所述，用結(jié)核分枝桿菌H37Rv(在C57BL/6巨噬細(xì)胞中麗；在 N0S2—/_中口)和Ased2突變體(在C57BL/6巨噬細(xì)胞中《;在N0S2+ 巨噬細(xì)胞中O)以M0I-1平行感染來(lái)自C57BL/6小鼠和來(lái)自N0S2+小 鼠的未活化的骨髓衍生巨噬細(xì)胞。圖中顯示的是四次實(shí)驗(yàn)的平均值土 平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。承與AsecA2突變體相比的p值為p < 0. 05 (Student氏t檢驗(yàn))。
圖21是顯示通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)量的II類(lèi)MHC表達(dá)的抑制的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。通過(guò)對(duì)由鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞或THP-1細(xì)胞制得的RNA 的qRT-PCR測(cè)定宿主mRNA表達(dá)。用結(jié)核分枝桿菌菌林以MOI-10感染
細(xì)胞并用rIFN-Y刺激，用rIFN-Y類(lèi)似地處理未感染的細(xì)胞。對(duì)于鼠 巨噬細(xì)胞，用結(jié)核分枝桿菌菌林感染細(xì)胞并在加入2 ng/ml rmIFN-Y 之前靜置21小時(shí)。加入rIFN-y后15小時(shí)取RNA樣品。對(duì)于THP-1 細(xì)胞，細(xì)胞同時(shí)用結(jié)核分枝桿菌感染并用200 ng/ml rhIFN-y進(jìn)行處 理。感染后24小時(shí)取RNA樣品。將qRT-PCR樣品相對(duì)于18S內(nèi)部對(duì)照 標(biāo)準(zhǔn)化。條柱表示在一天進(jìn)行的一式三份感染的經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的II類(lèi)MHC 水平，誤差條顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯示的數(shù)據(jù)代表對(duì)每種(A)鼠骨髓衍生巨 噬細(xì)胞和(B)THP-1細(xì)胞的5次實(shí)驗(yàn)。顯示的樣品為未感染的(黑條)， 或以H37Rv(灰條)，A"c^突變體(白條)，或補(bǔ)足菌林(陰影線條)感 染的細(xì)胞。*與野生型和補(bǔ)足型相比的p值為p < 0. 003 (Student氏 t檢驗(yàn))。 發(fā)明詳述
相應(yīng)地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SecA2蛋白阻止宿主細(xì)胞凋亡。發(fā)明人還發(fā) 現(xiàn)不表達(dá)SecA2的分枝桿菌突變體提高了分枝桿菌誘導(dǎo)針對(duì)毒性分 枝桿菌或由分枝桿菌表達(dá)的重組抗原的免疫應(yīng)答的能力。
因而，本發(fā)明涉及分枝桿菌，其包含(a)不在Sec^2基因中的突變， 其中當(dāng)與無(wú)該突變的野生型分枝桿菌相比時(shí)，包含該突變的野生型分 枝桿菌在哺乳動(dòng)物中顯示減弱的毒力；和(b)在Sed2基因中的突變， 其中所述突變消除SecA2活性。
這些分枝桿菌可以是任何種，例如恥垢分枝桿菌(脫^z e^z7a〃s)， 牛分枝桿菌(6oy")，鳥(niǎo)分枝桿菌(脫肝i咖)，草分枝桿菌(M ; 力/e"， 偶發(fā)分枝桿菌尸0"i7/7咖)，/"/V，副結(jié)核分枝桿菌(乂 ;^r^〃6ei"c〃/oW"，哈瓦那分枝桿菌(#. ^3&加)，瘰病分枝桿菌
scro/"u/sc函)，胞內(nèi)分枝桿菌(i/i"ace//u/are)，結(jié)核分枝 桿菌(t由環(huán)/,'s)，或堪薩斯分枝桿菌(ira扁"/)。-優(yōu)選地， 所迷分枝桿菌是牛分枝桿菌BCG或結(jié)核分枝桿菌，因?yàn)檫@些種作為疫 苗特別有用。
由于這些分枝桿菌通常在體內(nèi)使用，優(yōu)選所述分枝桿菌是無(wú)毒的 或被制成無(wú)毒的，例如，通過(guò)篩選無(wú)毒菌林或通過(guò)改造分枝桿菌使其 具有一個(gè)或多個(gè)能夠達(dá)到該目的的突變。許多這類(lèi)突變是本領(lǐng)域已知 的，例如使得分枝桿菌成為營(yíng)養(yǎng)缺陷型的突變，例如； a/2突變或Ars 突變，或消除致病性基因的突變諸如A/^缺失，如本領(lǐng)域已知的。因而， 不在Se"2基因中的突變優(yōu)選是RDl區(qū)的至少一部分中的缺失，或控 制維生素或氨基酸產(chǎn)生的基因中的缺失。參見(jiàn)例如國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)W0 03/070164，在此將其通過(guò)參考引用并入本文。還優(yōu)選用于本發(fā)明的分 枝桿菌可以在宿主中定殖，使得分枝桿菌對(duì)宿主提供長(zhǎng)期抗原性刺激， 從而建立強(qiáng)免疫應(yīng)答。
盡管可以使用非重組方法產(chǎn)生這些分枝桿菌，例如，使用誘變劑 并篩選AsecA2表型，但是優(yōu)選至少一種突變通過(guò)遺傳工程方法制成， 因?yàn)檫@些方法比非重組方法更為容易和準(zhǔn)確得多。
可選地，所述分枝桿菌可以進(jìn)一步包含可操作連接至啟動(dòng)子的重 組基因，當(dāng)該分枝桿菌感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，所述啟動(dòng)子指導(dǎo)該基因 的表達(dá)。優(yōu)選地，所述基因編碼抗原，例如贅生物、胂瘤或癌的抗原， 或最優(yōu)選人病原體的抗原，以便利用針對(duì)抗原的提高的免疫原性(作 為厶^eo^突變的結(jié)果)。在這些分枝桿菌中有用抗原的病原體(例如， 人病原體)的實(shí)例包括病毒(例如，HIV，丙肝病毒，皰滲病毒，'流感， 天花，白喉，破傷風(fēng)，麻滲，腮腺炎，狂犬病，脊髓灰質(zhì)炎病毒等)，
細(xì)菌(例如，致病性分枝桿菌，沙門(mén)氏菌屬等)，和真核寄生蟲(chóng)(例如， 瘧疾，利什曼原蟲(chóng)等)。
本發(fā)明還涉及包含在^ec^ 基因中的突變的分枝桿菌，其中所述 突變消除SecA2活性。這些分枝桿菌不是結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿 菌。但是，它們可以是任何其它分枝桿菌種。優(yōu)選地，所述分枝桿菌 是牛分枝桿菌，最優(yōu)選牛分枝桿菌BCG。如同以上所述的分枝桿菌， 這些分枝桿菌的突變優(yōu)選通過(guò)遺傳工程方法制得。也如同上述的分枝 桿菌，這些分枝桿菌可以進(jìn)一步包含可操作連接至啟動(dòng)子的重組基因， 當(dāng)該分枝桿菌感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，所述啟動(dòng)子指導(dǎo)該基因的表達(dá)。 優(yōu)選地，所述基因編碼抗原，例如贅生物、腫瘤或癌的抗原，或最優(yōu)選 人病原體的抗原。在這些分枝桿菌中有用抗原的病原體(例如，人病原 體)的實(shí)例包括病毒、細(xì)菌和真核寄生蟲(chóng)。
此外，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法。該方法包括對(duì)該 哺乳動(dòng)物接種任何上述分枝桿菌。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)人針對(duì)致病性分枝桿菌的免疫應(yīng)答的方法。所 述方法包括用分枝桿菌疫苗接種人。所述分枝桿菌疫苗包含含有在 ^"2基因中的突變的分枝桿菌，其中所述突變消除SecA2活性。優(yōu) 選地，所迷分枝桿菌疫苗包含牛分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌，最優(yōu)選牛分 枝桿菌BCG。
所述分枝桿菌疫苗中的分枝桿菌還可以進(jìn)一步包含不在^"2基 因中的突變，其中當(dāng)與沒(méi)有所述不在&"2基因中的突變的野生型分 枝桿菌相比時(shí)，包含所述不在Sed2基因中的突變的野生型分枝桿菌 在哺乳動(dòng)物中顯示減弱的毒力。當(dāng)疫苗所源自的野生型分枝桿菌是毒 性病原體例如結(jié)核分枝桿菌時(shí)，這些突變通常是重要的。優(yōu)選地，所 述不在^"^基因中的突變是RD1區(qū)的至少一部分中的缺失，或控制 維生素或氨基酸產(chǎn)生的基因中的缺失。
如同上面討論的分枝桿菌，所述分枝桿菌疫苗中的分枝桿菌可以 可選地進(jìn)一步包含可操作連接至啟動(dòng)子的重組基因，當(dāng)該分枝桿菌感 染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，所述啟動(dòng)子指導(dǎo)該基因的表達(dá)。優(yōu)選地，所述基
因編碼抗原，例如贅生物、胂瘤或癌的抗原，或最優(yōu)選人病原體的抗原，
以便利用針對(duì)抗原的提高的免疫原性(作為A5^"2突變的結(jié)果)。 在這些分枝桿菌中有用抗原的病原體(例如，人病原體)的實(shí)例包括病 毒、細(xì)菌和真核寄生蟲(chóng)。
在下列實(shí)施例中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案?？紤]說(shuō)明書(shū)或本 文所披露的發(fā)明的實(shí)施，在權(quán)利要求范圍內(nèi)的其它實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。意欲將說(shuō)明書(shū)連同實(shí)施例 一起僅僅 視作例示性的，本發(fā)明的范圍和精神由實(shí)施例后面的權(quán)利要求所指明。
實(shí)施例1.厶/2/W和Ase"2突變體的免疫學(xué)評(píng)估
使用免疫學(xué)和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)估A"/W(參見(jiàn)2006年1月12 日提交的PCT專利申請(qǐng)PCT/US06/01132)和△ se"2突變體 (Braunstein等，2003)誘導(dǎo)宿主凋亡和對(duì)分枝桿菌的免疫性的能力。
用結(jié)核分枝桿菌菌林H37Rv，厶A貝(HsuT，等，2003)， 和 Asec力2以M0I為10:1感染THP-1細(xì)胞(人髄/單核細(xì)胞系)。60小時(shí) 后收獲細(xì)胞，并如下通過(guò)TUNEL分析。以原位細(xì)胞死亡試劑盒(Roche) 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，所述試劑盒通過(guò)末端脫氧核普酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的向游 離3'-OHDNA末端添加熒光素dUTP來(lái)標(biāo)記鏈斷裂。通過(guò)測(cè)量前向和邊 緣光散射來(lái)評(píng)估受感染THP-1細(xì)胞的大小和復(fù)合性，并通過(guò)使用熒光 活化細(xì)胞分選儀(FACS)測(cè)定焚光素?fù)饺雭?lái)評(píng)估DNA斷裂(Schrijvers 等，2004)。用厶/2/W或Asec^ (但非Rv或厶^ /)感染的THP-1細(xì) 胞顯示廣泛的凋亡(圖1和2)。
結(jié)核分枝桿菌SecA2基因在超氧化物歧化酶A(SodA)分泌中發(fā)揮 作用(Braunstein等，2003)。從毒性結(jié)核分枝桿菌中缺失5W^2減弱 分枝桿菌在小鼠中的毒力。為了評(píng)估SecA2超氧化物歧化酶是否阻止 凋亡，通過(guò)用cxSodA質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染結(jié)核分枝桿菌AsecA2突變體來(lái) 恢復(fù)SodA活性(圖3A)。該載體呈現(xiàn)驅(qū)動(dòng)^W基因表達(dá)的Hsp60啟 動(dòng)子和Ag85信號(hào)序列(Braunstein等，2000)。這一質(zhì)粒驅(qū)動(dòng)SodA蛋 白質(zhì)的組成性表達(dá)，所述蛋白質(zhì)由SecAl系統(tǒng)分泌。這提供了不依賴
于SecA2的SodA蛋白質(zhì)，因而補(bǔ)足了 ASecA 突變體的SodA分泌缺 陷。用野生型結(jié)核分枝桿菌H37Rv， △ Sec〃突變體，和△ Se"2- oc SodA SOD恢復(fù)菌株感染THP-1細(xì)胞。如上所述利用TUNEL來(lái)評(píng)價(jià)THP-1細(xì) 胞的凋亡程度。如圖28B中所示，厶^"2突變體誘導(dǎo)凋亡，但厶^"2-菌林恢復(fù)了分枝桿菌抑制凋亡的能力。這表明SodA蛋白質(zhì)的 分泌能夠直接負(fù)責(zé)抑制感染誘導(dǎo)的凋亡。
據(jù)信凋亡通過(guò)使得病原體抗原可被旁觀樹(shù)突細(xì)胞呈遞而在宿主防 御中發(fā)揮作用(Schaible等，2003; Yrlid和Wick， 2000)。為了確 定巨噬細(xì)胞當(dāng)被誘導(dǎo)凋亡的分枝桿菌感染時(shí)是否比當(dāng)被不誘導(dǎo)凋亡的 分枝桿菌感染時(shí)呈遞更多的病原體抗原，將誘導(dǎo)凋亡的分枝桿菌菌林 △ sed2和A"/aJ，和抑制凋亡的菌林H37Rv(毒性)，△ i / 7和△ / a/7C"(減弱的毒力-參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩0 03/070164，通過(guò)參考引 用并入本文)用質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，所述質(zhì)粒構(gòu)建體包含在Hsp 60啟動(dòng) 子控制下的與雞卵白蛋白(0VA)的氨基酸殘基252-269 (SIINFEKL [SEQ ID NO: l])的編碼序列融合的19kDA脂蛋白抗原(圖4)，生成厶 secA2-19k-OVA， △ nlaA-19k-0VA， H37Rv-19k-0VA， ARDl-19k-0VA和 ApanCD-19k-0VA。這些菌林的每一林都與骨髓衍生巨噬細(xì)胞合并以便 感染巨噬細(xì)胞，隨后加入來(lái)自TCR轉(zhuǎn)基因0T-1小鼠的T細(xì)胞(SIINFEKL / H-2r特異性的)并通過(guò)ELISA測(cè)定干擾素-y (IFNy)。 OVA肽抗原 呈遞在巨噬細(xì)胞上的I類(lèi)匪C H-2Kb分子上，在那里OVA抗原被0T-1 細(xì)胞上的T細(xì)胞受體所識(shí)別，導(dǎo)致IFNy的產(chǎn)生(圖4)。如圖5中所示， 只有讓宿主凋亡的菌抹△ sed2-l 9k-0VA和△ / /a j-19k-OVA刺激0T-1 產(chǎn)生IFNy 。
通過(guò)將標(biāo)記了 5(6)-羧基熒光素二乙酸酯N-琥珀酰亞胺酯(CFSE) 的0T-1脾細(xì)胞(Thy 1.2+)注射入Thyl.l同類(lèi)小鼠體內(nèi)，然后在24 小時(shí)后用突變體分枝桿菌感染小鼠，來(lái)測(cè)定上述表達(dá)轉(zhuǎn)基因19k-0VA 融合蛋白的突變體在體內(nèi)刺激脾細(xì)胞增殖的能力。5-7天后，處死小 鼠并通過(guò)FACS分析其脾細(xì)胞以測(cè)定Thyl. 2+ T細(xì)胞中CFSE熒光的強(qiáng) 度(圖7)。 CFSE進(jìn)入細(xì)胞中并通過(guò)與胺反應(yīng)可逆地結(jié)合胞內(nèi)蛋白和細(xì)
胞表面蛋白。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，每個(gè)子細(xì)胞的熒光強(qiáng)度減半，所以增殖
細(xì)胞群(例如，抗原活化的T細(xì)胞)顯示如圖7右下所示的流式細(xì)胞熒 光曲線。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖8中。只有讓宿主凋亡的菌林A "d2-19k-0VA和Ai7/W-19k-0VA顯示體內(nèi)0T-1 T細(xì)胞活化。這表 明受感染細(xì)胞的凋亡促進(jìn)T細(xì)胞針對(duì)分枝桿菌抗原的致敏和活化。
用圖9中列出的體內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)測(cè)定來(lái)進(jìn)一步評(píng) 估誘導(dǎo)凋亡的突變體誘導(dǎo)針對(duì)分枝桿菌抗原的免疫應(yīng)答的能力。用上 述19k-0VA抗原分枝桿菌菌林對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。7-IO天后，對(duì)小鼠注 射以107個(gè)化71.2+ T細(xì)胞，所述細(xì)胞標(biāo)記了 (a)低濃度的CFSE和OVA SIINFEKL肽，或(b)高濃度的CFSE而無(wú)OVA肽。大約36h后，處死小 鼠并進(jìn)行FACS分析以定量低和高強(qiáng)度熒光性淋巴結(jié)細(xì)胞。當(dāng)小鼠具有 對(duì)OVA肽特異性的CTL應(yīng)答時(shí)，該反應(yīng)只會(huì)殺死CFSE1。細(xì)胞；CFSEhi細(xì) 胞應(yīng)不受影響并作為對(duì)照。
圖10顯示了該測(cè)定的結(jié)果。用誘導(dǎo)凋亡的分枝桿菌免疫的小鼠產(chǎn) 生了對(duì)攜帶OVA抗原的T細(xì)胞的CTL應(yīng)答，而用不誘導(dǎo)凋亡的類(lèi)似分 枝桿菌免疫的小鼠未產(chǎn)生CTL應(yīng)答。
實(shí)施例2.接種抑制宿主凋亡的結(jié)核分枝桿菌突變體減弱毒性結(jié) 核分枝桿菌的感染
對(duì)小鼠接種106個(gè)生物體的牛分枝桿菌BCG，實(shí)施例1中所述的具 有/3/W缺失的轉(zhuǎn)基因結(jié)核分枝桿菌(表1中的A/ /a力，組合了上述厶 和A/7/W缺失的轉(zhuǎn)基因結(jié)核分枝桿菌(Asecv^/A/ /a力，和如 國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O O3/070164 A2 (通過(guò)參考引用并入本文)中所述 具有i "7和pa/7中的缺失并表達(dá)轉(zhuǎn)基因李斯特菌溶胞素(如在Grode 等，2005中)的轉(zhuǎn)基因結(jié)核分枝桿菌(Ai^7/厶/7a/7"李斯特菌溶胞素)。 接種后兩個(gè)月，通過(guò)氣溶膠途徑用200 CFU的結(jié)核分枝桿菌Erdman 攻擊小鼠。攻擊后1個(gè)月和3個(gè)月評(píng)價(jià)肺和脾中的TB生長(zhǎng)。結(jié)果在表 1中提供。
表l.數(shù)值以lOgw表示
l個(gè)月迎旌
幼稚的(na'i've)6.30土0.065.35土0.07
BCG4.92+0.07(--1.38)4.24土0.18 (畫(huà).1.11)
4.52土0.15 (畫(huà)-1.78)4.04+0.24(--1.3"
△ secW/ △ "/a」5.25+0.08 (--1.05)4.27+0.20 (-.1.08)
3個(gè)月
幼稚的(nai've )5.43+0.024.93+0.10
BCG4.92+0.14 (畫(huà),0.51)4.31±0.11(-.0.62)
厶/j/a/(4.56+0.16(-0.87)3.79+0.26(-4.14)
△ sec爿2/厶刀/a爿5.17+0.14 (--0.26)4.88+0.09(-0.05)
在利用相同方案的第二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌A"d2和 △ /7/W，以及BCG的保護(hù)作用(表2)。 表2.
絲1個(gè)月肺1個(gè)月脾3個(gè)月肺3個(gè)月脾
幼稚的6. 67土0. 084. 61土0. 045. 78土0. 024. 79土0. 03
△4. 77土0. 07 (-1.90)3. 84土0. 11 (-0. 77)5. 16土0. 05 (-0. 62)4. 49土0. 15
厶/ /aJ5. 34之0. 08 (-1.33)4. 04土0. 19 (-0. 57)5. 38土0. 09 (-0. 40)4. 67土0. 07
BCG5. 52土0. 0215)3. 76土0. 08 (-0. 85)5. 73土0. 144. 67土0. 09
還測(cè)定了 BCG， A/7/W突變體，和AsecJ2/A/7/d突變體的細(xì)胞因 子誘導(dǎo)。用106個(gè)生物體接種后兩個(gè)月，通過(guò)氣溶膠途徑用200 CFU 的結(jié)核分枝桿菌Erdman攻擊小鼠。攻擊后的10天，取出肺細(xì)胞并利 用實(shí)時(shí)PCT分析細(xì)胞因子信使(message )(直接分析細(xì)胞而無(wú)體外刺 激)。結(jié)果在表3中報(bào)告，表示為相對(duì)于GAPDH管家基因的信使水平。
表3.
實(shí)驗(yàn)組IFN-yIL-12IL-4
幼稚的(naive )4. 0300. 8
BCG27250. 3
32160. 3
39201. 3
實(shí)施例3. SecA2突變體的進(jìn)一步表征
包含sed2基因的符合讀框的完全缺失的結(jié)核分枝桿菌突變體 mc23112在結(jié)核病鼠模型中毒力減弱(Braunstein等，2003) 。 SecA2是 一小組結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)輸出到培養(yǎng)物濾液中所需的輔助分泌因子 (Braunstein等，2003)。依賴于SecA2的蛋白質(zhì)之一是抗氧化劑超氧 化物歧化酶A (SodA) 。 Edwards等報(bào)道SodA減少的結(jié)核分枝桿菌菌林 毒力減弱，并且感染SodA-減毒型結(jié)核分枝桿菌菌抹的小鼠肺中的凋 亡細(xì)胞增加(Edwards等，2001)。上面的實(shí)施例1和2顯示sec A 突變 體導(dǎo)致宿主中凋亡增多并促進(jìn)抗原呈遞和T細(xì)胞活化。這與Schaible 等人(2003)—致，他們報(bào)道了結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的凋亡通過(guò)攜帶MTB 抗原至未感染的抗原呈遞細(xì)胞的凋亡泡來(lái)促進(jìn)抗原呈遞。這提示凋亡 增多可以促進(jìn)形成針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
分枝桿菌疫苗包括結(jié)核分枝桿菌疫苗和牛分枝桿菌BCG疫苗中整 合入促凋亡特性，可以在很大程度上有益于所引發(fā)的保護(hù)性應(yīng)答。因 此，結(jié)核分枝桿菌的Md2突變體和牛分枝桿菌的"d2突變體是改 進(jìn)型活分枝桿菌疫苗的候選物。所以構(gòu)建了牛分枝桿菌BCG的sed2 突變林。
具有se"2基因的符合讀框的缺失的牛分枝桿菌BCG突變體的構(gòu) 建.利用涉及自殺反選擇載體pMB179的等位基因交換策略來(lái)生成所迷 突變體(Braunstein等，2003)。用1 jj g堿處理的pMB179質(zhì)粒DNA對(duì) 牛分枝桿菌BCG Pasteur(W. R.Jacobs的菌抹收藏)和牛分枝桿菌BCG
Tice (Oranon)進(jìn)行電穿孔。自殺載體pMB179包含""^缺失等位基因 以及^3CA反選擇標(biāo)記和力/g(潮霉素抗性)選擇標(biāo)記。從每種菌林獲得 潮霉素抗性菌落，其源于pMB179上缺失的""2等位基因與染色體中 Md2的單一交換事件。這些單一交換菌株-牛分枝桿菌BCG Pasteur MB542和牛分枝桿菌BCG Tice MB543 -包含通過(guò)栽體力/g和^c"序列 分隔的突變型和野生型"c^等位基因。將MB542和MB543各自生長(zhǎng) 至飽和狀態(tài)并使用0. 5 ml接種10 ml 7H9-ADS培養(yǎng)基。生長(zhǎng)10天后， 將連續(xù)稀釋物平板接種至具有3%蔗糖的7H10-ADS瓊脂上。分枝桿菌 中^M的表達(dá)阻止在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。獲得源自兩個(gè)"d2等位基 因之間第二次重組事件的蔗糖抗性和潮霉素敏感性重組體。從重組體 中分離基因組DNA并進(jìn)行Southern分析以鑒定存在的等位基 因。用質(zhì)粒pMB146的1. 5 kb ^7oRI/#//^III片段對(duì)用fcoRI/i7//^111 消化的DNA進(jìn)行探針探測(cè)。獲得下列M(^2突變體MB544是牛分枝桿 菌BCG Pasteur的sed^突變體而MB546是牛分枝桿菌BCG Tice的 se"2突變體。得到的缺失突變體是"d2的符合讀框的未標(biāo)記突變， se"2基因的大部分缺失。全長(zhǎng)SecA2長(zhǎng)度為808個(gè)氨基酸，而sec^ 缺失突變只編碼SecA2框內(nèi)頭31個(gè)氨基酸和最后49個(gè)氨基酸。在這 兩種BCG突變體中的"cv^缺失都與相應(yīng)的結(jié)核分枝桿菌突變體中的 se"2缺失相同。
闡明結(jié)核分枝桿菌SecA2在巨噬細(xì)胞中的作用.對(duì)于結(jié)核分枝桿 菌突變體先前報(bào)道的在小鼠中的減毒表型是在早期感染過(guò)程中 的生長(zhǎng)缺陷(Braunstein等，2003)。在感染的該體內(nèi)生長(zhǎng)期間，結(jié)核 分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中復(fù)制。這提示se^2突變體對(duì)于在巨噬細(xì)胞中 生長(zhǎng)是缺陷型的。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，用H37Rv或sec^ 突變體感染 來(lái)自C57BL/6小鼠的鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞，并通過(guò)將巨噬細(xì)胞裂解物 鋪平板來(lái)測(cè)定與巨噬細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的活細(xì)菌的數(shù)目隨著時(shí)間的變化。這 些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，與H37Rv相比，sed2突變體在這些巨噬細(xì)胞內(nèi)生 長(zhǎng)的能力是缺陷型的(圖11)。這些結(jié)果與觀察到的結(jié)核分枝桿菌 se"2突變體的體內(nèi)生長(zhǎng)缺陷相符。
結(jié)核分枝桿菌抑制宿主的免疫應(yīng)答，這對(duì)于發(fā)病機(jī)理和形成保護(hù)
性免疫應(yīng)答可能是重要的(Beltan等，2000; Hussain等，19";Nau 等，2002;Noss等，2000)。本實(shí)施例顯示，經(jīng)IFN-y處理的感染了結(jié)核 分枝桿菌sed2突變體的細(xì)胞比感染了野生型結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌 林的相應(yīng)細(xì)胞更加高度活化。這提示SecA2在抑制巨噬細(xì)胞活化中的 作用，這可能解釋它在毒力中的作用。還提示用結(jié)核分枝桿菌或牛分枝 桿菌BCG的seo^突變體進(jìn)行免疫可通過(guò)增強(qiáng)的宿主細(xì)胞活化而引發(fā) 更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
如圖12和13中所示，用IFN-v處理并感染了 sec^2結(jié)核分枝桿 菌突變體的培養(yǎng)細(xì)胞比感染了 H37Rv的相同細(xì)胞更為活化(基于活性 氮中間體和HLA-DR/II類(lèi)MHC信使的產(chǎn)生增多)。
實(shí)施例4.結(jié)核分枝桿菌的SecA2分泌因子促進(jìn)在巨噬細(xì)胞中的生 長(zhǎng)并抑制宿主免疫應(yīng)答 實(shí)施例概述
SecA蛋白質(zhì)存在于所有細(xì)菌中，并且它是總的Sec-依賴型蛋白質(zhì) 輸出途徑的關(guān)鍵組分。結(jié)核分枝桿菌一個(gè)不尋常的特性是存在兩種 SecA蛋白SecAl -基本的"管家型"SecA，和SecA2 -輔助的分泌因子。 在此我們報(bào)道結(jié)核分枝桿菌的Ased2突變體對(duì)于在低劑量噴霧感染 CWBL/6小鼠早期的生長(zhǎng)方面是缺陷型的，此時(shí)所述桿菌主要在巨謹(jǐn) 細(xì)胞中復(fù)制。與這種體內(nèi)表型一致，我們發(fā)現(xiàn)A"d2突變體對(duì)于在來(lái) 自C57BL/6小鼠的巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)是缺陷型的。Ased2突變體對(duì)于 在來(lái)自phox—z-小鼠和來(lái)自N0S"—小鼠的巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)也是減毒的。 這些小鼠分別在生成活性氧中間體(ROI)的吞噬細(xì)胞氧化酶或生成活 性氮中間體(RNI)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶上是缺陷型的。這表明SecA2 在結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)生長(zhǎng)中發(fā)揮作用，所述生長(zhǎng)不依賴于針對(duì)這些 R0I或RNI的保護(hù)。感染了A""2突變體的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的 TNF- oc ， IL-6， RNI和IFN- y誘導(dǎo)的11類(lèi)MHC。這證明了結(jié)核分枝桿菌 SecA2在抑制巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答中的功能，這可以解釋SecA2在胞內(nèi)
生長(zhǎng)中的作用。我們的結(jié)果提供了結(jié)核分枝桿菌毒力和抑制宿主免疫 應(yīng)答之間關(guān)系的另 一個(gè)實(shí)例。 介紹
結(jié)核分枝桿菌-結(jié)核病的病原-在所有時(shí)候都是最成功的細(xì)菌病 原體之一。結(jié)核病的全球負(fù)擔(dān)處于其最高水平并包括不斷增加數(shù)目的
多重耐藥結(jié)核分枝桿菌感染(世界衛(wèi)生組織，2005)。需要新的抗結(jié)核病 預(yù)防和治療措施以控制這一健康危機(jī)，徹底了解結(jié)核分枝桿菌發(fā)病機(jī)
理將有助于實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。
結(jié)核分枝桿菌被吸入并被未活化的宿主巨噬細(xì)胞攝取，在那里它 能夠復(fù)制和存活。關(guān)于結(jié)核分枝桿菌如何在這些巨噬細(xì)胞中逃避宿主 防御知之甚少。涉及的過(guò)程可能是復(fù)雜和多因素的。在參與結(jié)核分枝 桿菌在巨噬細(xì)胞中存活的特性中，有所述桿菌阻斷吞噬泡酸化、阻斷 吞噬體-溶酶體融合和抵抗活性氧和氮中間體(ROI和RNI)的能力
(Koul等，2004; Smith, 2003)。
針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的早期先天免疫應(yīng)答包括巨噬細(xì)胞的Toll-樣 受體(TLR)刺激(Krutzik和Modiin， 2004; Quesniaux等，2004)。 TLR 信號(hào)傳遞導(dǎo)致RNI和促炎性細(xì)胞因子包括TNF-oc和IL-6的分泌。在 感染后期，發(fā)生適應(yīng)性TH1免疫應(yīng)答對(duì)宿主巨噬細(xì)胞的活化，導(dǎo)致抑 制胞內(nèi)生長(zhǎng)和控制結(jié)核分枝桿菌感染。I FN- y是這一反應(yīng)的重要介質(zhì)； 它上調(diào)抗分枝桿菌過(guò)程和巨噬細(xì)胞抗原呈遞(Flynn和Chan， 2001)。由 ifn- y誘導(dǎo)的抗分枝桿菌效應(yīng)物中的一種是rni，其由誘導(dǎo)型一氧化 氮合酶(N0S2)產(chǎn)生，盡管還存在其它的IFN- y依賴型效應(yīng)物機(jī)制 (Chan等，1992;MacMicking等，1997; MacMicking等，2003) 。 TNF-ct是 另一種在宿主控制結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮整體作用的細(xì)胞因子 (Bean等，1999; Botha和Ryffel， 2003; Flynn等，1995)。在對(duì)TNF-ot 報(bào)道的許多特性中，它能夠與IFN-y協(xié)同誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞強(qiáng)有力的抗分 枝桿菌活性(Chan等，1992;Flesch和Kaufmann， 1990; Flynn和 Chan,2001)。
越來(lái)越顯而易見(jiàn)的是，結(jié)核分枝桿菌能夠限制宿主免疫應(yīng)答和巨
噬細(xì)胞活化，并且這種抑制作用可能對(duì)于在巨噬細(xì)胞中存活是重要的
(Koul等，2004)。盡管取決于實(shí)驗(yàn)條件，有若干報(bào)道感染了毒性更 高的結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞，與被較低毒性或減毒的分枝桿菌感染 的巨噬細(xì)胞相比，產(chǎn)生的TNF-cx和/或RNI的水平或活性較低 (Balcewicz-Sablinska等，1998; Beltan等，2000; Falcone等，1994; Reed等，2004; Shimono等，2003)。以更加直接的方式已經(jīng)顯示結(jié)核分 枝桿菌抑制大腸桿菌(&c力er/c/ /a co7/)誘導(dǎo)的促炎性IL-12的表 達(dá)(Nau等，2002)。還已知結(jié)核分枝桿菌抑制IFN-y上調(diào)基因包括II 類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因(Fortune等，2005; Nagabhushanam等，2003; Noss等，2000; Pai等，2004)。對(duì)II類(lèi)MHC的 抑制減少參與在體內(nèi)形成有效TH1應(yīng)答的抗原呈遞。
在細(xì)菌發(fā)病機(jī)理中的一個(gè)共同主題是病原體的蛋白質(zhì)輸出和分泌 途徑對(duì)毒力的重要性。這些途徑將蛋白質(zhì)輸出細(xì)胞質(zhì)至細(xì)胞表面或?qū)?蛋白質(zhì)分泌出細(xì)菌。表面蛋白質(zhì)和分泌型蛋白質(zhì)都暴露于外部環(huán)境。 結(jié)果，這些蛋白質(zhì)理想地定位以保護(hù)細(xì)菌免受巨噬細(xì)胞攻擊或改變針 對(duì)桿菌的宿主免疫應(yīng)答(Coombes等，2004;Kurtz和Braunstein， 2005)。像所有細(xì)菌一樣，結(jié)核分枝桿菌具有常規(guī)的Sec途徑和Sec蛋 白質(zhì)用來(lái)將蛋白質(zhì)輸出細(xì)胞質(zhì)(Kurtz和Braunstein, 2005)。較為不尋 常的是結(jié)核分枝桿菌中存在兩種SecA蛋白質(zhì)(SecAl和SecA2) (Braunstein等，2001)。結(jié)核分枝桿菌的SecA2蛋白是一種輔助分泌 因子，其促進(jìn)一小組蛋白質(zhì)的分泌，包括超氧化物歧化酶(SodA)和過(guò) 氧化氫酶-過(guò)氧化物酶(KatG) (Braunstein等，2003)。這兩種酶都能解 毒氧自由基SodA將超氧化物轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和氧而KatG將過(guò)氧化氪 轉(zhuǎn)化為水和氧。KatG還能夠分解過(guò)氧亞硝酸鹽，后者是超氧化物和一 氧化氮的危險(xiǎn)反應(yīng)產(chǎn)物(Wengenack等，1999)。如先前在高劑量鼠結(jié)核 病^f莫型中使用結(jié)核分枝桿菌A"d2突變體所示，SecA2促成結(jié)核分枝 桿菌的毒力(Braunstein等，2003)。
在此描述的是結(jié)核分枝桿菌的A""2突變體在鼠感染噴霧模型 和在鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞中的研究。兩種模型的結(jié)果一致并且揭示了
SecA2在鼠感染早期和在未活化巨噬細(xì)胞中促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的 作用。使用來(lái)自phox+和N0S2+小鼠的巨噬細(xì)胞我們進(jìn)一步顯示SecA2 的作用并非簡(jiǎn)單地通過(guò)下列事實(shí)解釋，即不耐受由吞噬細(xì)胞氧化酶產(chǎn) 生的ROI或由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶產(chǎn)生的RNI。對(duì)比巨噬細(xì)胞針對(duì) A"^^突變體或親本H37Rv結(jié)核分枝桿菌感染的應(yīng)答，我們發(fā)現(xiàn)，基 于以下若干標(biāo)準(zhǔn)，感染了A"d2突變體的巨噬細(xì)胞更為活化增加的 TNF-oc， IL-6，RNI和IFN-y調(diào)節(jié)的II類(lèi)MHC。這表明SecA2在結(jié)核分 枝桿菌抑制免疫應(yīng)答中的作用，其可能對(duì)于在宿主中存活和發(fā)病機(jī)理 是重要的。
材料和方法
細(xì)菌菌抹和生長(zhǎng)條件.將本研究中所用的結(jié)核分枝桿菌菌株 H37Rv，mc23112(A^d2突變體，來(lái)自單個(gè)菌落的原種)和mc23116 (A鄉(xiāng)"，a〃A，ec^力(Braunstein等，2003)生長(zhǎng)在Middlebrook 7H9肉湯(Difco)中，所述肉湯含有0. 2%甘油，1 X ADS(白蛋白葡萄糖 鹽水)和0. 05% Tween 80(Tw)。適宜時(shí)，向培養(yǎng)基中添加抗生素卡那 霉素(2Q)ag/ml)。
動(dòng)物.雌性C57BL/6小鼠購(gòu)自Charles River Laboratories。如 先前所述生成并維持p47一"-小鼠(Barry-lane等，2001) 。 gp91ph°x—廠 小鼠和N0S2_/—小鼠購(gòu)自Jackson Laboratories,所有小鼠都圏養(yǎng)在無(wú) 菌微柵籠中并隨意給予經(jīng)高壓滅菌的食物和水。兩種phox〃—小鼠抹系 都維持在其水中伺以磺胺甲惡唑(200 mg/5ml)和甲氧節(jié)咬(40 mg/5ml) (Hi-Tech Pharmacal)的抗生素口服混懸液以預(yù)防才幾會(huì)性感 染。
噴霧感染.將38-45天齡的雌性C57BL/6小鼠用于噴霧研究。將結(jié) 核分枝桿菌菌林培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(0D600 ~ 0. 5-1. 0)。將培養(yǎng)物洗滌一 次并重懸于含有0.05% Tween 80 (PBS-Tw)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中 至1 x 107 CFU(菌落形成單位)/ml的濃度。將細(xì)菌懸液置入整體暴露 氣溶膠室的噴霧罐(Mechanical Engineering Workshop, Madison, WI) 中。將小鼠暴露15分鐘，室吹洗(purge)時(shí)間為20分鐘。在特定的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)co2窒息從每一組處死四只小鼠并取出肺、肝和脾，在 含有IOO ng/ml環(huán)已酰亞胺和50 |i g/ml羧節(jié)西林的PBS-Tw中均漿。 將勻漿鋪至含有10mg/ml環(huán)已酰亞胺的7H10 ADS甘油平板上進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。
巨噬細(xì)胞感染.如下從C57BL/6, p47ph°x+， gp9rh。"—，和N0S2+小鼠 制備骨髓衍生巨噬細(xì)胞。通過(guò)C02窒息處死小鼠并取出股骨。使用包 含10°/。熱滅活胎牛血清(HI-FBS) ， 2mM谷酰胺和IX非必需氨基酸(NEAA) 的補(bǔ)充型DMEM(Sigma)將細(xì)胞沖洗出股骨。將細(xì)胞洗兩次并于補(bǔ)充型 DMEM中在20% L929條件培養(yǎng)基(LCM)存在的情況下培養(yǎng)6天。6天后， 使用5mMEDTA(PBS中)取出細(xì)胞，用補(bǔ)充型DMEM洗兩次，并重懸于含 有10% LCM的補(bǔ)充型DMEM中。隨后將細(xì)胞接種入8孔腔式載玻片的孔 中(2xl05巨噬細(xì)胞/孔)，或24孔板的孔中(8xl05巨噬細(xì)胞/孔)，使其 貼壁過(guò)夜，然后進(jìn)行感染。在一些實(shí)驗(yàn)中，在感染前用10ng/ml重組 鼠IFN-y (rmIFN-y ， Chemicon)預(yù)處理巨噬細(xì)胞24小時(shí)。由生長(zhǎng)對(duì) 數(shù)中期取結(jié)核分枝桿菌菌林并在PBS-Tw中洗一次。將細(xì)胞重懸于 PBS-Tw中并進(jìn)一步在補(bǔ)充型DMEM中稀釋至適當(dāng)?shù)腃FU/ml。向細(xì)胞單 層中加入合適濃度的細(xì)菌以達(dá)到感染復(fù)數(shù)(MOI)為1或10。將巨謹(jǐn)細(xì) 胞感染4小時(shí)，此時(shí)用補(bǔ)充型DMEM將單層洗三次以去除任何非細(xì)胞關(guān) 聯(lián)的細(xì)菌，隨后加回含有10% LCM的新鮮培養(yǎng)基。在不同的時(shí)間點(diǎn)， 從孔中取出培養(yǎng)基并用0.1% Tween 80和強(qiáng)烈抽吸裂解細(xì)胞。將裂解 物在PBS-Tw中稀釋并鋪至7H10 ADS甘油0. 05% Tw板上進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。 RNI測(cè)量.我們^f吏用Griess試劑(Molecular Probes)并按照廠商 規(guī)程測(cè)量RNI。簡(jiǎn)言之，使用0.2 jum低蛋白結(jié)合濾器，將來(lái)自受感 染巨噬細(xì)胞單層的上清液過(guò)濾除菌兩次，并以1: l與Griess試劑混合。 于548nm測(cè)量樣品，并使用以亞硝酸鈉生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線將數(shù)值轉(zhuǎn)化為 iaM亞硝'酸鹽。
體外敏感性測(cè)定.將細(xì)菌在7H9 ADS甘油Tw中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期， 洗滌，并在PBS-Tw中稀釋至大約lxl06CFU/ml的密度。通過(guò)比較來(lái)自 處理樣品的CFU數(shù)與未處理樣品的CFU數(shù)，對(duì)每種菌林測(cè)定殺傷百分
比。釆用下列的處理熱激(53。C， 45分鐘)和酸性pH (pH4. 0， 24小時(shí))。 使用多種化合物進(jìn)行體外ROI殺傷測(cè)定。我們檢驗(yàn)了對(duì)次黃嘌呤/黃嘌 呤氧化酶的敏感性(0和3小時(shí))(250juM次黃嘌呤)(Sigma)/黃嘌呤氧 化酶(Q. lU/ml黃嘌呤氧化酶)(Roche)，存在或不存在過(guò)氧化氫酶 (lU/ml) (Sigma)，加入來(lái)解毒生成的過(guò)氧化氫(DeGroote 等，1997; Piddington等，2001)。檢驗(yàn)的其它生成R0I的化合物包括過(guò) 氧化氫(O， 5， 10mM， 4小時(shí))，白花丹素(O. 2mM, 3. 5, 7. 5， 10. 5小時(shí))， 焦沒(méi)食子酚(2 mM， 0， l，和4小時(shí))，和過(guò)氧化氫枯烯(O. 5mM， 0， 1和4 小時(shí))(Sigma)。使用精脒nonoate(SPER/N0)檢測(cè)對(duì)RNI的體外敏感性 (200juM， 0和4小時(shí))(Alexis Biochemicals)。所有的體外ROI和 RNI測(cè)定都在37°C進(jìn)行。
細(xì)胞計(jì)數(shù)微珠測(cè)定(CBA).如上所述進(jìn)行骨髓衍生巨噬細(xì)胞的感 染，以M0I為1來(lái)感染細(xì)胞。在感染后24小時(shí)從感染的巨噬細(xì)胞收集 上清液并通過(guò)0. "jum低蛋白結(jié)合濾器過(guò)濾2次，將上清液保存在 _80°C。使用小鼠炎癥CBA試劑盒(BD Biosciences)才艮據(jù)廠商的規(guī)程來(lái) 進(jìn)行CBA。在BD Biosciences FACSCalibur流式細(xì)胞儀上分析樣品。 將對(duì)每種菌株的一式三份樣品取平均值并將數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn) 偏差。
定量實(shí)時(shí)-PCR (qRT-PCR)測(cè)定感染巨噬細(xì)胞的IFN- Y反應(yīng).如上 所述制備鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞并以M0I為10感染3小時(shí)，此時(shí)洗去未 摻入的細(xì)菌并將新鮮培養(yǎng)基加回單層。感染后21小時(shí)，從單層取出培 養(yǎng)基并更換為含2 ng/ml rmIFN-y的新鮮培養(yǎng)基。rmIFN-y處理15 小時(shí)后，取出上清液，并用TRIzol試劑(Invitrogen)裂解單層。將人 單核細(xì)胞系THP-1(ATCC TIB-202)維持在含有10% HI-FBS的補(bǔ)充型 RPMI中。為了制備THP-1細(xì)胞進(jìn)行感染，將它們?cè)诤蠪BS的新鮮RPMI 中洗滌兩次，重懸于含有50ng/ml乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA) (Sigma)的 含F(xiàn)BS的RPMI中，并以2 x 106細(xì)胞/孔接種于6孔組織培養(yǎng)板中。 24小時(shí)PMA處理后，在200ng/ml重組人IFN-y (rhIFN-y Pierce)存 在下以M0I為10感染細(xì)胞4小時(shí)。攝取后，洗滌細(xì)胞并加入含有rhIFN-Y的新鮮培養(yǎng)基。感染后24小時(shí)，從受感染的單層取出上清液并用 TRIzol裂解細(xì)胞。對(duì)TRIzol裂解物處理進(jìn)行RNA抽提。將RNA樣品 逆轉(zhuǎn)錄并使用帶有Absolute QPCR Mix的Taq-Man序列檢測(cè)系統(tǒng)
(Applied Biosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR?；趯?duì)每種基因生成的標(biāo)準(zhǔn)曲 線來(lái)計(jì)算數(shù)值。通過(guò)將II類(lèi)MHCmRNA的拷貝數(shù)除以18S rRNA的拷貝 數(shù)來(lái)確定樣品的標(biāo)準(zhǔn)化。18S探針(5， -TAMRA-CAAATTACCCACTCCCGACCG -3， [SEQ ID N0:2])和引物F(5' -GCTGCTGGCACCAGACTT-3， [SEQ ID N0:3])和R(5' -CGGCTACCACATCCAAGG-3， [SEQ ID N0:4]);鼠II類(lèi) MHC(I-Ab)探針(5'-FAM-CGCAGCGCATACGATATGTGACCA-TAMRA-3' [SEQ ID N0:5])和引物Rev(5'-CTGTCGTAGCGCACGTACT-3' [SEQ ID N0:6〗) 和 Fo^(5,-GGCGAGTGCTACTTCACCA-3, [SEQ ID N0:7]);人 II 類(lèi) MHC (HLA-DRA) 探 針 (5' -FAM-CTGGACCCTTTGCAAGAACCCTTCCC-TAMRA-3' [SEQ ID N0:8〗)和引物F (5'-TCCAATGAACGGAGTATCTTGTGT-3' [SEQ ID NO: 9])和 R(5'-TGAGATGACGCATCTGTTGCT-3' [SEQ ID NO: 10]) (Gehring等，2003; Wengenack等，1999)。 結(jié)果
A""2突變體在鼠低劑量噴霧感染模型中減毒.先前,有人證明 結(jié)核分枝桿菌的符合讀框和未標(biāo)記的AsecA2缺失突變體在小鼠中高 劑量靜脈內(nèi)施用后減毒(Braunstein等，200D。為了更好地表征 △secA2突變體的表型，我們使用更加天然的低劑量噴霧暴露模型，用 大約200個(gè)桿菌感染C57BL/6小鼠的肺，并包括比先前所分析的更早的 時(shí)間點(diǎn)。用AsecA2突變體或毒性結(jié)核分枝桿菌親本H37Rv感染后，在 感染后時(shí)間處死各組小鼠，通過(guò)將勻漿鋪平板觀察菌落形成單位(CFU) 來(lái)計(jì)數(shù)肺、肝和脾中的細(xì)菌負(fù)荷。對(duì)于H37Rv我們?cè)谛∈蟮姆沃杏^察 到了典型的生長(zhǎng)模式在感染早期顯著生長(zhǎng)，隨后是持續(xù)期，在此期間 桿菌的數(shù)目隨時(shí)間保持恒定(Orme和Coll ins, 1994)(圖14A)。生長(zhǎng)期 與持續(xù)期之間的轉(zhuǎn)換與建立TH1應(yīng)答相關(guān)聯(lián)，它的核心特征是巨謹(jǐn)細(xì) 胞被IFN-y活化(North和Jung, 2004; Orme和Collins, 1994)。當(dāng)與 HWRv相比時(shí)，A""2突變體在感染的早期生長(zhǎng)期中有缺陷。早在感
染后9天，與H37Rv相比，Asec^突變體在肺中具有少一個(gè)對(duì)數(shù)的桿 菌(圖14A)。這一區(qū)別在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都得以保持，盡管兩種菌株 都繼續(xù)生長(zhǎng)至第16天的時(shí)間點(diǎn)。我們還觀察到，當(dāng)與H37Rv相比時(shí)， Ased2突變體在肝和脾中的CFU較少(少0. 5-1. 0 log)(數(shù)據(jù)未顯示)。 在感染的后期，A"^2突變體在持續(xù)方面與H3 Rv類(lèi)似，盡管在最后 第80天的時(shí)間點(diǎn)，在A^d2突變體感染小鼠的肺中的CFU負(fù)荷略微 下降。除了減少的桿菌負(fù)荷之外，與感染了 H37Rv的小鼠(平均存活 173 ±16天)相比，感染了A"c^ 突變體的小鼠顯示存活長(zhǎng)度增長(zhǎng)(平 均存活372±29天(圖14B)。
Ase^^突變體在未活化的巨噬細(xì)胞中具有減毒的表型，但在活化 的巨噬細(xì)胞中則并非如此。觀察到的A"c^突變體的體內(nèi)表型表明 SecA2在感染早期的作用，在此期間結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)。 假設(shè)A"" 突變體對(duì)于在未活化的巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)是缺陷型的。通過(guò) 將A"d 突變體和H37Rv在來(lái)自C57BL/6小鼠的未活化骨髓衍生巨噬 細(xì)胞中復(fù)制的能力進(jìn)行比較，來(lái)檢驗(yàn)這一假說(shuō)。離體感染巨嗟細(xì)胞， 攝取4小時(shí)后洗滌單層并加回新鮮培養(yǎng)基。通過(guò)將巨噬細(xì)胞裂解物鋪 平板計(jì)算活CFU，在5天的時(shí)間內(nèi)評(píng)價(jià)每種菌抹的生長(zhǎng)。Ased2突變 體顯示在巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)減弱，并到第5天顯示少了高達(dá)一個(gè)對(duì)數(shù)的 CFU(圖15A)。通過(guò)將野生型拷貝的secA2引入整合質(zhì)粒上而補(bǔ)足了 A"^^突變體的胞內(nèi)生長(zhǎng)缺陷，這表明突變體表型歸因于secA2的缺 乏(圖15B)。
與允許結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的未活化的巨噬細(xì)胞形成對(duì)比的是，活 化的巨噬細(xì)胞由于增強(qiáng)的抗分枝桿菌活性而抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng) (Chan等，1992; Flesch and Kaufmann， 1990; Flyrm and Chan， 2001)。 我們?cè)谟弥亟M鼠IFN-y (rmIFN-y)預(yù)處理24小時(shí)而活化的鼠骨髓衍 生巨噬細(xì)胞中比較了Asecy^突變體和H37Rv。在經(jīng)IFN-y處理的巨鎮(zhèn) 細(xì)胞中，H3 Rv隨時(shí)間未能生長(zhǎng)但存活，Asec〃突變體的表現(xiàn)類(lèi)似(圖 16A)。平行進(jìn)行對(duì)未活化的巨噬細(xì)胞的感染，并且再次揭示了 Asec^ 突變體的胞內(nèi)生長(zhǎng)缺陷(圖16B)。
這些結(jié)果揭示了 SecA2在促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌在未活化的巨噬細(xì)胞 中生長(zhǎng)的作用，但SecA2對(duì)于結(jié)核分枝桿菌在活化的巨噬細(xì)胞中存活 沒(méi)有明顯作用。其與體內(nèi)生長(zhǎng)模式相一致，其中厶""2突變體顯示 在感染的早生長(zhǎng)期在肺中的生長(zhǎng)減弱，隨后在出現(xiàn)TH1免疫應(yīng)答和伴 隨的巨噬細(xì)胞活化后與H37Rv表現(xiàn)類(lèi)似。
A"c^突變體在氧化爆發(fā)(oxidative burst)缺陷型巨噬細(xì)胞 中具有減毒表型.先前報(bào)道結(jié)核分枝桿菌的A""2突變體在分泌抗 氧化酶SodA和KatG方面是缺陷型的(Braunstein等，2003)。結(jié)核分 枝桿菌相對(duì)耐受R0I(Chan等，1992)，對(duì)于面對(duì)巨噬細(xì)胞氧化爆發(fā)而 在胞內(nèi)存活這可能是一種重要特性，并且SecA2依賴性分泌的SodA和 KatG是參與這種耐受性的結(jié)核分枝桿菌分子(Smith, 2003)。檢驗(yàn) SecA2在巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)中的唯一作用是否是保護(hù)桿菌免受胞內(nèi)感染期 間的氧化爆發(fā)。制備來(lái)自p47一-, gP91ph°x-7-,和C57BL/6小鼠的骨髓 衍生巨噬細(xì)胞并平行地感染A""2突變體或H37Rv。這些phox+小鼠 缺乏吞噬細(xì)胞氧化酶復(fù)合物的不同組分，所述吞噬細(xì)胞氧化酶復(fù)合物 負(fù)責(zé)巨噬細(xì)胞的氧化爆發(fā)(Nauseef, 2004)。在這些氧化爆發(fā)缺陷型巨 噬細(xì)胞中，A;yed^突變體顯示了與在野生型C57BL/6巨噬細(xì)胞中觀察 到的相同的生長(zhǎng)缺陷(圖17)。這表明SecA2即使在不存在氧化爆發(fā)的 情況下也有助于胞內(nèi)生長(zhǎng)。因此，在僅僅保護(hù)桿菌免受氧化爆發(fā)期間 生成的ROI攻擊之外，SecA2必然在胞內(nèi)生長(zhǎng)中也具有功能。
作為對(duì)SecA2在保護(hù)對(duì)抗氧自由基方面的作用的獨(dú)立評(píng)估，在 A"cX 突變體和H37Rv之間比較了對(duì)多種ROI物質(zhì)的體外敏感性。 檢驗(yàn)的化合物有焦沒(méi)食子酚和次黃噤呤/黃嘌呤氧化酶；這兩種處理都 生成胞外超氧化物。還檢驗(yàn)了白花丹素(細(xì)胞質(zhì)超氧化物生成劑)，過(guò) 氧化氫，和過(guò)氧化氫枯烯。在所有情形中，對(duì)Ased2突變體和H37Rv， ROI處理都顯示等同程度的殺傷(數(shù)據(jù)未顯示)。還對(duì)菌株測(cè)試了它們 對(duì)其它應(yīng)激的敏感性，包括酸性pH和熱激。同樣，在殺傷上沒(méi)有明顯 差異。A"^2突變體未改變的體外敏感性結(jié)合來(lái)自phox—〃巨噬細(xì)胞的 數(shù)據(jù)提示，SecA2在促進(jìn)在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)中的作用不僅僅是保護(hù)細(xì)
菌免受破壞性ROI攻擊，而是涉及其它機(jī)制。
感染Ase"2突變體的巨噬細(xì)胞釋放較高水平的促炎性細(xì)胞因子 和RNI.為了確定SecA2-依賴性分泌途徑是否促成結(jié)核分枝桿菌抑制 宿主免疫應(yīng)答，在感染了A""2突變體或H37Rv的巨噬細(xì)胞中比較了 細(xì)胞因子的產(chǎn)生。如前對(duì)來(lái)自C57BL/6小鼠的骨髓衍生巨噬細(xì)胞進(jìn)行 感染，感染后24小時(shí)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)微珠陣列(BDBiosciences)對(duì)上清 液測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生。感染了A""2突變體的巨噬細(xì)胞比感染H37Rv 的巨噬細(xì)雞產(chǎn)生更多的TNF-ot和IL-6(圖18)， TNF-ot的平均差異為 2. 5倍而IL-6為3. 5倍。引入表達(dá)野生型secA2的整合質(zhì)粒補(bǔ)償了 Ased2突變體細(xì)胞因子產(chǎn)生增多的表型。
還使用Griess試劑在受感染巨噬細(xì)胞的上清液中測(cè)定了 RNI的 產(chǎn)生，所述Griess試劑測(cè)定亞硝酸鹽(一氧化氮的氧化產(chǎn)物)。在 感染后48， 72和96小時(shí)進(jìn)行測(cè)量。與感染了 H37Rv的巨噬細(xì)胞相 比，感染了A""2突變體的巨噬細(xì)胞在所有時(shí)間點(diǎn)都產(chǎn)生更多的 RNI(圖19A，對(duì)"小時(shí)顯示了數(shù)據(jù))，平均差異為1.5倍。在感染后 0, 4和24小時(shí)的相同實(shí)驗(yàn)中，還測(cè)量了細(xì)胞中的ROI水平。在感染 了A""2突變體或H37Rv的細(xì)胞之間ROI的水平?jīng)]有明顯差異(數(shù)據(jù) 未顯示)。還檢驗(yàn)了在感染前24小時(shí)用IFN-Y預(yù)處理的感染細(xì)胞的RNI 產(chǎn)生水平，所述預(yù)處理上調(diào)RNI產(chǎn)生。正如預(yù)期的，與未處理的細(xì)胞 相比，用IFN-Y預(yù)處理的細(xì)胞的RNI產(chǎn)生有總體提高。在感染后24 小時(shí)，感染了 A""2突變體的巨噬細(xì)胞再次顯示了上清液中較高水平 的RNI(圖WB)。通過(guò)引入野生型拷貝的secA2，補(bǔ)償了在缺乏和存在 IFN-y的情況下感染Ase"2突變體后觀察到的RNI產(chǎn)生增多。
重要的是注意到，在這些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于兩種菌林在4小時(shí)感染期 之后巨噬細(xì)胞裂解物中的CFU數(shù)目等同。上面的結(jié)果提示，與H37Rv 相比，△ 突變體在抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫刺激性分子的能力方面
是缺陷型的。最終的結(jié)果是在感染A""2突變體之后更高度活化的巨 遵細(xì)胞。
A""2突變體在N0S2+巨噬細(xì)胞中具有減毒表型.鑒于RNI的抗
分枝桿菌活性，有可能所觀察到的RNI水平增加單獨(dú)導(dǎo)致A; ed2突變 體在巨噬細(xì)胞中的生長(zhǎng)缺陷。為了檢驗(yàn)這一想法，在來(lái)自N0S2—小鼠 的未活化的巨噬細(xì)胞中檢查Ased2突變體和H37Rv的生長(zhǎng)，所述小鼠 缺乏誘導(dǎo)型一氧化氮合酶并對(duì)于亞硝化爆發(fā)(nitrosative burst)是 缺陷型的(MacMicking等，1997a)。 A"" 突變體在N0S2+巨噬細(xì)胞 中仍然顯示生長(zhǎng)缺陷，所述缺陷等同于在來(lái)自C57BL/6小鼠的巨噬細(xì) 胞中觀察到的缺陷(圖20)。這一數(shù)據(jù)表明SecA2在胞內(nèi)生長(zhǎng)中的作用 涉及除保護(hù)對(duì)抗活性氮中間體之外的功能。
如對(duì)ROI所進(jìn)行的，還檢查了Asec^突變體和H37Rv對(duì)由精脒 nonoate(SPER/NO)生成的N0的體外敏感性。用SPER/N0處理導(dǎo)致對(duì) △""2突變體和H37Rv等同程度的殺傷(數(shù)據(jù)未顯示)。體外敏感性結(jié) 果連同觀察到的Ase"2突變體在N0S2—/_巨噬細(xì)胞中的生長(zhǎng)缺陷提示， SecA2在胞內(nèi)生長(zhǎng)中的作用并不僅僅是保護(hù)對(duì)抗RNI。
A"d2突變體與更高的IFN-y誘導(dǎo)的II類(lèi)MHC表達(dá)相關(guān)聯(lián). 已經(jīng)證實(shí)了與H37Rv感染的巨噬細(xì)胞相比，感染了Ai ed2突變體的 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的細(xì)胞因子和RNI，隨后評(píng)價(jià)了Ased2突變所 改變的其它巨噬細(xì)胞應(yīng)答的抑制。多家實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明結(jié)核分枝桿菌 抑制宿主若干種IFN-y調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。這些基因中有抗原呈遞所 需的IFN-y誘導(dǎo)的II類(lèi)MHC基因(Nagabhushanam等，2003; Noss等， 2000; Pai等，2004)。為了檢驗(yàn)SecA2在結(jié)核分枝桿菌抑制IFN-y反 應(yīng)中的作用，采用了兩種不同的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)先前被用來(lái)研究這種 IFN-y抑制原代鼠巨噬細(xì)胞和人單核細(xì)胞系thp-1。用a《ed2突變 體，HWRv，或補(bǔ)足型菌林以M0I為10預(yù)感染鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞24 小時(shí)，隨后用rmIFN-y刺激。IFN-y處理15小時(shí)后，通過(guò)定量實(shí)時(shí) PCR(qRT-PCR)測(cè)量II類(lèi)MHC(IA-b)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。如預(yù)期的，IFN-y 處理未感染細(xì)胞增加了 II類(lèi)MHC轉(zhuǎn)錄物并且H37Rv抑制IFN-y對(duì)II 類(lèi)MHC的誘導(dǎo)。相比之下，感染Ase"2突變體并未將II類(lèi)MHC水平 減少到與H37Rv相同的程度(圖2U)。在五次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，Asec^ 突變體和H37Rv之間在IFN-y誘導(dǎo)的II類(lèi)MHC水平方面的這種差異
是Ased2突變體大至少2.0倍(通過(guò)Mann-Whitney檢驗(yàn)p=0. 008)。 用人THP-1細(xì)胞進(jìn)行類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，在感染Ase"2突變 體，H37Rv，或補(bǔ)足型菌林時(shí)將rhIFN-y加入到細(xì)胞中。對(duì)在感染后24 小時(shí)收集的樣品進(jìn)行qRT-PCR來(lái)測(cè)量II類(lèi)MHC(HLA-DR)轉(zhuǎn)錄物的表 達(dá)。再次地，感染A""2突變體并未將II類(lèi)MHC水平減少到與H37Rv 相同的程度。A"c〃突變體和H37Rv之間在IFN-Y誘導(dǎo)的II類(lèi)MHC 水平方面的這種差異是可再現(xiàn)的，在五次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，Ase"2突變 體顯示HLA-DR轉(zhuǎn)錄物水平平均1. 5倍的差異(通過(guò)Student氏t檢驗(yàn) p- 0.00003)。通過(guò)引入野生型拷貝的secA2，補(bǔ)償了Ased2突變體 在鼠巨噬細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中的表型。這一數(shù)據(jù)提供了另一個(gè)實(shí)例， 即SecA2在結(jié)核分枝桿菌抑制宿主免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮作用。 討論
輔助分泌因子SecA2促成結(jié)核分枝桿菌的毒力。如本文用天然低 劑量噴霧感染模型所顯示的，早在感染后9天，與親本結(jié)核分枝桿菌 H37Rv相比，Ase^2突變體在小鼠的肺中具有較低的細(xì)菌負(fù)荷。突變 體的減毒表型在感染的早生長(zhǎng)期期間出現(xiàn)，此時(shí)結(jié)核分枝桿菌主要在 未活化的巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)。與此結(jié)果相一致，當(dāng)與H37Rv相比，Asec^ 突變體在未活化的鼠骨髓巨噬細(xì)胞中具有生長(zhǎng)缺陷。應(yīng)當(dāng)注意到當(dāng)生 長(zhǎng)在肉湯培養(yǎng)基中時(shí)，A""2突變體并不顯示任何顯著的生長(zhǎng)缺陷 (Braunstein等，2001)。與在未活化的鼠巨噬細(xì)胞中的表型相比， A""2突變體在IFN-Y活化的巨噬細(xì)胞中并不顯示表型。用原代鼠 巨噬細(xì)胞進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)似乎反映了在體內(nèi)在鼠感染模型中觀察到的 表型。由于SecA2是輔助分泌因子，SecA2的作用可能是胞內(nèi)生長(zhǎng)所 需的結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)的適當(dāng)分泌或表面定位。先前，將SodA和 KatG鑒定為其分泌入培養(yǎng)基中依賴于SecA2的蛋白質(zhì)(Braunstein等， 2003)。由于這兩種蛋白質(zhì)都是抗氧化劑，考慮簡(jiǎn)單的假設(shè)，即SecA2 促進(jìn)ROI的解毒并由此保護(hù)桿菌免受巨噬細(xì)胞的氧化爆發(fā)影響以促進(jìn) 胞內(nèi)生長(zhǎng)。巨噬細(xì)胞生成的ROI可能具有直接的抗微生物作用或間接 的涉及宿主細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑改變的作用(Nathan, 2003; Thannickal
和Fanburg， 2000)。有輸出的超氧化物歧化酶有助于細(xì)菌病原體毒力 的先例(Battistoni， 2003)，多種實(shí)驗(yàn)提示結(jié)核分枝桿菌SodA， KatG， 和表面定位的超氧化物歧化酶SodC在發(fā)病機(jī)理和保護(hù)對(duì)抗巨噬細(xì)胞 氧化爆發(fā)中的作用(Dussurget等，2001; Edwards等，2001; Manca 等，1999; Ng等，2004; Piddington等，2001)。不過(guò)，當(dāng)在phox— 巨噬細(xì)胞中檢驗(yàn)Asecy^突變體時(shí)，它顯示出等同于在野生型C57BL/6 巨噬細(xì)胞中觀察到的生長(zhǎng)缺陷。此外，檢測(cè)厶sec^ 突變體對(duì)ROI物 質(zhì)包括胞外生成的超氧化物的改變的體外敏感性的努力是不成功的。 總而言之，這些實(shí)驗(yàn)并未揭示SecA2在保護(hù)對(duì)抗氧化爆發(fā)中的作用， 并且它們表明SecA2在胞內(nèi)生長(zhǎng)中的不同功能。
然而，SecA2有助于ROI抗性的可能性并不能被完全排除。在巨 噬細(xì)胞中和在體外保護(hù)對(duì)抗ROI的作用可能被SecA2在胞內(nèi)生長(zhǎng)中的 其它功能和/或結(jié)核分枝桿菌的眾多ROI抗性機(jī)制所遮蔽。另外，即使 在缺乏吞噬細(xì)胞氧化酶的情況下，仍然有活性氧物質(zhì)在細(xì)胞中通過(guò)線 粒體電子傳遞而生成。線粒體生成的R0I促成Ased2突變體表型的可 能性并不能被排除。
還評(píng)估了 SecA2在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的作用。越來(lái)越明顯的是毒性 結(jié)核分枝桿菌抑制先天性和適應(yīng)性的免疫應(yīng)答。關(guān)于先天性免疫應(yīng)答， 在共感染測(cè)定中已經(jīng)顯示結(jié)核分枝桿菌抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12 (Nau 等，2002)。此外，有新出現(xiàn)的傾向，即毒性結(jié)核分枝桿菌菌林比毒性 較弱的結(jié)核分枝桿菌菌林由巨噬細(xì)胞引發(fā)降低水平的促炎性細(xì)胞因子 (包括TNF-a和IL-6)和RNI。已經(jīng)對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的高毒性HN878 菌林和結(jié)核分枝桿菌的高毒性mcel突變體描述過(guò)這一現(xiàn)象(Manca等， 2004; Reed等，2004; Shimono等，2003)。還有毒性結(jié)核分枝桿菌 由巨噬細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞因子和RNI的水平或活性低于減毒和無(wú)毒分枝桿 菌的報(bào)道(Balcewicz-Sablinska等，1998; Beltan等，2000; Falcone 等，1994; Freeman等，2006)。不過(guò)，必須注意到對(duì)于TNF-a來(lái)說(shuō)， 提高的分枝桿菌毒力和降低的細(xì)胞因子產(chǎn)生之間的關(guān)聯(lián)不是普遍的發(fā) 現(xiàn)(Byrd， 1997; Engele等，2002;Rao等,2005; Silver等，1998)。
關(guān)于適應(yīng)性應(yīng)答，結(jié)核分枝桿菌抑制巨噬細(xì)胞對(duì)IFN-Y刺激的反應(yīng)， 諸如II類(lèi)MHC的上調(diào)(Fortune等，2004; Nagabhusha畫(huà)等，2003; Noss等，2000; Pai等，2004)。 II類(lèi)MHC和分枝桿菌抗原向CD4+ T 細(xì)胞的呈遞是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的基本組成成分 (Flynn和Chan， 2001)。
在本研究中，感染A""2突變體的巨噬細(xì)胞比感染H37Rv的巨 噬細(xì)胞產(chǎn)生顯著更高水平的TNF-oc ， IL-6和RNI。這提示SecA2在抑 制先天性免疫應(yīng)答中的功能。未能檢測(cè)到受感染巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12。 相對(duì)于H37Rv對(duì)于A^ec^ 突變體觀察到的IFN-yi秀導(dǎo)的II類(lèi)MHC信 使水平的提高提示，SecA2在抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的額外作用。這 是對(duì)具有抑制IFN-Y反應(yīng)的缺陷的結(jié)核分枝桿菌突變體的第一次報(bào) 道。
SecA2的這些免疫調(diào)節(jié)活性可能對(duì)于結(jié)核分枝桿菌毒力是重要 的。被鑒定為受SecA2調(diào)節(jié)的所有宿主分子都被證實(shí)有助于控制小鼠 模型中的結(jié)核病。正如與野生型小鼠感染相比器官細(xì)菌負(fù)荷增多以及 存活時(shí)間長(zhǎng)度縮短所示，TNF-ot, IL-6， N0S2，或CIITA(II類(lèi)MHC轉(zhuǎn)
錄調(diào)節(jié)蛋白)缺陷的小鼠全部都對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染更加易感(Bean 等，1999; Flynn等，1995; MacMinking等，1997b; Repique等，2002; Saunders等，2000)。 SecA2的免疫抑制作用可能以許多方式影響結(jié)核 分枝桿菌感染的過(guò)程，包括建立允許在巨噬細(xì)胞中進(jìn)行胞內(nèi)生長(zhǎng)的環(huán) 境和限制宿主中的抗原呈遞。通過(guò)用A"c^突變體感染N0S2—〃巨噬細(xì) 胞，證實(shí)對(duì)RNI的抑制并不是SecA2調(diào)控的用來(lái)促進(jìn)胞內(nèi)生長(zhǎng)的唯一重 要因素。Asec^ 突變體在巨噬細(xì)胞和小鼠中的減毒表型似乎反映了 多種細(xì)胞因子和效應(yīng)物機(jī)制的不平衡，可能包括我們尚未識(shí)別的分子。 令人感興趣的是，由感染了Ase"2突變體的巨噬細(xì)胞上調(diào)的所有四種 分子都與宿主細(xì)胞中的Toll樣受體2(TLR2)和髓系分化因子88(MyD88) 信號(hào)傳遞途徑相關(guān)聯(lián)。在不同的程度上，分枝桿菌刺激TLR2-依賴性 MyD88-依賴性途徑誘導(dǎo)TNF-oc 、 IL-6和RNI (Brightbi 11等，1999; Heldwein等，2003; Jang等，2004; Nicolle等，2004; Reiling等，
2002; Shi等，2005; Shi等,2003; Underhill等，1999)。因而， A"cW突變體通過(guò)TLR2-MyD88-依賴性途徑傳遞信號(hào)的能力的提高可 以解釋增強(qiáng)的巨噬細(xì)胞應(yīng)答。不過(guò)，鑒于細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑的復(fù)雜性， 存在有其它不同的解釋。令人感興趣的是，TLR2在結(jié)核分枝桿菌抑制 IFN-y誘導(dǎo)的II類(lèi)MHC的過(guò)程中也有作用(Fortune等，2004; Gehring 等，2003; Noss等,2001)。不過(guò)，我們的觀察結(jié)果，即感染Asec^ 突變體比感染H37Rv導(dǎo)致更高的IFN-y誘導(dǎo)的II類(lèi)MHC信使，與通 過(guò)增強(qiáng)的TLR2信號(hào)傳遞會(huì)預(yù)測(cè)的結(jié)果相反。結(jié)核分枝桿菌抑制IFN-Y反應(yīng)的TLR2-非依賴性途徑也已被鑒定，SecA2可能涉及其中 (Fortune等，2004; Quesniaux等，2004)?；蛘撸葾sec"突變體 產(chǎn)生的TNF-a水平提高可與IFN-Y協(xié)同促進(jìn)所觀察到的II類(lèi)MHC的 增力口(Watanabe和Jacob, 1991)。
改變免疫應(yīng)答是其它細(xì)菌病原體為在宿主中存活所使用的策略， 涉及的細(xì)菌因子經(jīng)常是通過(guò)特化分泌系統(tǒng)定位的分泌型和表面蛋白 (Coombes等，2004)。當(dāng)前，在結(jié)核分枝桿菌中有兩種已知的特化分 泌系統(tǒng)SecA2-依賴性系統(tǒng)和ESAT-6/Snm系統(tǒng)(Kurtz和 Braunstein, 2005)。令人感興趣的是，定位小ESAT-6和CFP-10蛋 白的ESAT-6/S認(rèn)系統(tǒng)也已被報(bào)道有助于免疫抑制(MacGurn等，2005; Stanley等，2003)。缺乏ESAT-6系統(tǒng)的 ^m^0 W《7T) 和 m邁夕O W"Jc)組分的結(jié)核分枝桿菌突變體引起巨噬細(xì)胞產(chǎn)生增加水 平的TNF-ct、 RNI和IL-12。另外，結(jié)核分枝桿菌m/b突變體表現(xiàn)出 在未活化的巨噬細(xì)胞中的生長(zhǎng)缺陷和在小鼠中的早期生長(zhǎng)表型 (Fortune等，2005; Guinn等，2004; Hsu等，2003; MacGurn等， 2005; Stanley等，2003)。對(duì)于s/ 邊和A sed^突變體表型的類(lèi)似性 沒(méi)有直接的解釋，因?yàn)锳""2突變體分泌ESAT-6(數(shù)據(jù)未顯示)。
因?yàn)镾ecA2是分泌因子，它在免疫調(diào)節(jié)中的作用最有可能與免疫 抑制因子的適當(dāng)分泌或細(xì)胞壁定位有關(guān)。不過(guò)，尚未了解由SecA2定 位的所有蛋白質(zhì)，特別是細(xì)胞壁蛋白質(zhì)。分枝桿菌細(xì)胞壁是一種復(fù)雜 的結(jié)構(gòu)，其包含許多不同的具有報(bào)道過(guò)的免疫調(diào)節(jié)特性的分子(Karakousis等，2004)。這些包括若千表面分子，據(jù)報(bào)道其影響炎性 TNF-ot、 IL-6和/或RNI的產(chǎn)生，諸如表面脂蛋白，脂阿拉伯甘露聚 糖(LAM)及其前體脂甘露聚糖(LM),結(jié)核菌醇dimycocerosates (PDIM 或DIM)，和經(jīng)修飾的海藻糖二霉菌酸酯(Adams等，1993; Barnes等， 1992; Brightbill等，1999; Dao等，2004; Krutzik和Modlin， 2004; Quisniaux等，2004a， b; Rao等，2005; Rousseau等，2004)。 由A""2突變體引發(fā)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)可以解釋如下，即細(xì)胞壁中不同 量的免疫調(diào)節(jié)分子，或改變的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使得與宿主受體如TLR2 相互作用的刺激性分子更大暴露。因而，我們正在考慮這種可能性， 即SecA2的免疫抑制作用歸因于在影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁合成酶的 定位中的作用。最后的可能性是Ase"2突變體表型實(shí)際上代表刺激性 分子的釋放增多(Braunstein等，2003)。
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鑒于以上所述，可以看出實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的若干益處并取得了其它 益處。
由于可以對(duì)以上方法和組合物進(jìn)行多種改變而不偏離本發(fā)明的范 圍，意圖將包含在以上說(shuō)明書(shū)以及顯示在附圖中的所有內(nèi)容都解釋為 示例性的而非限定意義。
特此將本說(shuō)明書(shū)中引用的所有文獻(xiàn)都通過(guò)參考引用并入本文。在 此對(duì)參考文獻(xiàn)的討論僅僅意在概述由作者所作出的斷言，而非承認(rèn)任 何參考文獻(xiàn)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。申請(qǐng)人保留挑戰(zhàn)所引用文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和適 當(dāng)性的權(quán)利。
附錄一 SEQ ID NO
SEQ ID NO: 1-雞卵白蛋白的氨基酸殘基252-269的編碼序列 SII翻KL
SEQ ID NO:2-18S rRNA的探針 CAAATTACCCACTCCCGACCG
SEQ ID N0:3-18S rRNA的正向引物 GCTGCTGGCACCAGACTT
SEQ ID NO: 4 - 18S rRNA的反向引物 CGGCTACCACATCCAAGG
SEQ ID N0:5-鼠II類(lèi)MHC(I-Ab)的探針 CGCAGCGCATACGATATGTGACCA
SEQ ID NO: 6 -鼠II類(lèi)MHC(I-Ab)的反向引物 CTGTCGTAGCGCACGTACT
SEQ ID NO: 7 -鼠II類(lèi)MHC (I-Ab)的正向引物 GGCGAGTGCTACTTCACCA
SEQ ID NO: 8 -人II類(lèi)MHC (HLA-DRA)的探針 CTGGACCCTTTGCAAGAACCCTTCCC
SEQ ID N0:9-人II類(lèi)MHC(HLA-DRA)的正向引物 TCCAATGAACGGAGTATCTTGTGT
SEQ ID NO: 10 -人II類(lèi)MHC (HLA-DRA)的反向引物 TGAGATGACGCATCTGTTGCT
權(quán)利要求
1. 一種分枝桿菌，其包含(a)不在SecA2基因中的突變，其中當(dāng)與不含該突變的野生型分枝桿菌相比時(shí)，包含該突變的野生型分枝桿菌在哺乳動(dòng)物中顯示減弱的毒力；和(b)在SecA2基因中的突變，其中該突變消除SecA2活性。
2. 權(quán)利要求1的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌是恥垢分枝桿菌 傲s頂eg邁"/s入牛分枝桿菌n ，鳥(niǎo)分枝桿菌化S7/'"邁入草分枝桿菌W. p力7e/入偶發(fā)分枝桿菌沐/o"u/twz7入7i/尸"，副 結(jié)核分枝桿菌況/7S了"u6ercu/oi /s人p合瓦那分才支桿菌(力a6a/ fl)， 瘰疬分枝桿菌沐sci^/""/sce"/i7人胞內(nèi)分枝桿菌W. //7mce/7〃/sreJ 結(jié)核分枝桿菌(#. f"6erc"7c^/《)，或堪薩斯分枝桿菌(M ira"^y/7)。
3. 權(quán)利要求1的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌是牛分枝桿菌BCG。
4. 權(quán)利要求1的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌。
5. 權(quán)利要求l的分枝桿菌，其中所述不在^e"2基因中的突變 是RD1區(qū)的至少一部分中的缺失，或控制維生素或氨基酸產(chǎn)生的基因 中的缺失。
6. 權(quán)利要求1的分枝桿菌，其中至少一種所述突變由遺傳工程 方法制得。
7. 權(quán)利要求1的分枝桿菌，進(jìn)一步包含可操作連接至啟動(dòng)子的 重組基因，當(dāng)該分枝桿菌感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，所述啟動(dòng)子指導(dǎo)該基 因的表達(dá)。
8. 權(quán)利要求7的分枝桿菌，其中所述基因編碼贅生物、腫瘤或 癌的抗原。
9. 權(quán)利要求7的分枝桿菌，其中所述基因編碼哺乳動(dòng)物病原體 的抗原。
10. 權(quán)利要求9的分枝桿菌，其中所述病原體是病毒。
11. 權(quán)利要求9的分枝桿菌，其中所述病原體是細(xì)菌。
12. 權(quán)利要求9的分枝桿菌，其中所迷病原體是真核寄生蟲(chóng)。
13. 權(quán)利要求9的分枝桿菌，其中所述哺乳動(dòng)物病原體是人病原體。
14. 包含在^d^基因中的突變的分枝桿菌，其中所述突變消除 SecA2活性，并且其中所述分枝桿菌不是結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿 菌。
15. 權(quán)利要求14的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌是牛分枝桿菌。
16. 權(quán)利要求14的分枝桿菌，其中所述分枝桿菌是牛分枝桿菌BCG。
17. 權(quán)利要求14的分枝桿菌，其中所述突變通過(guò)遺傳工程方法 制得。
18. 權(quán)利要求14的分枝桿菌，進(jìn)一步包舍可操作連接至啟動(dòng)子 的重組基因，當(dāng)該分枝桿菌感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，所述啟動(dòng)子指導(dǎo)該 基因的表達(dá)。
19. 權(quán)利要求18的分枝桿菌 或癌的抗原。
20. 權(quán)利要求18的分枝桿菌 體的抗原。
21. 權(quán)利要求20的分枝桿菌
22. 權(quán)利要求20的分枝桿菌
23. 權(quán)利要求20的分枝桿菌
24. 權(quán)利要求20的分枝桿菌 原體。
25. —種誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括用權(quán)利要 求1-24任一項(xiàng)的分枝桿菌接種該哺乳動(dòng)物。
26. 誘導(dǎo)人針對(duì)致病性分枝桿菌的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括 用分枝桿菌疫苗接種人，其中所述分枝桿菌疫苗包含含有在Se"2基 因中的突變的分枝桿菌，其中所述突變消除SecA2活性。，其中所述基因編碼贅生物、肺瘤，其中所述基因編碼哺乳動(dòng)物病原，其中所述病原體是病毒。,其中所述病原體是細(xì)菌。，其中所述病原體是真核寄生蟲(chóng)。，其中所述哺乳動(dòng)物病原體是人病
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述分枝桿菌疫苗包含牛分枝桿 菌或結(jié)核分枝桿菌。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述分枝桿菌疫苗包含牛分枝桿 菌BCG。
29. 權(quán)利要求26的方法，其中所述分枝桿菌疫苗中的分枝桿菌 進(jìn)一步包含不在Sed2基因中的突變，其中當(dāng)與不含所述不在Sec^ 基因中的突變的野生型分枝桿菌相比時(shí)，包含所述不在Se"2基因中 的突變的野生型分枝桿菌在哺乳動(dòng)物中顯示減弱的毒力。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述不在Se"2基因中的突變是 RD1區(qū)的至少一部分中的缺失，或控制維生素或氨基酸產(chǎn)生的基因中 的缺失。
31. 權(quán)利要求26的方法，其中所述分枝桿菌疫苗中的分枝桿菌 進(jìn)一步包含可操作連接至啟動(dòng)子的重組基因，當(dāng)該分枝桿菌感染哺乳 動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，所述啟動(dòng)子指導(dǎo)該基因的表達(dá)。
32. 權(quán)利要求31的分枝桿菌，其中所述基因編碼贅生物、腫瘤 或癌的抗原。
33. 權(quán)利要求31的分枝桿菌，其中所述基因編碼哺乳動(dòng)物病原 體的抗原。
34. 權(quán)利要求33的分枝桿菌，其中所述病原體是病毒。
35. 權(quán)利要求33的分枝桿菌，其中所述病原體是細(xì)菌。
36. 權(quán)利要求33的分枝桿菌，其中所述病原體是真核寄生蟲(chóng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了分枝桿菌，其包含(a)不在SecA2基因中的突變，所述突變減弱所述分枝桿菌在哺乳動(dòng)物宿主中的毒力，和(b)在SecA2基因中的突變，所述突變消除SecA2活性。還提供了包含在SecA2基因中的突變的分枝桿菌，所述突變消除SecA2活性，其中所述分枝桿菌不是結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌。此外提供了使用以上分枝桿菌突變體誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法和誘導(dǎo)人針對(duì)致病性分枝桿菌的免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)A61K39/04GK101395265SQ200780007413
公開(kāi)日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月12日
發(fā)明者M·布朗斯坦, S·A·波爾切利, W·R·雅各布 申請(qǐng)人:猶太大學(xué)阿爾伯特愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院;查珀?duì)栂柋笨_來(lái)納大學(xué)