專利名稱：免疫調(diào)節(jié)化合物和治療與炎性細(xì)胞因子過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)的疾病的方法
免疫調(diào)節(jié)化合物和治療與炎性細(xì)胞因子 過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)的疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)化合物用于治療與炎性細(xì)胞因子過(guò)度產(chǎn)生相
關(guān)的疾病的用途，諸如選自下組的疾病孝喘、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性 鼻炎、前列腺炎、炎癥性腸病、糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
近來(lái)我們已經(jīng)在理解微生物信號(hào)先天免疫系統(tǒng)的機(jī)制方面取得了 重大進(jìn)展。另外顯而易見(jiàn)的是這類先天免疫系統(tǒng)的活化是引起適應(yīng)性 免疫應(yīng)答和確定產(chǎn)生的適應(yīng)反應(yīng)類型所必需的。這些觀察結(jié)果對(duì)研發(fā) 免疫療法的合理手段重新產(chǎn)生了巨大的關(guān)注。
兩個(gè)主要發(fā)現(xiàn)對(duì)先天免疫活化的理解增加是關(guān)鍵
1) 樹(shù)突細(xì)胞(DC)作為誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答所必需的抗原呈遞細(xì)胞
的作用；
2) 檢測(cè)微生物結(jié)構(gòu)的存在，從而導(dǎo)致刺激先天免疫系統(tǒng)的Toll-樣受體(TLR)和其它"模式識(shí)別"受體的發(fā)現(xiàn)。
在補(bǔ)充了 GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中產(chǎn)生(Sallusto F， Lanzavecchia A. J Exp Med 1994, 179:1109-18)。然而，迅速變得顯而易見(jiàn)的是除 GM-CSF和IL-4外，額外的成熟因子是獲得完全作為抗原呈遞細(xì)胞(APC) 起作用的成熟DC所需的。成熟DC能夠引起和操縱適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
這類成熟信號(hào)由微生物產(chǎn)物提供。已經(jīng)證實(shí)這些產(chǎn)物通過(guò)TLRs 起作用。已經(jīng)鑒定了有能力的或識(shí)別不同微生物產(chǎn)物的ll種TLRs。 TLR4為特異性識(shí)別細(xì)菌脂多糖(LPS)的受體，即已知先天免疫系統(tǒng)最 有效刺激劑之一。
國(guó)際申請(qǐng)W0 2005 007699中描述了特異性結(jié)合成員，特別是人抗 -IL-13抗體分子且尤其是中和IL-13活性的那些在診斷或治療IL-13 相關(guān)病癥，包括哞喘、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性鼻炎、纖維化、炎癥性腸病和何杰金淋巴瘤中的用途。
然而，研究仍然是了解IL-13在免疫調(diào)節(jié)中的確切作用所必需的， 且解釋與研究IL-13/IL-4途經(jīng)相關(guān)的結(jié)果仍然具有推定性質(zhì)，正如通 過(guò)下列2篇近期公開(kāi)文獻(xiàn)中所示的。
Michael Kabesch等(J. Allergy Clin. Immunol. Volume 117， Number 2)的公開(kāi)文獻(xiàn) "IL-4/IL-13 pathway genetics strongly influence serum IgE levels and childhood asthma" 中描述了 IgE 產(chǎn)生，即孝喘和特應(yīng)性疾病的標(biāo)志可以在涉及IL-4和IL-13途經(jīng)的基 因的遺傳控制下。因?yàn)镮gE轉(zhuǎn)換是人免疫性和存活的基礎(chǔ)，所以IgE 的調(diào)節(jié)是微妙的。盡管IL-4/IL-13途經(jīng)可以主要通過(guò)其對(duì)IgE調(diào)節(jié)的 作用影響津喘發(fā)生，但是得到的結(jié)果表明這并非為唯一的情況。
David B Corry和Farrah Kheradmand的公開(kāi)文獻(xiàn)"Control of allergic airway inflammation through immunomodulation，， (J. Allergy Clin. Immunol. Volume 117， Number 2)中描述了與臨床試 驗(yàn)相關(guān)的主要發(fā)現(xiàn)，這些臨床試驗(yàn)改變了對(duì)津喘的管理和沒(méi)有改變并 且值得進(jìn)一步研究。據(jù)報(bào)導(dǎo)B-細(xì)胞IgE反應(yīng)所需的細(xì)胞因子IL-4是I 型超敏反應(yīng)所必需的并且IL-4由此為哞喘臨床試驗(yàn)中通過(guò)使用結(jié)合 和失活I(lǐng)L-4的IL-4受體oc鏈的可溶性形式(sIL-4Ra)靶向的首要細(xì) 胞因子之一。IL-13為具有許多與IL-4相同作用，但不受sIL-4a抑 制的另一種細(xì)胞因子。結(jié)論在于未來(lái)研究由此可以嘗試同時(shí)抑制IL-4 和IL-13以便治療哮喘。
本發(fā)明依賴于本發(fā)明者證實(shí)如下文所述的分子為具有良好安全特 性的TLR4有效激動(dòng)劑，它們能夠誘導(dǎo)功能性單核細(xì)胞-衍生的DC完全 成熟并且活化其它表達(dá)TLR4的細(xì)胞類型。使用本發(fā)明化合物處理的 DC， s能夠誘導(dǎo)初級(jí)T-細(xì)胞活化并且有利于Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明者還證實(shí)本發(fā)明的化合物能夠顯著減少由抗-CD3和抗 -CD28抗體以多克隆方式活化的CD4+ T細(xì)胞分泌IL-13。
此外，當(dāng)通過(guò)腹膜內(nèi)或鼻內(nèi)途經(jīng)對(duì)譯喘鼠模型給予化合物之一時(shí)， 本發(fā)明者證實(shí)可預(yù)防由抗原致敏和隨后氣溶膠接觸抗原產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)。測(cè)定的免疫參數(shù)提示Th2反應(yīng)相對(duì)減少，這可以解釋本發(fā)明化合 物在這種哞喘模型中起作用的機(jī)理。另外，作者證實(shí)本發(fā)明的化合物 能夠減少非肥胖型糖尿病小鼠的糖尿病發(fā)生。
本發(fā)明涉及治療患有與炎性細(xì)胞因子過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)的疾病或病癥 的溫血?jiǎng)游?，包括人的方法，包括?duì)有此需要的患者給予適量的藥物 組合物，該藥物組合物包含
至少一種下列通式(I)的免疫調(diào)節(jié)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽， 溶劑合物或異構(gòu)體
<formula>formula see original document page 12</formula>
其中
- m和n彼此獨(dú)立為1-4的整數(shù)，
- X和Y各自表示中性或帶電荷狀態(tài)的基團(tuán)，其選自下組 *羧基-COOH，
* 二羥基磷酰氧基-0-P (0) (OH) 2， *羥基磺酰氧基-0-S02 (OH)，
*氨基-冊(cè)2， *羥基-OH，
* [氨基(C「d。)烷基]氨基羰基-C0NH(CH丄「NH2，其中ih為l-10的整 數(shù)，
* [二羧基(C「C5)烷基]氨基羰基-C0-NH-CH(C00H)-(CH2)nl-C00H，其中 m為1-5的整數(shù)，
* {羧基[氨基(CrC5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH (C00H) - (CH2) nl-NH2 ， 其中ih為1-5的整數(shù)，
*氨基(C廣ds)烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-NH2，其中ih為1-15的整數(shù)，
* 二羥基(d-d。)烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-CH0H-CH20H，其中m為I一IO的整數(shù)，
承羥基(d-d。)烷酰氧基-0-C0-(CH2)nl-0H，其中&為1-10的整數(shù)， *羧基(d-d。)烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-C00H，其中&為1-10的整數(shù)， *氧代(d-。烷酰氧基-0-C0-(CH2)nl-CH0,其中rii為l-5的整數(shù)，
* [羧基(C廣d。)烷?；鵠氨基(d-C15)烷酰氧基 -0-C0-(CH丄廣NH-C0-(CH丄2-C00H，其中n:為l-10的整數(shù)且ri2為1-15 的整數(shù)，
- Ri和R,各自表示衍生自具有2-18個(gè)碳原子的飽和或不飽和直鏈或支 鏈的羧酸的?；?，其未被取代或帶有1-3個(gè)取代基，所述的取代基選 自羥基，二羥基磷酰氧基，2-18個(gè)碳原子的烷基，2-18個(gè)碳原子的烷 氧基，在?；糠稚系?-18個(gè)碳原子的酰氧基，氨基，酰氨基， -C"和C"彼此獨(dú)立為構(gòu)型R、 S或外消旋形式RS中的不對(duì)稱碳； 任選與惰性無(wú)毒性藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體結(jié)合或混合。 更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中
* X選自下組
*象基-COOH，
* 二羥基磷酰氧基-O-P(O) (0H)2， *羥基磺酰氧基-0-S02 (OH)，
*氨基-冊(cè)2，
* [氨基(d-d。)烷基]氨基羰基-CONH(CH2)nl-NH2，其中m為1-10 的整數(shù)，
* [二羧基(d-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH (C00H) — (CH2) nl-C00H ， 其中n,為1-5的整數(shù)，
* {羧基[氨基(d-C5)烷基]}氨基羰基 -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)nl-NH2，其中n,為1-5的整數(shù)，
*氨基(d-ds)烷酰氧基-0-C0-(CH2)d-NH2，其中m為1-15的整
數(shù)，
*且Y選自下組
* 二羥基磷酰氧基-0-P (0) (OH) 2，*羥基磺酰氧基-0-S02 (OH), *氨基-NH2， *羥基-OH，
*氨基(C「d5)烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-NH2，其中m為1-15的整
數(shù)，
* 二鞋基(C廣d。)烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-CHOH-CH2OH，其中n！為 1-10的整數(shù)，
*羥基(d-C,。)烷酰氧基-0-CO-(CH丄!-OH,其中n!為1-10的整數(shù)， *羧基(d-d。)烷酰氧基-0-C0-(CH丄廣C00H，其中r^為1-10的整
數(shù)，
*氧代(CrCs)烷酰氧基-0-C0-(CH2)m-CH0，其中n!為1-5的整數(shù)，
* [羧基(d-d。)烷?；鵠氨基(C廣CJ烷酰氧基 -0-C0-(CH丄廣NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中ni為1-10的整數(shù)且112為1-15 的整數(shù)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中 * X選自下組
*羧基-C00H，
* 二羥基磷酰氧基-O-P (0) (0H)2， *羥基磺酰氧基-0-S02 (0H),
*氨基-朋2，
* [氨基(d-C6)烷基]氨基羰基-C0NH(CH丄「NH2，其中r^為l-6的 整數(shù)，
* [二羧基(d-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH (C00H) 一 (CH2) nl-C00H， 其中化為1-5的整數(shù)，
* {羧基[氨基(d-C5)烷基]}氨基羰基 -CO-NH-CH (COOH)-(CH2)nl-NH2，其中n,為1-5的整數(shù)，
*氨基(C廣Cu)烷酰氧基-O-C0-(CH2)nl-NH2,其中rh為2-12的整
數(shù)，
*且Y選自下組* 二羥基磷酰氧基-0-P (0) (0H) 2， *羥基磺酰氧基-O-S02 (OH)，
*氨基-冊(cè)2，
*羥基-0H，
*氨基(C廣Cu)烷酰氧基-0-C0-(CH2)nl-NH2，其中ih為2-12的整
數(shù)，
* 二幾基(C廣C7)烷酰氧基-0-C0-(CH丄廣CH0H-CH20H，其中為 3-7的整數(shù)，
*羥基(C廣Ce)烷酰氧基-0-C0-(CH2)nl-0H，其中m為2-6的整數(shù)， *羧基(C3-C6)烷酰氧基-0-CO-(CH丄廣C00H,其中n,為3-6的整
數(shù)，
*氧代(C廠C5)烷酰氧基-0-C0-(CH丄廣CH0，其中n丄為2-5的整數(shù)，
* [羧基(c3-c6)烷?；鵠氨基(c2-c12)烷酰氧基
-0-CO-(CH2)nl-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中m為3-6的整數(shù)和ri2為2-12 的整數(shù)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如上所迷的方法，其中 * X選自下組
* -COOH，
* -0-P (0) (OH) 2，
* -0-S02(0H)，
* -肌，
* -CO-NH- (CH2)廣冊(cè)2或-國(guó)H- (CH2) 6-NH2，
* -C0-NH-CH (C00H) -CH廣C00H，
* -C0-NH-CH (C00H) - (CH2) 4-NH2，
* -0-CO-(CH2)5-NH2， *且Y選自下組
* -0-P (0) (OH) 2，
* -0-S02(0H)，
* 一冊(cè)2,* -0H，
* -0-CO-CH2-冊(cè)2(2-氨基乙酰氧基)，-0-0)-(012)2-冊(cè)2(3-氨基丙 酰氧基)，-0-CO- (CH2) 5-NH2 (6-氨基己酰氧基)或-0-C0- (CH2) U-NH2 (12-
氨基十二烷酰氧基)，
* -O-CO- (CH2) 4-CH0H-CH20H (6， 7-二羥基庚酰氧基)，
* -0-CO-(CH2)5-OH(6-羥基己酰氧基)，
* -0-CO-(CH2)2-COOH(3-羧基丙酰氧基)
* -O-CO- (CH2) 4-CHO (6-氧代己酰氧基)，
* -0-CO- (CH2) 5-NH-CO- (CH2)廣COOH (3-羧基丙酰基氨基己酰氧基)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如上所迷的方法，其中Ri和R2選自 -CO-CH廣OH
- (CH2) 5-CH3， ( [2 (d。0) C8] NC2)， -CO-OH
- (CH2) fCHs, (3 (BnO) C14)， -C0-CH2-C*H
- (CH2) 1D-CH3 ， (3 [ (OH) 2-P (0) 0] C14)， O相當(dāng)于上述式中構(gòu)型R、 S或外消旋形式RS中的不對(duì)稱碳。 更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中 - K選自
-C0-CH2-C'"H [O-CO- (CH2) wCHj - (CH2) wCH" (3 (C120) C14)， -CO-CH廣dOH- (CH2) lfl-CH3, (3 (HO) C14)， -CO-CH" (C2)，
一C0-CH2-NH-C0-C'"H [O-CO- (CH2) 8-CH3] - (CH2) 5-CH3， ( [2 (C10O) C8] NC2)， 一C0-C'"H
- (CH2) ,CH" (3 (BnO) C"),
-CO-CH2-C"2H [O-P (0) (OH) 2〗-(CH2) 10-CH3， (3 [ (OH) 2-P (0) 0] C14)，
C'"和C'"相當(dāng)于上述式中構(gòu)型R、 S或外消旋形式RS中的不對(duì)稱碳。
本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其中給予的化合物具有通式 (II):
X- (CH2) rC"H-CO-NH- (CH2) 3-C'2H-CH2—Y
(II)
職,
跳
其中X， Y， RlR2和m如上述所定義，C"在構(gòu)型R、 S中或?yàn)橥庀?旋RS且C"在構(gòu)型R中。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中給予的化合物選 自式(II)的那些，其中
一 X = -0-P (0) (OH) 2 ， Y = -0-P (0) (OH) 2 ， K = -CO-CH2-(T"H
-(CH2h。-CH3 ， R2 =
-CO-CH2-C"2HOH-(CH2)1Q-CH3, m = 2， C"在構(gòu)型S中，C"在構(gòu)型R中， C'"和C"2在構(gòu)型R中，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰 氨基]-4-氧代-5-氮雜-9- [ (R) -3-羥基十四烷?；被鵠-癸-l， 10-二 醇(1， 10)-雙-二氫磷酸酯(0M-294-DP (S， R))，
- X - -O-P (0) (OH) 2 ， Y = -O-CO- (CH2) 4-CHOH-CH2OH ， K =
-co-c^-cTiuo-co-a^hQ-ciy-cciyu-ci^ ， r2 =
-CO-CH2-C'"HOH-(CH2)i。-CH3， m = 2， C"在構(gòu)型S中且C"在構(gòu)型R中， C'"和C"2在構(gòu)型R中，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰 氨基]-4-氧代-5-氮雜-9- [ (R) -3-羥基十四烷酰氨基]-癸-1， 10-二醇 1-二氫磷酸酯10-(6，7-二羥基庚酸酯)(OM-197-MP-HD(S，R))，-X = -C00H ， Y = -0-C0-(CH2) 4-CHOH-CH2OH ， K = -CO-CH2-C'"H
-(CH丄。-CH3 ， R2 =
-CO-CH2-C"2HOH-(CH2h。-CH3， m=l， C'1在構(gòu)型S中且C"在構(gòu)型R中， (T和(T在構(gòu)型R中，即N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷?；鵠-L-天 冬氨酸，a-N- {(4R) -5-羥基-4- [ (R) -3-羥基十四烷酰氨基]戊基}酰 胺5-0-(6， 7-二羥基庚酸酯)(OM-197-MC-HD(S，R))，
- X = -O-P (0) (OH) 2 ， Y = -0-C0- (CH2) 5-NH2 ， = -CO-CH2-C*'1H
-(CH2)1。-CH3 ， R2 =
-C0-CH2-C"2H0H-(CHJu-CH" m = 2， C'1在構(gòu)型S中且C"在構(gòu)型R中, C'"和C"2在構(gòu)型R中，即(3S， 9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰 氨基]-4-氧代-5-氮雜-9- [ (R) -3-羥基十四烷酰氨基]-癸-l， 10-二醇 1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(OM-197-MP-AC(S，R))，
一 X = -NH2 ， Y = -0-P (0) (OH) 2 ， K = -CO-CHfC^HtO-CO-O^U-CHj-WH^fC^ ， R2 =
-CO-CH2-(T2HOH-(CH2)i。-CH3，m = 4， C"在構(gòu)型S中且C'2在構(gòu)型R中， C'"和C"2在構(gòu)型R中，即(5S， 11R)-l-氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基 十四烷酰氨基]-6-氧代-7-氮雜-ll-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]-十二 烷-12-醇12-二氫磷酸酯(OM-294-BA-MP (S， R))。
本發(fā)明還涉及如上所述用于治療溫血?jiǎng)游?，包括人的方法，所?的溫血?jiǎng)游?，包括人患有與生物體中T淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞或抗原呈
癥，其中所述的炎性細(xì)胞因子或炎性疾病標(biāo)記屬于IL-1P， IL-4， IL-5 IL-6， IL-8， IL-9, IL-13, IFN-y， TNF-a和MCP-1的組。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述的疾病選自 孝喘，糖尿病，特應(yīng)性皮炎，過(guò)敏性鼻炎，前列腺炎，炎癥性腸病和 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其在于通過(guò)粘膜或非 腸道途經(jīng)給予治療有效量的如上述定義的在藥學(xué)上可接受的載體，賦 形劑或制劑中的本發(fā)明式(I)的任意化合物。更具體地說(shuō)，本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其在于通過(guò)腹膜， 皮下，口服，鼻內(nèi)，舌下或氣溶膠途經(jīng)給予治療有效量的如上述定義 的本發(fā)明式(I)的化合物。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及耐胃液的藥物組合物，其包含治療有效 量的如上述定義的式(I)的化合物與耐胃液的載體，諸如親水性伯洛沙
姆表面活性劑，諸如伯洛沙姆407 (Lutro1 F-127)。當(dāng)使用腸溶聚合 物，諸如甲基丙烯酸酯聚合物時(shí)，膠態(tài)載體，諸如聚合納米粒或微粒 也為用于式(I) 口服遞送的適當(dāng)制品。
在一種更常規(guī)的方式中，通過(guò)使用腸溶衣獲得的耐胃液的片劑或 膠囊的應(yīng)用也可以為口服途經(jīng)的可替代選擇。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其中如上述定義的 本發(fā)明式(I)的免疫調(diào)節(jié)分子在人體中的所需劑量在0. 01-50mg/m2。
本發(fā)明還涉及如上述定義的式(I)的至少一種化合物在制備預(yù)防 或治療疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，所述的疾病或病癥與炎性細(xì)胞因 子或炎性疾病標(biāo)記的過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)，諸如哮喘，糖尿病，特應(yīng)性皮 炎，過(guò)敏性鼻炎，前列腺炎，炎癥性腸病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明還涉及如上述定義的式(I)的化合物和包含所述化合物與 生理學(xué)可接受載體的藥物。
有關(guān)式(I)化合物的制備和在治療癌癥或作為免疫佐劑中的應(yīng)用 可以按照W0 00/00462和WO 01/46127中所述的方法制備如上述定義
的本發(fā)明式(I)的化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述在下列化合物0M-294-DP(S，R)， 0M-197-MP-HD(S，R) ， OM-197-MC-HD(S，R) ， OM-197-MP-AC(S, R)和 0M-294-BA-MP (S， R)合成及其生物特性的描述中。
實(shí)施例
姿滋辨丄'
^ /^-^十二^教處差"/"四處教^差/-一真^- 5-^雜 -夕-/7"-,在差"/"四處^扇^7-#-人"-二^ —二蟲(chóng)#凝凝賓差3凝游,~做-"7-M^a《"J f才黃"
1. (2R)-5-(芐氧基羰基氨基)-2-[(R)-3-芐氧基十四烷酰氨 基]-1- (2-四氫吡喃氧基)戊烷(C-l)
向在室溫下和氬氣環(huán)境中的(2R)-5-(千氧基羰基氨 基)-2-
戊-1-醇(PCT W000146127A1) (2. 5 g; 4.39 mmol)在無(wú)水CH2C12 (83 ml)中的溶液中 連續(xù)加入3，4-二氫-2^吡喃(DHP) (1.4 ml， 15.38 mmol)，然后是吡 啶鑰對(duì)-甲苯磺酸鹽(PPTS) (441 mg, 1.75 mmol)。將該溶液在室溫下 攪拌18小時(shí)，然后用CH2C12(100 ml)稀釋，用5% NaHC03水溶液，隨 后用&0洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，過(guò)濾并且濃縮。通過(guò)硅膠快速色 鐠法純化(Ac0Et/石油醚4/1)而得到化合物C-1(2. 86 g ; 100%)，為 白色結(jié)晶固體(在Ac0Et/石油醚4/1中Rf = 0.66; U,V.和磷鉬酸鹽)。
C39H6。N206. IS/MS: 邁/z 653. 5 ([M+H]+) ， 675. 5 ([M+Na]+) 。 Mp = 84-86。C。
2. (2R)-5-氨基-2- [ (R)-3-芐氧基十四烷酰氨基]-1- (2-四氫 吡喃氧基)-戊烷(C-2)
在室溫下和氫氣環(huán)境壓力下和有10% Pd/C存在下將化合物 C-l(2. 5 g; 4. 4 mmol)在含有三乙胺(4 ml)的Et0H(150 ml)中的溶 液氫化3. 5小時(shí)。然后通過(guò)過(guò)濾除去催化劑，用乙醇洗滌并且濃縮濾 液且在高度真空中干燥而得到游離胺C-2(2. 15g; 96%),為非晶形白 色固體。C31H54NA. IS/MS:/zz/z 519. 5 ([M+H]+)。
3. (S)-(a)-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-Y-丁內(nèi)酯 (C-3)
向在-15匸下和氬氣環(huán)境中的(R) -3-十二烷酰氧基十四烷酸[Bul 1. Chem. Soc. Jpn^(1987)， 2205-2214] (2. 16 g ; 5.1mmol)在無(wú)水 THF(28ml)中的溶液中連續(xù)加入iV"曱基嗎啉(0. 56ml ; 5. 1 mmol ; leq) 和氯甲酸異丁酯(657]nl ; 5.1mmol; leq)。在-15C和攪拌下1小時(shí)后，加入作為在0. 72 M NaHC03水溶液(14 ml, 2 eq)的L-高絲氨酸內(nèi) 酯氫溴酸鹽(916 mg; 5.1 mmol ; leq)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪 拌20小時(shí)。用Et2O(130mL)稀釋該混合物，分離有機(jī)相并且用H20洗 滌，然后用MgS04干燥，過(guò)濾并且濃縮。通過(guò)結(jié)晶純化(最小體積的 CH2Ch和過(guò)量的戊烷，在On下)而得到化合物C-3(2. 17 g; 85%),為 白色固體。C3。H55N05。 IS/MS:邊A 510. 5 ([M+H]+) ， 532. 5 ([M+Na〗+)。 mp- 79-80r。
4. (3S， 9R) -3- [ (R) -3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮雜-9- [ (R) -3-芐氧基十四垸酰氨基]-10- (2-四氫吡喃基)氧基-癸-l-醇(C-4)
向在20-21匸下化合物C-2 (638 mg， 1.23 mmol， 1.3 eq)在無(wú)水 CH2C12(1. 5 mL)中的溶液中加入化合物C-3 (483 mg， 0， 95 mmol)。將 該溶液在20-21°C下攪拌3天；在減壓下蒸發(fā)溶劑。通過(guò)硅膠快速色 譜法純化(CH2CW丙酮5/1-1/1)而得到醇C-4 (829 mg， 85%)，為白色 固體。C"IUNA。 IS/MS:邊々1029. 0 ([M+H]+) ， 1051. 0 ([M+Na]+)。 mp= 81-82。C。
5. (3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮雜-9- [ (R) -3-芐氧基十四烷酰氨基]-10- (2-四氫吡喃基)氧基-癸-l-醇二爺基磷酸酯(C-5)
向在室溫下和氬氣環(huán)境中醇C-4(120 mg ; 0， 12 mmol)和l薩四唑 (25 mg; 0.35 mmol ; 3 eq)在無(wú)水THF (5 ml)中的溶液中加入N， N-二千基二乙基亞磷酰胺(85%， 95 pl ; 0.27 mmol ; 2.3 eq)。在攪拌 下45分鐘后，將該反應(yīng)混合物冷卻至-40TC，然后加入znCPBA (57-86%; 75 mg; 0.43 mmol ; 3,7 eq)在CH2C12(3 ml)中的溶液。在-40X:下 45分鐘后，^f吏該混合物升溫并且加入飽和^23203溶液(3 ml)并且將該 混合物攪拌10分鐘。用乙醚稀釋該溶液，分離有機(jī)相并且用飽和 Na2S203 (5x)，然后用飽和NaHC03(2x)洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，過(guò)濾并且濃縮。通過(guò)硅膠快速色鐠法純化(CH2Cl2/丙酮4/1，然后2/1)而得 到二千基磷酸酯C-5(126 mg; 84%),為非晶形固體。
6. (3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮雜-9- [ (R) -3-芐氧基十四烷酰氨基]-癸-1， 10-二醇1- (二芐基 磷酸酯)(C-6)
向在OX:下1%HC1在曱醇中的溶液(25ml)中加入化合物C-5(700 mg, 0.54 mmol)在CH2C12(2. 5 ml)中的溶液。在O'C和攪拌下45分鐘 后，用5% NaHC03水溶液中和該反應(yīng)混合物，用CH2Cl2稀釋，然后分 離有機(jī)相。用CH2Cl2(3x)萃取水相，然后合并有機(jī)相，用MgS04干燥， 過(guò)濾并且濃縮至得到醇C-6 (640 mg; 98%)。
7. (3S， 9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮雜-9- [ (R) -3-芐氧基十四烷酰氨基]-癸-l, 10-二醇1-二芐基磷 酸酯10-(6-爺氧基羰基氨基己酸酯(C-7)
向在OX:下和氬氣流中的上述制備的化合物C-6 (640 mg， 0.53 mmol.)和6-(千氧基羰基氨基)己酸(423 mg， 1.60 mmol.)在無(wú)水 CH2Cl2(25 ml)中的溶液中依次加入商購(gòu)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基
碳二亞胺鹽酸鹽(306 mg， 1. 60mmol.)和4-二甲氨基吡啶(20mg， 160 pmol.)。然后將該反應(yīng)混合物在OX:下攪拌30分鐘且此后在室溫下攪 拌過(guò)夜。然后用水和1NHC1溶液洗滌反應(yīng)介質(zhì)，隨后進(jìn)行層分離。用 MgS04干燥有機(jī)層，過(guò)濾并且蒸發(fā)。通過(guò)進(jìn)行硅膠快速色譜純化(4/1， 然后2/1 CH2Cl2/丙酮洗脫劑)回收偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物C-7 (537 mg; 71%)。
13c-NMR(62，89MHz， CDCl3)，以ppm計(jì)的S: 173. 18, 171. 16， 170. 38， 169.60， 156.30， 138.23， 136.50， 135. 38， 135.28， 128. 42， 128.26， 128.17， 127. 79 , 127.74， 127.44, 76. 48， 71. 15, 70. 84， 69.47， 69. 39, 69. 31, 66.25， 65. 62, 64.37， 49. 78， 47. 76， 41.41,41.34， 40.57， 38.97， 34.22， 34. 16, 33. 96， 33. 57， 32. 95， 31.70 ， 29.15， 28.95， 28. 32， 25. 87， 25. 46， 25.02, 28.80， 24.18， 22.49, 13.94。8. (3S， 9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氛雜-9-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]-癸-l， 10-二醇1-二氫磷酸酯 10-(6-氨基己酸酯)(C-8) (= 0M-197-MP-AC(S，R))
將化合物C-7 (500 mg， 0.35 mmol.)在含有乙酸(10 ml)的5/2 CH2Cl2/乙醇混合物(70 ml)中的溶液在室溫下和氫氣環(huán)境壓力下和有
含10% Pd的Pd/碳存在下氫化12-24小時(shí)。過(guò)濾出催化劑。蒸發(fā)濾液 至干且然后通過(guò)從真空泵中抽吸干燥殘余物而得到C-8 (368 mg，定量 產(chǎn)率)。ES/MS: m/z比為1047. 9 [M+H]+; 1069.8方案1
<formula>formula see original document page 24</formula>;W / W - j-十二處應(yīng)處差十四處^ ^差/歲/七'成殺 在差,織^教^差7-癸-A^-二寧卜二產(chǎn)^浚游
7-二在差產(chǎn)^游J ~做-W7-il^-朋","J
1. 6-庚烯酸爺酯(C-9)
向在Or下6-庚烯酸(4. 71 g, 36.75 mmol)在AcOEt (80 mL)中的 溶液中一次加入三乙胺(15. 3 mL， 110.24 mmol)，節(jié)基溴(13.1 mL， 110.24 mmol)和Bu4NI (6. 79 g， 18.37 mmol)。將該反應(yīng)混合物在0 。C下攪拌2小時(shí)并且在真空中濃縮。將殘余物溶于AcOEt,用飽和 NaHC03和H20洗滌有機(jī)相。用MgS04干燥有;f幾相并且在真空中除去溶劑。 對(duì)殘余物進(jìn)行硅膠快速色鐠(jH-庚烷/EtOAc， 9:1)而得到化合物 C-9(6. 00 g; 75%),為無(wú)色油狀物。"C-腿(62. 89 MHz， CDCI3):
24.42， 28. 34， 33.37， 34.13， 66.08， 114.73， 128.19， 128.55， 136. 16， 138. 37， 173. 43。
2. 6，7-環(huán)氧庚酸芐酯(C-10)
向在OX:下m-CPBA(2. 76 g， 12. 29 mmol)在CH2C12 (50 mL)中的溶 液中緩慢加入C-9(1.79 g， 8.19 mmol)在CH2C12(20 mL)中的溶液。 將該溶液在OC下攪拌2小時(shí)，然后在室溫下攪拌18小時(shí)。用CH2C12 稀釋該溶液并且用飽和Na2S203水溶液(5x)洗滌有機(jī)相。用MgS04干燥 有機(jī)相并且在真空中除去溶劑。對(duì)殘余物進(jìn)行硅膠快速色鐠0￡-庚烷 /EtOAc， 5:1)而得到化合物C-10(1.54 g; 80%),為無(wú)色油狀物。 13C-NMR(62. 89 MHz， CDCI3): 24. 60, 25.39， 32. 00， 34.02， 46.86，
51.91,66.04， 128. 11， 128. 46， 136.01, 173.17。
3. 6，7-異亞丙基庚酸芐酯(C-11)
向在室溫下C-10(1. 54 g， 6.59 mmol)在丙酮(50 mL)中的溶液中 加入硫酸(O. 42mL, 7. 9mmo1)。將該溶液攪拌3小時(shí)，用乙醚稀釋并 且用飽和NaHC03水溶液洗滌有機(jī)相。用MgS04干燥有機(jī)相并且在真空中除去溶劑而得到C-11U.73 g)，為淡黃色油狀物，將其不經(jīng)進(jìn)一步 純化用于下一步。
4. 6，7-亞異丙基庚酸(C-12)
將化合物C-11(1.53 g)在含有Et3N(3.65 mL， 26.16謹(jǐn)l)的 Et0Ac(20 ml)中的溶液在室溫下和氫氣環(huán)境壓力中在有含10% Pd的 Pd/碳存在下氫化3小時(shí)。過(guò)濾出催化劑并且將濾液蒸發(fā)至干。對(duì)殘余 物進(jìn)行硅膠快速色鐠(CH2Ch/Me0H， 5: 1)而得到化合物C-12 (0. 63 g; 2步內(nèi)54%),為無(wú)色油狀物。
5. (3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四烷酰氨基]-癸-1，10-二醇1-二芐基磷 酸酯10-(6,7-異亞丙基庚酸酯(C-13)
向在下和氬氣流中上述制備的化合物C-6 (248 mg， 0. 21 inmol.) 和化合物6，7-異亞丙基庚酸(C-12) (92 mg， 0.45 mmol.)在無(wú)水 CH2Cl2(5 ml)中的溶液中依次加入商購(gòu)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基
碳二亞胺鹽酸鹽(91 mg， 0.47 mmol.)和4-二甲氨基吡啶(催化劑)。
然后將該反應(yīng)混合物在ox:下攪拌30分鐘且此后在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。然
后用水和IN HC1溶液洗滌反應(yīng)介質(zhì)，隨后進(jìn)行層分離。用MgS04干燥 有機(jī)層，過(guò)濾并且蒸發(fā)。通過(guò)進(jìn)行硅膠快速色鐠純化(CH2Cl2/Me0H，
99: l)回收偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物C-13 (240 mg; 83%)。ES/MS: m/z 1390 [M+H〗+; 1411 [M+Na]+。
6. (3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代
-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]-癸-1,10-二醇1-二氫磷酸酯
10-(6, 7-二羥基庚酸酯)(C-14) (= OM-197-MP-HD(S，R))
將化合物C-13(180 mg， 0.13鵬ol.)在含有乙酸(3 ml)的5/2 CH2Cl2/乙醇混合物(21 ml)中的溶液在室溫下和氫氣環(huán)境壓力下和有
含10% Pd的Pd/碳存在下氫化12-36小時(shí)。過(guò)濾出催化劑。蒸發(fā)濾液至干且然后通過(guò)從真空泵中抽吸干燥殘余物而得到C-14(139 mg，定 量產(chǎn)率)。ES/MS: m/z 1079 [M+H]+; 1101 [M+Na]+。
方案2
<formula>formula see original document page 27</formula>《 〃
os;夕"-j- / w - j- 二處翁真差四處^扇差7 一-處^ -/-^染 "P-/y"-j-,差十^處應(yīng)扇差7-癸—，^-二殍人^-雙-二蟲(chóng)磷凝 ~ ,廁-"/Y《w廣才黃"
1, (3S， 9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮雜-9- [ (R) -3-芐氧基十四烷酰氨基]-癸-1， 10-二醇(C-l5)
向在25 。C下(2R) -5-氨基-2- [ (R) -3-千氧基十四烷酰氨基]戊-l-醇(PCT W000146127A1) (8 g， 18. 4 mmol)在無(wú)水CH2C12 (60 mL)中的溶 液中加入在無(wú)水CH2Cl2(28 mL)中的化合物C-3(9 g， 17.5 mmoi)。將 該溶液在20-21。C下攪拌3天。用CH2C12(66 mL)稀釋該混懸液并且溫 至30。C而得到澄清溶液。向該溶液中緩慢加入乙腈(320 mL)。將該溶 液冷卻至20。C并且攪拌2小時(shí)。過(guò)濾沉淀，用乙腈洗滌并且在真空中 干燥而得到C-15(13. 7 g， 83%),為白色固體。mp= 103 "C。
2. (3S， 9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四烷酰氨基]-癸-l， 10-二醇I，IO-雙 -(二芐基磷酸酯)(C-16)
向在室溫下和氬氣環(huán)境中的C-15(1.02 g; 1.08 mmol)和1F四 唑(454 mg; 6.48 mmol ; 6 eq)在無(wú)水THF(46 mL)中的溶液中加入 N，N-二節(jié)基二乙基亞磷酰胺(85。/。， 1.50 mL; 4.97 mmol ; 4.6 eq)。 在攪拌下30分鐘后，將該反應(yīng)混合物冷卻至-20t:，然后加入 /dCPBA (57-86% ; 1. 32 g ; 7.67 mmol ; 7. 4 eq)在CH2C12 (30 mL)中的 溶液。在-20'C下45分鐘后，將該溶液溫至On并且加入飽和Na2S203 溶液(25 mL)并且將該混合物攪拌10分鐘。用乙醚稀釋該溶液，分離 有機(jī)相且用飽和Na2S203 (5x)，然后用飽和NaHC03(2x)洗滌。用MgS04 干燥有機(jī)相，過(guò)濾并且濃縮。通過(guò)硅膠快速色譜法純化(CH2Cl2/丙酮 4/1，然后3/1)而得到C-16(1. 38 g ; 87%)，為無(wú)色油狀物。3. (3S， 9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代 -5-氮雜-9- [ (R) -3-羥基十四烷酰氨基]-癸-1， 10-二醇1,10-雙-二氫 磷酸酯)(C-17) (= 0M-294-DP(S，R))
將化合物C-16(2. 7 g， 1. 84 mmol)在異丙醇(150 mL)中的溶液在 室溫下和氫氣環(huán)境壓力中用10% Pd/C(320 mg)氫化3小時(shí)。通過(guò)經(jīng)微 孔濾膜過(guò)濾除去催化劑。濃縮濾液并且在高度真空中干燥而得到 C-17(1.8 g; 98%),為非晶形固體。
方案3
<formula>formula see original document page 29</formula>
實(shí)施例4
-3-,二處教真差十四處^4差7-/Y4W-J-
在差-^-/^^-在差十^處應(yīng)減差/-4'差乂翁廢7-二,差^ 凝游J VC-^ C f才黃W
1. N-[ (R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-L-天冬氨 酸，a-N- {(4R) -5-羥基-4_ [ (R) -3-爺氧基十四烷酰氨基]戊基}酰胺-B-芐酯，5-0-(6， 7-異亞丙基庚酸酯)(C-18)
向在OX:下和氬氣流中的化合物N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷 酰氨基]-L-天冬氨酸，a-N- {(4R) -5-羥基-4- [ (R) -3-芐氧基十四烷酰 氨基]戊基)酰胺-P-芐酯(PCT誦0146127A1) (1,14 g, 1.09 mmol.)
和化合物6， 7-異亞丙基庚酸(C-12) (487 mg， 2.48 mmol.)在無(wú)水 CH2Cl2(30mL)中的溶液中依次加入商購(gòu)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基
碳二亞胺鹽酸鹽(485 mg, 2. 53mmol.)和4-二甲氨基吡啶(43mg， 0. 35 mmol)。然后將該反應(yīng)混合物在OX:下攪拌30分鐘且此后在室溫下攪 拌過(guò)夜。然后用水和1NHC1溶液洗滌反應(yīng)介質(zhì)，此后進(jìn)行層分離。用 MgSO,干燥有機(jī)層，過(guò)濾并且蒸發(fā)。通過(guò)進(jìn)行硅膠快速色鐠純化 (CH2Cl2/丙酮，9:1)回收偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物C-18(1.20 g; 76%),為白色
固體。ES/MS:m/z 1255 [M+Na]+。
2. N- [ (R) -3-十二垸酰氧基十四烷酰氨基]-L-天冬氨 酸，a-N-U4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]-戊基}酰胺 5-0-(6， 7-二羥基庚酸酯)(C-19) (= OM-197-MC-HD(S，R))
將化合物C-18(1.20 g， 0.97 mmol.)在含有乙酸(5 ml)的2/1 CH2Cl2/乙醇混合物(50 ml)中的溶液在室溫下和氫氣環(huán)境壓力下和有
含10% Pd的Pd/碳存在下氫化12-36小時(shí)。過(guò)濾出催化劑。蒸發(fā)濾液
至干且然后通過(guò)從真空泵中抽吸干燥殘余物而得到C-19(1 g,定量產(chǎn)
率)。ES/MS: m/z 1012 [M+H]+; 1034 [M+Na]+。<formula>formula see original document page 31</formula>1. Na- [ (R) -3-十二烷酰氧基十四烷?；鵠釅-爺氧基羰基-L-賴 氨酸(C-20)
向在-15C下和氬氣環(huán)境中的(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酸 P-109 [Bull. Chem. Soc. Jpn^(1987)， 2205-2214] (153 mg ; 0,36 mmol)在無(wú)水THF(4 ml)中的溶液中依次加入A^甲基嗎啉(40 jal; 0.36 mmol; leq)和氯甲酸異丁酯(47pl ; 0. 36 mmol ; leq)。在-15 。C下攪拌30分鐘后，加入商購(gòu)H-L-賴氨酸(Z)-OH(100mg ; 0. 36 mmol ; leq)在含EloN( 0.16 mL)的CH3CN/H20 (3. 5/1 (4. 5 mL)中的溶液。將該 反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20小時(shí)。然后蒸發(fā)有機(jī)溶劑并且將水層冷卻至0°C，用10%檸檬酸水溶液酸化至pH = 3并且用Ac0Et(3x)萃取。 用MgS04干燥有機(jī)層，過(guò)濾并且蒸發(fā)。通過(guò)進(jìn)行硅膠快速色鐠純化(含
0. 25%乙酸的1/1石油醚/AcOEt洗脫液)，隨后共蒸發(fā)甲苯得到 C-20 (172 mg; 70%),為白色結(jié)晶固體。MS: (IS+)邊/z 690.0 [M+H]+, 707.0 [M+NH4]+， 712.0 [M+Na]+， 727.5 [M+K]+. 13C-NMR (62. 89 MHz, CDCl3)，以ppm計(jì)的S: 174.90， 173.73， 170.66， 156.98， 136,53,
128.57 ， 128.17， 128.05 ， 71.27, 66.79, 52.24， 41.32， 40,47， 34.59， 34.24， 31.99, 31.45， 29.72， 29. 43， 29.25, 25. 29， 25. 07， 22.76, 22.27， 14.19。
2. (5S， 11R) -l-芐氧基羰基氨基-5- [ (R) -3-十二烷酰氧基十四 烷?；?氨基]_6-氧代-7-氮雜-ll- [ (R) -3-芐氧基十四烷酰氨基] -十 二烷-12-醇(C-21)。
向在OC下C-20 (150 mg; 0. 22 mmol.)和(2R) -5-氨基-2-[ (R)-3-
節(jié)氧基-十四烷酰氨基]戊-l-醇WZ-10b(PCT W000146127A1) (95 mg; 0. 22mmol.; 1.0 eq)在無(wú)水CH2Cl2(3 ml)中的溶液中加入商購(gòu)
H0At(l-二羥基-7-氮雜苯并三唑)(36 mg， 0.26 mmol. ， 1.2 eq.)和 商購(gòu)N，r-二異丙基碳二亞胺(41 ^1, 0.22 mmol,, 1.2 eq.)。將該 反應(yīng)混合物在0C下攪拌1小時(shí)且此后在室溫下攪拌過(guò)夜。隨后用水， IN HC1溶液和飽和NaHC03溶液洗滌該反應(yīng)混合物，隨后進(jìn)行層分離。 用MgS04干燥有機(jī)層，過(guò)濾并且蒸發(fā)。通過(guò)進(jìn)行硅膠快速色譜純化(3/1 CH2Cl2/丙酮洗脫液)回收C-21(165 mg ; 68%),為白色結(jié)晶固體。
MS: (IS+) zz 々1105.8 [M+H]+， 1128.0 [M+Na]+， "C-NMR (62. 89 MHz， CDCl3)，以ppm計(jì)的S: 173.56， 172.20， 171.87， 170. 23, 156. 82,
138.32, 136. 69, 128. 53, 128.47， 128. 09， 128.00， 127. 91， 127. 82， 76. 77， 71.48， 71.15， 66. 59， 64. 77， 53,1, 51.39， 41.71,41.63， 40.46 ，39.45 ，34.57 ，34.51, 34. 12 ,31. 97 ,29.70 , 29. 51， 29. 41， 29. 25， 28.69， 25. 38, 25. 29, 25.19， 25.09， 22.74， 22.50, 14.18。3. (5S， 11R) -1-芐氧基羰基氨基-5- [ (R) -3-十二烷酰氧基十四 烷酰氨基]-6-氧代-7-氮雜-11- [ (R) -3-芐氧基十四烷酰氨基]-十二烷 -12-醇12-二爺基磷酸酯(C-22)。
向在室溫下和氬氣環(huán)境中的C-21(150 mg; 0.14 mmol)和lf四 唑(29mg; 0. 41 mmol ; 3 eq)在無(wú)水THF (8 mL)中的溶液中加入N， N-二節(jié)基二乙基亞磷酰胺(85%， 110jLiL; 0.31 mmol ; 2. 3 eq)。在攪拌 下30分鐘后，將該反應(yīng)混合物冷卻至-20t:，然后加入/hCPBA (57-86% ; 87 g; 0.50麵l; 3. 7 eq)在CH2C12 (6 mL)中的溶液。在-20匸下45 分鐘后，將該溶液溫至Ot:并且加入飽和Na2SA溶液(5 mL)并且將 該化合物攪拌10分鐘。用乙醚稀釋該溶液，分離有機(jī)相并且用飽和 Na2S203 (5x)，然后用飽和NaHC03(2x)洗滌。用MgSO,干燥有機(jī)相，過(guò)濾 并且濃縮。通過(guò)快速硅膠色鐠法純化(CH2Cl2/丙酮4/1，然后2/1)得到 C-22 (149 mg; 81%)，為非晶形固體。MS: (IS+)邁/z 1366. 0 [M+H〗+， 1383.5 [M+NH4] + ， 1388.5 [M+Na〗+, 1088.0 [M-(BnO) 2OPOH〗+H] + ， 13c-NMR(62. 89 MHz， CDCl3)，以ppm計(jì)的S: 173.51,171. 77， 171.27，
169.95， 156. 67， 138. 32， 136. 69， 135.66 (d)， 135.55 (d)， 128.69， 128.51, 128.43， 128.03， 127.77， 127.69， 76.49， 71.28， 71.20， 69，66(d)， 69.58 (d)， 68. 72 (d) ， 66.51, 52.82， 48. 62 (d) ， 41,76， 41.46， 40. 46, 39. 01, 34. 54, 34.06, 31.96， 29.68， 29. 49, 29.39， 29.22， 27. 95， 25.29， 25.18， 25.05， 22.73， 22.45， 14.17。
4. (5S， llR)-l-氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨
基]-6-氧代-7-氮雜-11-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]-十二烷-12-醇
12-二氫磷酸酯(C-23) (- OM-294-BA-MP(S，R))
將化合物C-22 (130 mg， 0.095 mmol.)在含有乙酸(3 ml)的3/1 CH2Cl2/乙醇混合物(20 ml)中的溶液在室溫下和氫氣環(huán)境壓力下和有
含10% Pd的Pd/碳存在下氫化36小時(shí)。過(guò)濾出催化劑。蒸發(fā)濾液至 干且然后通過(guò)從真空泵中抽吸干燥殘余物而得到C-23 (84 mg， 91%)。MS: (IS+)邊/z 962. 0 [M+H]、 984.0 [M+Na]+,
:方案5
<formula>formula see original document page 34</formula>本Jt效^合參W蘭#活^ 《 "
0M-197-MP-AC和0M-294-DP對(duì)鼠DC細(xì)胞上LPS誘導(dǎo)的炎性(IL-12 和TNF-a)和抗炎(IL-lO)細(xì)胞因子的體外調(diào)節(jié)作用 方案
分離骨髓細(xì)胞并且如下所述培養(yǎng)
從2只6周齡雄性C57BI77的(Charles River Laboratories France)中取出股骨和脛骨，剝離肌肉和腱并且用70%乙醇消毒。切下 各骨的兩端并且使用帶有26號(hào)針頭的注射器用HBSS(Gibco BRL)沖洗 骨髓。以500g離心所得細(xì)胞混懸液5min并且用HBSS洗滌。將細(xì)胞以 3xl()5個(gè)細(xì)胞/ml重新懸浮于補(bǔ)充了 2 mML-谷氨酰胺(Sigma) ， 100 U/ml 青霉素(Sigma) ， lOOpg/ml鏈霉素(Sigma) ， 50jnM p -巰基乙醇(Sigma)， 10%熱滅活的 FCS (Sigma)和 15 ng/ml 鼠 rGM-CSF(R&D)的 RPMI—1640 (Gibco BRL)中。
為了產(chǎn)生骨髓(BM)衍生的樹(shù)突細(xì)胞(DC)，在第0天時(shí)在100-mm 細(xì)菌培養(yǎng)皿(Falcon 1029)中將BM白細(xì)胞在37C下和5% C02中培養(yǎng)8 天。在第0天，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種10 ml細(xì)胞混懸液。在第3天時(shí)， 向各平板中再加入10 ml新鮮制備的培養(yǎng)基并且在第6天時(shí)從每個(gè)平 板中謹(jǐn)慎取出9 ml上部培養(yǎng)基并且用10 ml新鮮培養(yǎng)基替代。
收集8日齡BM細(xì)胞培養(yǎng)物的非貼壁細(xì)胞，以500g離心5分鐘并 且以1. 25xl0'個(gè)細(xì)胞/ml重新懸浮于含有10 ng/ml GM-CSF的補(bǔ)充的 RPMI中。然后將細(xì)胞接種在24-孔組織培養(yǎng)板(lxl(^個(gè)細(xì)胞/孔)中并 且在 37 "C下和 5% C02中，在沒(méi)有或有 0M-294-DP 或 0M-197-MP-AC(O. 01-100jLig/ml/200nl/孔)存在下孵育1小時(shí)30分鐘。 然后以lpg/ml加入LPS(大腸桿菌(E. coli) 026: B6， Sigma)并且進(jìn) 一步孵育該平板。在孵育20小時(shí)后，采集上清液用于細(xì)胞因子分析。
通過(guò)ELISA， 4吏用來(lái)自BD Pharmingen的OptEIA配對(duì)的Ab對(duì)測(cè) 定DC培養(yǎng)物上清液中的IL一12p70， IL-10和TNF-a濃度。Supers ignalELISA Pico化學(xué)發(fā)光過(guò)氧化物酶底物(BD Pharmingen)用于通過(guò)發(fā)光 測(cè)定法(luminometry )檢測(cè)(Wallac 1420多標(biāo)記計(jì)數(shù)器Victor-2)。 按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果
a) OM-197-MP-AC和0M-294-DP對(duì)LPS-誘導(dǎo)的IL-12和IL-IO 產(chǎn)生的作用
對(duì)LPS-誘導(dǎo)的IL-12和IL-IO產(chǎn)生的作用如

圖1中所示。
b) 0M-197-MP-AC和OM-294-DP對(duì)LPS-誘導(dǎo)的TNF-a產(chǎn)生的作
對(duì)LPS-i秀導(dǎo)的TNF-a產(chǎn)生的作用如圖2中所示。 結(jié)論
上述結(jié)果清楚地表明OM-197-MP-AC和0M-294-DP均減少了 LPS-誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子(IL-12和TNF-a)產(chǎn)生，而明顯相反的是增加了 抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)量，從而提示本發(fā)明的化合物可以作為治療 性抗炎藥起作用。
《滋辨7
一系列4種三?；苌飳?duì)人004+ T細(xì)胞的直接作用 方案
如下概括地直接測(cè)試本發(fā)明的一系列4種化合物(0M-197-MP-AC， 0M-197-MC-HD， OM-294-BA-MP， 0M-197-MP-HD):
從健康血液供體(血沉棕黃層)中以磁方式分選首次用于實(shí)驗(yàn)的 CDf T細(xì)胞。在有或沒(méi)有分級(jí)劑量的三?；苌?0，02; 0,2; 2和 20 ing/ml)存在下使用平板結(jié)合的抗-CD3(5 jig/ml)和可溶性抗 -CD28(1 pg/ml)刺激細(xì)胞。6天后，使用ELISA在培養(yǎng)物上清液中測(cè) 試細(xì)胞因子水平(IFN-y和IL-13)。
結(jié)果:
細(xì)胞因子產(chǎn)生結(jié)果如圖3中所示。還測(cè)試了 T細(xì)胞增殖，但并未被本發(fā)明化合物改變。
結(jié)論
CD4+ T細(xì)胞在有0M-197-MP-AC, OM-197-MC-HD， 0M-294-BA-MP， OM-197-MP-HD存在下產(chǎn)生IL-13減少(白色直方圖)，而IFN- y產(chǎn)生(深 色直方圖)和T細(xì)胞增殖保持不受影響。這表明在有測(cè)試的4種三?；?分子存在下向Thl反應(yīng)轉(zhuǎn)移。
，辨《
OM-197-MP-AC在津喘模型中的作用
由于在上述實(shí)施例中已經(jīng)證實(shí)測(cè)試的三酰化分子減少了哞喘病理 學(xué)中可能涉及的細(xì)胞因子產(chǎn)生(即IL-13),所以本發(fā)明者在本文中的 目的在于研究所述系列中的成員(OM-197-MP-AC)在體內(nèi)調(diào)節(jié)首次用于 實(shí)驗(yàn)的T輔助細(xì)胞Th2分化和隨后過(guò)敏性哞喘發(fā)生中的作用。
在本研究中，本發(fā)明者已經(jīng)首次研究了 (部分a)給出的 OM-197-MP-AC在致敏期過(guò)程中對(duì)LACK-誘導(dǎo)的過(guò)敏性哞喘發(fā)生的作用 和隨后治療測(cè)試分子的作用(部分b)。
部分a)嗜喘的"預(yù)防性"治療 方案
過(guò)敏性哮喘小鼠和誘導(dǎo)
6周齡雌性Balb/c ByJ小鼠購(gòu)自 Centre d， Elevage Janvier (CERJ， Genest-St-Isle， France)。在第0天和第7天時(shí) 通過(guò)腹膜內(nèi)2次注射沉淀在2 mg白鞏(PerBio Science France SAS， BrebQres， France)中的lO jug LACK蛋白使所有小鼠致敏。
如下將動(dòng)物分組
-LACK-致敏和鹽水-攻擊的小鼠(4只小鼠) -LACK-致敏和攻擊小鼠(8只小鼠)
-OM-197-MP-AC-治療，LACK-致敏和攻擊的小鼠(8只小鼠)
使用1 mg/Kg(20 jig/小鼠)OM-197-MP-AC通過(guò)腹膜內(nèi)治療第3組小鼠。在如下天時(shí)治療小鼠-1，1，2， 3， 6， 8， 9， lO和ll。
從第16-第21天，使B和C組小鼠每天接觸20分鐘LACK溶液
(0. 15%)氣溶膠攻擊，而鹽水組小鼠接受鹽水溶液作為對(duì)照組。 氣道高反應(yīng)性(AHR):
在最后抗原攻擊后1天通過(guò)全身體積描記術(shù)(Emka)測(cè)定所有小鼠 對(duì)增加濃度(6-25 mg/m 1)的吸入乙酰甲膽堿(乙酰基甲基膽堿，S igma) 的反應(yīng)的AHR。將AHR表示為增加的暫停(Penh，參見(jiàn)圖4),即完全與 氣道順應(yīng)性和抗性計(jì)算值有關(guān)的無(wú)量綱參數(shù)，它與氣道阻力，阻抗和 胸膜內(nèi)壓測(cè)量相關(guān)。
試劑
-在大腸桿菌中產(chǎn)生并且如Mougneau等，1995所迷純化的LACK 重組蛋白。
-OM-197-MP-AC， 0.98 mg/ml濃度的批號(hào)DL040906來(lái)自0M PHARMA。
-抗-IgE EM-95 mAbs為來(lái)自,X(Palo Alto， CA， USA)的贈(zèng)品。 -乙酰甲膽堿(乙?；谆憠A)購(gòu)自Sigma(Saint Quentin Fallavier, France)。
-CBAP車歹沐(Flex set)購(gòu)自BD Biosciences,
抗體滴度
在最后的氣溶膠后1天通過(guò)心臟穿刺對(duì)所有小鼠取血。通過(guò) ELISA，使用大鼠EM-95抗-IgE mAbs作為包被抗體和如所述的與生物 素偶聯(lián)的大鼠抗-IgE mAbs作為二次抗體對(duì)總IgE定量(Julia等， 2002)。
支氣管肺泡灌洗(BAL)細(xì)胞分析(嗜酸細(xì)胞百分比) 對(duì)各小鼠放血并且將導(dǎo)管插入其氣管。用1 ml溫?zé)酨BS將肺洗滌 3次。用PBS洗滌細(xì)胞，重新懸浮于300 ju 1中并且使用Burker-Tii rk室計(jì)數(shù)。為了進(jìn)行差別BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞離心涂片器制品并 且用Wright/Giemsa染色進(jìn)行染色。通過(guò)顯微鏡檢查測(cè)定中性白細(xì)胞，嗜酸細(xì)胞和其它單核細(xì)胞的相應(yīng)數(shù)量。此處僅報(bào)導(dǎo)了嗜酸細(xì)胞百分比
(圖5)。
肺細(xì)胞因子含量分析
為了研究治療和未治療動(dòng)物的肺細(xì)胞因子含量，由LACK-致敏和 PBS-攻擊的wt小鼠("對(duì)照組")，LACK-致敏和攻擊的wt小鼠(哮喘" 組)，OM-197-MP-AC-治療的wt小鼠("OM-197"組)的肺制備蛋白質(zhì)提 取物。通過(guò)多路分析，使用FACSArray分析IL-4， IL-5， IL-13含量。
結(jié)果:
氣道高反應(yīng)性(AHR)測(cè)定
接下來(lái)每日用LACK氣溶膠將治療或未治療LACK-致敏小鼠(參見(jiàn) 上文)連續(xù)攻擊5天。在最后的氣溶膠后1天通過(guò)全身體積描記術(shù)測(cè)定 對(duì)增加濃度的氣溶膠化乙酰甲膽堿的反應(yīng)的AHR。
正如預(yù)計(jì)的，LACK-致敏和鹽水-攻擊的小鼠在接觸乙酰甲膽堿時(shí) 不會(huì)發(fā)生AHR，而未治療的LACK-致敏和攻擊的小鼠發(fā)生顯著的AHR， 正如通過(guò)高Penh值反映出的(圖4)。明顯相反的是，用OM-197-MP-AC 治療的LACK-致敏和攻擊的小鼠未表現(xiàn)出AHR。
結(jié)論
通過(guò)使用0M-197-MP-AC治療使在有乙酰甲膽堿存在下測(cè)定的小 鼠接觸氣溶膠抗原時(shí)的氣道高反應(yīng)性下降至對(duì)照組水平(鹽水)。 嗜酸細(xì)胞在支氣管-肺泡灌洗液(BAL)中的百分比表征 將結(jié)果報(bào)導(dǎo)在圖5中。
接受鹽水氣溶膠的LACK-致敏小鼠在BAL中未顯示出嗜酸細(xì)胞， 而接受LACK氣溶膠攻擊的LACK-致敏小鼠會(huì)在BAL中顯示出嗜酸細(xì) 胞。此外，OM-197-MP-AC-治療的小鼠表現(xiàn)出低于未治療對(duì)照組小鼠 3-倍的嗜酸細(xì)胞(圖5)。
結(jié)論用0M-197-MP-AC治療顯著減輕了 BAL嗜酸性細(xì)胞增多癥。
血清中免疫球蛋白(Ig)的測(cè)定 IgE結(jié)果如圖6中所示
在使用OM-197-MP-AC化合物治療時(shí)總IgE滴度(圖6)顯著降低。 結(jié)論
因此，使用OM-197-MP-AC治療的小鼠血清包含的總IgE低于未治 療致敏攻擊小鼠(即"哮喘型小鼠")2-倍。
肺細(xì)胞因子的測(cè)定
為了進(jìn)一步研究預(yù)防性O(shè)M-197-MP-AC對(duì)過(guò)敏性氣道炎癥的作用， 從治療和未治療WT小鼠的肺中提取蛋白質(zhì)并且通過(guò)多路分析，使用 CBA陣列珠和FACSarray定量已知在津喘中起重要作用的細(xì)胞因子 (IL-4， IL-5和IL-13)。將數(shù)據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)的總量校準(zhǔn)并且定為pg細(xì)胞 因子/mg肺蛋白質(zhì)。
盡管IL-4, IL-13和IL-5的量在LACK-致敏和PBS-攻擊小鼠肺中 的檢測(cè)限內(nèi)(參見(jiàn)圖7中的"對(duì)照組")，但是這些細(xì)胞因子的量在LACK 攻擊時(shí)顯著增加(參見(jiàn)圖7中的"哮喘")。相反，用OM-197-MP-AC 治療的LACK-致敏和攻擊小鼠肺包含低于未治療小鼠5倍的 IL-4 (p=0. 0003，) ， 5 倍的 IL-5 (p=0. 0003)和 3.5 倍的 IL-13(p-0. 003)(參見(jiàn)圖7中的"OM-197")。
除IL-4， IL-5和IL-13夕卜，通過(guò)多路分析，使用CBA陣列珠和 FACSarray定量其它細(xì)胞因子。將主要結(jié)果報(bào)導(dǎo)在下文中。還發(fā)現(xiàn)IFN-y在LACK-致敏和攻擊的小鼠肺中比LACK-致敏和PBS-攻擊的小鼠得 到增量調(diào)節(jié)。OM-197-MP-AC-治療小鼠的肺包含低于那些未治療小鼠 2-倍的IFN-y 。
KC為人IL-8或CXCL8的功能同源性趨化因子并且結(jié)合中性白細(xì) 胞和嗜酸細(xì)胞表達(dá)的CXCR2。實(shí)際上，KC能夠使粒細(xì)胞補(bǔ)充至發(fā)炎組 織。盡管KC以極低量存在于LACK-致敏和PBS-攻擊小鼠肺中，其表達(dá)在LACK氣溶膠攻擊時(shí)顯著增加。在肺中產(chǎn)生的KC的量在使用 0M-197-MP-AC治療時(shí)減少一半。
在LACK-致敏和PBS-攻擊的肺中發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子IL-6并且在使 用LACK氣溶膠時(shí)適度增加。OM-197-MP-AC-治療的小鼠肺表現(xiàn)出低于 那些未治療小鼠1. 5-倍的IL-6。發(fā)現(xiàn)趨化因子MCP-1在致敏和PBS-攻擊小鼠肺中表達(dá)并且在攻擊時(shí)適度得到增量調(diào)節(jié)。使用 0M-197-MP-AC治療的小鼠肺包含低于那些未治療動(dòng)物1. 8倍的MCP-1 。
TNF-a在治療和未治療小鼠肺中的量未產(chǎn)生顯著性差異。
在任何樣品中未檢測(cè)到IL-9 。
這些數(shù)據(jù)共同表明預(yù)防性0M-197-MP-AC不僅誘導(dǎo)對(duì)誘發(fā)過(guò)敏性 氣道炎癥和AHR關(guān)鍵的Th2細(xì)胞因子顯著減少，而且誘導(dǎo)其它細(xì)胞因 子和趨化因子減少，而這些細(xì)胞因子和趨化因子促成肺炎癥和炎性效 應(yīng)細(xì)胞，諸如嗜酸細(xì)胞募集。
實(shí)施例8a的一般性結(jié)論
本研究清楚地證實(shí)本發(fā)明的一種分子0M-197-MP-AC在發(fā)生過(guò)敏 性津喘中的防護(hù)作用。恰在致敏期前開(kāi)始使用0M-19 7 -MP-AC治療抑制 了 AHR發(fā)生并且顯著減輕了 BAL嗜酸性細(xì)胞增多癥。此外，總IgE量 在使用OM-197-MP-AC治療的小鼠血清中減少。
數(shù)據(jù)還證實(shí)OM-197-MP-AC治療主要影響涉及哮喘的細(xì)胞因子發(fā) 展和其它炎性細(xì)胞因子分泌。一種可能的機(jī)制在于OM-197-MP-AC可以 誘導(dǎo)控制Th2發(fā)展和隨后氣道炎癥的特異性免疫抑制應(yīng)答。
部分b)哮喘的"治療性"治療 方案
與上述(部分a)方案相比的主要差別
*僅在第15， 17和19天時(shí)(即在第二次致敏后至少1周)通過(guò)腹 膜內(nèi)使用OM-197-MP-AC以1 mg/Kg(20pg/小鼠)的劑量治療小鼠。 參通過(guò)多路分析，使用FACSArray測(cè)定的肺細(xì)胞因子為IL-4，IL-5， IL-13, IFN-y和IL-IO。 結(jié)果
BAL中的總細(xì)胞數(shù)和嗜酸細(xì)胞
在最后使用氣溶膠后2天，處死小鼠并且收集BAL細(xì)胞。正如預(yù) 計(jì)的，在LACK攻擊時(shí)未治療的LACK-致敏小鼠在BAL中表現(xiàn)出大量細(xì) 胞流入(比PBS-攻擊小鼠多20-倍)(圖8)。極為有意義的是，在使用 0M-197-MP-AC治療性給藥時(shí)，BAL細(xì)胞募集被影響了 90%(p < 0. 01)(圖 9)，其中嗜酸細(xì)胞低于未治療的小鼠40-45-倍。
結(jié)論
提供三次治療的OM-197-MP-AC能夠顯著減少肺細(xì)胞外滲和BAL 中的嗜酸性細(xì)胞增多癥。
肺細(xì)胞因子測(cè)定
由于氣道嗜酸性細(xì)胞增多癥在使用OM-197-MP-AC進(jìn)行治療性治 療時(shí)如此徹底地減少，所以我們尋求分析IL-4， IL-5， IL-13, IL-IO 和IFN-y肺含量(圖10)。實(shí)際上，當(dāng)與未治療的小鼠肺比較時(shí)，Th2-細(xì)胞因子IL-4， IL-5和IL-13的量在治療小鼠肺中顯著下降。在使 用OM-197-MP-AC治療時(shí)IL-4水平下降了 90°/。， IL-13的量下降了 85% 且IL-5的量下降了 70% (p<0. 00005-0. 005)。
結(jié)論
顯然，OM-197-MP-AC在僅提供三次治療時(shí)能夠降低Th2細(xì)胞因子 水平。這不是因向Thl細(xì)胞因子移動(dòng)所致，因?yàn)镮FN-y水平對(duì)所有小 鼠而言保持較低(l. 5-3 pg / ml)并且在治療小鼠中減少。為Th2和免 疫抑制因子的IL-10的量低并且在治療時(shí)未顯著增加。
IgE水平的測(cè)定
為了進(jìn)一步表征使用OM-197-MP-AC治療性治療后小鼠的免疫狀 態(tài)，我們通過(guò)ELISA分析了治療后和那些未治療小鼠血清中的LACK-特異性IgE。而LACK-特異性IgE水平在接觸LACK氣溶膠時(shí)增加7-倍， OM-197-MP-AC-治療小鼠的血清包含低于未治療LACK攻擊小鼠2-倍 (p<0. 05)的LACK-特異性IgE。 結(jié)論
顯然，0M-197-MP-AC在提供治療時(shí)降低了血清LACK-特異性IgE水平。
實(shí)施例8b的一般性結(jié)論
我們?cè)诒疚闹凶C實(shí)本發(fā)明的產(chǎn)品OM-197-MP-AC在提供治療時(shí)明 顯減輕了嗜酸性細(xì)胞增多癥和降低了諸如IL-4， IL-5和IL-13這類 Th2細(xì)胞因子水平并且還降低了過(guò)敏原-特異性IgE水平。
實(shí)施例8的一般性結(jié)論
顯然，0M-197-MP-AC在體內(nèi)孝喘模型中在預(yù)防和治療上均具有活 性，諸如根據(jù)其對(duì)許多津喘-相關(guān)讀出值的影響所判定的。
OM-197-MP-AC在鼠嗜喘模型通過(guò)其它給藥途徑給予的作用 實(shí)施例8中提供的結(jié)果表明，在通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給藥時(shí)， OM-197-MP-AC有效預(yù)防津喘鼠LACK模型中的過(guò)敏反應(yīng)。由此在該模 型中研究了與人體應(yīng)用更相容的其它給藥途徑(鼻內(nèi)，灌胃，皮下)。 方案
43只6-周齡雌性BALB/c ByJ小鼠購(gòu)自Centre d， Elevage Janvier (CERJ， Le Genest-St-Isle， France)。在第1和8天時(shí)通過(guò) 腹膜內(nèi)注射2次沉淀在2 mg白諷中的10 jig LACK蛋白(PerBio Science France SAS， Brebidres， France)使所有小鼠致敏(Julia等，2002)。
如下所述在第0-12天給予OM-197-MP-AC。在第16-第20天時(shí)如 下所述使用LACK溶液(0. 15%)或PBS攻擊所有小鼠。
實(shí)驗(yàn)組如下
- A組未治療的LACK-致敏和PBS-攻擊的小鼠(3小鼠)-B組未治療的LACK-致敏和-攻擊的小鼠(7小鼠)
- C組腹膜內(nèi)0M-197-MP-AC-治療的LACK-致敏和-攻擊的小鼠 (5小鼠)
-D組:灌胃OM-197-MP-AC-治療的LACK-致敏和-攻擊的小鼠(7 小鼠)
- E組皮下OM-197-MP-AC-治療的LACK-致敏和-攻擊的小鼠(7
小鼠)。
-F組鼻內(nèi)OM-197-MP-AC-治療的LACK-致敏和-攻擊的小鼠(7 小鼠)
- G組氣溶膠OM-197-MP-AC-治療的LACK-致敏和-攻擊的小鼠
在第0, 2， 3， 4， 7， 9， 10， ll天時(shí)治療C， D， E和G組小鼠； 而僅在第0， 4， 7和11時(shí)治療F組小鼠(鼻內(nèi)途徑)。
分別通過(guò)腹膜內(nèi)和皮下使用1 mg/Kg(20ng/小鼠)0M-197-MP-AC 治療C和E組小鼠。
通過(guò)灌胃法使用50 mg/Kg(1 mg/小鼠)OM-197-MP-AC治療D組小鼠。
通過(guò)鼻內(nèi)使用在2(^1體積中的20jig OM-197-MP-AC治療F組小 鼠(0M-197-MP-AC， 2 mg/ml， 10pl/鼻孔)。
G組小鼠接受0. 2% (2 mg/ml) 0M-197-MP-AC溶液氣溶膠10分鐘。
-在大腸桿菌中產(chǎn)生并且如所述純化的LACK重組蛋白(Mougneau 等，1995)。
-批號(hào)#050323，濃度為2. 2 mg/ml和批號(hào)#050322，濃度為2. 17 mg/ml的OM-197-MP-AC由0M PHARMA提供并且分別用于口服和所有其 它給藥。
-與生物素偶聯(lián)的抗-IgE(R35-118)購(gòu)自BD Biosciences (Le Pont deClaix, France)?？?IgE EM-95 mAbs為來(lái)自,X(PaloAlto，
試劑:CA， USA)的贈(zèng)品。
—在使用異氟烷(Aerrane， Baxter)輕度麻醉小鼠后進(jìn)行鼻內(nèi)治療。
抗體滴度
在最后使用氣溶膠后2天通過(guò)心臟穿刺給所有小鼠取血。通過(guò) ELISA，使用大鼠EM-95抗-IgE mAbs作為包被抗體和與生物素偶聯(lián)的 大鼠抗-IgE mAbs作為二次抗體如本文其它處所述對(duì)總IgE定量 (Julia等，2002)。
支氣管肺泡灌洗液(BAL)細(xì)胞分析
對(duì)各小鼠放血并且將導(dǎo)管插入其氣管。用lml溫?zé)酨BS將肺洗滌 3次。用PBS洗滌細(xì)胞，重新懸浮于300 ji 1中并且4吏用Burker-Tii rk室計(jì)數(shù)。為了進(jìn)行差別BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞離心涂片器制品并 且用Wright/Giemsa染色。
結(jié)果
a)通過(guò)顯微鏡檢查測(cè)定中性白細(xì)胞，嗜酸細(xì)胞和其它單核細(xì)胞的 相應(yīng)數(shù)量并且對(duì)測(cè)試的每一給藥途徑報(bào)導(dǎo)在圖11中。
正如本發(fā)明者預(yù)先在實(shí)施例8中報(bào)導(dǎo)的，通過(guò)腹膜內(nèi)使用 OM-197-MP-AC治療的小鼠表現(xiàn)出BAL中嗜酸細(xì)胞百分比和數(shù)量均下 降。然而使用0M-197-MP-AC皮下和灌胃治療的小鼠的BAL細(xì)胞含量未 產(chǎn)生與那些未治療的小鼠的差別。相反，在鼻內(nèi)接受OM-197-MP-AC 的小鼠BAL中嗜酸細(xì)胞頻率(未顯示)和數(shù)量(圖ll)減少一半。此外， 使用OM-197-MP-AC氣溶膠治療的小鼠表現(xiàn)出與鼻內(nèi)治療動(dòng)物相同的 趨向。
結(jié)論
至少OM-197-MP-AC在該模型中減少對(duì)過(guò)敏原敏感的小鼠支氣管 肺泡灌洗液中嗜酸細(xì)胞數(shù)量的腹膜內(nèi)和鼻內(nèi)途徑中明顯有效。b)然后如方法部分中所述測(cè)定血漿IgE水平。
與我們上述數(shù)據(jù)一致(實(shí)施例8)，我們發(fā)現(xiàn)使用OM-197-MP-AC腹 膜內(nèi)治療的小鼠表現(xiàn)出總IgE數(shù)量減少(圖12)。此外，接受鼻內(nèi)注射 0M-197-MP-AC的小鼠表現(xiàn)出總血清IgE滴度下降。相反，灌胃，皮下 和使用氣溶膠治療的小鼠提供了與未治療小鼠相比類似量的總血清 IgE。
結(jié)論
通過(guò)腹膜內(nèi)或通過(guò)鼻內(nèi)途徑給予的0M-197-MP-AC顯著減少了該 哮喘模型中的總IgE水平。
配制的OM-197-MP-AC通過(guò)鼠津喘模型中的口月艮給藥途徑的作用
增力口
實(shí)施例9中提供的結(jié)果表明OM-197-MP-AC在通過(guò)口服途徑未配方 給藥時(shí)預(yù)防鼠津喘LACK模型的過(guò)敏反應(yīng)無(wú)效。由此在這種模型中研究 了為了通過(guò)口服途徑增加0M-197-MP-AC活性的制劑方法。因此，在本 研究中，我們研究了三酰化OM PHARMA化合物OM-197-MP-AC在作為 耐胃腸制劑(OM-197-MP-AC與Lutrol F 127,也稱作伯洛沙姆407) 提供時(shí)是否可以防止小鼠發(fā)生過(guò)敏性氣道炎癥。
方案
通過(guò)將12. 875 ml OM-197-MP-AC 4. 35 mg/ml溶液和5. 6 mL 50 mg/ml Lutrol F127混合制備OM—197-MP-AC / Lutrol F 127制劑。 給藥體積為33(^1。
試劑和儀器
-將鹽水溶液指定為對(duì)照組氣溶膠。
-重組LACK蛋白在大腸桿菌中產(chǎn)生并且在Ni-NTA親和柱上純化 —?dú)溲趸X(白諷)購(gòu)自Pierce。-所用的血細(xì)胞分離器為 Cytospin 4 (Thermo-Shandon , Cheschire， U.K.),細(xì)胞載玻片購(gòu)自Thermo-Shandon且Wright和 Giemsa染料購(gòu)自Sigma。
-氣溶膠使用超聲噴霧器Ultramed(Medicalia， Forenze， Italy)得到。
-CBA珠P車歹iJ IL-4購(gòu)自BD Biosciences。
-流式細(xì)胞儀FACSarray購(gòu)自BD Biosciences,
動(dòng)物
-6周齡雌性BALB/c ByJ小鼠購(gòu)自The Centre d， Elevage Janvier, France并且將它們保持在動(dòng)物設(shè)施中的無(wú)特異性病原體條 件下。給它們祠喂Safe(Augy， France)提供的標(biāo)準(zhǔn)膳食。
方案
15只BAL/c小鼠(包括如實(shí)施例8和9中所示的對(duì)照組A和B的 小鼠)用于本實(shí)驗(yàn)。
A:未治療的LACK-致敏和鹽水-攻擊的小鼠(3小鼠) B:未治療的LACK-致敏和攻擊的小鼠(6小鼠) 預(yù)防性治療
F:0M-197-MP-AC(口服)-治療的LACK-致敏和攻擊的小鼠(6小鼠)
在第0, 2， 3， 4, 7， 9， 10， 11和12天使用1 mg配制的0M 197 MP AC對(duì)F組小鼠口服治療。
在第1天和第8天時(shí)，通過(guò)腹膜內(nèi)使用LACK/白礬使小鼠致敏。 從第16天-第20天，使用LACK溶液氣溶膠(O. 15%)攻擊除A組小鼠外 的所有組。而A組接受鹽水溶液(NaCl 0.9%) 40分鐘。
在第22天時(shí)，處死所有小鼠。對(duì)所有動(dòng)物而言，釆集BAL和無(wú)支氣管周淋巴結(jié)的肺。
對(duì)BAL細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并且在使用wright/giemsa染色后對(duì)細(xì)胞離 心涂片器進(jìn)行顯微鏡檢查后分析細(xì)胞含量。此外，采集每組的肺并且 冷凍在液氮中以便進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)胞因子含量分析。為了研究細(xì)胞因子 含量，由LACK-致敏和PBS-攻擊的小鼠(A組)，LACK-致敏和攻擊的小 鼠(B組)和配制的0M-197-MP-AC-治療的wt小鼠(F組)的肺制備蛋白 質(zhì)提取物。通過(guò)多路分析，使用FACSArray分析IL-4的量。
結(jié)果
通過(guò)顯微鏡檢查測(cè)定中性白細(xì)胞，嗜酸細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和其它單 核細(xì)胞的相對(duì)量并且報(bào)導(dǎo)在圖13中。
與實(shí)施例8(和圖11)中報(bào)導(dǎo)的結(jié)果使用0M-197-MP-AC(未配制的) 通過(guò)灌胃治療小鼠的BAL細(xì)胞含量相反，在使用Lutrol配制 OM-197-MP-AC時(shí)，中性白細(xì)胞，嗜酸細(xì)胞(p〈0. 05)，淋巴細(xì)胞和其它 單核細(xì)胞的數(shù)量在接受配制的OM-197-MP-AC的小鼠BAL中減少一半 (參見(jiàn)圖13)。
此外，分析治療和未治療小鼠肺中IL-4的量。而IL-4肺含量極 低至在PBS-攻擊動(dòng)物中無(wú)法檢測(cè)到，IL-4的量在LACK-攻擊的未治療 的對(duì)照組小鼠中增加了 20-倍。在使用配制的0M-197-MP-AC 口服治療 (參見(jiàn)圖14)時(shí)，IL-4在肺中的量減少了 75 %(p<0. 01)。
結(jié)論
當(dāng)適當(dāng)配制時(shí)，口服OM-197-MP-AC能夠顯著減少這種模型中對(duì)過(guò) 敏原敏感小鼠支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸細(xì)胞數(shù)量。這種減少與IL-4 減少相關(guān)。
《滋辨U
0M-197-MP-AC對(duì)非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的作用
到目前為止，我們提供了 OM-197-MP-AC僅在哞喘鼠模型中的體內(nèi)功效的實(shí)施例。在本實(shí)施例中，我們將提供0M-197-MP-AC還對(duì)另一種 炎癥病理學(xué)情況糖尿病具有活性的一定證據(jù)。
方案
我們預(yù)先證實(shí)OM-197-MP-AC和其它三酰化分子減輕了哮喘型動(dòng) 物的氣道炎癥。
在本研究中，我們研究了 0M-197-MP-AC是否能夠在另一種鼠炎性 疾病模型，即NOD糖尿病模型(非肥胖型糖尿病)中誘導(dǎo)防護(hù)作用。
在10周過(guò)程中使用0. 01， 0. 1和1 mg/kg OM-197-MP-AC治療10 只雌性6-周齡N0D小鼠的組。將6只腹膜內(nèi)接受每周3次200^1 PBS 的雌性MOD小鼠組用作對(duì)照組。
在該系列實(shí)驗(yàn)中，持續(xù)治療至小鼠達(dá)到16周齡。這是對(duì)照組動(dòng)物 開(kāi)始發(fā)生明顯糖尿病的時(shí)間點(diǎn)。
將糖尿病發(fā)病率的結(jié)果與在對(duì)照組動(dòng)物中獲得的那些結(jié)果比較。 每周使用測(cè)試條(Glukotest⑧，Roche， France),通過(guò)糖尿測(cè)試檢查 一次糖尿病，當(dāng)糖尿病出現(xiàn)時(shí)，每周進(jìn)行2次。通過(guò)^f吏用測(cè)試條 (Gl畫(huà)trend⑧)評(píng)價(jià)糖血0 3mg/ml)證實(shí)糖尿病。
使用Kaplan-Meier法繪制不同實(shí)驗(yàn)組中糖尿病的發(fā)生率(參見(jiàn)圖 15)，即非參數(shù)累積存活圖。使用提供相應(yīng)f值的時(shí)序(Mantel-Cox) 檢驗(yàn)進(jìn)行曲線之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。1 mg/kg劑量的OM-197-MP-AC具有 顯著活性(p = 0. 0321)并且0. 1 mg/kg的本發(fā)明化合物表現(xiàn)出陽(yáng)性趨 勢(shì)(p《0543)。
在使用0. 3 mg/kg劑量OM-197-MP-AC的另一種實(shí)驗(yàn)中，在第27 周時(shí)獲得的結(jié)果表現(xiàn)出0. 0362的顯著性p值。在第27周時(shí)，在對(duì)照 組動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)82%的動(dòng)物為糖尿病，而在0M-197-MP-AC治療組(O. 3 mg/kg)中僅有27°/。表現(xiàn)出該病。
毒理學(xué)LAL內(nèi)毒性首先通過(guò)鱟屬(Limulus)阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)色試驗(yàn)測(cè)定0M-197-MP-AC和0M-294-DP的內(nèi)毒性(Bio-Whittaker的Chromogenic- LAL，試劑盒n。 50-650U)。
方案
本試驗(yàn)基于脂多糖(LPS)或相差無(wú)幾結(jié)構(gòu)產(chǎn)物通過(guò)存在于LAL中的酶級(jí)聯(lián)的活化。通過(guò)用蛋白酶裂解與肽連接的色原證實(shí)這種酶活化。這種酶反應(yīng)在37C下進(jìn)行并且在405 nm處測(cè)定隨時(shí)間的色原形成。記錄達(dá)到0. 2個(gè)單位D. 0.所必需的時(shí)間并且與LPS標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)曲線)相比計(jì)算內(nèi)毒素活性。與標(biāo)準(zhǔn)化大腸桿菌LPS制品相比用EU(內(nèi)毒素單位)表示結(jié)果(l EU相當(dāng)于O. 08 ng當(dāng)量的LPS)。
結(jié)果
OM-197-MP-AC和OM-294-DP在色原LAL測(cè)定中幾乎未表現(xiàn)出或無(wú)鱟屬活性。結(jié)論
OM-197-MP-AC和0M-294-DP在與LPS相比時(shí)內(nèi)毒素性極弱(至少降低1Q6倍)。
,滋辨W毒理學(xué)家兔中的致熱原性
最終，測(cè)試0M-197-MP-AC和0M-294-DP在家兔中可能的致熱原性。方案
給3只新西蘭白色家兔/組通過(guò)腹膜內(nèi)注不同劑量的OM-197-MP-AC或OM-294-DP(按照歐洲藥典2001，方法2. 6. 8)。
產(chǎn)品0. 0009， 0. 009， 0. 09， 0. 9 mg/kg的OM-197-MP-AC和0. 001，0.01， 0.1和1 mg/kg的OM-294-DP。
動(dòng)物讀出值溫度增加
結(jié)果將兩種化合物視為在體內(nèi)無(wú)致熱原性，因?yàn)樵谧罡邷y(cè)試劑量(0. 9mg/kg)下未達(dá)到0M-197-MP-AC的致熱閾且OM-294-DP僅在0. 01-0. 1mg/kg下達(dá)到致熱原性。
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風(fēng)^"
圖1:單獨(dú)的LPS(ling/ml)或在前90分鐘過(guò)程中用所示濃度(以jug/ml計(jì))的0M-197-MP-AC(A)或294-DP (B)且然后用LPS(ljug/ml)再進(jìn)行20小時(shí)刺激的鼠DC的IL-12(左組)和IL-10(右組)分泌。從DC培養(yǎng)物中收集上清液并且通過(guò)ELISA分析存在的IL-12和IL-IO。
圖2:單獨(dú)的LPS(14g/邁l)或在前90分鐘過(guò)程中用所示濃度(以jig/ml計(jì))的294-DP (294)或0M-197-MP-AC (197)且然后用LPS (l|ug/ml)再進(jìn)行20小時(shí)刺激的鼠DC的TNF-a分泌。從DC培養(yǎng)物中收集上清液并且通過(guò)ELISA分析存在的TNF-a。
圖 3:增加劑量的4種測(cè)試化合物(OM-197-MP-AC ， n-5;0M-197-MC-HD， n-5; 0M-294-BA-MP， n=7; 0M-197-MP-HD， 11=3)對(duì)多克隆活化后人D^ T細(xì)胞的IFN-y和IL-13產(chǎn)生的作用。將結(jié)果表示為n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(土p25/p75)并且顯示處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞(^1為100%，參見(jiàn)虛線)相比的百分比(%)增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生。使用非參數(shù)未配對(duì)Mann-Whi tney t檢驗(yàn)(2-尾)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
圖4:通過(guò)全身體積描記術(shù)(Emka)的對(duì)最后抗原攻擊后1天增加濃度(6-25 mg/ml)的吸入乙酰甲膽堿的反應(yīng)的AHR。如方案部分中所述治療動(dòng)物。顯示了鹽水-攻擊的動(dòng)物(作為陰性對(duì)照組，n=4)，未治療的LACK-攻擊的動(dòng)物(作為陽(yáng)性對(duì)照組，n-8)和0M-197-MP-AC-治療的LACK攻擊的小鼠(n-8)的結(jié)果(意味著"增強(qiáng)的中止值，，+/-SEM)。
圖5:通過(guò)對(duì)用Wright/Giemsa染色進(jìn)行染色的細(xì)胞離心涂片器制品進(jìn)行顯微鏡檢查分析的支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸細(xì)胞百分比。研究組與圖4所用的那些相同。虛線表示整個(gè)圖中在未治療的哞喘動(dòng)物中獲得的值。
ilj—如方案部分中所述治療小鼠并且在最后使用氣溶膠后1天通過(guò)心臟穿刺放血。通過(guò)ELISA，如所述的^f吏用大鼠EM-95抗-IgE mAbs作為包被抗體和與生物素偶聯(lián)的大鼠抗-IgE mAbs作為二次抗體定量總IgE(Julia等，2002)。每點(diǎn)相當(dāng)于單一動(dòng)物。研究組與圖4和5中所用的那些相同。
圖7:由LACK-致敏和PBS-攻擊的wt小鼠(Control) ， LACK-致敏和攻擊的wt小鼠(哞喘)，0M-197-MP-AC-治療的wt小鼠(OM-197)的左肺制備蛋白質(zhì)提取物(400jal)。通過(guò)多路分析，使用FACSArray分析IL-4， IL-5和IL-13含量。以pg/ml給出結(jié)果。虛線表示整個(gè)圖中在未治療的津喘動(dòng)物中獲得的值。
圖8:如方法部分中所述通過(guò)治療方式將小鼠治療3次，在使用插入氣管的套管放血的各小鼠中進(jìn)行灌洗。用lml溫PBS將肺洗滌3次。用PBS洗滌細(xì)胞，重新懸浮于300 nl并且4吏用Burker-Tiirk室計(jì)數(shù)。為了進(jìn)行差別BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞離心涂片器制品并且用Wright/Giemsa染色進(jìn)行染色。測(cè)試組為L(zhǎng)ACK-致敏和PBS-攻擊的wt小鼠(Control), LACK-致敏和攻擊的wt小鼠(孝喘)和OM-197-MP-AC-治療的wt小鼠(OM-197)。通過(guò)對(duì)使用Wright/Giemsa染色進(jìn)行染色的細(xì)胞離心涂片器制品顯微鏡檢查測(cè)定BAL中的總細(xì)胞數(shù)量。虛線表示整個(gè)圖中在未治療的哮喘動(dòng)物中獲得的值。
圖9:通過(guò)對(duì)使用Wright/Giemsa染色進(jìn)行染色的細(xì)胞離心涂片器制品顯微鏡檢查分析的BAL中的嗜酸細(xì)胞的百分比。如方法部分中所述以治療方式將小鼠治療3次，如圖8中例證的采集來(lái)自BAL的細(xì)胞。研究的(治療)組與圖8中所用的那些相同。虛線表示整個(gè)圖中未治療的哮喘動(dòng)物中獲得的值。
圖10:為了分析肺細(xì)胞因子含量，采集肺并且將左肺用于制備蛋白質(zhì)提取物。每個(gè)左肺回收400|nl。通過(guò)多路分析，使用FACSArray測(cè)定細(xì)胞因子并且以pg / ml給出結(jié)果。研究的(治療)組與圖8和9中所用的那些相同。虛線表示整個(gè)圖中未治療的孝喘動(dòng)物中獲得的值。
圖11:鼠BAL中的嗜酸細(xì)胞，中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量。如方法部分中所述獲得并且洗滌細(xì)胞。為了進(jìn)行差別BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞離心涂片器制品并且用Wright/Giemsa染色。對(duì)每個(gè)載玻片數(shù)至少400個(gè)細(xì)胞并且通過(guò)顯微鏡檢查測(cè)定嗜酸細(xì)胞，中性白細(xì)胞和淋巴 細(xì)胞數(shù)量。虛線表示整個(gè)圖中在未治療的津喘動(dòng)物中獲得的值。
圖12:鼠血清中過(guò)敏原-特異性IgE的測(cè)定，在最后使用氣溶膠 后2天通過(guò)心臟穿刺放血并且制備血清。通過(guò)ELISA測(cè)定LACK-特異 性IgE。報(bào)導(dǎo)來(lái)自各小鼠的結(jié)果(ng/ml)，將每組中的平均值表示為棒 形圖。* = P<0，05。虛線表示整個(gè)圖中在未治療的哞喘動(dòng)物中獲得的值。
圖13:鼠BAL中嗜酸細(xì)胞，中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量。如方案 部分中所述獲得并且洗滌細(xì)胞。為了進(jìn)行差別BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備細(xì) 胞離心涂片器制品并且用Wright/Giemsa染色。對(duì)每個(gè)載玻片數(shù)至少 400個(gè)細(xì)胞并且通過(guò)顯微鏡檢查測(cè)定嗜酸細(xì)胞，中性白細(xì)胞，淋巴細(xì) 胞和其它細(xì)胞(巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞和肺單核細(xì)胞)數(shù)量。實(shí)施例10 中方案部分中描述了測(cè)試的3個(gè)組。虛線表示整個(gè)圖中在未治療的哮 喘動(dòng)物中獲得的值。
圖14:為了分析肺細(xì)胞因子含量,收集肺并且將左肺用于制備蛋 白質(zhì)提取物。對(duì)每個(gè)左肺收集400^1。通過(guò)FACSArray測(cè)定IL-4并且 以pg/ml表示結(jié)果。實(shí)施例10中方案部分中描述了測(cè)試的3個(gè)組。虛 線表示整個(gè)圖中在未治療的哞喘動(dòng)物中獲得的值。
圖15: NOD小鼠中糖尿病的發(fā)生。使用PBS(6只動(dòng)物)或3種所示 劑量的0M-197-MP-AC (10只動(dòng)物的3個(gè)組)通過(guò)腹膜內(nèi)治療小鼠。每周 1次通過(guò)糖尿測(cè)試(Glukotest)檢查糖尿病并且在糖尿病出現(xiàn)時(shí)每周2 次。通過(guò)使用測(cè)試條(Glucotrend⑧)評(píng)價(jià)糖血0 3mg/ml)證實(shí)糖尿病。 使用Kaplan-Meier法繪制不同實(shí)驗(yàn)組中的糖尿病發(fā)生率(參見(jiàn)圖15)， 即非參數(shù)累積存活圖。使用提供相應(yīng)5C2值的時(shí)序(Mantel-Cox)檢驗(yàn)進(jìn) 行曲線之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較OM-197-MP-AC 1 mg/kg p= 0.321; 0.1mg/kg = 0. 0543,
權(quán)利要求
1. 治療患有與炎性細(xì)胞因子過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)的疾病或病癥的溫血?jiǎng)游?，包括人的方法，包括?duì)有此需要的患者給予適量的藥物組合物，該藥物組合物包含至少一種下列通式(I)的免疫調(diào)節(jié)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，溶劑合物或異構(gòu)體其中-m和n彼此獨(dú)立為1-4的整數(shù)，-X和Y各自表示中性或帶電荷狀態(tài)的基團(tuán)，其選自下組*羧基-COOH，*二羥基磷酰氧基-O-P(O)(OH)2，*羥基磺酰氧基-O-SO2(OH)，*氨基-NH2，*羥基-OH，*[氨基(C1-C10)烷基]氨基羰基-CONH(CH2)n1-NH2，其中n1為1-10的整數(shù)，*[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH，其中n1為1-5的整數(shù)，*{羧基[氨基(C1-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2，其中n1為1-5的整數(shù)，*氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH2，其中n1為1-15的整數(shù)，*二羥基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH，其中n1為1-10的整數(shù)，*羥基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-OH，其中n1為1-10的整數(shù)，*羧基(C1-C10)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-COOH，其中n1為1-10的整數(shù)，*氧代(C1-C5)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-CHO，其中n1為1-5的整數(shù)，*[羧基(C1-C10)烷?；鵠氨基(C1-C15)烷酰氧基-O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中n1為1-10的整數(shù)且n2為1-15的整數(shù)，-R1和R2各自表示衍生自具有2-18個(gè)碳原子的飽和或不飽和直鏈或支鏈的羧酸的酰基，其未被取代或帶有1-3個(gè)取代基取代，所述的取代基選自羥基，二羥基磷酰氧基，2-18個(gè)碳原子的烷基，2-18個(gè)碳原子的烷氧基，在?；糠稚?-18個(gè)碳原子的酰氧基，氨基，酰氨基，-C*1和C*2彼此獨(dú)立為構(gòu)型為R、S或外消旋形式RS中的不對(duì)稱碳；任選與惰性無(wú)毒性藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體結(jié)合或混合。
2.權(quán)利要求l的方法，其中* X選自下組*羧基-COOH,* 二羥基磷酰氧基-O-P (0) (OH) 2，*羥基磺酰氧基-0-S02 (OH)，*氨基-匪2，* [氨基(d-d。)烷基]氨基羰基-C0NH(CH丄廣冊(cè)2，其中n!為I-IO的整數(shù)，* [二羧基(C廣C5)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH (COOH) - (CH2) nl-COOH ，其中iii為1-5的整數(shù)，* {羧基[氨基(d-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)nl-NH2，其中m為1-5的整數(shù)，*氨基(d-ds)烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-NH2，其中rh為1-15的整數(shù)，*且Y選自下組* 二羥基磷酰氧基-0-P(O) (0H) 2，*羥基磺酰氧基-0-S02 (OH)，*氨基-冊(cè)2，*羥基-0H，*氨基(C廣dJ烷酰氧基-0-C0-(CH2)M-NH2，其中r^為1-15的整數(shù)，* 二羥基(C廣d。)烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-CHOH-CH2OH,其中m為1-10的整數(shù)，*羥基(d-Cj烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-OH，其中m為1-10的整數(shù)，*羧基(C廣d。)烷酰氧基-0-C0-(CH2)nl-C00H，其中r^為1-10的整數(shù)，*氧代(d-Cs)烷酰氧基-0-C0-(CH2)rCH0,其中仏為1-5的整數(shù)，* [羧基(c「c1Q)烷?；鵠氨基(d-C15)烷酰氧基-0-C0-(CH2)nl-NH-C0-(CH2)n2-C00H，其中n丄為1-10的整數(shù)和112為1-15的整數(shù)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中* X選自下組*羧基-C00H，* 二羥基磷酰氧基-O-P (0) (0H)2，*羥基磺酰氧基-O-S02 (0H)，*氨基-NH2，* [氨基(C廣C》烷基]氨基羰基-C0NH(CH丄「NH2，其中n!為1-6的整數(shù)，* [二羧基(C廣Cs)烷基]氨基羰基-CO-NH-CH (COOH) - (CH2) ^-C00H，其中iii為1-5的整數(shù)，* {羧基[氨基(d-C5)烷基]}氨基羰基-CO-NH-CH(C00H)-(CH2)nl-NH2，其中t^為1-5的整數(shù)，*氨基(C廣CJ烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-NH2，其中n!為2-12的整數(shù)，*且Y選自下組* 二羥基磷酰氧基-O-P (0) (OH) 2，*羥基磺酰氧基-0-S02 (OH)，*氨基-冊(cè)2，*羥基-OH，*氨基(C廣d2)烷酰氧基-0-CO-(CH丄廣NH2，其中m為2-12的整數(shù)，* 二羥基(Cr"C7)烷酰氧基-0-C0-(CH2)^-CHOH-CH2OH，其中ni為3-7的整數(shù)，*羥基(C廣C6)烷酰氧基-0-CO-(CH2)nl-OH，其中ih為2-6的整數(shù)，*羧基(C廣C》烷酰氧基-0-C0-(CH2),C00H，其中m為3-6的整數(shù)，*氧代(C廣C5)烷酰氧基-O-CO-(CH丄r"CHO，其中n!為2-5的整數(shù)，* [羧基(c3-c6)烷酰基]氨基(c2-c12)烷酰氧基-O-CO-(CH2)nl-NH-CO-(CH2)n2-COOH，其中n！為3-6的整數(shù)且112為2-12的整數(shù)。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的方法，其中:* X選自下組* -COOH，* -0-P (0) (OH) 2，* -O-SO"OH)，* _NH2，* -CO-NH- (CH2) 3-NH2或-CONH- (CH2) 6-NH2，* -CO-NH-CH (COOH) -CH廣COOH，* -CO-NH-CH (COOH) - (CH2) 4-NH2，* -0-C0-(CH2) 5-NH2，*且Y選自下組* -0-P (0) (OH) 2，* -0-S02(0H)，* -NH2，* -OH，* -0-C0-CH2-NH2(2-氨基乙酰氧基)，-0-CO-(CH2)2-NH2(3-氨基丙 酰氧基)，-0-CO- (CH2) 5-NH2 (6-氨基己酰氧基)或-O-CO- (CH2) U-NH2 (12-氨基十二烷酰氧基)，* -O-CO- (CH2) 4-CH0H-CH20H (6， 7-二羥基庚酰氧基)，* -0-CO- (CH2) 5-0H (6-幾基己酰氧基)，* -0-CO-(CH2)2-COOH(3-羧基丙酰氧基)* -O-CO- (CH2)廣CHO (6-氧代己酰氧基)，* -O-CO- (CH2) 5-NH-CO- (CH2) 2-COOH (3-羧基丙?；被乎Ｑ?br> 5. 權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其中Ri和R2選自 -CO-CH廣OH
- (CH2) "-CH" (3 (C120) C14)， -CO-CH廣OHOH- (CH2) wCH;, (3 (HO) C")，-C0-CH3, (C2)，-CO-CH廣NH-CO-OH
- (CH2) 5-CH3, ([2 (d。0) C8〗NC2)， -CO-OH
- (CH2) 5-CH3, (2 (C60) C8)， -CO-(CH2)"-CH3， (CI 8),-CO-CH廣OH
- (CH2) 10-CH3， (3 (BnO) C")， -C0-CH2-C*H
- (CH2) 1Q-CH3 ， (3 [ (OH)廣P (0) 0] C14)， O相當(dāng)于上述式中構(gòu)型為R、 S或外消旋形式RS中的不對(duì)稱碳。
6. 權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的方法，其中 -Ri選自-C0-CH2-C'"H
- (CH2) 10-CH3， (3 (C120) C14)， -C0-CH2-C'"H0H- (CH2) ir"CH3， (3 (HO) C")，-C0-CH3， (C2)，-C0-CH廠NH-C0-C'"H [O-CO- (CH2) 8-CH3〗 一 咖5-CH3， ([2 (C10O) C8] NC2)， -CO-C'"H
— (CH2) 5-CH3, (2 (C60) C8)， -CO-(CH2)16-CH3， (CI 8)，- 1選自-CO-CH2-C"2H [O-CO- (CH2) 10-CH3] - (CH2) 10-CH3， (3 (C120) C14)， -CO-CH2-C"2HOH- (CH2) CH3， (3 (HO) C14)， -CO-CH2-C"2H [0-CH2-C6H5〗-(CH2) ^CH" (3 (BnO) C")， -CO-CH2-C"2H
- (CH2) 10-CH3， (3 [ (OH) 「P (0) 0] C14)。 (T和C'"相當(dāng)于上述式中構(gòu)型為R、 S或外消旋形式RS中的不對(duì) 稱碳。
7. 權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的方法，其中給予的化合物具有通式 (II):X- (CH2) rCTH-CO-NH- (CH2) 3-C*2H-CH2-Y (I I)I I醒i 腿2其中X, Y， 112和m如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所定義，C"為構(gòu) 型R、 S或?yàn)橥庀齊S且C"為構(gòu)型R。
8. 權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的方法，其中給予的化合物選自式 (II)的那些，其中- X - -O-P (0)卿2 ， Y = -O-P (0) (OH) 2 ， = -CO-CHrC"1!!
— (CH2) n-CH; ， R2 = -CO-CH廣C"2HOH-(CH2),CH3， m = 2， C'1為構(gòu)型S， C'2為構(gòu)型R， C"1 和C'"為構(gòu)型R，即(3S，9R)-3-
-4-氧代-5-氮雜-9- [ (R) -3-羥基十四烷?；被鵠-癸-l， 10-二醇(1， 10)-雙-二氫磷酸酯(0M-294-DP (S， R))，<formula>formula see original document page 8</formula>-CO-CH廠C"2HOH-(CH2),CH3， m = 2， C"為構(gòu)型S且C"為構(gòu)型R， C"1 和C'"為構(gòu)型R，即(3S,9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨 基]_4-氧代-5-氮雜-9- [ (R) -3-羥基十四烷酰氨基]-癸-l， 10-二醇l-二氫磷酸酯10-(6， 7-二羥基庚酸酯)(0M-197-MP-HD(S，R))，- X - -COOH ， Y - -0-CO-(CH2) 4-CHOH-CH2OH ， ^ -一CO-CH廣C'"H [O-CO- (CH2) wCH^ - (CH2) 10—CH3 ， R2 = -CO-CHrdOH-^HJm-CH" m = 1， C"為構(gòu)型S且匚2為構(gòu)型R， C.'1 和C'"為構(gòu)型R,即N-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷?；鵠-L-天冬氨 酸，a-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]戊基}酰胺 5-0-(6， 7-二羥基庚酸酯)(OM-197-MC-HD(S， R))，一 X = -0-P (0) (OH) 2 , Y - -O-CO- (CH2) 5-NH2 ， ^ --CO-CH2-C*'1H
-(CH2)1。-CH3 ， R2 --CO-CHHr'SHOH-O^ho-CH" m = 2， C"為構(gòu)型S且C"為構(gòu)型R， C"1 和C"2為構(gòu)型R，即(3S，9R)-3-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨 基]-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]-癸-1, 10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(0M-197-MP-AC(S，R))，- X - -NH2 , Y = -0-P (0) (OH) 2 ， R！ = -CO-CH^CTEHO-CO-a^Kiy-(CH2"-CH3 ， R2 --CO-CH2-C"2HOH-(CH2h。-CH3,邁- 4， C"為構(gòu)型S且(T為構(gòu)型R， C"1 和C"為構(gòu)型R，即(5S，llR)-l-氨基-5-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷 酰氨基]-6-氧代-7-氮雜-11- [ 00 -3-羥基十四烷酰氨基]-十二烷-12-醇12-二氫磷酸酯(0M-294-BA-MP(S,R))。
9.權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的方法，用于治療溫血?jiǎng)游?，包括人?他們患有與生物體中T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞活化的炎 性細(xì)胞因子過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)的疾病或病癥，其中所述的炎性細(xì)胞因子或炎癥標(biāo)記屬于IL-1 p , IL-4， IL-5， IL-6， IL-8， IL-9， IL-13， IFN-y , TNF-a和MCP-l。
10. 權(quán)利要求1-9的方法，其中所述的疾病選自哞喘，糖尿病，特 應(yīng)性皮炎，過(guò)敏性鼻炎，前列腺炎，炎癥性腸病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
11. 權(quán)利要求1-10的方法，其在于通過(guò)粘膜或非腸道途經(jīng)給予在 藥學(xué)上可接受的載體，賦形劑或制劑中的治療有效量的如權(quán)利要求 1-8中定義的任意化合物。
12. 權(quán)利要求1-11的方法，其在于通過(guò)腹膜，皮下，口服，鼻內(nèi)， 舌下或氣溶膠途經(jīng)給予治療有效量的如權(quán)利要求1-8中定義的化合 物。
13. 權(quán)利要求1-12的方法，其中所需的如權(quán)利要求1-8中定義的 免疫調(diào)節(jié)分子在人體中的劑量為0. 01-50mg/m2。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)化合物在治療與炎性細(xì)胞因子過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)的疾病中的用途，所述的疾病諸如選自哮喘，特應(yīng)性皮炎，過(guò)敏性鼻炎，前列腺炎，炎癥性腸病，糖尿病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疾病，所述的化合物具有通式(I)，其中m和n彼此獨(dú)立為1-4的整數(shù)，X和Y表示-COOH，-O-P(O)(OH)₂，-O-SO₂(OH)，-NH₂，-OH，-CONH(CH₂)_n1-NH₂，-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)_n1-COOH，-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)_n1-NH₂，-O-CO-(CH₂)_n1-NH₂，-O-CO-(CH₂)_n1-CHOH-CH₂OH，-O-CO-(CH₂)_n1-OH，-O-CO-(CH₂)_n1-COOH，-O-CO-(CH₂)_n1-CHO，-O-CO-(CH₂)_n1-NH-CO-(CH₂)_n2-COOH，R₁和R₂各自表示衍生自具有2-18個(gè)碳原子的飽和或不飽和直鏈或支鏈的羧酸的?；湮幢蝗〈驇в?-3個(gè)取代基，所述的取代基選自羥基，二羥基磷酰氧基，2-18個(gè)碳原子的烷基，2-18個(gè)碳原子的烷氧基，在?；糠稚系?-18個(gè)碳原子的酰氧基，氨基，酰氨基。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101511379SQ200780007571
公開(kāi)日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者C·赤婭瓦洛麗, J·鮑爾, S·莫特爾 申請(qǐng)人:Om藥物公司