專利名稱：含有同種異體或異種腫瘤細(xì)胞的腫瘤疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胂瘤的治療。具體而言，本發(fā)明涉及免疫介導(dǎo)的腫瘤治療。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)由兩個分支組成，這兩個分支雖然在速度和特異性方面有 所區(qū)別，但彼此之間仍是有著復(fù)雜的聯(lián)系，并針對內(nèi)源和外源損傷產(chǎn)生 快速且直接的應(yīng)答"'21。先天性免疫系統(tǒng)提供了針對物理、化學(xué)和微生物 損傷的即時宿主防御"'21。它包括嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 補(bǔ)體、細(xì)胞因子和急性期蛋白16'"。盡管缺少抗原特異性，但是先天性免 疫系統(tǒng)仍然能夠分辨自身的肽和非自身的外源肽"'21。然而，適應(yīng)性免疫包括高度特異性抗原指導(dǎo)的應(yīng)答中的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞"'21。適應(yīng) 性免疫的一個優(yōu)勢是免疫記憶能力，這使得可對進(jìn)一步刺激產(chǎn)生更強(qiáng)和 更快的應(yīng)答"?？乖囟允荏w的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞"'21。 i要的I細(xì)胞效應(yīng)子為 帶有CD4受體的T輔助細(xì)胞和帶有CD8受體的細(xì)胞毒性T細(xì)胞"'21。 T輔 助細(xì)胞與MHC II相互作用，并且負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答、識別外源抗原、活 化該免疫系統(tǒng)的各個部分以及活化B細(xì)胞。細(xì)胞毒性T細(xì)胞與MHC I受 體相互作用并且在發(fā)動針對外源病原體的免疫應(yīng)答的過程中起重要作用16， 21主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是一種編碼在調(diào)節(jié)和調(diào)整免疫應(yīng)答的 過程中起重要作用的蛋白的基因區(qū)域1M6。根據(jù)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特質(zhì)，MHC 的基因產(chǎn)物分為兩個不同組MHC I和MHC n1。16。 MHC I類受體存在于所有的有核細(xì)胞上"'16。它們呈遞內(nèi)源合成的肽并且與自身識別密切相關(guān)。MHC n類受體僅存在于與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞上并且呈遞外源蛋白，例如那些由細(xì)菌生產(chǎn)的蛋白1D'"。通常，認(rèn)為MHC I與腫瘤排斥有關(guān)，但最近發(fā)現(xiàn)匪c n也起作用。MHC I類分子所結(jié)合的抗原的多樣性基于三種基本的和相互關(guān)連的原 理。首先I類分子能夠結(jié)合許多具有不同序列的肽2，16。這些I類MHC:抗 原復(fù)合體可以被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CDS)所識別，最終導(dǎo)致任何攜帶有 類似外源蛋白的細(xì)胞均遭到毀滅2'"。其次，每種生物都會表達(dá)許多不同 的I類基因2'16。最后，MHC表現(xiàn)出多態(tài)性，在每個基因座上有多個等位 基因2"'"。在人體內(nèi)，MHC I在多個被稱為人白細(xì)胞抗原(HLA)的基因座 上表達(dá)，所述基因座為HLA-A、 HLA-B和HLA-C，其中多態(tài)性最高的是 HLA-B"'"。上述因素導(dǎo)致了高度的個體特異性并且需要調(diào)節(jié)物(細(xì)胞免疫系統(tǒng))來施加選擇壓力。在個體之間移植器官和組織時利用了這種高度的特異性和主要選擇壓力23。同卵雙生子和近緣家族成員之間排斥移植組織的可能性較低，因 為他們具有類似的HLA基因座16。這是基于下述事實，即MHCI是共顯性 表達(dá)的，并且在大多數(shù)情況下會完整遺傳而不會發(fā)生重組"'"。因此，理 論上，純合個體(例如同卵雙生子和同基因大鼠)能夠接受來自他/她的純 合供體的腦肺瘤。更重要的是，基于特異性和靶向性的免疫應(yīng)答，他們 將排斥來自雜合供體的腦腫瘤。如前所述，MHCI類受體為位于大多數(shù)細(xì)胞上的表面糖蛋白，所迷表 面糖蛋白會在免疫應(yīng)答中起到至關(guān)重要的作用，這些MHC I類與抗原肽 結(jié)合并且與NK細(xì)胞和CD8相互作用5'"'25。上述肽來源于病毒和腫瘤感染 的細(xì)胞中的降解的內(nèi)源蛋白5'16，25?？乖庸な且环N包括許多步驟的復(fù)雜 機(jī)制。上述步驟中任何一步的缺陷都可能會導(dǎo)致無法表達(dá)MHC I類抗原 復(fù)合體以及逃避T細(xì)胞的識別和破壞12。 MHC I復(fù)合體的缺失或失調(diào)是用 來逃避被CD8破壞的常見機(jī)制12。直覺地，人們可能會假定這種"丟失自 我，，"標(biāo)記可能會導(dǎo)致被NK細(xì)胞識別的機(jī)率增加，所述識別是通過與MHC I復(fù)合體相互作用而^:抑制，也可利用具有下調(diào)的HLA-2/HA表達(dá)的細(xì)胞 而被刺激18。即使使用全功能免疫系統(tǒng)，腫瘤也可能通過使用難以捉摸的 逃逸策略來逃避識別。盡管逃逸機(jī)制尚不清楚，但是實驗已經(jīng)描述了幾 種可使得肺瘤逃避免疫系統(tǒng)識別的機(jī)制。這些機(jī)制包括從HLA單倍型 (halotype)的缺失或突變至對干擾素的無應(yīng)答12。所以雖然MHC I類受體 的變化或缺失與多種肺瘤的發(fā)病有關(guān)，但是已經(jīng)證明了 MHC I類分子具 有抗癌作用。一個匪C I類分子的抗肺瘤發(fā)生作用的實例為對線粒體DNA完整性 的免疫監(jiān)視。在一項研究中，MHCI分子的一個作用是消滅具有線粒體突 變的細(xì)胞"。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞在線粒體DNA和線粒體復(fù)合體兩者中具有多個 突變7。根據(jù)這項數(shù)據(jù)，人們可能會假定具有相同組織學(xué)分類/分級的膠 質(zhì)瘤將會在其DM中具有類似的突變并且具有類似的異常表面蛋白，所 述表面蛋白與MHC I類分子和細(xì)胞膜兩者都有關(guān)。相反，完整的免疫系 統(tǒng)也可能會允許胂瘤的發(fā)生和發(fā)展。已經(jīng)證明了某些癌癥的發(fā)展與腫瘤特異性抗原的表達(dá)以及相關(guān)的免 疫應(yīng)答有關(guān)15。因此，僅通過自身的疫苗(self-vaccination)無法獲得有 效的腫瘤排斥和免疫力。盡管存在上述障礙，但是有越來越多的證據(jù)表 明免疫系統(tǒng)可以用于抵御癌癥。雖然失調(diào)的和正常功能的免疫系統(tǒng)二者 均會與癌癥的免疫排斥作斗爭，但已經(jīng)報道了對惡性肺瘤的自發(fā)排斥的 結(jié)果"'"。值得注意的是，還已經(jīng)證實了自身免疫性疾病可能會有助于使 患有惡性腫瘤的患者實現(xiàn)更好的預(yù)后6'19。在這些患者中，大多數(shù)鑒別出 的特異性IgG與人和微生物的肽共有相當(dāng)多的同源性"。由此產(chǎn)生了這樣 一種假說，即分子模擬物可能會觸發(fā)所觀察到的腫瘤自免疫。與之相關(guān) 的研究已經(jīng)證實在對四名患者進(jìn)行顱內(nèi)感染之后惡性腦腫瘤得到了長期 緩解4，并且利用微生物感染提高了癌癥患者的存活率2°'22。這產(chǎn)生了這 樣一個問題，即所述會誘發(fā)自身免疫的分子模擬物是否可用于治療腫瘤。 重要的是，已經(jīng)證明了人的蛋白和其他物種的蛋白之間存在明顯的同源 性。進(jìn)一步的實驗已經(jīng)證實內(nèi)皮細(xì)胞的異種抗原可以破壞對自身血管生 成內(nèi)皮細(xì)胞的免疫耐受2°。這表明通過與同源性外源抗原交叉反應(yīng)可以破 壞對腫瘤的自身耐受。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于下述認(rèn)識，即如果兩個或兩個以上雜合個體含有具有類 似或相同組織學(xué)分級的相同的癌癥/腫瘤，那么將一個(或多個)個體的腫 瘤/癌癥的組織/細(xì)胞移植到另 一個(或多個)個體體內(nèi)不但將會誘發(fā)對所 述移植的組織/癌癥的排斥反應(yīng)，而且將會提高免疫系統(tǒng)對某些肽的免疫 敏感性，所述的肽為該腫瘤/癌癥與其他具有類似肽的肺瘤之間所共有 的。因此，同種異體肺瘤可以用于接種免疫已經(jīng)存在的肺瘤，減小其大小或消除它并且建立持久的記憶。這種技術(shù)不但將會導(dǎo)致對原發(fā)性肺瘤 的最終排斥，而且將會產(chǎn)生持久的免疫記憶，防止該生物再次患有所述 腫瘤。根據(jù)本發(fā)明的第一方面， 一種用于治療或預(yù)防腫瘤的組合物，包括(i) 同種異體或異種的肺瘤細(xì)胞；和(ii) 一種可藥用的賦形劑。 所述同種異體或異種細(xì)胞可由一個或多個同種異體個體或同基因個體提供，并且以完整的細(xì)胞或溶胞產(chǎn)物形式存在。所述組合物還可以包 括同基因細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了同種異體或異種腫瘤細(xì)胞在制備用 于治療患者體內(nèi)腫瘤的藥劑中的用途。所述藥劑還可以包括同基因細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。所述同種異體或異種 腫瘤細(xì)胞可以是全細(xì)胞或溶胞產(chǎn)物。本發(fā)明不但可以治療腫瘤，而且具有使免疫系統(tǒng)能夠有效地耙向該 腫瘤的優(yōu)勢，避免了常規(guī)化學(xué)療法的遞送/靶向的相關(guān)問題。此外，化學(xué) 療法具有許多不合需要的副作用，包括脫發(fā)、惡心、腹瀉、貧血以及升 高的感染風(fēng)險，而使用本發(fā)明的療法可以避免這些副作用。


參照附圖來描述本發(fā)明，其中圖1為用Sprague Dawley大鼠進(jìn)行的實驗^:計示意圖。將大鼠分為 兩組。接受了同基因細(xì)胞系的大鼠(C6; SD-A)和接受了同種異體細(xì)胞系 的大鼠(9L; SD-B)。該研究的同基因分支(arm)分為兩組對照組(5只大 鼠；SD-Al)和治療組(4只大鼠；SD-A2)。第27天，將4只SD-Al大鼠處 死。此時，對其余的SD-A1大鼠(大鼠9)實施所述治療方案。所有最初注 射了 9L同種異體分支的SD大鼠(SD-B)均經(jīng)脅腹注射同基因C6細(xì)胞系 (100， 000個細(xì)胞)，十天后再快速注射500， 000個C6細(xì)胞。圖2為用Fisher 344進(jìn)行的實驗設(shè)計示意圖。將大鼠分為兩組。接 受了同基因9L細(xì)胞系的大鼠(Fisher A)和接受了同種異體C6細(xì)胞系的 大鼠(Fisher B)。將同基因組的大鼠(Fisher A)分為對照組(Fisher A-l) 和治療組(Fisher A-2)。用同基因RG2、 9L或僅用培養(yǎng)基攻擊Fisher A-l大鼠。用同種異體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞和細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、同基因細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和異種細(xì)胞或者單獨用異種細(xì)胞處理Fisher A-2大鼠。開始時給 Fisher B大鼠注射C6同種異體細(xì)胞。隨后用經(jīng)脅腹注射的同基因9L細(xì) 胞(IOO， OOO個細(xì)胞)對它們進(jìn)行攻擊，然后在IO天后再快速注射500， 000 個細(xì)胞。圖3為繪制了皮下植入同基因肺瘤(C6)的9只SD大鼠體內(nèi)腫瘤演化 /發(fā)展情況的圖表。如前所述將大鼠分為對照組或治療組。肺瘤發(fā)展情況 是通過測量腫瘤體積(mm"來加以確定的。大鼠l、 2、 3、 4在植入C6腫 瘤后未接受治療。大鼠5、 6、 7、 8接受了使用同種異體9L細(xì)胞和胞溶 產(chǎn)物以及同基因C6胞溶產(chǎn)物的治療。使大鼠9形成非常大的肺瘤后將其 轉(zhuǎn)移到同大鼠5-8 —樣的治療組中。圖4為繪制了皮下植入同基因腫瘤(9L)的Fisher344大鼠體內(nèi)腫瘤 演化/進(jìn)展情況的圖表。然后給對照大鼠(Fisher A-1)注射RG2細(xì)胞(大 鼠l)、同基因9L細(xì)胞(大鼠2)或僅注射培養(yǎng)基(大鼠3)。大鼠l的注射 細(xì)胞劑量加倍并且形成以特別大的肺瘤。治療的大鼠(Fisher A-2)是分 別用單獨的同種異體C6細(xì)胞(大鼠4)、同種異體C6細(xì)胞和溶胞產(chǎn)物(大 鼠5)、同基因9L溶胞產(chǎn)物和異種U87及LN229細(xì)胞(大鼠6)、單獨異種 U87和LN229細(xì)胞(大鼠7)來治療的。大鼠8是單獨用同基因9L細(xì)胞溶 胞產(chǎn)物來治療的。腫瘤發(fā)展情況是通過測量腫瘤體積(mm3)來加以確定的。圖5示出了取自A對照的和B治療的Fisher 344大鼠的腫瘤切片。 按照前人所述的方案將切片切成7 nm厚并且用抗CD4受體的抗體進(jìn)行染 色。箭頭指示了 CD4表面標(biāo)記染色陽性的細(xì)胞位置。對照(A)和治療(B) 樣品的放大倍數(shù)均為40X。圖6示出了取自A對照的和B治療的Fisher 344大鼠的肺瘤切片。 按照前人所述的方案將切片切成7 nm厚并且用抗CD8受體的抗體進(jìn)行染 色。箭頭指示了 CD8表面標(biāo)記染色陽性的細(xì)胞位置。對照(A)和治療(B) 樣品的放大倍數(shù)均為40X。圖7示出了取自A對照的和B治療的Fisher 344大鼠的胂瘤切片。 按照前人所述的方案將切片切成7 ja m厚并且用抗B淋巴細(xì)胞(CD20)受體 的抗體進(jìn)行染色。箭頭指示了 CD20表面標(biāo)記染色陽性的細(xì)胞位置(圖5b)。 對照(A)和治療(B)樣品的放大倍數(shù)均為40X。圖8示出了取自A對照的和B治療的Fisher 344大鼠的腫瘤切片。按照前人所述的方案將切片切成7 m m厚并且用抗巨噬細(xì)胞(CD68)受體的 抗體進(jìn)行染色。箭頭指示了 CD68表面標(biāo)記染色陽性的細(xì)胞位置。對照(A) 和治療(B)樣品的放大倍數(shù)均為40X。圖9示出了取自A對照的和B治療的Fisher 344大鼠的腫瘤切片。 按照前人所述的方案將切片切成7nm厚并且用抗樹突細(xì)胞標(biāo)記(DRC)受 體的抗體進(jìn)行染色。箭頭指示了 DRC表面標(biāo)記染色陽性的細(xì)胞位置。對 照(A)和治療(B)樣品的放大倍數(shù)均為40X。
具體實施方式
本發(fā)明利用同種異體或異種腫瘤細(xì)胞和同基因細(xì)胞來增加患者免疫 系統(tǒng)的敏感性以治療腫瘤。本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞疫苗與一些癌癥/腫瘤具有 類似的肽，所述癌癥/腫瘤和本發(fā)明疫苗的腫瘤具有相同組織學(xué)分級，但 具有不同的MHC分子。所述疫苗是使用整個同種異體或異種腫瘤細(xì)胞或 者同種異體或異種腫瘤細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物制備的。所述疫苗還可能會包括 一種或多種同基因細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述同種異體或異種細(xì)胞為與所要治療的患者的腫瘤細(xì)胞 具有相同(或相似)組織學(xué)分級的腫瘤細(xì)胞。因此，如果該患者腦惡性膠 質(zhì)瘤，則使用同種異體或異種的腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞來制備疫苗。按照這 種方式，細(xì)胞中所含的肽將是相似的并且會增加產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的 可能性。所述疫苗組合物通常將包括來自兩個或兩個以上雜合個體的同種異 體或異種細(xì)胞/溶胞產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述疫苗組合物是使用來自至少三個 雜合個體的同種異體或異種細(xì)胞/溶胞產(chǎn)物制備的。術(shù)語"同種異體的"是指細(xì)胞取自相同物種的不同個體。術(shù)語"異種的"是指源自或取自不同物種的生物。術(shù)語"同基因的"是指相同物種的遺傳上完全相同的成員。例如同 卵雙生子將具有同基因的細(xì)胞和組織。說明書中提到了具有"相同或相似組織學(xué)分級"的癌癥/腫瘤。技術(shù) 人員將會理解這是指相同類型的癌癥，并且所述癌癥將具有相同的分化 水平?？梢园凑誆lston-Ellis的方法來進(jìn)4亍分級(Simpson efa/， J. Clin. Oncol.， 2000; 18: 2059-2069)。術(shù)語"癌癥"和"腫瘤"可互換使用。本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括給予治療有效量的同種異體或 異種腫瘤細(xì)胞以及任選的可藥用賦形劑。所述藥物組合物可以是用于人或動物的人和獸用藥物，并且通常將 包括可藥用的賦形劑?？伤幱玫馁x形劑在藥物領(lǐng)域中是公知的，并且在例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit 1985)中有所描述?？梢圆鹏迵?jù)預(yù)計的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的 藥學(xué)實踐來選擇藥物賦形劑。所述藥物組合物可以包括——或額外包 括一一任何適合的粘合劑、潤滑劑、助懸劑、包衣衣料、增溶劑來作為 賦形劑。術(shù)語"賦形劑"包括稀釋劑和載體。所述藥物組合物中可以含有防腐劑、穩(wěn)定劑和染料。防腐劑的實例 包括苯曱酸鈉、山梨酸和對羥基苯曱酸的酯。還可以使用抗氧化劑和助 懸劑。根據(jù)不同的送遞系統(tǒng)可能會存在不同的組合物/制劑要求。 在適當(dāng)?shù)那闆r下，所述藥物組合物可以通過腸胃外注射(例如靜脈 內(nèi)、肌內(nèi)或皮下)來給藥。對于經(jīng)腸胃外給藥，最好使用無菌水溶液形式 的組合物，所述溶液可能會含有其他物質(zhì)(例如足夠的鹽或單糖)以使得 該溶液與血液等滲。疫苗可以用本發(fā)明的組合物來制備。疫苗的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，所述疫苗含有免疫原細(xì) 胞作為活性成分。通常，這類疫苗可以被制成可注射的液體溶液或懸液 形式；也可以制成適合于在注射前溶于或懸浮于液體中的固體形式。所 述制劑還可以是乳化的或是包封于脂質(zhì)體中的細(xì)胞。所述活性免疫原性 成分通常與可相容的藥用賦形劑混合。合適的賦形劑例如水、鹽水、 葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它們的組合。此外，如果需要的話，所述疫苗可含有最少量的助劑，例如增濕劑 或乳化劑、pH緩沖劑和/或可增強(qiáng)疫苗效力的佐劑?？赡軙行У淖魟┑?實例包括但不限于氫氧化鋁、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺 (thr-MDP)、 N-乙酰-nor-胞壁酰-L-內(nèi)氨酰-D-異谷酰胺(CGP 11637，稱 為nor-MDP)、 N-乙酰胞壁酰-L-內(nèi)氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(l-2，-而棕櫚酰-sn-甘油-3-羥磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A,稱為MTP-PE)和 RIBI，它含有溶于2。/。的鯊烯/Tween 80乳液的三種提取自細(xì)菌的組分單磷酸類脂A、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑和其他試劑的其他實例包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀 (alum)、硫酸鈹、二氧化硅、高嶺土、碳、油包水乳劑、水包油乳劑、 胞壁酰二肽、細(xì)菌內(nèi)毒素、月旨質(zhì)X、短小棒狀桿菌(6biy/7e6ac&W咖 (戶ro/ /oiz/6a"er/咖 Jc/ es)、 百曰咳桿菌 ("oi7/"e"a /7e"wM/》、多核糖核苷酸、海藻酸鈉、羊毛脂、溶血卵磷脂、維生素A、 皂苷、脂質(zhì)體、左旋咪唑、DEAB-葡聚糖、嵌段共聚物或其他合成的佐劑。 這類佐劑可購自各種來源，例如Merck佐劑65 (Merck and Company, Inc.， Rahway， N. J.)或弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)。通常，可使用例如Amphigen(水包油乳劑)、Alhydrogel (氫氧化鋁) 或Amphigen和Alhydrogel的混合物。僅批準(zhǔn)將氫氧化鋁用于人類。免疫原和佐劑的比例可以在一個較大的范圍內(nèi)變化，只要這兩者都 以有效量存在。例如，氫氧化鋁的量(按Ah03計算)為疫苗混合物的大約 0.5%。方便地，將所述疫苗配制成含有終濃度為0.2-200 mg/ml、優(yōu)選 5-50 mg/ml、最優(yōu)選15 mg/ml的免疫原。通常通過例如皮下注射或肌內(nèi)注射來經(jīng)腸胃外給予所述疫苗。 通常，醫(yī)師將會確定最適合于各個受試者的實際劑量，該劑量將隨 著具體患者的年齡、體重和反應(yīng)而變化。下述劑量為示例性的平均情況。 當(dāng)然會存在需要較高或較低劑量范圍的個別情況。每種組分的用量對于技術(shù)人員來說是顯而易見的。適合的用量如下a) 1 x 106(± 0. 5 x 106)個經(jīng)DNP修飾的同種異體腫瘤細(xì)胞，所述細(xì) 胞具有不同的MHC I。b) 2 x 106 ( ± 1 x 106)個經(jīng)DNP和i文射l務(wù)飾的異種胂瘤細(xì)胞。c) 2 x 106(±1 x 106)個自體(同基因)腫瘤細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。d) 1 x 106 (± 0. 5 x 106)個同種異體腫瘤細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。 下文將參照附圖對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一 步的描述。實施例本實驗中所用的細(xì)胞系為大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(9L、 C6、 RG2)和人膠質(zhì) 瘤細(xì)胞系(U87、 LN229)。所有細(xì)胞系均獲自美國典型組織保藏中心 (American Type Tissue Collection, ATTC)，并且在添加有10%熱滅活胎牛血清(FCS)、 5%的青霉素~^霉素以及Hepes緩沖液的達(dá)爾伯克氏改 良伊格爾氏培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM) (GIBCO， Grand Island, NY)中生長，培養(yǎng)設(shè)備為37X:、 5% 0)2氣氛的加濕培養(yǎng)箱。 誠溶^y^樹斧/備..將1. 0xl()5個細(xì)胞置于5 ml試管的培養(yǎng)基中并且以2. 5xl03 rpm 的速度離心5分鐘。棄去上清并且將150 n 1無菌過濾水加入到該試管 中。使所述細(xì)胞/水溶液充分混合并且轉(zhuǎn)移到1.0 ml離心管中，以1.0 x 104的速度離心10分鐘。保留上清并且將全部溶液用于細(xì)胞溶胞產(chǎn)物注 射。拔體^^6瘦邀織^夢；將取自Fisher 344大鼠的肺瘤樣品;^文入最適溫度4匕合物(Optimum Temperature Compound, 0TC)中冷凍并且在恒冷切片機(jī)上切成7 |im的切 片。將上述切片干燥、用丙酮固定并且用PBS充分沖洗1-2分鐘。使用 免疫血清進(jìn)行封閉，所述免疫血清獲自用于提取二抗的物種。再次充分 沖洗切片，然后用一抗進(jìn)行染色，所述一抗分別為抗CD-4、 CD-57的一抗 (Nora Castro Lab Ltd., Burlingame， CA)，抗CD8、樹突網(wǎng)狀細(xì)胞(DRC) 的一抗(Dako Corporation, Carpenteria， CA),抗CD-20、 CD-68的一 抗(Ventana， Tucson, AZ)。再次沖洗切片并且加入生物素化的二抗。再 次對它們進(jìn)行漂洗并且將其放入含有1份3%過氧化氫和9份1°/。疊氮化納 的PBS溶液中。然后漂洗切片并且加入ABC,持續(xù)30-40分鐘。用PBS對 其進(jìn)行沖洗、使用二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽進(jìn)行顯影并且對其進(jìn)行負(fù)染。 利用光顯微術(shù)拍攝所有切片的照片。 長絲所有腫瘤都是通過目檢和觸診發(fā)現(xiàn)的。 一旦發(fā)現(xiàn)，則通過用電動剃 刀刮毛來進(jìn)一步暴露肺瘤附近的區(qū)域。在進(jìn)行注射的時候，使用游標(biāo)卡 尺測量腫瘤大小(以毫米為單位)。從顱/尾方向(長度)、上/下方向(高度) 和內(nèi)/外方向(寬度)進(jìn)行測量。按長度x寬度x高度x 0. 5來計算腫瘤體 積。所有動物方案均得到了南加利福尼亞大學(xué)實驗動物管理與使用委員 會(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)的批準(zhǔn)。 所有大鼠均在無病原體環(huán)境中飼養(yǎng)。為進(jìn)行該實驗，我們使用了 SpragueDawley和Fisher 344大鼠。所有大鼠均為雄性且年齡在4-6周之間。大 鼠獲自Harlan (Indianapolis, Indiana)。在皮下腫瘤模型中，收集C6 和9L,僅使用匿EM將它們從組織培養(yǎng)瓶中清洗出來。然后準(zhǔn)備裝有150 H 1含有100, 000-150， 000個細(xì)胞的懸液的注射器。將Sprague Dawley (SD)大鼠分為兩組(圖1)。給SD-A(9只大鼠)植 入C6膠質(zhì)瘤， 一種用于SD大鼠的同基因樣膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。給SD-B(3只 大鼠)注射9L同種異體細(xì)胞系。 一旦在A組大鼠體內(nèi)發(fā)展出可觸知的脅 腹腫瘤，則將它們再分為兩組。SD-Al(對照組-5只大鼠)未進(jìn)行注射。給 SD-A2 (治療組-4只大鼠)注射同種異體9L細(xì)胞、同種異體9L溶胞產(chǎn)物和 同基因C6溶胞產(chǎn)物。第27天，將5只SD-A1大鼠中的4只處死。此時 一只對照大鼠(大鼠9)開始接受與SD-A2大鼠相同的治療方案。使用同種 異體細(xì)胞、同基因和同種異體溶胞產(chǎn)物來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。利用下述方法 測試從未形成過腫瘤的SD-B大鼠的免疫記憶用同基因C6細(xì)胞(100， 000 個細(xì)胞)攻擊所述SD-B大鼠，10天后再追加500， 000個C6細(xì)胞，并且檢 查脅腹腫瘤的形成情況。將Fisher大鼠分為兩組(圖2)。給Fisher-A(8只大鼠)植入同基因 9L細(xì)胞系。給Fisher-B(3只大鼠)注射同種異體C6細(xì)胞系。 一旦在 Fisher-A大鼠體內(nèi)發(fā)展出可觸知的脅腹腫瘤，則將它們再細(xì)分為兩組。 給Fisher A-l (對照組-3只大鼠)注射同基因9L細(xì)胞、同基因RG2細(xì)胞 或僅注射培養(yǎng)基。給Fisher A-2(治療組-5只大鼠)注射同種異體C6細(xì) 胞、同種異體C6細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或異種U87和LN229細(xì)胞的組合(參見圖 2)。通過用同基因9L細(xì)胞和溶胞產(chǎn)物的組合混合物攻擊最初形成隨后會 遭到排斥的腫瘤的Fisher B大鼠來測試其免疫記憶，并且檢查肺瘤生長 情況。炎桌發(fā)7"逸織.'所有實驗動物均用過量的戊巴比妥處死。移出所有的腫瘤并且在無 菌條件下解剖，切成4片并且在-80。C下貯藏。將所有的肺瘤切片均切成 7 jim并且利用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染色。結(jié)果大多數(shù)膠質(zhì)瘤研究均采用小型實驗動物模型。最常用的具有免疫能 力的宿主模型包括兩個不同種系的大鼠，Sprague Dawley大鼠和Fisher344大鼠1。 C6為一種用于SD大鼠的同基因樣細(xì)胞系，而9L和RG2細(xì)胞 系與Fisher 344大鼠同基因"11。給三只Fisher大鼠注射C6細(xì)胞系(Fisher B)。當(dāng)確實形成了界限 清楚的腫瘤時，則這些腫瘤隨后會在40天內(nèi)遭到排斥。使用類似的方法 來用9L細(xì)胞系處理三只SD大鼠(SD-B)。每只SD大鼠均會排斥9L腫瘤， 從而沒有可見或可觸知的腫瘤生長。給每只SD-A大鼠注射C6細(xì)胞系。 所有的上述大鼠均會在IO天內(nèi)發(fā)展出明顯的腫瘤。此時，保留5只大鼠 作為對照組(SD-A1)同時將余下4只大鼠放入治療組中(SD-A2)。第27天 時處死大鼠l-4并且努力"拯救"大鼠9。此時，將大鼠9放入治療組并 且開始接受同SD-A2組一樣的注射。我們分析9只SD-A大鼠體內(nèi)的肺瘤生長和治療應(yīng)答情況(圖3)。在 接受治療的SD-A2大鼠中(大鼠5-8)，每只大鼠均被給予了同種異體和同 基因溶胞產(chǎn)物以及細(xì)胞的不同組合。例如，5天后，5號大鼠具有可觸知 的脅腹腫瘤并且在其肺瘤對側(cè)接受了一次注射，所述注射含有同種異體 9L溶胞產(chǎn)物(50， 000)、同基因C6溶胞產(chǎn)物(50， 000)和9L同種異體細(xì)胞 (50, 000)。注射5天后，腫瘤分解。注射18天后，大鼠6、 7、 8 (SD-A2 大鼠)均具有明顯的腫瘤。此時，它們均被注射了 50， 000個同種異體9L 溶胞產(chǎn)物細(xì)胞、50， 000個同基因C6溶胞產(chǎn)物細(xì)胞和50, 000個9L同種異 體細(xì)胞。在第23天和28天時重復(fù)上述注射。第33天、治療開始后第15 天，大鼠6還接受了額外的治療。為測量腫瘤大小，在注射后的第27天 處死未治療的大鼠(SD-A1，大鼠1-4)。與未治療的大鼠(大鼠l-4)體內(nèi) 的腫瘤發(fā)展情況相比，大鼠5、 6、 7、 8(SD-A2)完全分解了它們的腫瘤。 9號大鼠在實驗開始時屬于未治療組，然后在大鼠1-4被處死之后獲得拯 救。每四天給大鼠9注射同種異體9L溶胞產(chǎn)物(50, 000) 、 C6同基因溶胞 產(chǎn)物(50， 000)和9L同種異體細(xì)胞(50， OOO)并且在第55天時將其處死以 進(jìn)行組織學(xué)分析，此時肺瘤大小為開始拯救時的11%。20天后，在"經(jīng)治療"的無明顯肺瘤的SD大鼠的對側(cè)后脅腹再次注 射會導(dǎo)致所述初始腫瘤的同一種同基因C6腫瘤細(xì)胞系(使用100, 000個 細(xì)胞)，并且在10天后注射5倍劑量的細(xì)胞(500， 000個細(xì)胞)。每三天監(jiān) 測大鼠是否出現(xiàn)任何可視或可觸知的腫瘤生長跡象。第160天時，所述 SD大鼠仍然沒有腫瘤。圖4示出了植入9L細(xì)胞的8只Fisher大鼠(Fisher-A)的肺瘤生長以及對治療的反應(yīng)。在第20天時，在大鼠l、 2和3(Fisher A-l)的對側(cè) 脅腹注射同基因RG2(100， 000個細(xì)胞；大鼠1)和9L(100， 000個細(xì)胞；大 鼠2)或者僅注射培養(yǎng)基(大鼠3)。腫瘤大小沒有下降，而且RG2甚至似 乎在大鼠l體內(nèi)產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)。大鼠4-8 (Fisher A-2)注射了C6同種 異體細(xì)胞/C6同種異體溶胞產(chǎn)物、9L同基因溶胞產(chǎn)物或U87和LN229異 種細(xì)胞，所有大鼠的肺瘤大小似乎均有所減小。在第40天時將所有的Fisher 344大鼠處死，此時它們都出現(xiàn)了足 下垂并且無法移動。移出上述每只大鼠的腫瘤并且進(jìn)行切片以便染色。 我們發(fā)現(xiàn)我們治療的腫瘤的CD4 、 CD8 、 B淋巴細(xì)胞(CD2 0)、巨噬細(xì)胞(CD6 8) 和樹突細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對照腫瘤(圖3-7)。為確定免疫記憶的作用，我們檢查了開始時注射了同種異體細(xì)胞系 的SD和Fisher 344大鼠是否能夠接受同基因細(xì)胞系。給40天后排斥C6 的Fisher 344大鼠(Fisher B)再次注射同基因9L細(xì)胞；給開始時即排 斥9L細(xì)胞系的SD大鼠(SD-B)注射C6細(xì)胞。所有的注射均是在原始注射 的對側(cè)脅腹進(jìn)行的并且使用了 500， 000個細(xì)胞。在所述SD大鼠體內(nèi)，未 發(fā)展出可視或可觸知的腫瘤。在Fisher大鼠體內(nèi)，在注射的位置產(chǎn)生了 很小的生長(<1 cmx<l cmxl cm)。該生長僅能通過觸診感知并且逐漸 變小，到第IO天時完全無法檢測到。第150天時，兩個種系的大鼠仍然 沒有腫瘤。上述結(jié)果表明反復(fù)經(jīng)皮下注射同種異體(或異種)細(xì)胞、同種異體細(xì) 胞溶胞產(chǎn)物和同基因細(xì)胞溶胞產(chǎn)物會通過增強(qiáng)免疫敏感性而導(dǎo)致腫瘤大 小減小。本說明書中所引用的所有出版物均通過引用的方式納入本文。1. 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1.一種用于治療或預(yù)防腫瘤的組合物，包括(i)同種異體或異種的腫瘤細(xì)胞；和(ii)一種可藥用的賦形劑。
2. 權(quán)利要求l的組合物，還包括一種同基因細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中(i)為一種溶胞產(chǎn)物。
4. 權(quán)利要求1-3任一項的組合物，還包括一種同種異體細(xì)胞或異種細(xì) 胞的溶胞產(chǎn)物。
5. 前述權(quán)利要求任一項的組合物，其中所述(i)的細(xì)胞為腦源性細(xì)胞。
6. 當(dāng)權(quán)利要求5從屬于權(quán)利要求2時權(quán)利要求5的組合物，其中所述 同基因細(xì)胞為腦源性細(xì)胞。
7. 前述權(quán)利要求任一項的組合物，其中所述同種異體或異種細(xì)胞來源 于兩個或兩個以上雜合個體的腫瘤。
8. 同種異體或異種腫瘤細(xì)胞在制備用于治療患者體內(nèi)腫瘤的藥劑中 的用途。
9. 權(quán)利要求8的用途，其中所述患者的肺瘤與所述同種異體或異種細(xì) 胞的胂瘤具有相同的組織學(xué)分級。
10. 權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的用途，其中所述藥劑還包括同基因細(xì)胞或同基因細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。
11. 權(quán)利要求5-7任一項的用途，其中所述同種異體肺瘤細(xì)胞是以溶胞產(chǎn)物的形式提供的。
12. 權(quán)利要求8-11任一項的用途，其中所述同種異體或異種腫瘤細(xì)胞 來源于兩個或兩個以上雜合個體的腫瘤。
13. —種用于治療或預(yù)防腫瘤的方法，包括給予患者權(quán)利要求l-7任一項中所限定的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于腫瘤治療的組合物，包括(i)同種異體或異種腫瘤細(xì)胞；和(ii)一種可藥用的賦形劑。如果兩個或兩個以上雜合個體含有具有相同或類似組織學(xué)分級的相同的癌癥/腫瘤，那么將一個個體的腫瘤/癌癥的組織/細(xì)胞移植到另一個個體體內(nèi)不但將會誘發(fā)對所述移植的組織/癌癥的排斥反應(yīng)，而且將會增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對某些肽的免疫敏感性，所述的肽為該腫瘤/癌癥與其他具有類似肽的腫瘤之間所共有的。
文檔編號A61P35/00GK101405025SQ200780009893
公開日2009年4月8日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日
發(fā)明者阿波斯特洛斯·斯塔索普洛斯 申請人:阿波斯特洛斯·斯塔索普洛斯