專利名稱：：Nogo受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及-申經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)。本發(fā)明更具體涉及免疫原性Nogo受體-l(NgRl)多肽，Nogo受體-l抗體，其抗原結(jié)合片革殳，可溶性Nogo受體及其融合蛋白以及編碼它們的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及Nogo受體-1拮抗劑多聚核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含該種Nogo受體4元體，其4元原結(jié)合片,更，免疫原性Nogo受體-l多肽，可溶性Nogo受體及其融合蛋白，編碼它們的核酸以及拮抗劑多聚核苷酸的組合物，以及這些成分的制備和使用方法。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)元的軸突和樹突是由神經(jīng)元向外延伸的長細(xì)胞突起。伸展的軸突或神經(jīng)突的尖端包含了一個?；膮^(qū)域，該區(qū)域被稱作生長錐。生長錐感受局部環(huán)境并引導(dǎo)軸突向神經(jīng)元耙細(xì)胞生長。生長錐可響應(yīng)表面粘性，生長因子，神經(jīng)傳遞素和電場等多個環(huán)境線索。錐的生長引導(dǎo)涉及多類吸附分子，胞間信號以及刺激和抑制生長錐的因素。生長神經(jīng)突的生長錐可以不同的速率生長，但其速度通常為每天一至兩毫米。生長4偉呈手形，具有可差異^J付至胚胎表面的扁平突起U鼓端絲或絲狀偽足)。絲狀偽足具有持續(xù)的活性，部分絲狀偽足可縮回生長錐，而其它的絲狀偽足可持續(xù)延長透過基質(zhì)。不同絲狀偽足之間的延長形成了片狀偽足。生長4,通過片狀偽足和絲狀偽足#笨索其前方和兩側(cè)的區(qū)域。當(dāng)延長物4妻觸到不適宜的表面時，它將縮回當(dāng)延長物4妄觸到適宜的生長表面時，它將繼續(xù)延伸并將生長《,導(dǎo)向該方向。生長錐可受到基質(zhì)表面屬性的細(xì)微變化所引導(dǎo)。生長錐到達(dá)合適的靶細(xì)胞后將建立突觸耳關(guān)系。神經(jīng)細(xì)胞的功能受神經(jīng)元與其直接環(huán)境中的其它細(xì)胞的"t妄觸所影響(U.Rutishauser,T.M.Jessell，P一o/.68:819(1988))。這些細(xì)胞包4舌中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的特殊神經(jīng)月交質(zhì)細(xì)月包，少突細(xì)胞以及以髓磷脂(多層膜的隔離結(jié)構(gòu))包覆神經(jīng)元軸突的周圍一申纟至系纟克(PNS)的施萬纟田月包(G.Lemke，in/Wradw"/o"toMo/ecw/ar臉MraZ/o/ogy,Z.Hall,Ed.(Sinauer,Sunderland,Mass.),p.281(1992》。盡管CNS神經(jīng)元具有在損傷后再生的能力，該種能力可由于髓磷脂中抑制蛋白的存在，或者也可能由于在其局部環(huán)境中常發(fā)現(xiàn)的其它類型的分子的存在而受到抑制(Brittis和Flanagan,Neuron50:11-14(2001);Jones等人，iVew簡c.22:2792-2803(2002);Grimpe等人，臉訓(xùn)sc/.22:3144-3160(2002))。在少突細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的多種髓磷脂抑制蛋白已得到鑒定，例如，NogoA(Chen等人，胸匿403:434-439(2000);Grandpre等人，淑廚403:439-444(2000)),髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG，McKerracher等人，A^/ra"13:805-811(1994);Mukhopadhyay等人，TVeMraw13:151-161(1994))以及少突細(xì)月包4唐蛋白(OM-gp,Mikol和Stefansson,Ce〃.106:1213-1219(1988))。這些蛋白各自顯示為對申經(jīng)元Nogo受體-1的配體(Wang等人，iV"/1""417:941-944(2002);Liu等人，297:1190-93(2002);Grandpre等人，胸,403:439-444(2000);Chen等人，淑,403:434-439(2000);Domeni函i等人，臉w謂35:283-90(2002》。Nogo受體-1是一種包含了含8個富亮氨酸重復(fù)序列的GPI錨定的膜蛋白(Foumier等人，TVa^re409:341-346(2001))。在與抑制蛋白(例如，NogoA,MAG和OM-gp)相互作用后，該Nogo受體-1復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)了可導(dǎo)致生長錐萎縮和神經(jīng)突生長抑制的信號。對抑制Nogo受體-1與其配體結(jié)合以及減少髓石粦月旨-介導(dǎo)的生長錐萎縮和神經(jīng)突生長抑制的分子存在著迫切的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及Nogo受體-1拮抗劑在促進(jìn)神經(jīng)突生長，神經(jīng)元存活，以及CNS神經(jīng)元中軸突再生中的應(yīng)用。本發(fā)明的特4正在于可用于抑制神經(jīng)突生長抑制，促進(jìn)神經(jīng)元存活，和/或促進(jìn)CNS一申經(jīng)元中軸突再生的分子和方法。本發(fā)明還涉及可溶性Nogo受體-1多肽及包含其的融合蛋白，以及針對Nogo受體-1特異性免疫原區(qū)的抗體及其抗原片段。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的抗體結(jié)合的免疫原性Nogo受體-1多肽。本發(fā)明還涉及可與Nogo受體-1結(jié)合的單克隆抗體結(jié)合的Nogo本發(fā)明的抗體具有類似特異性的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明多肽的核酸，包含該種核酸的載體和宿主細(xì)胞以及制備該種肽的方法。本發(fā)明的抗體，可溶性受體和受體融合蛋白對抗或阻斷Nogo受體-1并可用于抑制Nogo受體-1與其配體的結(jié)合，抑制神經(jīng)元內(nèi)生長4偉萎縮并減少^申經(jīng)元內(nèi)^申經(jīng)突生長或4由芽。在部分實施方式中，本發(fā)明4是供了選自如下組合的多肽AAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQIDNO:26);LDLSDNAQLR(SEQIDNO:27);LDLSDDAELR(SEQIDNO:29);LDLASDNAQLR(SEQIDNO:30);LDLASDDAELR(SEQIDNO:31);LDALSDNAQLR(SEQIDNO:32);LDALSDDAELR(SEQIDNO:33);LDLSSDNAQLR(SEQIDNO:34);LDLSSDEAELR(SEQIDNO:35);DNAQLRWDPTT(SEQIDNO:36);DNAQLR(SEQIDNO:37);ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQIDNO:41);ALSDNAQLRWDPTT(SEQIDNO:42);LDLSDNAALRVVDPTT(SEQIDNO:43);LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQIDNO:44);以及LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQIDNO:45)。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的核酸。在部分實施方式中，該核酸可才喿作地連接至表達(dá)控制序列。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸的載體。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。在部分實施方式中，本發(fā)明才是供了生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括培養(yǎng)包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞，然后從該宿主細(xì)月包或培養(yǎng)基回收該多肽。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)抗體的方法，其包括以本發(fā)明的多肽或包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細(xì)胞對宿主免疫4妄種，然后回收4元體。本發(fā)明還4是供了由該方法生產(chǎn)的4元體及其抗原結(jié)合片段。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或其抗原結(jié)合片,史，其中該抗體不是由雜交瘤細(xì)胞系HB7E11(ATCC⑧編號PTA-4587)生產(chǎn)的單克隆抗體。在本發(fā)明的部分實施方式中，該抗體或其抗原結(jié)合片段(a)抑制神經(jīng)元的生長錐萎縮；(b)減少對神經(jīng)元神經(jīng)突生長和抽芽的抑制；以及(c)抑制Nogo受體-1與配體的結(jié)合。在部分實施方式中，該神經(jīng)突生長和抽芽為軸突生長。在部分實施方式中，該神經(jīng)元為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在部分實施方式中，本發(fā)明的抗體為單克隆抗體。在部分實施方式中，本發(fā)明的抗體為鼠抗體。在部分實施方式中，本發(fā)明的抗體選自由人源化抗體，嵌合抗體以及單《連抗體構(gòu)成的組合。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了抑制Nogo受體-1與配體結(jié)合的方法，其包括將Nogo受體-l與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片革殳相4妄觸。在部分實施方式中該配體選自由NogoA,NogoB,NogoC，MAG和OM-gp構(gòu)成的組合。在部分實施方式中，本發(fā)明4是供了抑制神經(jīng)元中生長相接觸。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了減少神經(jīng)元中神經(jīng)突生長或抽芽抑制的方法，其包括將神經(jīng)元與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片革殳相4妄觸。在部分實施方式中，該神經(jīng)突生長或抽芽為軸突生長。在部分實施方式中，該神經(jīng)元為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含藥學(xué)可接受載中，該組合物進(jìn)一步包括一種或多種附加治療劑。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了促進(jìn)具有死亡風(fēng)險的神經(jīng)元存活的方法，其包括將該神經(jīng)元與有效量的本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段相接觸。在部分實施方式中，該神經(jīng)元處于體夕卜。在部分實施方式中，該—中經(jīng)元在哺乳動物體內(nèi)。在部分實施方式中，該哺乳動物顯示了多發(fā)性石更化癥，ALS，亨廷頓病，阿爾茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神經(jīng)病變，中風(fēng)，外傷性腦損傷或脊髓損傷的信號或癥狀。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中促進(jìn)具有死亡風(fēng)險的神經(jīng)元存活的方法，其包括(a)l是供表達(dá)本發(fā)明抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的培養(yǎng)后的宿主細(xì)胞；以及(b)在該神經(jīng)元的4立點或附近將該宿主細(xì)力包導(dǎo)入該哺乳動物。在部分實施方式中，本發(fā)明4是供了促進(jìn)具有死亡風(fēng)險的對申經(jīng)元存活的基因治療方法，其中該3申經(jīng)元處于哺乳動物體內(nèi)，其包括在該神經(jīng)元位點或附近施用包含了編碼本發(fā)明抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片,殳的核苷酸序列的病毒載體，其中該抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片,殳的表達(dá)量足以促進(jìn)該神經(jīng)元的存活。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含除了最多三個氨基酸替換外選自如下組合的氨基酸序列的具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽SEQIDNO:49的氨基酉交309-335;SEQIDNO:49的氨基酸309-336;SEQIDNO:49的氨基酸309-337;SEQIDNO:49的氨基酸309-338;SEQIDNO:49的氨基酸309-339;SEQIDNO:49的氨基酸309-340;SEQIDNO:49的氨基酸309-341;SEQIDNO:49的氨基酸309-342;SEQIDNO:49的氨基酸309-343;SEQIDNO:49的氨基酸309-344;SEQIDNO:49的氨基酸309-345;SEQIDNO:49的氨基酸309-346;SEQIDNO:49的氨基酸309-347;SEQIDNO:49的氨基酸309-348NO:49的氨基酸309-350NO:49的氨基酸301-344NO:49的氨基酸303-344NO:49的氨基酸305-344NO:49的氨基酸307-344NO:49的氨基酸336-344NO:49的氨基酸334-344NO:49的氨基酸332-344NO:49的氨基酸330-344NO:49的氨基酸328-344NO:49的氨基酸326-344NO:49的氨基酸324-344NO:49的氨基酸322-344NO:49的氨基酸320-344NO:49的氨基酸318-344NO:49的氨基酸316-344NO:49的氨基酸314-344NO:49的氨基酸312-344NO:49的氨基酸310-344NO:49的氨基酸336-345NO:49的氨基酸336-347NO:49的氨基酸336-349SEQIDNO:49的氨基酸309-349;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸300-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸302-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸304-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸306-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸308-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸335-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸333-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸331-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸329-344;SEQEOSEQIDNO:49的氨基酸327-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸325-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸323-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸321-344;SEQIDSEQIDNO:49的氛基酉臾319-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸317-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酉臾315-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸313-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸311-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸336-344;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸336-346;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸336-348;SEQIDSEQIDNO:49的氨基酸336-350;4壬意所述多肽片段的變體或衍生物，以及至少兩個任意所述多肽片段的組合。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含選自如下組合的氨基酸序列的具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽SEQIDNO:49的氨基酸311-344;SEQIDNO:49的氨基酸310-348;SEQIDNO:49的氨基酸323-328;SEQIDNO:49的氨基酸339-348;SEQIDNO:49的氨基酸378-414;SEQIDNO:49的氨基酸27-38;SEQIDNO:49的氨基酸39-61;SEQIDNO:49的氨i酸257-267;SEQIDNO:49的氨基酸280畫292;SEQIDNO:49的氨基酸301-323;SEQIDNO:49的氨基酸335-343;SEQIDNO:49的氨基酸310-335;SEQIDNO:49的氨基酸326-328;任意所述多肽片段的變體或衍生物，以及至少兩個任意所述多肽片革殳的組合。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包含除了最多三個單獨氨基酸替換外與參考氛基酸序列一致的氛基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸x-344，(b)SEQIDNO:49的氨基酸309-y,以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸x-y，其中x為由305至326的4壬意整^t,而y是由328至350的4壬意整凄丈；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包含除了最多三個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸x'畫344,(b)SEQIDNO:49的氨基酸309-y'，以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸x'-y',其中x'為由300至326的任意整數(shù)，而y'是由328至360的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，本發(fā)明4是供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片-度，其包含除了最多三個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合SEQIDNO:49的氨基酸309-335;SEQIDNO:49的氨基酸309-344;SEQIDNO:49的氨基酸310-335;SEQIDNO:49的氨基酸310-344;SEQIDNO:49的氛基酉臾309-350;SEQIDNO:49的氛基酉菱300—344;以及SEQIDNO:49的氨基酸315-344。在部分實施方式中，本發(fā)明才是供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片,殳，其包含除了最多三個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基酸309-335。在部分實施方式中，本發(fā)明所4是供的多肽為環(huán)^l大。在部分實施方式中，該環(huán)狀多肽進(jìn)一步包含連接在N-末端的第一分子和連接在C-末端的第二分子；其中所述的第一分子和所述的第二分子4皮此連4妻形成所述的環(huán)狀分子。在部分實施方式中，該第一和第二分子選自如下組合生物素分子，半胱氨S吏殘基，以及乙?；腚装彼釟埢Ｔ诓糠謱嵤┓绞街?，該第一分子為連接至本發(fā)明多肽N-末端的生物素分子而該第二分子為連接至本發(fā)明多肽C-末端的半胱氨酸殘基。在部分實施方式中，該第一分子為連4妻至本發(fā)明多肽N-末端的乙?；腚装彼釟埢摰诙肿訛檫B4妄至本發(fā)明多肽C-末端的半胱氨酸殘基。在部分實施方式中，該第一分子為連接至本發(fā)明多肽N-末端的乙?；腚装彼釟埢摰诙肿訛檫B接至本發(fā)明多肽C-末端的半胱氨酸殘基。在部分實施方式中，該C-末端半胱氨酸連接了NH2部分。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多二十個單獨氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸a-445,(b)SEQIDNO:49的氨基酸27-b,以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸a-b,其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；其中所述的第二多肽片段包含了除了最多二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基S吏序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸c-445，(b)SEQIDNO:49的氨基酸27-d，以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸c-d,其中c為由25至35的任意整數(shù)，而d是由300至450的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中該第一多肽片段包含了除了最多二十個單獨氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中該第一參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸27-310,以及(b)SEQIDNO:49的氨基酸27-344。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步才是供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中該第二多肽片段包含了除了最多二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中該第二參考氨基S臾序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸27-310，以及(b)SEQIDNO:49的氨基酸27-344。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中該第二多肽片段包含了除了最多二十個單獨氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中該第一參考氨基酸序列包含SEQIDNO:49的氨基酸27-310而該第二參考氨基酸序列包含SEQIDNO:49的氨基酸27-310，或其中其中該第一參考氨基酸序列包含SEQIDNO:49的氨基酸27-344而該第二參考氨基酸序列包含SEQIDNO:49的氨基酸27-310,或其中該第一參考氨基酸序列包含SEQIDNO:49的氨基酸27-344而該第二參考氨基酸序列包含SEQIDNO:49的氨基酸27-344。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該第一多肽片段位于該第二多肽片段的上游。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了在第一多肽片段和第二多肽片^:之間的肽-接頭。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步^是供了該肽-接頭包含SEQIDNO:65(G4S)3。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步4是供了該肽接頭包含SEQIDNO:66(G4S)2。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多肽，其中至少一個半月光氛酸殘基一皮外源氛基酸一^換。在部分實施方式中，該至少一個半月光氨酸殘基為C266。在部分實施方式中，該至少一個半月光氨S臾殘基為C309。在部分實施方式中，該至少一個半月光氨酸殘基為C335。在部分實施方式中，該至少一個半月光氨酸殘基4立于C336。在部分實施方式中，該至少一個半胱氨S臾殘基^皮選自丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的氨基酸替換。在部分實施方式中，該替換氨基酸為丙氨酸。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了分離多肽，其包含(a)除了參考氨基酸序列中至少一個半胱氨酸殘基一皮不同氨基酸替換外，與所述參考序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合(i)SEQIDNO:49的氨基酸a-445，(ii)SEQIDNO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQIDNO:49的氨基酸a-b，其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C266被不同氨基酸替換。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C309被不同氨基酸替換。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C335,皮不同氨基酸替換。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步才是供了所述的參考氨基酸序列的C266和C309被不同氨基酸替換。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C309和C335被不同氨基酸替換。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該不同的氨基酸為丙氨酸。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了分離多肽，其包含(a)除了最多二十個單獨氨基酸替換外與參考序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合(i)SEQIDNO:49的氨基酸a-445,(ii)SEQIDNO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQIDNO:49的氨基酸a-b，其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含除了最多二十個單獨氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:60的氨基酸a-305,(b)SEQIDNO:60的氨基酸l-b，以及(c)SEQIDNO:60的氨基酸a-b，其中a為由1至27的4壬意整凌t,而b是由264至309的任意整數(shù)；并且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸c-332,(b)SEQIDNO:49的氨基酸275-d，以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸c-d,其中c為由265至306的任意整數(shù)，而d是由308至340的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在特定的實施方式中，該第一參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸1-274;以及(b)SEQIDNO:49的氨基酸1-305。在特定的實施方式中，該第二參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:60的氨基酸275-311;(b)SEQIDNO:60的氨基酸275-332;(c)SEQIDNO:60的氨基酸306-311;(d)SEQIDNO:60的氨基臥復(fù)306-308;以及(e)SEQIDNO:60的氨基酸306-309。在一種實施方式中，該第一多肽片段序列包含SEQIDNO:49的氨基酸1-274而該第二多肽片4爻包含SEQIDNO:60的氨基酸275-311。在部分實施方式中，該第一多肽片,殳序列包含SEQIDNO:49的氨基酸1-274而該第二多肽片,爻包含SEQIDNO:60的氨基酸275-332。在部分實施方式中，該第一多肽片,殳序列包含SEQIDNO:49的氨基酸1-305而該第二多肽片l殳包含SEQIDNO:60的氨基酸306-308。在部分實施方式中，該第一多肽片段序列包含SEQIDNO:49的氨基酸1-305而該第二多肽片l殳包含SEQIDNO:60的氨基酸306-309。在部分實施方式中，至少一個附加氨基酸被添加至第二多肽片段的C-末端。在一種實施方式中，該至少一個附加氨基酸為色氨酸。在部分實施方式中，該第一多肽片段的A269被不同的氨基酸替換。在一種實施方式中，該不同的氨基酸為色氨酸。在部分實施方式中本發(fā)明才是供了包含第一多肽片l史和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段除了不超過二十個單獨氨基酸替換外由SEQIDNO:49的氨基酸1-310組成；且其中所述的第二多肽片,殳除了不超過五個單獨氨基酸^辦」換外由SEQIDNO:60的氨基酸311-318組成；并且其中所述的多肽抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中本發(fā)明進(jìn)一步4是供了該外源多肽選自以下組合(a)血清白蛋白，(b)Fc區(qū)，(c)信號肽，(d)多肽標(biāo)記，以及(e)兩種或多種所述外源多肽的組合。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該Fc區(qū)選自如下組合IgAFc區(qū)；IgDFc區(qū)；IgGFc區(qū)；IgEFc區(qū)以及IgMFc區(qū)。在一種實施方式中，該Fc區(qū)為IgGFc區(qū)。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了介于該氨基酸序列和IgGFc區(qū)之間的肽接頭。在部分實施方式中，該肽接頭包含了SEQIDNO:66(G4S)2。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步4是供了該多肽標(biāo)記選自如下組合FLAG標(biāo)記；Strep標(biāo)i己；聚組氨酸標(biāo)i己；VSV-G才示i己；流感病毒血達(dá)是素(HA)才示i己；以及c-Myc才示i己。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了與一種或多種聚烷撐二醇部分連^妻的本發(fā)明多肽。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該一種或多種聚烷撐二醇部分為聚乙二醇(PEG)部分。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了與l-5PEG部分連接的本發(fā)明多肽。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的分離多聚核苷酸。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該核苷酸序列被可操作地連接至表達(dá)控制元件(例如，可誘導(dǎo)啟動子，組成型啟動子，或分泌信號)。附加的實施方式包括包含本發(fā)明分離多聚核苷酸的載體以及包含所述載體的宿主細(xì)胞。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了選自如下組合的分離多聚核苷酸(i)反義多聚核苷酸；(ii)核酶；(iii)小干護(hù)0RNA(siRNA);以及(iv)小發(fā)夾RNA(shRNA)。在部分實施方式中，多聚核苦酸為包含了與NgRlmRNA編碼部分互補的至少10個石咸基的反義多聚核苷酸。在部分實施方式中，該多聚核苷酸為核酶。在更進(jìn)一步的實施方式中，該多聚核苷酸為siRNA或shRNA。在部分實施方式中，本發(fā)明沖是供了該siRNA或shRNA抑制NgRl表達(dá)。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該siRNA或sh認(rèn)A與包含了CUACUUCUCCCGCAGGCG或CCCGGACCGACGUCUUCAA或CUGACCACUGAGUCUUCCG的核苷酸序列至少有90%的一致性。在另一實施方式中，該siRNA或shRNA核苦酸序歹'J為CUACUUCUCCCGCAGGCG或CCCGGACCGACGUCUUCAA或CUGACCACUGAGUCUUCCG。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步?jīng)_是供了該siRNA或shRNA核苦酸序列與多聚核苷酸序列GATGAAGAGGGCGTCCGCT或GGGCCTGGCTGCAGAAGTT或GACTGGTGACTCAGAGAAGGC生成的m畫A互補。本發(fā)明的附加實施方式包i舌藥物組合物，其包4舌本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸，載體或宿主細(xì)胞并在特定的實施方式中包^括藥學(xué)可4妻受的載體。在特定的實施方式中，該組合物包含SEQIDNO:7的氨基酸27-310以及抗炎劑。在另一實施方式中，該組合物包含SEQIDNO:9的氨基酸27-310以及抗炎劑。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該抗炎劑選自由甾體抗炎劑和非甾體抗炎劑構(gòu)成的組合。在特定的實施方式中，該甾體抗炎劑選自如下組合氫化可的松，21-醋酸基娠烯醇酮，阿氯米松，阿爾孕酮，安西奈德，丙酸倍氯米松，倍他米松，倍他米+>戊酸，布地奈德，氯潑尼+>,丙酸氯倍他索，丙g吏氯倍他索，氯倍他+>，氯倍他+>丁酸鹽，氯可4乇龍，氯7發(fā)尼醇，皮質(zhì)酮，可的+>,可的4戈口坐，deflazacon，l也奈德，去羥米松，地塞米松，二氟拉松，二氟可龍，二氟潑尼酯，甘草次酸，氟4L可特，氟氯奈德，氟美+〉，新戊@吏氟米+>，氟尼縮+>,氟輕+>曲安縮+>,醋酸氟輕爭>,氟氫爭〉醋S吏酯曲安縮+^，氟可丁丁酯，氟考龍，氟考龍己酸鹽，二氟可龍戊酸鹽，氟米龍，氟培龍醋酸鹽，醋酸氟潑尼定，氟潑尼龍，氟氫縮松，氟曱酰龍，哈西奈德，囟美伸，囟潑尼+>醋酸鹽，氬可4也酯，氬4b可的水〉，醋酸氬4匕可的松，丁酸氪化可的松，氫化可的松磷酸鹽，氫化可的松，21-琥珀酸鈉，氫化可的松A又丁乙酸鹽，馬潑尼酮，甲羥松，曱基強(qiáng)的木〉，曱潑尼龍，糠酸莫米+>，帕^立米*>,潑尼卡酯，強(qiáng)的+>,強(qiáng)的+>龍21畫diedryaminoacetate，〉發(fā)尼+>龍石粦酉臾鈉，醋酉臾〉發(fā)尼+>龍3虎珀酉吏鈉，強(qiáng)的+>龍鈉21-m-苯石黃酸，強(qiáng)的木〉龍鈉21-石更脂酸乙醇酸酯，一又丁乙酸鹽強(qiáng)的松，強(qiáng)的松龍21-三曱基乙S臾鹽，潑尼松，潑尼松龍戊酸酯，潑尼立定，潑尼立定21-二乙氨基醋酸鹽，^#可的+>，曲安西龍，曲安西龍曲安縮^^,苯曲安奈德和己曲安奈德。在特定的實施方式中，該甾體抗炎劑為曱潑尼龍。在另一實施方式中，該非甾體抗炎劑選自如下組合阿明洛芬，苯惡洛芬，布氯酸，卡布洛芬，芬布芬，非諾洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬，咪洛芬，萘普生，奧沙普秦，吡洛芬，普拉洛芬，舒洛芬，噻洛芬酸，碌u惡洛芬，吲P朱美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，環(huán)氯茚酸，雙氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸，呋羅芬酸，異丁芬酸，{尹索克酸，oxpinac，舒林酸，石克平酸，4乇美汀，齊多美辛，佐美酸，氟芬那酸，曱氯芬那酸酸，曱芬那酸，尼氟滅酸，4乇芬那酸，二氟尼柳，氟苯沙酸，伊索昔康，吡羅昔康，舒多昔康，替諾昔康，乙酰水楊酸，柳氮石黃胺吡t定，阿4L丙宗，bezpiperylon,非普^立宗，莫非布宗，羥基{呆泰木>和苯乙丁氮酮。附加的實施方式包括組合物，其中SEQIDNO:7或9的氨基酸27-310被融合至外源多肽。在部分實施方式中，該外源多肽為Fc。本發(fā)明的實施方式還包括促進(jìn)神經(jīng)突生長的方法，其包括將神經(jīng)元與包含本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸或組合物的藥劑相接觸，其中所述的藥劑抑制Nogo受體1介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。附加實施方式包括抑制NgRl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包括將神經(jīng)元與有效量的包含本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸或組合物的藥劑相4妄觸，其中所述的藥劑抑制NgRl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。其它實施方式包4舌在哺乳動物中治療中才區(qū)神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，紊亂或損傷的方法，其包纟舌向需要該種治療的哺乳動物施用有效量的包含本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸或組合物的藥劑相接觸，其中所述的藥劑抑制Nogo受體1介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在特定的實施方式中，該疾病，紊亂或損傷選自如下組合多發(fā)性石更化癥，ALS，亨廷頓病，阿爾茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神經(jīng)病變，中風(fēng)，外傷性腦損傷，脊髓損傷，^L神經(jīng)炎，青光眼，聽力喪失以及腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。在部分實施方式中本發(fā)明進(jìn)一步才是供了該多肽;故融合至外源多肽。在部分實施方式中，該外源多肽為血清白蛋白。在部分實施方式中，該外源多月太為Fc區(qū)。在部分實施方式中，該外源多肽為信號肽。在部分實施方式中，該外源多肽為多肽標(biāo)記。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該Fc區(qū)選自如下組合IgAFc區(qū)；IgDFc區(qū)；IgGFc區(qū)；IgEFc區(qū)以及IgMFc區(qū)。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該多肽標(biāo)記選自如下組合Flag標(biāo)記；Strep標(biāo)i己；聚組氨酸標(biāo)記；VSV-G標(biāo)記；流感病毒血;疑素(HA)標(biāo)i己；以、Ac-Myc才示i己。圖1為Nogo受體-1的結(jié)構(gòu)示意圖。人sNogoR310包含SEQIDNO:7的殘基26-310而sNogoR344包含SEQIDNO:6的殘基26-344。大鼠sNogoR310包含SEQIDNO:9的殘基27-310而sNogoR344包含SEQIDNO:8的殘基27-344。圖2顯示了通過VectorNtiTM壽欠件獲得的Nogo受體-1蛋白的4元原性圖。大鼠P-617為SEQIDNO:10而大鼠P-618為SEQIDNO:ll。人P-617為SEQIDNO:47而人P-618為SEQIDNO:48。圖3A顯示了抗-Nogo受體-1抗體7E11的結(jié)合活性。該圖顯示了7E11濃度對Nogo66與Nogo受體-1結(jié)合的影響。圖3B顯示了抗-Nogo受體-1抗體1H2的結(jié)合活性。該圖顯示了1H2濃度對Nogo66與sNogoR344-Fc(在此處和美國專利申請60/402,866中也稱為Fc-sNogoR344或Ig-sNogoR344)結(jié)合的影響。Fc-MAG不與Nogo66竟?fàn)幗Y(jié)合sNogoR344-Fc。圖4顯示了抗Nogo畫R-l抗體1H2，3G5和2F7的ELISA結(jié)果?？贵w在固定化抗原存在下對OD45。的作用得到了檢測。該固定化抗原為sNogoR310-Fc(在此處和美國專利申i貪60/402,866中也稱為Fc-sNogoR310或Ig-sNogoR310),sNogoR344-Fc,p-617,p-618,p一4，p-5和卵白蛋白以及BSA。圖5顯示了單克隆抗體7Ell在不同凄t量的髓-壽脂存在下對大鼠DRG神經(jīng)突生長的作用。圖6A顯示了在如下竟?fàn)幷叽嬖谙聅NogoR310與1251-Nogo66或125I-Nogo40的結(jié)合作用Nogo66，Nogo40以及抗-Nogo受體-1單克隆抗體上清液。圖6B顯示了125I-Nogo66與sNogoR310的結(jié)合活性。圖7顯示了sNogoR310-Fc對125I-Nogo40與sNogoR310結(jié)合的作用。圖8顯示了sNogoR310-Fc與125I-Nogo40的結(jié)合活性。圖9A顯示了sNogoR310在髓磷脂存在或缺失的情況下對神經(jīng)突生長/細(xì)胞的作用。圖9B顯示了sNogoR310在髓磷脂存在或缺失的情況下對神經(jīng)突生長的作用。圖10A顯示了sNogoR310-Fc在持續(xù)增多的髓磷脂的存在或擊夾失下對大鼠DRG神經(jīng)突生長的作用。圖10B顯示了在以PBS,PBS+sNogoR310-Fc,20ng髓石壽脂和髓石粦脂+sNogoR310-Fc處理后的神經(jīng)突/纟田胞數(shù)。圖11顯示了單克隆抗體5B10在持續(xù)增多的髓-岸脂存在下對DRG神經(jīng)突生長/細(xì)胞的作用。圖12顯示了在大鼠脊髓才黃切才莫型中直至謙導(dǎo)損傷后30曰內(nèi)sNogoR310-Fc對BBB評分的作用。圖13A和13B凈艮導(dǎo)了WT或?qū)幓蛐∈笃废?8或品系01進(jìn)行脊髓半切后運動BBB評分隨時間的變化。圖13C顯示了WT和轉(zhuǎn)基因小鼠損傷后最大容忍傾斜角度隨時間的變化。圖13D顯示了傾斜網(wǎng)才各爬升過程中后肢4晉誤隨損傷后時間的變化。在所有的圖中均才艮導(dǎo)了每組7-9只小鼠的平均士s.e.m.。轉(zhuǎn)基因組的^f直與WT小鼠的值具有統(tǒng)計學(xué)差異(雙星號，P<0.01;學(xué)生"企-瞼)。圖14A顯示了在溶々某或sNogoR310-Fc處理動物進(jìn)4亍脊髓半切后運動BBB評分隨時間的變化。圖14B顯示了網(wǎng)4各行走過程中后肢錯誤隨損傷后時間的變化。圖14C顯示的足跡分析揭示了對照小鼠比未損傷或損傷+sNogoR310-Fc大鼠具有更短的步長和更大的步幅。在所有的圖中均才艮導(dǎo)了每組7-9只大鼠的平均士s.e.m.。sNogoR310-Fc組的值與對照的值具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖14A-B)。在圖14C中的對照值和無SCI或SCI+sNogoR310-Fc大鼠的值具有統(tǒng)計學(xué)差異。(星號，p<0.05;雙星號，p<0.01;學(xué)生t才企-驗)。圖15顯示了抗-rNgRl抗體1D9與大鼠NgRl的可溶性片段(srNgR310)的結(jié)合模型。圖16A顯示了人Nogo受體cDNA的核苷酸序列。在起始和終止密碼子下添加了下劃線。選定的RNAi輩巴區(qū)以4+體表示。RNAi-l和RNAi-3特異性輩巴向人NgR基因，所i殳計的RNAi-2輩巴向人，小鼠和大鼠NgR基因。圖16B顯示了用于將NgRRNAi構(gòu)建進(jìn)入表達(dá)載體pU6的DNA寡聚核苦酸的核普酸序列。圖17顯示了在小鼠L細(xì)胞中RNAi阻抑的瞬時轉(zhuǎn)染測試的結(jié)果。圖18顯示了人NgR表達(dá)載體對SKN和293細(xì)月包的轉(zhuǎn)染。圖19顯示了人SKN細(xì)月包中RNAi阻抑的瞬時4爭染測試。圖20顯示了RNAH曼病毒載體的示意圖。該RNAi表達(dá)盒可插入Pacl位點或EcoRI位點。LTR-長末端重復(fù)；RRE-Rev應(yīng)答元件；cPPT-中央聚。票p令通道；CBA-雞卩月幾動蛋白；WPRE-旱獺肝炎4爭錄后調(diào)節(jié)元4牛；SINLTR-自我失活型LTR。圖21顯示了以7E11抗體-驗i正克隆Neuroscreen細(xì)月包中NgRl卩iU中的western印跡分片斤。圖22顯示了以LV(克隆弁3G9，1E51E91E10),LV-NgRRNAi或原態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的克隆NeuroScreen細(xì)月包中NgR表達(dá)的相克括。Western印跡中的NgR和GAPDH信號通過光密度掃描進(jìn)4亍定量。圖23顯示了通過不同的NgR阻抑水平構(gòu)建的四種NeuroScreen纟田月包克隆。NgR表達(dá)表示為原態(tài)NeuroScreen細(xì)月包中NgR:GAPDH4言號比例的百分比。圖24A-B顯示了融合至大鼠IgG[NgR(310)ecto-Fc]的大鼠NgRl(27-310)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和曱潑尼龍(MP)在體外對髓磷脂誘導(dǎo)的雞背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)中神經(jīng)突生長抑制的作用。(A)將分離胚月臺13天的雞背才艮神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在NgR(310)ecto-Fc或NgR(310)ecto-Fc存在下置于磷酸鹽緩沖液(PBS)或髓磷脂(400ng/樣i孔)中。(B)以PBS對照士SEM(ri-3)百分比表示的每個細(xì)胞(ri-3)神經(jīng)突生長的定量。比例尺，200jmi。與PBS對照比4交P〈0.05。圖25A-E顯示了融合至大鼠IgG[NgR(310)ecto-Fc]的大鼠NgRl(27-310)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和曱潑尼龍(MP)對脊髓損傷(SCI)后功能性恢復(fù)的作用。(A)在4周內(nèi)每周記錄BBB評分。(B)SCI后兩天MP-處理大鼠中的BBB評分。(C)對單獨動物的BBB評分歸一化至第二日。(D)—致性腳掌行走頻率和后肢-前肢協(xié)調(diào)性，顯示了SCI后3和4周獲得14或更高；平分的各組中的大鼠比例。(E)NgR(310)ecto-Fc-和MP+NgR(310)ecto-Fc-處理組的平均步長與只于照的比壽交。圖26A-B顯示了融合至大鼠IgG[NgR(310)ecto-Fc]的大鼠NgRl(27-310)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和曱潑尼龍(MP)處理對尾部至脊髓損傷后軸突數(shù)量的作用。圖27顯示了融合至大鼠IgG[NgR(310)ecto-Fc]的大鼠NgRl(27-310)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和曱潑尼龍(MP)處理對接觸腹角運動神經(jīng)元的生物素葡聚糖胺(BDA)-標(biāo)記的軸突數(shù)量的作用。發(fā)明詳述定義及通用4支術(shù)除非另朽說明，此處所用的4支術(shù)和禾牛學(xué)術(shù)i吾的含義等同于本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的普遍理解。在產(chǎn)生沖突的情況下，將受本申請包括定義所支配。此外，除非上下文另行指明，單數(shù)形式的術(shù)語可包括復(fù)凄t形式，而復(fù)數(shù)形式的術(shù)語可包括單H形式。此處涉及的所有出版物，專利及其它參考文獻(xiàn)均以全部目的在此全文引用作為參考。盡管其它與此處所述類似或等同的方法和才才津+也可用于對本發(fā)明的實施或測試，下文描述了適用的方法和材料。該材料，方法和實施例僅作闡釋目的，并非意在限制。從具體描述和權(quán)利要求中可顯而易見地得到本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢。在整個說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語"包含"及其變體應(yīng)理解為包括了任何所列舉的整體或整體組合，但排除了任何其它整體或整體組合。為進(jìn)一步明確本發(fā)明，此處提供了下列術(shù)語和定義。應(yīng)當(dāng)注意術(shù)語"一個"或"一種"實體指一個或多個該種實體；例如，"一種免疫J求蛋白分子"應(yīng)理解為代表一個或多個免疫^求蛋白分子。因此，術(shù)語"一個"(或"一種")，"一個或多個"以及"至少一個"在此處可進(jìn)4于互換。在整個i兌明書和沖又利要求中，術(shù)語"由…組成"及其變體指包括了任何所列舉的整體或整體組合，但該特定的方法，結(jié)構(gòu)或組合物中不可加入其它的整體或整體組合。在整個說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語"基本由…組成"及其變體指包括了任何所列舉的整體或整體組合，且選擇性地包含了不會實質(zhì)改變特定的方法，結(jié)構(gòu)或組合物的基礎(chǔ)或新穎性能的整體或整體組合。"此處所用的"抗體"指完整的免疫球蛋白，或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體可屬于任何同型或類別(例如，M,D，G,E和A)或4壬何亞類(例如，Gl-4，Al-2)，并可具有kappa(K)或lambda(人)輕鏈。此處所用的"Fc"指包含一種或多種重《連恒定區(qū)CH1，CH2和CH3的免疫J求蛋白重《連部分。例如，抗體的重《連恒定區(qū)的一部分可通過木瓜蛋白酶獲得。此處所述的"NogoR融合蛋白"指包含融合至外源多肽的可溶性Nogo受體-1部分的蛋白。此處所用的"人源化抗體"指至少部分非人源序列^皮人源序列替換的抗體。如何制備人源化抗體的范例可參見美國專利6,054,297,5,886,152以及5,877,293。此處所用的"嵌合抗體"指包含了一個或多個來自第一抗體的區(qū)域并包含了一個或多個來自另一抗體的區(qū)域的抗體。該第一抗體和附加抗體可來自相同或不同物種。如此處和美國專利申請60/402,866所用，"Nogo受體"，"NogoR，，，"NogoR-l"，"NgR，,，"NgR-l"，"NgRl，，以及"NGRl"均指Nogo受體-1。此處所用的術(shù)語"多肽"同時包括了單數(shù)和復(fù)數(shù)的"多肽"，并指由酰胺4建(也稱作肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)所組成的一種分子。術(shù)語"多肽"指任何兩個或多個氨基酸的鏈，且不指定產(chǎn)物的具體長度。因此，肽，二肽，三肽，寡肽，"蛋白"，"氨基酸鏈"或任何其它指代兩個或多個氨基酸鏈的術(shù)語都包含在"多肽"的定義之內(nèi)，且術(shù)語"多肽"可取代任何上述術(shù)語或與之互換。術(shù)語"多肽"還指多肽表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，該種修飾包括但不限于糖基化，乙?；姿峄?，酰胺化，通過已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)進(jìn)行衍生化，蛋白水解裂解，或通過非天然存在的氨基酸進(jìn)行修飾。多肽可衍生自天然的生物來源或通過重組技術(shù)生產(chǎn)，但不一定需要翻譯自指定的核酸序列。它可通過任何方式生成，包括化學(xué)合成。本發(fā)明的多肽的大小約為3個或更多，5個或更多，10個或更多，20個或更多，25個或更多，50個或更多，75個或更多，100個或更多，200個或更多，500個或更多，1000個或更多，或者2000個或更多的氨基酸。多肽可具有一種指定的三維結(jié)構(gòu)，但_并非必須具有該種結(jié)構(gòu)。具有指定三維結(jié)構(gòu)的多肽一皮稱為折疊結(jié)構(gòu)，而不具有指定三維結(jié)構(gòu)，^旦可采用多種構(gòu)型的多肽凈皮稱為未折疊結(jié)構(gòu)。此處所用的術(shù)語糖蛋白指一種至少與一個糖部分連4妄的蛋白，該糖部分通過一種氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基或天冬氨酸殘基)的含氧或含氮側(cè)鏈與蛋白連接。"分離的"多肽或其片段，變體或衍生物指一種不存在于其天然環(huán)境中的多肽。不要求達(dá)到特定的純化水平。例如，一種分離的多肽可取自其自然的或天然的環(huán)境中。在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組生產(chǎn)的多肽和蛋白被認(rèn)為對于本發(fā)明的目的而言是分離的，因為它們是通過任何合適的技術(shù)分離，分割，或者部分或充分純化的天然或重《且多肽。在本發(fā)明中，"多肽片段"指更大多肽的短氨基酸序列。蛋白片段可以是"獨立式的"或是包含在更大的多肽中(該片段作為其部分)。本發(fā)明的多肽片段的代表性范例包括，例如，包含約5個氨基酸，約10個氨基酸，約15個氨基酸，約20個氨基酸，約30個氨基酸，約40個氨基酸，約50個氨基酸，約60個氨基酸，約70個氨基酸，約80個氨基酸，約90個氨基酸，以及約100個氨基酸或長度更長的片段。術(shù)語"片段"，"變體"，"衍生物"及"類似物"在指本發(fā)明的多肽時包括任何至少保留了部分生物活性的任意多肽。只要該多肽仍然能發(fā)揮功能，此處所述的多肽可不受限制地包括其片l殳，變體或衍生物。本發(fā)明的可溶性NgRl多肽可包括水解片段，刪除片段并特別包括傳遞至動物時更容易到達(dá)作用位點的片段。多肽片段進(jìn)一步包括包含了天然多肽抗原性或免疫原性表位(包括線性和三維表位)的任意多肽部分。本發(fā)明的可溶性NgRl多肽和多肽片段包括變體區(qū)，包括如上所述的片段，以及具有由氨基酸替換，缺失或插入所得的變更氨基酸序列的多肽。變體可天然產(chǎn)生，例如等位基因變體。"等位基因"指占據(jù)了有機(jī)體的染色體上給定位點的基因的副本。GenesII,Lewin，B.，ed.,JohnWiley&Sons,NewYork(1985).非天然存在的變體可通過本領(lǐng)域已知的突變沖支術(shù)制備。本發(fā)明的NgRl多肽和多肽片段可包含保守或非保守氨基酸替換，缺失或添加。本發(fā)明的NgRl多肽和多肽片段還可包含衍生分子。變體多肽在此也可稱為"多月太類4以物"。ot匕處所用的多月太或多月太片革殳'"汙生物"指具有一個或多個經(jīng)過功能性側(cè)基團(tuán)反應(yīng)化學(xué)衍生得到的殘基的主體多肽。"衍生物"還包括包含了二十個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一個或多個天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羥基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羥基賴氨酸可取代賴氨酸；3-曱基組氨酸可取代組氨酸；高絲氨酸可耳又代絲氨酸；以及鳥氨酸可取代賴氨酸。此處所用的術(shù)語"二石克4定"包括了兩個》克分子間形成的共價鍵。氨基酸半胱氨酸包含了能與另一硫醇基團(tuán)形成二硫鍵或橋的好u醇基團(tuán)。此處所用的"融合蛋白"指包含了通過肽鍵可操作地連4妻至第二多肽的第一多肽的蛋白。該第一多肽和第二多肽可相同或不同，且它們可直接連接或通過肽接頭進(jìn)行連接(見下文)。術(shù)語"多聚核普酸"包括了單lt或復(fù)數(shù)的核酸，并指分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如，信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。多聚核苦酸和包含全長cDNA序列的核香酸序列，包括未翻譯的5'和3'序列，編碼序列。多聚核苷酸可包括常規(guī)的磷酸二酯鍵或非常規(guī)的鍵(例如，于肽核酸(PNA)等發(fā)現(xiàn)的酰胺鍵)。多聚核苦S臾可由可以是未ff飾RNA或DNA或是^f務(wù)飾后的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核苷酸組成。例如，多聚核香酸可由單《連和雙《連DNA，由單《連和雙《連區(qū)混合得到的DNA,單嗜連和雙4連RNA,以及由單4連和乂又4連區(qū)混合4尋到的RNA，包含了可能是單鏈，或者更典型為雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)混合物的DNA和RNA的雜交分子所組成。此夕卜，該多聚核苷酸可由包含RNA或DNA或者同時包含RNA和DNA的三《連區(qū)所組成。多聚核苷酸還可包含為穩(wěn)定或為其它目的進(jìn)行修飾的一個或多個修飾》咸基或者DNA或RNA骨架。"修飾的"堿基包括，例如，三苯曱基化石成基和異常石成基如肌苦。DNA和RNA可進(jìn)行多種修飾；因此，"多聚核普酸"包括了化學(xué)，酶或代i射修飾的形式。術(shù)語"核酸"指在多聚核苷酸中存在的4壬何一個或多個核酸片段，例如DNA或RNA片段。"分離的"核酸或多聚核苷酸指從其天然環(huán)境中分離的核酸分子，DNA或RNA。例如，包含在載體中的一種編碼NgR多肽或多肽片,殳的重組多聚核苷酸一皮i人為對于本發(fā)明的目的而言是分離的。分離多聚核苷酸的進(jìn)一步范例包括存在于外源宿主細(xì)胞中的重組多聚核苷酸或在溶液中(部分或完全)純化的多聚核香酸。分離的RNA分子包括對本發(fā)明多聚核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。如本發(fā)明所述的分離的多聚核苷酸或核酸進(jìn)一步包4舌合成制備的該種分子。此外，多聚核苷酸或核酸可以是啟動子，核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子等調(diào)節(jié)元件或是包含該種調(diào)節(jié)it/f牛。此處所用的"編碼區(qū)"指由翻i奪氨基酸的密碼子組成的一部分核酸。盡管"終止密碼子"(TAG,TGA,或TAA)不翻譯成氨基酸，它仍可一皮i人為是編石馬區(qū)的一部分，^f旦如啟動子，4亥沖唐體結(jié)合4立點，轉(zhuǎn)錄終止子等側(cè)翼序列不是編碼區(qū)的一部分。本發(fā)明的兩個或多個編碼序列可存在于一個單獨的多聚核苷酸構(gòu)建體(例如，單獨的載體)中或分離的多聚核苷酸構(gòu)建體(例如，分離的(不同)載體)中。此外，任《可載體可包含一個單獨的編碼區(qū)，或包含兩個或多個編碼區(qū)，例如，一種單獨載體可分別編碼一種免疫^求蛋白的重《連可變區(qū)和一種免疫J求蛋白的輕4連可變區(qū)。此外，本發(fā)明的載體，多聚核苷酸或核酸可編碼與編碼本發(fā)明NgR多肽或多肽片革殳的核酸融和或未融合的外源編碼區(qū)。夕卜源編碼區(qū)包括但不限于專門的元件或基序，例如分泌信號肽或外源功能性區(qū)域。在特定的實施例中，該多聚核苷酸或核酸為DNA。當(dāng)為DNA時，一種包含了編碼多肽的核酸的多聚核苷酸通常包括與一個或多個編石馬區(qū)i或可才喿作連4妻的一個啟動子和/或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件?？刹僮鞯倪B接指當(dāng)某種基因產(chǎn)物(例如，多肽)的編碼區(qū)域與一個或多個調(diào)節(jié)序列以一種特定方式連接時，基因產(chǎn)物的表達(dá)受到調(diào)節(jié)序列的影響或控制。如啟動子功能的誘導(dǎo)可使mRNA的轉(zhuǎn)錄編石馬目標(biāo)基因產(chǎn)物，并且如果兩個DNA片l殳之間的4妻頭的板被轉(zhuǎn)錄的能力，則兩個DNA片段(例如一個多肽編碼區(qū)i或和與之連4妄的啟動子)^皮"可才喿作地連4妻"。因此，如果一個啟動子能夠影響一種編碼多肽的核酸的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子區(qū)i或?qū)皮可才喿作地連接至該核酸。該啟動子可以是一種僅能在預(yù)定細(xì)胞中引導(dǎo)DNA的充分轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞特異性啟動子。除啟動子外的其它轉(zhuǎn)錄控制元件，如增強(qiáng)子，才喿作子，阻遏子以及轉(zhuǎn)錄終止信號可與多聚核苦酸進(jìn)4亍可操作連接以引導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。此處披露了合適的啟動子和其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。各種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域已為本領(lǐng)域:技術(shù)人員所熟知。其包括，但不限于，在脊推動物細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域，例如，但不限于，來自細(xì)胞巨化病毒的啟動子和增強(qiáng)子片段(立即早期啟動子，與內(nèi)含子-A相連接)，猿病毒40(早期啟動子)以及逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(例如禽勞斯肉瘤病毒)。其它的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域包括衍生自肌動蛋白，熱休克蛋白，牛生長激素和兔P-球蛋白的脊推動物基因的區(qū)域以及其它能夠在真核細(xì)胞中控制基因表達(dá)的序列。其它合適的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域包括組織特異性啟動子和增強(qiáng)子以及淋巴因子4秀導(dǎo)型啟動子(例如，受干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動子)。類似地，各種翻"^奪控制元件已為本領(lǐng)域的普通4支術(shù)人員所熟知。其包括，但不限于核糖體結(jié)合位點，翻i斧啟動和終止密碼子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特別是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點，或是IRES，也被稱為CITE序列)。在其它的實施方式中，本發(fā)明的多聚核苷酸為RNA,例如，以信4吏RNA(mRNA)的形式存在。本發(fā)明的多聚核香酸和核S吏編碼區(qū)可與編碼分泌或信號肽的附加編碼區(qū)(引導(dǎo)本發(fā)明的多聚核苦酸編碼的多肽的分泌)相連接。根據(jù)信號假設(shè)，由哺乳動物細(xì)胞分泌的蛋白具有一種信號欣或分泌型前導(dǎo)序列，后者在生長蛋白鏈向粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輸出被啟動時從成熟蛋白上被裂解。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員均了解由脊推動物分泌的多肽通常具有融合到多肽N末端的信號肽，它從完整或"全長"多肽序列裂解以生產(chǎn)分泌或"成熟"型多肽。在特定實施例中采用了如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽等天然信號肽，或保留了引導(dǎo)與之可操作連接的多肽分泌能力的該序列的功能性衍生物。此外還可以使用外源哺乳動物信號肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導(dǎo)序列可被人組織型纖溶酶原激活劑(TPA)或小鼠P-葡萄糖醛酸酶的前導(dǎo)序列替換。此處所用的術(shù)語"工程改造的"包4舌通過人工方法(例如，通過重組:技術(shù)，體外肽合成，肽的酶催化或化學(xué)偶合或是這些:技術(shù)的組合)處理核酸或多肽分子。此處所用的術(shù)語"連4妄的"，"融合的"或"融合"可相互^齊換。這些術(shù)語指通過化學(xué)連4妄或重組4支術(shù)等任4可方法連4妄兩個或多個元件或成分。"框內(nèi)融合"指以能夠維持原始開放閱讀框架(ORFs)的正確翻譯閱讀框的方式連接兩個或多個多聚核香酸ORFs以形成一個更長的連續(xù)ORF。因此，重組融合蛋白是一種含有兩個或更多與原始ORFs所編碼的多肽相應(yīng)的片段的單獨蛋白(該片段一般在天然狀態(tài)下不進(jìn)行該種連接)。盡管該閱讀框架在融合片段中彼此連續(xù)，該片段可被框內(nèi)接頭序列等序列物理或空間分隔。"接頭"序列指在融合蛋白中分割兩個多肽編碼區(qū)的一種或多種氨基酸的系列。典型的接頭至少包含5個氨基酸。其它的4妻頭包含至少10個或至少15個氨基酸。在特定的實施方式中，可對肽4妻頭的氨基酸進(jìn)4于選4奪以4吏該4妄頭具有親水性。4妄頭(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(G4S)3(SEQIDNO:65)為一種優(yōu)選接頭，它由于可提供足夠的靈活性而廣泛應(yīng)用于多種抗體。其它接頭包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(G4S)2(SEQIDNO:66),GluSerGlyArgSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQIDNO:67),GluGlyLysSerSerGlySerGlySerGluSerLysSerThr(SEQIDNO:68)，GluGlyLysSerSerGlySerGlySerGluSerLysSerThrGin(SEQIDNO:69),GluGlyLysSerSerGlySerGlySerGluSerLysValAsp(SEQIDNO:70),GlySerThrSerGlySerGlyLysSerSerGluGlyLysGly(SEQIDNO:71),LysGluSerGlySerValSerSerGluGinLeuAlaGinPheArgSerLeuAsp(SEQIDNO:72)以及GluSerGlySerValSerSerGluGluLeuAlaPheArgSerLeuAsp(SEQIDNO:73)。更短接頭的范例包括上述4妻頭的片段，而更長4妻頭的范例包括上述纟妄頭的組合，上述接頭片革殳的組合，以及上述4矣頭與上述4妄頭片,爻的組合。在有關(guān)多肽的上下文中，"線性序列"或"序列"指多肽中的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列內(nèi)彼此相鄰的殘基在多肽的一級結(jié)構(gòu)內(nèi)鄰近。此處所用的術(shù)語"表達(dá)"指通過基因生產(chǎn)RNA或多肽等生化物質(zhì)的過程。該過程包括任何該基因的功能存在的顯現(xiàn)，包括但不限于，基因阻抑以及瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。它包括但不限于將基因轉(zhuǎn)錄為信^吏RNA(mRNA)，轉(zhuǎn)移RNA(tRNA),小發(fā)夾RNA(shRNA),小干護(hù)0RNA(siRNA)或4壬4可其它RNA產(chǎn)物，和一夸mRNA翻譯為多肽，以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻i奪的^f壬何過程。如果該最終產(chǎn)物是一種生化產(chǎn)物，則表達(dá)包括了該種生化產(chǎn)物和任何前體的生成?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)生了"基因產(chǎn)物"。此處所用的基因產(chǎn)物既可以是核S復(fù)(例如，由基因轉(zhuǎn)錄生成的信使RNA),也可以是通過轉(zhuǎn)錄物翻譯得到的多肽。此處所述的基因產(chǎn)物進(jìn)一步包括經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后^f'務(wù)飾(例如，多聚腺苦酸化)的核酸，或是經(jīng)翻譯后修飾(例如，曱基化，糖基化，以及脂質(zhì)的添加，與其它蛋白亞基的結(jié)合，蛋白水解裂解等)的多肽。術(shù)語"RNA干護(hù)G"或"RNAi，，指通過siRNAs來沉,默或減少基因表達(dá)。雙相區(qū)對沉默基因序列具有同源性的siRNA啟動了動物和植物的序列特異性，轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程。該基因可以是該有機(jī)體的內(nèi)源或外源基因，整合于染色體或存在于未整合入基因組的轉(zhuǎn)染載體。該基因的表達(dá)被完全或部分抑制。也有人認(rèn)為RNAi可抑制靶RNA的功能；該靶RNA的功能可以是完全或部分的。此處所用的術(shù)語"治療"指治療性或預(yù)防性措施，其目的為預(yù)防或延緩(減輕)有害的生理變化或紊亂，例如多發(fā)性硬化癥的發(fā)展。有益或目標(biāo)臨床結(jié)果包括，但不限于，可測或不可測的癥狀的纟爰和，疾病程度的減輕，疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(即，不惡化)，疾病進(jìn)展的延遲或減纟爰，疾病爿大態(tài)的文善或減輕，以及(部分或完全)消除。"治療"還指與未接受治療的預(yù)計存活相比更長的存活時間。需要接受治療的對象包括已經(jīng)患有疾病或紊亂以及容易患該疾病或紊亂的^"象或是需要予貞防該疾病或紊舌L的對象。"對象"或"個體"或"動物"或"患者"或"哺乳動物"指需要進(jìn)行i貪斷，預(yù)后或治療的任何對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物對象包4舌，〗旦不限于，人類，馴養(yǎng)動物，畜4欠動物以及動物園，運動，寵物動物，例如狗，貓，"參鼠，兔子，大鼠，小鼠，馬，家畜，牛等；靈長類動物，例如猴，猿，以及黑猩猩；犬科動物，如狗和《良；貓科動物，如貓，聊以及虎；馬考牛動物，如馬，驢以及斑馬；食用動物，如牛，豬以及羊；有^帝動物，如鹿和長頸鹿；嚙齒動物，如小鼠，大鼠，倉鼠以及力豕鼠等。在特定的實施方式中，該哺乳動物為人類對象。此處所用的"治療有歲文量"指在必要的劑量和時間周期下其效果足以達(dá)到所需的治療結(jié)果的^t量。治療結(jié)果可以是，例如，癥狀的減輕，延長存活時間，改善活動性等等。治療結(jié)果不必要"治愈"。此處所用的"預(yù)防有效量"指在必要的劑量和時間周期下其效果足以達(dá)到所需的預(yù)防結(jié)果的lt量。由于預(yù)防劑量通常在疾病發(fā)生前或疾病早期施用，預(yù)防有效量將小于治療有效量。本發(fā)明涉及促進(jìn)CNS神經(jīng)元等神經(jīng)元存活，神經(jīng)元的神經(jīng)突生長和軸突再生的特定NgRl拮抗劑。例如，本發(fā)明l是供了片段，抗體及其片段，以及多聚核苦酸。因此，本發(fā)明的NgRl拮抗劑可用于治療能夠通過促進(jìn)神經(jīng)元存活，或通過刺激CNS中軸突生長或再生得到緩和的損傷，疾病或紊亂。示范性的CNS疾病，紊亂或損傷包括，但不限于，多發(fā)性石更化癥(MS),進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病(PML),腦脊髓炎(EPL)，橋腦中央髓鞘溶解癥(CPM),腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，亞歷山大病以及佩-梅病(PMZ),球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(克拉伯病)以及華勒氏變性，視神經(jīng)炎，橫貫性脊髓炎，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS),亨廷頓舞蹈病，阿爾茨海,默病，帕金^架氏病，脊ft損傷，顱腦損傷，輻射后損傷，化療后的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，中風(fēng)，急性缺血性視神經(jīng)病變，維生素E擊夾乏癥，單獨的維生素E擊夾乏綜合癥，AR，巴康氏綜合癥，Marchiafava-Bignami綜合癥，異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥，三叉神經(jīng)痛和貝爾麻痹癥。MS是這些疾病中傳播最廣的一種，在全世界約有250萬患者。Nogo受體-1多肽—方面，本發(fā)明涉及具有免疫原性的Nogo受體-1多肽。在本發(fā)明的部分實施方式中，該免疫原性多肽主要由選自以下組合的氨基酸序列組成LDLSDNAQLRVVDPTT(大鼠)(SEQIDNO:1);LDLSDNAQLRSVDPAT(人)(SEQIDNO:2);AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(大鼠)(SEQIDNO:3);AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(人)(SEQIDNO:4);以及CRLGQAGSGA(小鼠)(SEQIDNO:5)。在部分實施方式中，本發(fā)明涉及^皮結(jié)合Nogo受體-l的單克隆抗體結(jié)合的Nogo受體-1多肽。在部分實施方式中，該多肽尋皮單克隆7E11抗體識別。在部分實施方式中，該多肽選自如下組合LDLSDNAQLR(SEQIDNO:27);LDLSDDAELR(SEQIDNO:29);LDLASDNAQLR(SEQIDNO:30);LDLASDDAELR(SEQIDNO:31);LDALSDNAQLR(SEQIDNO:32);LDALSDDAELR(SEQIDNO:33);LDLSSDNAQLR(SEQIDNO:34);LDLSSDEAELR(SEQIDNO:35);DNAQLRVVDPTT(SEQIDNO:36);DNAQLR(SEQIDNO:37);ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQIDNO:41);LALSDNAQLRVVDPTT(SEQIDNO:42);LDLSDNAALRVVDPTT(SEQIDNO:43);LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQIDNO:44);以及LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQIDNO:46)。在部分實施方式中，本發(fā)明涉及編碼SEQIDNOs:1-5,26-27,29-37和41-45的多肽的核酸。在本發(fā)明的部分實施方式中，該核酸分子^皮連4妄至表達(dá)4空制序列(例如，pCDNA(I))。本發(fā)明還涉及了包含編碼本發(fā)明多肽的核酸的載體。在本發(fā)明的部分實施方式中，該載體為克隆載體。在本發(fā)明的部分實施方式中，該載體為表達(dá)載體。在本發(fā)明的部分實施方式中，該載體包含至少一個選4奪性標(biāo)記。本發(fā)明還涉及包含上述核酸或載體的宿主細(xì)月包。本發(fā)明還涉及包含培養(yǎng)宿主細(xì)胞步驟的生產(chǎn)本發(fā)明免疫原性多月大的方法。在部分實施方式中，該宿主細(xì)月包為原核細(xì)月包。在部分實施方式中，該宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。在部分實施方式中，該宿主細(xì)力包為酵母。本發(fā)明還涉及可用于，例如，促進(jìn)神經(jīng)突生長，促進(jìn)神經(jīng)元存活，促進(jìn)軸突存活，或抑制NgRl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特定Nogo受體-1多肽和多肽片,殳。本發(fā)明的多肽和多肽片段通常通過阻斷NgRl-介導(dǎo)的神經(jīng)元存活，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)為下文的SEQIDNO:49。全長人NgRl(SEQIDNO:49):MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCJPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAWVGIPA副VDPATFHGLGRLHTLHmRCmQELGPGLFR(3LAALQYLYLQDNALQALPDmm饑GNL孤顧GMUSSVPERAFRGLHSLDKIXLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFLAGRDLKELAi^DLQGCAVATOPYHHWTGRATDEEPLOLPKCCQTOAADKASVLEFGRPASAGNALKGRWPGDSPK3NGSGPRHMDSPFG窗GSAEPPLTAVRPB3SEPPGFPTSGPRRRKSCSRKMITRSHC虹GQAGSGG(30TG固SGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC大鼠NgRl多肽顯示為下文的SEQIDNO:50。全長大鼠NgRl(SEQIDNO:50):〖fll2Slmkrassggsrllawvlwlqa纖vatpcpgacvcynepk:vttscpqqglqawlmpjlrslqylrlndnpwvcdcrarplwawlqkfrgsssevpcnlpqrladrdlkrlaasdlegCAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGMALKXHWPPGmPPGNGSGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSErTGLPTTGPRRRPGCSRKHRTRSHCRLGQAGSGASGTGDAEGSGALPALACSLAmLALVLWTVLGPC小鼠NgRl多肽顯示為下文的SEQIDNO:51。全長小鼠NgRl(SEQIDNO:51)'.101271MKRASSGGSRULAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQG3LQAVPHVVTDFrTFHOLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFROLAALQYLYLQDNNLQAJLPDNTFRDLGNLTCAVASGRFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALICGRWKJDTPPGNGSGPRH,S押GTLPSSAEJPPLTALRPGGSEJPK3LFrrG:PRRRPGCSRKHRTRSHCilIX3QAGSGASGTGDAEGSGAJLPALACSLAPLGLALVLWTVXGPC抗體本發(fā)明進(jìn)一步涉及特異性結(jié)合本發(fā)明的Nogo受體-1多肽的抗體或其抗原結(jié)合片l殳。在部分實施方式中該抗原或抗原結(jié)合片段與主要由選自SEQIDNOs:1-5，26-27，29-37和41-45的氨基酸序列組成多肽相結(jié)合。本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可在體內(nèi)或體外生產(chǎn)。下文討-論了抗體或抗原結(jié)合片l殳的生產(chǎn)。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段抑制Nogo受體-1與酉己體(寸列^口，NogoA,NogoB,NogoC,MAG,OM-gp)的纟吉合并減少髓磷脂介導(dǎo)的對神經(jīng)突生長和抽芽，特別是軸突生長的抑制，還可減少髓磷脂介導(dǎo)的生長錐萎縮。在部分實施方式中，該抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片l殳來自鼠科動物。在部分實施方式中，該Nogo受體-l來自大鼠。在其它實施方式中，該Nogo受體-1來自人。在部分實施方式中，該抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片革殳為重組，工程改造，人源化和/或嵌合。在部分實施方式中，該抗體選自組合單克隆7E11(ATCC編號PTA-4587);單克隆1H2(ATCC編號PTA-4584);單克隆2F7(ATCC編號PTA-4585);單克隆3G5(ATCC編號PTA-4586);以及單克隆5B10(ATCC編號PTA-4588)。在部分實施方式中，該抗體為多克隆抗體46。示范'I"生的^元原結(jié)合片,殳為Fab,Fab'，F(xiàn)(ab')2,Fv，F(xiàn)d,dAb,以及包含決定簇互補區(qū)(CDR)片段的片段，單鏈抗體(scFv)，嵌合抗體，雙價抗體以及至少包含免疫球蛋白部分的多肽，其中該部分足以使該多肽進(jìn)行特異性抗原結(jié)合(例如，免疫粘附素)。此處所用的Fd指由Vh和CH1區(qū)纟且成的片革殳；Fv指由抗體單>^的vL和VH區(qū)《且成的片段；而dAb指由VH區(qū)ia成的片段(Ward等人，7VWwre341:544-546(1989))。此處所用的單4連4元體(scFv)指Vl區(qū)和VH區(qū)通過可使其形成單蛋白鏈的合成接頭配對形成單^介分子的抗體(Bird等人，Sc/e"ce242:423-426(1988)andHuston等人，Ato/.爿c^/.5W,USA55:5879-5883(1988))?！坟疤幩玫碾p價抗體指雙特異性抗體，其中vH和VL區(qū)表達(dá)在單個多肽鏈上，但所采用的接頭太短以至于不能使同一鏈上的兩個區(qū)域配對，因而(例3口，參見Holliger,P.，等人，Prac.7Va"^cad5W.USA90:6444-6448(1993)以及Poljak，R.J.，等人，5^w"wre2:1121-1123^介或非共^介整合了一個或多個CDRs的分子。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明Nogo受體-1抗體的亞基多肽，其中該亞基多肽選自如下組合(a)重《連或其可變區(qū)；以及(b)輕鏈或其可變區(qū)。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的Nogo受體-1抗體的亞基多肽的編碼重鏈或其可變區(qū)，或是輕鏈和其可變區(qū)的核酸。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的Nogo受體-1抗體的高變區(qū)(CDR)或編碼CDR的核酸。免疫本發(fā)明的抗體可通過免疫接種適當(dāng)?shù)乃拗?例如，包4舌人，小鼠，大鼠，綿羊，山羊，豬，牛，馬，爬4亍動物，魚，兩棲動物等脊一,動物，以及在鳥，爬4亍動物和魚的卵中)生成。該種抗體可以是多克隆或單克隆抗體。在部分實施方式中，該宿主通過本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽進(jìn)行免疫4妄種。在其它實施方式中，該宿主以與完整或破碎細(xì)胞的細(xì)胞膜相關(guān)的Nogo受體-1進(jìn)行免疫接種且本發(fā)明的抗體通過與本發(fā)明的Nogo受體-1多肽進(jìn)行鑒定。在部分實施方式中，該Nogo受體-1:抗原與佐劑施用以刺激免疫應(yīng)答。通常需要伴隨抗原施用佐劑以引發(fā)該抗原的免疫應(yīng)答。該種佐劑通常為可促進(jìn)非特異性發(fā)炎，并在免疫位點募集單核噬菌細(xì)力包的不溶或不可降解物質(zhì)。佐劑的范例包4舌，-f旦不限于，弗氏試劑，RIBI(胞壁酰二肽)，ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)或其片段。只于4元體制備方法的綜述可參見，例3口，Harlow和Lane，y4油力o血s,ALaboratoryManual(1988);Yelton，D.E.等人,爿朋.iev.。/飾c/7倒.50:657-80.(1981);以及A醫(yī)bel等人，Cwr固f尸ratoco/sMo/ecw/arS/o/ogv(NewYork:JohnWiley&Sons)(1989)。以本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽對免疫反應(yīng)性的測定可通過本領(lǐng)域公知的多種方法中的任意一種進(jìn)行，包括，例如，免疫印跡測定和ELISA。#元體生產(chǎn)及生產(chǎn)4元體的細(xì)月包系本發(fā)明的單克隆3元體可通過上文例如Harlow和Lane,^""Zwd/M,力丄a60ra/00^A/am/a/(1988)中4苗述的才示準(zhǔn)方法進(jìn)4亍制備。筒言之，在適當(dāng)?shù)臅r間處死動物，并采用例如EBV或與永生化細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞)的融合產(chǎn)物通過本領(lǐng)域公知的多種方法(包括-f旦不限于轉(zhuǎn)化)中的任意一種永生化淋巴結(jié)和/或B-細(xì)胞。然后，將細(xì)胞克隆分離并測試各克隆的上清液中對本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽具有特異性的抗體的生成。選擇，克隆和擴(kuò)增雜交瘤的方法已為本領(lǐng)7>知。類似地，鑒定免疫^求蛋白基因的核苷酸和氨基酸序列的方法已為本領(lǐng)域所知。胞暴露至本發(fā)明的Nogo受體-1或免疫原性多肽，或替代性地，在噬菌體或類似的載體中選才奪抗體庫。參見Huse等人，5Wewce，246:1275-81(1989)?？捎糜诒景l(fā)明的抗體可〗務(wù)飾或未^f奮飾狀態(tài)下4吏用。抗原(此處為本發(fā)明的Nogo受體-1或免疫原性多肽)和抗體可通過共價或非共價連接能提供可測信號的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。各種標(biāo)記和結(jié)合技術(shù)已為本領(lǐng)域所知，并可用于實施本發(fā)明。適用的標(biāo)記包括，但不限于，核素，酶，底物，輔因子，抑制劑，熒光劑，化學(xué)發(fā)光劑，磁性顆粒等。揭示該種標(biāo)記使用的專利包括美國專利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149和4,366,241。此外還可生產(chǎn)重組免疫j求蛋白(參見美國專利4,816,567)。在本發(fā)明的部分實施方式中，抗體具有多重結(jié)合特異性，例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一系列技術(shù)中的任意一種制備的雙功能抗體，該種4支術(shù)包括生產(chǎn)雜交雜交瘤，二好u4定耳又^C，化學(xué)交耳關(guān)，在兩個單克隆抗體間添加肽4妻頭，向特定細(xì)月包系導(dǎo)入兩組免疫球蛋白重和輕《連等等(參見下文更具體的討i侖)。本發(fā)明的抗體還可以是人單克隆抗體，例如，通過7Jc生化人細(xì)胞，通過SCID-hu小鼠或其它能生成"人"抗體的非人動物生產(chǎn)的抗體。p藍(lán)菌體展示庫本發(fā)明的4元誦Nogo受體-1抗體可通過篩選重組組合4元體庫分離得到。示范性組合可結(jié)合本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽，例如通過本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽免疫化的動物的mRNA制備的Vl和VhcDNAs制備的scFv噬菌體展示庫。制備和篩選該種庫的方法已為本領(lǐng)域所知?？赏ㄟ^商業(yè)的方法和材術(shù)牛生成p羞菌體展示庫(例々口，Pharmacia重ia，寇菌體^t體系鄉(xiāng)克，目錄編號27-9400-01;StratageneSurfZApTM噬菌體展示試劑盒，目錄編號240612;以及MorphoSys的其它產(chǎn)品)。還存在其它可用于生成和篩選抗體展示庫的方法和試劑(例如，參見Ladner等人.美國專利號5,223,409;Kang等人.PCT^^開號WO92/18619;Dower等人.PCT7>開號WO91/17271;Winter等人PCT^>開號WO92/20791;Markland等人.PCT^>開號WO92/15679;Breitling等人.PCT^厶開號WO93/01288;McCafferty等人.PCT^>開號WO92/01047;Garrard等人.PCT^>開號WO92/09690;Fuchs等人，說0/rec/2"0/0gyP:1370-1372(1991);Hay等人，^""力od外6r油畫s3:81-85;(1992)Huse等人，5W匿e246:1275-1281(1989);McCafferty等人，7VWw"348:552-554(1990);Griffiths等人,五7kffiO/12:725-734(1993);Hawkins等人，/Mo/.S/o/.226:889-896(1992);Clackson等人，淑廳352:624-628(1991);Gram等人，尸rac.淑/爿cadUSA89:3576-3580(1992);Garrad等人，5/o/7fec/wo/，9:1373-1377(1991》Hoogenboom等人，M/c/.爿c/Ai仏7P:4133-4137(1991);以及Barbas等人，TVa".JcadUSA55:7978-7982(1991)。乂人重組免疫5求蛋白展示庫篩選和分離本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體后，可從展示包(例如，從噬菌體基因組)中獲得編碼選定抗體的核酸，并通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA纟支術(shù)亞克隆進(jìn)入其它的表達(dá)載體。該核酸可4艮據(jù)需要進(jìn)行進(jìn)一步纟喿作以生成下文所述的本發(fā)明其它抗體形式。如上所述，為表達(dá)通過篩選組合庫分離4尋到的抗體，可爿尋編石馬該^t體重《連和輕《連或其可變區(qū)的DNA克隆進(jìn)入重組表達(dá)載體并導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)月包。類型轉(zhuǎn)換本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體可以是任意同型。任意目標(biāo)同型的抗體均可通過類型轉(zhuǎn)換生成。為進(jìn)行類型轉(zhuǎn)換，可采用本領(lǐng)域公知技術(shù)分離不包括編碼d或CH的核普S臾序列的編碼或Vh的核酸。然后該編碼Vl或Vh的核酸一皮可才乘作地連^妄至來自目標(biāo)免疫主求蛋白分子類別的編碼Cl或CH的核苷酸序歹1]。如上所述，這可以通過采用包含C^或Q^連的載體或核酸實現(xiàn)。例如，最初為IgM的本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體可被轉(zhuǎn)換為IgG。此夕卜，類型轉(zhuǎn)換可用于將一種IgG亞類轉(zhuǎn)化為另一種亞類，例如，由IgGl至IgG2。突變抗體在其它實施方式中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可在重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)進(jìn)行突變以改變抗體的結(jié)合屬性。例如，可在一個或多個CDR區(qū)進(jìn)行突變以提高或降低抗體對Nogo受體-1的Kd，提高或降低K。ff，或改變該抗體的結(jié)合特異性。定點突變的才支術(shù)已為本^貞i或7^^口。例^口，參見Sambrook等人，Mo/ecw/arC7om'wg-y4丄aZwrato^yMawwa/,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)和Ausubel等人，Cw/Tew/1尸ra/oco/s/"Mo/ecw/ar所o/ogy(NewYork:JohnWiley&Sons)(1989)。在優(yōu)選的實施方式中，可在已知與本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體的可變區(qū)中的胚系不同的氨基酸殘基進(jìn)行突變。在部分實施方式中，可在已知與本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體的可變區(qū)中的胚系不同的一個或多個氨基酸殘基進(jìn)4亍突變。在另一實施方式中，在編碼;抗體重《連或輕《連可變區(qū)的核酸中的一個或多個框架區(qū)發(fā)生突變。可在恒定區(qū)或框架區(qū)進(jìn)行突變以提高半衰期。還可通過框架區(qū)或恒定區(qū)的突變來改變抗體的免疫原性，提供與另一分子的共價或非共價結(jié)合位點，或改變補體固定等特性?？稍趩蝹€突變抗體的框架區(qū)，恒定區(qū)和可變區(qū)分別進(jìn)行突變。此夕卜，可僅在單個突變抗體的框架區(qū)，恒定區(qū)和可變區(qū)中的一個進(jìn)行突變。融合抗體和免疫粘附素在其它實施方式中，可制備包含了完全或部分連4妄至另一多肽的本發(fā)明抗-Nogo受體-1抗體的融合抗體或免疫粘附素。在部分實施方式中，^又抗-Nogo受體-1抗體的可變區(qū)^皮連4妻至該多肽。在其它實施方式中，本發(fā)明抗-Nogo受體-1抗體的Vh區(qū)^皮連接至第一多肽，而該抗體的VL區(qū)被連接至第二多肽，且該第一多肽和第二多肽;f皮此關(guān)Jf關(guān)的方式^f吏得VH和VL可以相互作用以形成抗體結(jié)合位點。在其它實施方式中，該Vh區(qū)和Vl區(qū)由允許Vh和VL區(qū)相互作用的4妄頭隔離(參見下文單《連^t體部分)。然后^1奪該VH-才妄失-Vl抗體連4妄至目標(biāo)多肽。該融合抗體可用于將多肽導(dǎo)向表達(dá)Nogo受體-1配體的細(xì)月包或組織。該目標(biāo)多肽可以是治療劑(例如毒素)，或可以是診斷劑(例如可以進(jìn)行簡單可^f見化的酶，例如，辣根過氧化酶)，此外，可生成其中兩個(或多個)彼此連接的單《連抗體的融合蛋白。當(dāng)想要在單個多肽《連上生成雙^介或多《介抗體，或想要生成雙特異性抗體時，這便非常有用。單鏈抗體本發(fā)明包括了可結(jié)合本發(fā)明Nogo受體-1多肽的單鏈抗體(scFv)。名夂制備該ScFv,可將Vh-和Vr編碼DNA可才喿作地連接至編碼柔性接頭(例如，編碼氨基酸序歹'j(Gly4-Ser)3(SEQIDNO:10))的DNA,乂人而在Vl和Vh區(qū)一皮柔性4妄頭連4妄時4吏Vh和Vl序列表達(dá)為相鄰單《連蛋白(例如，參見Bird等人，Sc/e"ce242:423-426(1988);Huston等人，淑/.爿cadSc/.USA55:5879-5883(1988);McCafferty等人，A^w"348:552-554(1990))。該單寺連抗體可在<義4吏用單個Vh和VL時為單〗介，在使用兩個Vh和V^時為雙價，或在使用兩個以上VH和VL時為多{介。嵌合抗體本發(fā)明進(jìn)一步包括了雙特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中一種特異性針對本發(fā)明的Nogo受體-1多肽。在一個實施方式中生成了通過一個結(jié)合域特異性結(jié)合本發(fā)明的Nogo受體-1多肽并通過第二結(jié)合域特異性結(jié)合第二分子的嵌合抗體。該嵌合抗體可通過重組分子生物技術(shù)生成，也可通過物理方法結(jié)合在一起。此外，可生成包含一個以上Vh和VL的單《連抗體，該抗體可特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽以及與減少髓磷脂介導(dǎo)的生長錐萎縮和神經(jīng)突生長和抽芽抑制相關(guān)的其它分子。該中雙特異性抗體可通過本領(lǐng)域/>知技術(shù)生成，例如，F(xiàn)anger等人.，/w扁wo/她^/":72-81(1994)以及Wright和Harris,見上文，連同(iii)例如參見，Traunecker等人.乂C騰er0，/.」7:51-52(1992)。在部分實施方式中，該嵌合抗體采用來自本發(fā)明抗體的一個或多個可變區(qū)進(jìn)4亍制備。在另一實施方式中，該嵌合抗體采用來自所述抗體的一個或多個CDR區(qū)進(jìn)行制備。書f生4匕和才示^己的4元體一分子(例如，另一肽或蛋白)。一4殳而言，該抗體或抗原結(jié)合片l史以對本發(fā)明多肽的結(jié)合不受彩f生化或標(biāo)記的不良影響的方式進(jìn)行衍生化。例如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可功能性連接(通過化學(xué)偶合，遺傳融合，非共價結(jié)合或其他方式)至一個或多個其它分子實體，例如其它抗體(例如，雙特異性抗體或雙^介抗體)，才企測劑，細(xì)胞毒性劑，藥物劑，和/或可介導(dǎo)抗體或抗原結(jié)合片l殳與其它分子結(jié)合的蛋白或肽。(例如鏈霉親和素核心區(qū)或聚組氨酸標(biāo)記)。在部分實施方式中，可通過交聯(lián)兩種或多種抗體(相同類型或不同類型，例如，生成雙特異性抗體)生成衍生化抗體。適用的交聯(lián)劑包4舌具有^皮間隔基適當(dāng)隔離的兩個不同反應(yīng)基團(tuán)的異型雙功能交耳關(guān)劑(例如，m-順丁埽酰胺苯曱酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯)，或是同型雙功能交耳關(guān)劑(例如，二琥珀酰亞胺辛二酸酯)。該類接頭可從PierceChemicalCompany,Rockford,111購買。在部分實施方式中，該書亍生化抗體為標(biāo)記的抗體?？珊衔铮ǚ俟馑?，異硫氰酸螢光素，丹磺酰，5-二曱胺-1-萘磺酰氯，藻紅蛋白，鑭系熒光粉等。還可采用能用于檢測的酶(例如，l束才艮過氧化酶，P-半乳糖芬酶，熒光素酶，石咸性^粦酸酶，葡萄糖氧化酶等)標(biāo)記4元體。在以可測酶進(jìn)4t標(biāo)記的實施方式中，可通過添加該酶用于生成可測反應(yīng)產(chǎn)物的附加試劑4全測該抗體。例如，對于,束才艮過氧化酶可添加過氧化氫和二氨基耳關(guān)苯胺。還可以采用生物素標(biāo)記抗體，并通過間接測量抗生物素蛋白或鏈霉親和素的結(jié)合進(jìn)行檢測。還可采用由二級報導(dǎo)基因識別的預(yù)定多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列，第二抗體的結(jié)合位點，金屬結(jié)合域，表位標(biāo)記)標(biāo)記抗體。還可采用放射標(biāo)記的氨基酸來標(biāo)記抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片l殳。該》文射標(biāo)記還可用于診斷和治療目的。該》文射標(biāo)記的抗-Nogo受體-1抗體可用于診斷，例如，用于測定對象中的Nogo受體-1水平。此夕卜，該》文射標(biāo)記的抗-Nogo受體-1抗體還可用于治療脊髓損傷等治療目的。用于多肽標(biāo)記的范例包括，但不限于，下列放射性同位素或核素」H，14C,15N,35S,9°Y,"Tc,Ulln,125j131工還可采用聚乙二醇(PEG)，曱基或乙基基團(tuán)，或糖部分等化學(xué)基團(tuán)衍生化抗-Nogo受體-1抗體或其抗原片段。這些基團(tuán)可用于改善抗體的生物特性，例如，4是高血清半衰期或增加組織結(jié)合。受體-14元體的表4i抗-Nogo受體-1抗體的類別和亞類抗-Nogo受體-1抗體的類別和亞類可通過<壬<可本4貞域已知的方法進(jìn)4亍確定。一4義而言，可采用對特定抗體類別和亞類具有特異'l"生的抗體來測定纟元體的類別和亞類。該種抗體可,人市場購得。類別和亞類可通過ELISA,Western印跡以及其它寺支術(shù)進(jìn)ff測定。替代性地，可對該抗體的重和/或輕4連的恒定區(qū)的全部或部分進(jìn)行測序，并將其氨基酸序列與各免疫球蛋白類別和亞類的已知氨基酸序列進(jìn)行比較，從而確定該抗體的類別和亞類?？?Nogo受體-1抗體對Nogo受體-1的結(jié)合親和力。本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體對本發(fā)明的Nogo受體-1多肽的結(jié)合親和力和解離速率可通過任何本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行測定。例如，可通過竟?fàn)幮訣LISAs,RIAs，BIAcore或KinExA4支術(shù)測定該結(jié)合親和力。該解離速率還可通過BIAcore或KinExA才支術(shù)進(jìn)行測定。結(jié)合親和力和解離速率可通過BIAcore等表面等離子共振進(jìn)行測定。經(jīng)測定7E11和1H2的Kd分別為1x1CT7M和2xIO-8M?？?Nogo受體-1抗體對Nogo受體活性的抑制在部分實施方式中，本發(fā)明的抗-Nogo受體-14元體或其抗原結(jié)合片段可抑制Nogo受體-1與配體的結(jié)合。該抑制的IC50可通過任4可本領(lǐng)域已知的方法(例如，ELISA，RIA或功能性拮抗作用)進(jìn)4亍測定。在部分實施方式中，該ICso介于0.1和500nM。在部分實施方式中，該IC5o介于10和400nM。在其它實施方式中，該抗體或其部分的IQ()介于60nM和400nM。通過結(jié)合測定測才尋7E11禾口1H2的ICso分另寸為400nM禾口60nM。還可參見下文表3。在部分實施方式中，本發(fā)明還包括作為NgRl活性拮抗劑的NgRl-特異性抗體或抗原結(jié)合片段，變體或衍生物。例如，特定NgRl抗體與NgRl的結(jié)合阻斷NgRl-介導(dǎo)的神經(jīng)元存活，中才區(qū)一申纟至系纟充(CNS)一申紹在其它實施方式中，本發(fā)明包^^特異性或優(yōu)先結(jié)合NgRl的至少一個表位的抗體，或其抗原結(jié)合片段，變體或衍生物，其中該表4立包含SEQIDNO:49的至少四至五個，至少七個，至少九個，或介于至少約15至約30個氨基酸，主要由其組成或由其組成。所述的SEQIDNO:49的給定表位的氨基酸可以是(但并非必需)鄰近或線性的。在特定的實施方式中，NgRl的至少一個表^f立包括在細(xì)胞表面表達(dá)的或作為可溶性片段的NgRl胞外區(qū)形成的(例如，融合至IgGFc區(qū))非線性表位，主要由其組成，或由其組成。因此，在特定的實施方式中，NgRl的至少一個表位包括SEQIDNO:49的至少4個，至少5個，至少6個，至少7個，至少8個，至少9個，至少10個，至少15個，至少30個，介于約15至約30個，或至少10,15,20,25，30，35，40，45,50，55，60，65，70，75,80，85，90，95或100個冷卩近或非冷卩近氛基酉臾，主要由其組成，或由其組成，其中非鄰近氨基酸通過蛋白折疊形成表位。在其他實施方式中，本發(fā)明包括特異性或優(yōu)先結(jié)合NgRl至少一個表位的抗體，或其抗原結(jié)合片段，變體或衍生物，其中該表位在上述的一個，兩個，三個，四個，五個，六個或更多個SEQidNO:49的鄰近或非鄰近氨基酸的基礎(chǔ)上包括修飾蛋白的附加部分(例如，可包括糖部分，乂人而〗吏NgRl抗體能夠?qū)f奮飾目標(biāo)蛋白以高于未l奮飾蛋白的親和性進(jìn)行結(jié)合)，主要由其組成或由其組成。替代性地，該NgRl抗體完全不與未經(jīng)修飾的該目標(biāo)蛋白相結(jié)合。在特定的實施方式中，本發(fā)明的抗體，或其抗原結(jié)合片段，變體或衍生物可特異性結(jié)合上述NgRl或片段或變體的至少一個表位(即，與不相關(guān)的或隨才幾表位相比更輕易地與該表位結(jié)合)；優(yōu)先結(jié)合上述NgRl或片段或變體的至少一個表位(即，與不相關(guān)的，相近的，同源的，或類似表位相比更輕易地與該表位結(jié)合)；竟?fàn)幮砸种票旧砼c上述NgRl或片段或變體的至少一個表位或片段或變體的特定表位結(jié)合的參考抗體的結(jié)合；或以解離常數(shù)KD小于約5xlO-2M,約lCr2M,約5xl0—3M，約10-3M，約5乂10，約l(y4M,約5xlO—5M,約1(T5m，約5xl(r6M，約10，約5x10-7M，約10-7M，約5xl(T8M,約l(T8M,約5xl(T9M,約10-9M,約5xl(T10M,約l(r1QM,約5x10-11M,約l(T11M，約5x10-12M,約10"2M，約5xlO"3M，約10-"M,約5xl(T14M,約l(T14M，約5xlO"5M,約10-"M表征的親和性結(jié)合上述NgRl或片段或變體的至少一個表位。在一個特定的方面，該抗體或其片4殳相對鼠NgRl多肽或其片段優(yōu)先結(jié)合人NgRl多肽或其片段。在抗體結(jié)合解離常凄t上下文所用的術(shù)語"約"允許了用于測量抗體親和性的方法的內(nèi)在變差程度。例如，依據(jù)所用〗義器的精度，基于所測樣本的樣本數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，以及常規(guī)誤差，術(shù)語約"10—2m可包括，如乂人0.05m至0.005m。在特定實施方式中，本發(fā)明的抗體，或其抗原結(jié)合片段，變體或衍生物以小于或等于5Xl(T2/秒，10-2/秒，5XlCr3/秒或10-3/秒的解離速率(k(off))與NgRl多肽或其片,殳或變體相結(jié)合。此外，本發(fā)明的抗體，或其抗原結(jié)合片4殳，變體或書f生物以小于或等于5X10—4/秒，l(T4/秒，5Xl(T5/秒，或IO-5/秒5X1CT6/秒，l(T6/秒，5X10-7/秒或10-7/秒的解離速率(k(off))與NgRl多肽或其片,爻或變體相結(jié)合。在其它實施方式中，本發(fā)明的抗體，或其抗原結(jié)合片段，變體或衍生物以大于或等于103M"/秒，5X103M力秒，104M力秒或5X104M力秒的結(jié)合速率(k(on))與NgRl多肽或其片段或變體相結(jié)合。此外，本發(fā)明的抗體，或其抗原結(jié)合片,殳，變體或形于生物以大于或等于105M"/秒、，5X105M"/秒、，106M力秒、或5X106M"/秒或107M-V秒的結(jié)合速率(k(on))與NgRl多肽或其片,史或變體相結(jié)合。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法中采用的NgRl拮抗劑為抗體分子，或其免疫特異性片段。除非特別注明，此處所用的"抗體的片段"指免疫特異性片段，即，抗原特異性片段。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體為雙特異性結(jié)合分子，結(jié)合多肽或抗體，例如對超過一個表^立(例如，一個以上抗原或在相同抗原中的一個以上表位)具有結(jié)合特異性的雙特異性抗體，微抗體，區(qū)域缺失抗體或融合蛋白。在一個實施方式中，雙特異性抗體至少具有一個針對NgRl上至少一個表位的結(jié)合區(qū)。雙特異性抗體可以是具有兩個特異性4十對NgRl表^f立的目才示結(jié)合區(qū)和兩個釗1于其它目標(biāo)的目標(biāo)結(jié)合區(qū)的四價抗體。因此，四價雙特異性抗體可以對各特異性為雙價。本發(fā)明特定的實施方式包括施用NgRl拮抗劑抗體，或其免疫特異性片段，其中至少一個或多個恒定區(qū)域的至少一個部分被刪除或以其它方式改造從而提供所需的生化性質(zhì)，例如下降的效應(yīng)功能，非共價二聚化的能力，-提高的腫瘤位點定位能力，下降的血清半衰期，或是與具有大致相同免疫原性的完整，未改造的抗體相比具有^是高的血清半衰期。例如，此處所述的治療方法中采用的特定抗體為包含了與免疫球蛋白重鏈類似的多肽鏈，但缺失了一個或多個重鏈區(qū)的至少一部分的區(qū)域缺失抗體。例如，在特定的抗體中，修飾抗體的恒定區(qū)中的一個完整區(qū)域?qū)^皮刪除，例如，CH2區(qū)的全部或部分將被刪除。在此處所述的治療方法中采用的特定NgRl拮抗劑抗體或其免疫特異性片段中，可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)對Fc部分進(jìn)行突變以改變(例如，-提高，降低或調(diào)節(jié))效應(yīng)功能。例如，(通過點突變或其它方法)^f恒定區(qū)i或的刪除或滅活可降〗氐或改變Fc受體結(jié)合與循環(huán)修飾抗體的結(jié)合從而提高腫瘤定位。在其它情況下恒定區(qū)修飾與本發(fā)明的適度互補結(jié)合相一致乂人而減少了血清半衰期以及與結(jié)合細(xì)胞毒素的非特異性結(jié)合。恒定區(qū)的另一種修飾可用于修飾二好J建或寡糖部分/人而通過提高抗原特異性或抗體靈活性來增強(qiáng)定位。通過+務(wù)飾得到的生理功能，生物相容性以及其它生化作用(例如胂瘤定位，生物分布以及血清半衰期)可通過/>知的免疫技術(shù)在不采取附加試驗的情況下進(jìn)行檢測和定量。此處描述的診斷和治療方法采用的抗體或其免疫特異性片,殳的〗務(wù)飾形式可采用本領(lǐng)i或已知的4支術(shù)由完整的前體或父代4抗體制備。本文對示范性的技術(shù)進(jìn)行了更具體的討論。在特定的實施方式中此處描述的治療方法采用的NgRl拮抗劑抗體或其免疫特異性片,殳的可變和恒定區(qū)均為完全人源。全人源抗體可通過本領(lǐng)域已知的以及此處描述的技術(shù)進(jìn)行制備。例如，針對特異性抗原的全人源抗體可通過向經(jīng)^奮飾在應(yīng)答抗原性攻擊時生產(chǎn)該種抗體同時其內(nèi)源性基因座凈皮滅活的轉(zhuǎn)基因動物施用抗原進(jìn)行制備。可用于制備該種抗體的示范性技術(shù)參見美國專利6，150,584;6,458,592;6,420,140。其它的4支術(shù)已為本4頁i或所知。如本文其它部分將作更具體討論，全人源抗體還可通過各種展示技術(shù)進(jìn)行制備，例如噬菌體展示或其它病毒展示系統(tǒng)。此處4皮露的i貪斷和治療方法中采用的NgRl拮抗劑抗體或其免疫特異性片,史可通過本領(lǐng)域已知的4支術(shù)進(jìn)行制備或生產(chǎn)。在特定的實施方式中，抗體分子或其片,殳可進(jìn)4亍"重組生產(chǎn)"，即，采用重組DNA技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。制備抗體分子或其片段的示范性技術(shù)將在本文其它部分作更詳細(xì)的討i侖。此處4皮露的治療方法中采用的NgRl拮抗劑抗體或其免疫特異性片段包括修飾(例如，通過向該抗體共價連接任何類型的分子，且該種共價連接不阻止抗體特異性結(jié)合其同源表位)后的衍生物。例如，但非限制，該抗體衍生物包括通過糖基化，乙?；垡叶蓟?，磷?；?，酰胺化，通過已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)進(jìn)行衍生化，蛋白水解裂解，與細(xì)胞配體或其它蛋白連接等方法修飾得到的抗體。各種化學(xué)修飾中的任意一種均可通過已知技術(shù)實現(xiàn)，包括，但不限于特異性化學(xué)裂解，乙?；?，曱酰化，衣霉素代i射合成等。此外，該書t生物可能包含一個或多個非傳統(tǒng)氨基酸。在優(yōu)選的實施方式中，此處4皮露的治療方法中采用的人)體內(nèi)的有害免疫應(yīng)答。在一種實施方式中，此處4皮露的治療方可的技術(shù)進(jìn)行修飾以降低其免疫原性。例如，可對抗體進(jìn)行人源化，靈長源化，去免疫化，或可制備嵌合抗體。這些抗體類型來自于非71在人體內(nèi)具有更低免疫原性的鼠或靈長動物抗體。這可通過多種方法實現(xiàn)，包括(a)將完整非人類可變區(qū)嫁接至人恒定區(qū)以生成嵌合抗體；(b)將一個或多個非人類決定簇互補區(qū)(CDRs)的至少部分嫁接至保留或未保留關(guān)4定框架殘基的人框架和恒定區(qū)；或(c)移植整個非人類可變區(qū)，但通過替換表面殘基以類人切片將其"包覆"。該類方法參見Morrison等人.，尸亂淑/.爿c^/.81:6851-6855(1984);Morrison等人，/i<iv./m應(yīng)"o/.44:65-92(1988);Verhoeyen等人，Scze膨232:1534-1536(1988》Padlan，/扁肌25:489-498(1991);Padlan，A/o/ec/ww"".31:169-217(1994),以及美國專利5,585,089,5,693,761，5,693,762和6,190,370,其全文在此引用作為參考。去免疫化還可用于降^f氐一種抗體的免疫原性。此處所用的術(shù)語"去免疫化"包4舌對抗體進(jìn)4亍改造以^修飾T細(xì)月包表位(例如，參見W09852976A1,WO0034317A2)。例如，對來自起始抗體的VH和Vl序列迸行分析，由各V區(qū)"定位"的人T細(xì)胞表位顯示了與序列內(nèi)的決定簇互補區(qū)(CDRs)和其它關(guān)鍵殘基相關(guān)的表位定位。對來自于T細(xì)胞表位圖i普的單獨T細(xì)胞表位進(jìn)行分析，以在不輕易改變終抗體活性的情況下鑒定選擇性的氨基酸替代物。經(jīng)設(shè)計得到了一系列包括氨基酸替代物組合物的的VH和Vl序列，隨后這些序列被整合進(jìn)入一系列的結(jié)合多肽(例如，NgRl拮抗劑抗體或其免疫特異性片段)以用于此處所述的診斷和治療方法，并對功能進(jìn)行測驗。通常可生成和測一瞼12-24個變體抗體。然后將包含〗務(wù)飾后的V區(qū)和人C區(qū)的完整重鏈和輕鏈基因克隆進(jìn)入表達(dá)載體，將該后續(xù)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞系進(jìn)行全抗體生產(chǎn)。對該類抗體通過適當(dāng)?shù)纳蜕餃y定進(jìn)行比較，并鑒定得到最佳變體。本發(fā)明的方法中采用的NgRl拮抗劑抗體或其片l殳可通過本領(lǐng)域的任何適用技術(shù)生成。多克隆抗體可通過本領(lǐng)域/>知的多種方法進(jìn)行制備。例如，可向多種宿主動物包括，但不限于，兔子，小鼠，大鼠等施用NgRl免疫特異性片段以誘導(dǎo)針對該抗原的含血清多克隆抗體的制備。依據(jù)宿主種類不同，各種佐劑可用于提高免疫應(yīng)答，其包括^f旦不限于，弗氏試劑(完全或不完全)，礦物凝膠(如氫氧化鋁)，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油乳劑，匙孔血藍(lán)蛋白，二硝基酚以及潛在有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。該類佐劑已為本領(lǐng)域熟知。單克隆抗體可通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行制備，包括雜交瘤，重組和噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用及其組合。例如，單克隆抗體可通過本領(lǐng)域已知的雜交瘤寺支術(shù)進(jìn)4亍生產(chǎn)，該4支術(shù)還在i午多文獻(xiàn)中4尋到4苗述，例3口，Harlow等人，v4w"'6c<i/&sv爿丄a60n3c^yAfowwa/，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.(1988);Hammerling等人,in:Mo"oc/o"a/v4w"'ZoWes1awJ71Ce//Elsevier,N.Y.,563-68l(19S1)(所述文獻(xiàn)在此全文引用作為參考)。此處所用的術(shù)語"單克隆抗體"不限于通過雜交瘤4支術(shù)生產(chǎn)的抗體。術(shù)語"單克隆抗體"指由單個克隆(包括真核，原核或噬菌體克隆)得到的抗體，而非它的生產(chǎn)方法。因此，術(shù)語"單克隆抗體"不限于通過雜交瘤才支術(shù)生產(chǎn)的抗體。單克隆抗體可通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行制備，包括雜交瘤，重組和噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用。在一個實施方式中，采用本領(lǐng)域認(rèn)可的方案，可通過多次皮下或腹腔注射相關(guān)抗原(例如，純化的NgRl抗原，如包含該種抗原的細(xì)月包或細(xì)月包萃耳又物)和佐劑在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生4元體。原反應(yīng)抗體的免疫應(yīng)答。盡管可從動物血漿獲取所得的抗體以進(jìn)行多克隆制備，通常可從脾，淋巴結(jié)或外周血分離單獨的淋巴細(xì)胞以進(jìn)行單克隆抗體(MAbs)的均一制備。該淋巴細(xì)胞優(yōu)選從脾獲取。在該公知方法中(Kohler等人，淑匿255:495(1975))，該耳又自注射了抗原的哺乳動物的相對短命或死亡的'淋巴細(xì)胞與一個永生腫瘤細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)相融合，從而得到了永生的并能生產(chǎn)B細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因編碼抗體的雜交細(xì)胞或雜交瘤摂。所得的雜交物通過挑選和稀釋分離得到單獨遺傳抹系，對包含了能夠形成單獨抗體的特定基因的單獨林系進(jìn)行再生。它們可生產(chǎn)針對目標(biāo)抗原的相似抗體，并由于其單純的遺傳親緣而一皮稱為"單克隆"。將由此制備的雜交瘤細(xì)胞接種和培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，該培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的，親代骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員均了解用于雜交瘤形成，挑選和培養(yǎng)的試劑，細(xì)胞系和介質(zhì)可從多個來源購買，且已充分建立了標(biāo)準(zhǔn)化的方案。通常對雜交瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)基進(jìn)行分析以測定4十對目標(biāo)抗原的單克隆抗體的生產(chǎn)。優(yōu)選地，由雜交瘤細(xì)力包生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀，》文射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)等體外分析進(jìn)行測定。當(dāng)雜交瘤經(jīng)鑒定能夠生產(chǎn)具有所需特異性，親和性和/或活性的抗體后，該克隆可通過有卩艮,希釋法進(jìn);f亍亞克隆并以才示準(zhǔn)方法i備養(yǎng)(Goding,Mowoc/o"a/J油力oWwiV/wc^/esawc/Prac"'ce,AcademicPress,pp59-103(1986))。由亞克隆分泌的單克隆4元體可/人i咅養(yǎng)基，腹水或血漿中通過蛋白-A,羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析或親和層析等傳統(tǒng)方法進(jìn)4于純化。識別特定表位的抗體片,殳可通過已知技術(shù)生成。例如，可采用木瓜蛋白酶(生產(chǎn)Fab片段)或胃蛋白酶(生產(chǎn)F(ab')2片段)等酶通過蛋白水解裂解免疫球蛋白分子獲得Fab和F(ab')2片段。F(ab')2片段包含了可變區(qū)，輕鏈恒定區(qū)和重鏈CH1區(qū)?？乖Y(jié)合位點)的DNA還可以乂人抗體謹(jǐn)菌體庫獲得。該種喧菌體可特別用于展示由抗體庫或組合抗體庫(例如，人或鼠)表達(dá)的抗原結(jié)合區(qū)。表達(dá)能夠結(jié)合目標(biāo)抗原的抗原結(jié)合區(qū)的噬菌體可通過抗原(例如，采用標(biāo)記抗原或者固體表面或珠子結(jié)合或捕獲的抗原)進(jìn)行選沖奪和鑒別。這些方法中常用的噬菌體通常為絲狀噬菌體，包括帶有重組融合至噬菌體基因III或基因VIII蛋白的Fab,Fv或二石克鍵穩(wěn)定的Fv抗體區(qū)域的噬菌體表達(dá)的fd和M13。示范性方法可參見，例如，EP368684B1;美國專利5,969,108，Hoogenboom,H.R.以及Chames,/顯,/.7b勿21:371(2000);Nagy等人.淑她t/.5:801(2002);Huie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:2682(2001);Lui等人.，/Mo/.S/o/.315:1063(2002)，分另ij在jt匕引用^f乍為參考。i午多文獻(xiàn)(例Jt口，Marks等人，S/o/Tec/wo/ogy10:779-783(1992))均已描述了通過鏈替換，以及作為構(gòu)建大型噬菌體庫的策略的組合感染和體內(nèi)重組只于高親和性人^t體的生產(chǎn)。在另一實施方式中，可采用核糖體展示替代噬菌體作為展示平臺(例如，參見Hanes等人,胸.腸/ec/wo/18:1287(2000);Wilson等人，尸rac.胸/.Jcad.5W.USA98:3750(2001);或Irving等人，乂/國腳/M"Ws248:31(2001))。在另一實施方式中，可通過細(xì)胞表面庫篩選抗體(Boder等入"TVoc.7Va"JcadSc/.t/SJ97:10701(2000);Daugherty*入"乂/wwimo/.M^/7。A243:211(2000))。該類方法可為用于單克隆4元體的分離和后續(xù)克隆的傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)提供替代方法。在噬菌體展示方法中，功能性抗體區(qū)被展示在攜帶了對其編碼的多聚核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上。特別地，可從cDNA庫(例如，人或鼠'淋巴組織cDNA庫)或合成cDNA庫擴(kuò)增編碼Vh和VL區(qū)的DNA序列。在特定實施方式中，該編；馬Vh和VL區(qū)的DNA在PCR中通過scFv4妄頭相連4妄并,皮克隆進(jìn)入一個嗟菌粒載體(例如，pCANTAB或pComb3HSS)。將該載體導(dǎo)入E.coli并以I肅助喧菌體感染E.coli。這些方法中常用的p藍(lán)菌體通常為絲^犬噬菌體，包括通常重組融合至噬菌體基因III或基因VIII的fd和M13以及Vh或VL區(qū)。表達(dá)能夠結(jié)合目標(biāo)抗原(即，NgRl多肽或其片段)的抗原結(jié)合區(qū)的噬菌體可通過抗原(例如，采用標(biāo)記抗原或者固體表面或J朱子結(jié)合或捕獲的抗原)進(jìn)4亍選4奪和鑒別?？捎糜谥苽湓摽贵w的噬菌體展示方法的附加示范可參見Brinkman等人，J./畫,/.她^fe752:41-50(1995);Ames等人，乂/畫,/.她^fe184:177-186(1995);Kettleborough等人,//畫畫/.24:952-958(1994);Persic等人，G匿187:9-18(1997);Burton等人，W麗c^/扁腳/ogy57:191-280(1994);PCT/>布PCT/GB91/01134;PCT/>布WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/2040U以及U.S.Pat.Nos.5,698,426;5,223，409j5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108;其全文在此引用作為參考。如上述參考文獻(xiàn)所述，在p藍(lán)菌體篩選后，可/人該，，藍(lán)菌結(jié)合片段的完整抗體，并在包括哺乳動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)月包，酵母和細(xì)菌的目標(biāo)宿主中表達(dá)。例如，用于重組生產(chǎn)Fab，F(xiàn)ab'和F(ab')2片革殳的技術(shù)也可采用本領(lǐng)域已知的^支術(shù)，例如參見PCTpublicationWO92/22324;Mullinax等人，飾rec/z柳々瞎12(6):864-869(1992);以及Sawai等人，^L/i/34:26-34(1995);和Better等人，5Wewce240:1041-1043(1988)(所述參考文獻(xiàn)全文引用作為參考)。可用于生產(chǎn)單《連Fvs和抗體的才支術(shù)示范可參見U.S.Pat.Nos.4,946,778和5,258,498;Huston等人，M^/70A/"￡"z，o/ogy205:46-88(1991);Shu等人，90:7995-7999(1993》以及Skerra等人，Sc/e"ce240:1038-1040(1988)。對于某些用途，包括抗體在人體的體內(nèi)應(yīng)用和體外檢測分析，優(yōu)選使用嵌合，人源化或人抗體。嵌合抗體是一種抗體的不同部分來自不同動物種類的分子，例如一種包含了鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。生產(chǎn)嵌合^t體的方;去在已為本4貞i或戶斤^口。侈'J^口，參見Morrison,5We"ce229:1202(1985);Oi等人，腸rec/7m々固4:214(1986);Gillies等人，/畫,/.125:191-202(1989》美國專利5,807,715;4,816,567;和4,816397,其全文在此引用作為參考。人源化抗體指能夠與具有一個或多個來自非人類決定簇互補區(qū)(CDRs)和人免疫球蛋白分子框架區(qū)的目標(biāo)抗原相結(jié)合的由非人類抗體書1"生的抗體分子。人框架區(qū)的框架殘基通?？杀籆DR供體抗體的相應(yīng)殘基所替代從而改變，優(yōu)選提高抗原結(jié)合。這些框架替換可通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行鑒定，例如，可通過對CDR和框架殘基的相互作用建模以鑒定對抗原結(jié)合重要的框架殘基，可通過序列比較鑒定在特定位點的反常框架殘基。(例如，參見Queen等人.，美國專利5,585,089;Riechmann等人，淑匿332:323(1988),其全文在此引用作為參考)?？贵w可通過多種本領(lǐng)域已知的:|支術(shù)進(jìn)4亍人源化，例如，CDR畫4家4妄(EP239,400;PCT乂仝布WO91/09967;美國專利5,225,539;5,530,101;和5,585,089)，4裏飾或重塑(EP592,106;EP519,596;Padlan,她/腦/ar/麵,/，28(4/5):489-498(1991);Studnicka等人，五wg/匿〃77g7(6):805-814(1994);Roguska等人.，尸7VJS91:969-973，1994)，以及鏈替換(美國專利5,565,332)。完整人類抗體可特別用于人類患者的治療。人類抗體可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備，包4舌上述采用來自人免疫J求蛋白序列的抗體庫進(jìn)4亍的噬菌體展示方法。還可參見美國專利4,444,887和4,716,111;以及PCT^>布WO98/46645,WO98/50433,WO98/24893,WO98/16654，WO96/34096，WO96/33735，和WO91/10741;分別全文引用作為參考。人類抗體還可采用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫J求蛋白，但能表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行生產(chǎn)。例如，人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物可隨機(jī)導(dǎo)入或通過同源重組進(jìn)入'J、鼠胚胎干細(xì)胞。除人重鏈和輕鏈基因外，還可將人可變區(qū)，恒定區(qū)和多樣區(qū)導(dǎo)入鼠胚胎干細(xì)胞。鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因可通過同源重組導(dǎo)入的人免疫球蛋白基因座進(jìn)行單獨或同時的非功能性修飾。特別地，JH區(qū)純合子的刪除防止了內(nèi)源抗體的生產(chǎn)。擴(kuò)增該修飾后的胚胎干細(xì)胞并注射進(jìn)入胚泡以生產(chǎn)親和小鼠。飼養(yǎng)該嵌合小鼠以生產(chǎn)表達(dá)人抗體的純合子型后代。該轉(zhuǎn)基因小鼠以選擇抗原(例如，所需目標(biāo)多肽的全部或部分)通過常身見方式進(jìn)行免疫。針對該抗原的單克隆抗體可采用常^L雜交瘤4支術(shù)/人免疫后的轉(zhuǎn)基因小鼠獲取。轉(zhuǎn)基因小鼠包含的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B-細(xì)胞分化時重排，隨后進(jìn)行類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，通過該種才支術(shù)可生產(chǎn)治療有效的IgQIgA,IgM和IgE抗體。該技術(shù)生產(chǎn)人類抗體的綜述可參見Lonberg和Huszar/"A7mwww/.13:65-93(1995)。對技術(shù)用于生產(chǎn)人類抗體和人類單克隆抗體以及生產(chǎn)該類抗體的方案的具體討^侖可參見PCT乂>布WO98/24893;WO96/34096;WO96/33735;美國專利5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5，661，016;5,545,806;5,814,318和5,939,598等，其全文在此引用作為參考。jt匕夕卜,可委4乇Abgenix,Inc,(Freemont，Calif.),口GenPharm(SanJose,Calif.)等^>司通過與上述類似的技術(shù)4是供針對選定抗原的人類抗體。識別選定表位的完整人類抗體可通過一種稱為"定向選才奪"的寺支術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。在該方法中采用一種選定的非人類單克隆抗體(例如，小鼠抗體)引導(dǎo)識別相同表位的完整人類抗體的篩選。(Jespers等人，B/o/Tec/z"o/ogy72:899-903(1988))。還可參見，美國專利5,565,332。在另一實施方式中，編碼所需單克隆抗體的DNA可采用常規(guī)方法簡單分離和測序(例如，可采用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重《連和輕《連基因的寡核苷酸纟笨針)。分離的亞克隆雜交瘤細(xì)月包可用作該DNA的優(yōu)選來源。該DNA在分離后可導(dǎo)入表達(dá)載體，隨后將后者轉(zhuǎn)染進(jìn)入不生產(chǎn)免疫J求蛋白的原核或真核宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞，猿COS纟田胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)月包。更具體的i兌，如1995年1月25日Newman等人4是交的美國專利5,658,570所述(在此引用作為參考)，該分離DNA(如此處所述，可為合成DNA)可用于為制備抗體克隆恒定和可變區(qū)序列。筒要而言，將來自該選定細(xì)胞的RNA遺傳^是耳又物轉(zhuǎn)化為cDNA,然后以Ig特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。能夠完成該目的的合適引物還可參見美國專利5,658,570。如下文所將詳述，可相對大量培養(yǎng)該表達(dá)所需抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以提供臨床或商業(yè)所需的免疫球蛋白。在特定的實施方式中，該重鏈和/或輕《連可變區(qū)的氨基酸序列可通過本領(lǐng)域/>知的方法4企查以確定決定蔟互補區(qū)(CDRs)的序列，例如，可通過比較已知氨基酸序列和其它重《連和輕《連可變區(qū)以確定高可變序列區(qū)?？刹捎贸Ｉ硪娭亟MDNA4支術(shù)將一個或多個CDRs插入框架區(qū)，例如，插入人一匡架區(qū)以將非人類抗體人源化。該框架區(qū)可以是天然存在的或為共有框架區(qū)，且優(yōu)選人框架區(qū)(例^口，參見Chothia等人.，A/o/.S/o/.278:457-479(1998)的人片匡架區(qū)列表)。由框架區(qū)和CDRs的組合生成的多聚核苷酸優(yōu)選編碼一種能與所需多肽(例如，NgRl)的至少一個表位特異性結(jié)合的抗體。在框架區(qū)內(nèi)可優(yōu)選進(jìn)行一個或多個氨基酸替換，該氨基酸替換優(yōu)選能夠提高抗體與其抗原的結(jié)合。此外，該類方法可用于對參與4連間二硫鍵的半胱氨酸殘基的一個或多個可變區(qū)進(jìn)行氨基酸替換或刪除，/人而生成缺失一個或多個4連間二好u4建的抗體分子。其它對多聚核苦酸的改造在本發(fā)明和本領(lǐng)域的現(xiàn)有4支術(shù)范圍內(nèi)。此外，可采用通過拼接具有適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子基因和具有適當(dāng)生物活性的人類抗體分子基因生產(chǎn)"嵌合抗體"的技術(shù)(Morrison等人，淑/.Jcad81:851-855(1984);Neuberger等人，淑,372:604-608(1984);Takeda等人，淑,374:452-454(1985))。此處所用的嵌合抗體是一種抗體的不同部分來自不同動物種類的分子，例如包含了鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體，如人源化抗體。替代性的，根據(jù)描述用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat.No.4,694,778;Bird,5Wewce242:423-442(1988);Huston等人.，7VW/.爿c^/."5^85:5879-5883(1988)以及Ward等人，A^/^"334:544-554(1989))也可用于生成單《連抗體?？赏ㄟ^氨基酸橋連才妻Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段生成單鏈抗體。也可采用在大腸桿菌內(nèi)組裝功能性Fv片段的^支術(shù)(Skerra等人，Sc/e"ce242:1038-1041(1988))。NgRl拮抗劑抗體還可以是在不能生成內(nèi)源免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)體內(nèi)生成人源或?qū)嵸|(zhì)人源抗體(例如，參見美國專利6,075,181，5,939,598,5,591,669和5,589,369，分別在此引用作為參考)。例如，據(jù)描述在嵌合和胚系突變小鼠中的抗體重鏈結(jié)合區(qū)的純合子缺失可導(dǎo)致內(nèi)源抗體生產(chǎn)的完全抑制。人免疫球蛋白基因陣列向該胚系突變小鼠的轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致在抗原攻擊下的人抗體生產(chǎn)。另一4吏用SCID小鼠生成人抗體的優(yōu)選方法可參見美國專利5,811,524，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。應(yīng)當(dāng)可以理解與這些用于生成重組抗體的另一高效方法可參見Newman,10:1455-1460(1992)。該才支術(shù)可特別生成包含了賓矣可變區(qū)和人恒定區(qū)的靈長動物源化抗體。該參考文獻(xiàn)在此全文引用作為參考。此夕卜，該技術(shù)還可參見共同受讓的美國專利5,658,570，5,693,780和5,756,096,該文獻(xiàn)在此引用作為參考。在另一實施方式中，可通過顯微操作選擇淋巴細(xì)胞并分離可變基因。例如，可從免疫哺乳動物分離外周血單核細(xì)胞并在體外培養(yǎng)7天。篩選該培養(yǎng)物以獲得達(dá)到篩選標(biāo)準(zhǔn)的IgGs。可對positivewells的細(xì)萬包進(jìn)4亍分離?？赏ㄟ^FACS或^卜體介導(dǎo)的〉容血空斑才企測的鑒定分離得到生產(chǎn)Ig的單獨B細(xì)胞?？赏ㄟ^顯孩"喿作將生成Ig的B細(xì)胞轉(zhuǎn)移至試管，并可采用RT-PCR等方法擴(kuò)增Vh和Vl基因。將Vh和VL基因克隆至抗體表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞(例如，真核或原核細(xì)月包)以進(jìn)4亍表達(dá)。替代性地，可采用本領(lǐng)域4支術(shù)人員/>知的技術(shù)篩選抗體生成細(xì)胞系并進(jìn)行培養(yǎng)。該類技術(shù)可/人各種試-險手冊和出版物中得到描述。在此方面，適用于本發(fā)明的技術(shù)的描述可見下文，并可參見CM^Tewf尸n^oco/sColigan等人.,Eds"GreenPublishingAssociatesandWiley-Interscience,JohnWileyandSons,NewYork(1991),其內(nèi)容全文(包括附錄)在此引用作為參考。用于此處披露的治療方法的抗體可通過本領(lǐng)域已知的任何抗體合成方法，特別是化學(xué)合成方法或是優(yōu)選此處所述的重組表達(dá)技術(shù)進(jìn)行制備。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解本發(fā)明的范圍進(jìn)一步包4舌抗原結(jié)合DNA序列所有的等位基因，變體及突變體。眾所周知，RNA可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如在異石克氰酸胍萃取和沉淀后進(jìn)行離心或?qū)游?從原始雜交瘤細(xì)胞或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離。在需要時可通過oligodT纖維素層析等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)乂人總RNA分離mRNA。適用的寺支術(shù)已為本領(lǐng)域熟知。在一個實施例中，編碼該抗體輕《連和重《連的cDNAs可參照^^知的方法采用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶同時或單獨制備?？赏ㄟ^共有恒定區(qū)引物或基于7>開的重《連和輕《連DNA和氨基酉臾序列的更具特異性的引物啟動PCR。如上文討論，PCR還可用于分離編碼該抗體輕《連和重《連的DNA克隆。在此處可用共有引物或更具同源性探針如鼠恒定區(qū)探針篩選該庫。DNA,通常是質(zhì)粒DNA,可采用本領(lǐng)i或已知才支術(shù)乂人細(xì)胞分離，并參考標(biāo)準(zhǔn)的，公知技術(shù)(例如，其具體內(nèi)容可參見前述有關(guān)重組DNAl支術(shù)的參考文獻(xiàn))獲得限制性酶圖"i普和測序。當(dāng)然，該DNA可在分離過程或后續(xù)分析中參照本發(fā)明在任意點進(jìn)行合成。該表達(dá)載體通過常規(guī)j支術(shù)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，然后以常頭見技術(shù)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染細(xì)胞以生產(chǎn)用于此處所述方法的抗體。因此，本發(fā)明包括了包含可操作地連接至一種外源啟動子的編碼本發(fā)明抗體，或其重或輕鏈的多聚核苷酸的宿主細(xì)胞。在針對表達(dá)雙鏈抗體的優(yōu)選實施例中，如下文詳述，同時編石馬重和輕《連的載體可在宿主細(xì)月包中共表達(dá)以表達(dá)完整免疫5求蛋白分子?？刹捎枚喾N宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)用于此處所述方法的抗體分子。該種宿主表達(dá)系統(tǒng)代表了可生產(chǎn)和后續(xù)純化目標(biāo)編碼序列的載體，還4&表了在以適當(dāng)核苦酸編碼序列進(jìn)4亍轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后原位表達(dá)本發(fā)明抗體分子的細(xì)胞。其包括但不限于孩i生物，如以包含了抗體編碼序列的重組噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)菌(例如，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌)；以包含抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的酵母(例如，畢赤酵母)；以包含抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；以包含抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花浙卩菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)感染或重纟且質(zhì)4立表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染的^it物細(xì)胞系統(tǒng)；或包含了帶有哺乳動物細(xì)月包基因組啟動子(例如，金屬辟u蛋白啟動子)或哺乳動物病毒啟動子(例3。，^泉病毒B免期啟動子；牛痘病毒7.5k啟動子)的重紐—表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)月包系統(tǒng)(例如，COS,CHO,BLK，293，3T3細(xì)月包)。優(yōu)選地，可使用細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，更優(yōu)選使用真核細(xì)胞表達(dá)重組抗體分子，特別是完整重組抗體分子。例如，結(jié)合來自胞如中國倉鼠卯巢細(xì)胞(CHO)是一種有效的抗體表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等人.，G,45:101(1986);Cockett等人.，腸/Tec/mo/ogy8:2(1990))。在細(xì)菌系統(tǒng)中，才艮據(jù)尋皮表達(dá)的抗體分子的目標(biāo)用途，可選擇使用多種表達(dá)載體。例如，當(dāng)需要生產(chǎn)大量該種蛋白，以得到一種抗體分子的藥物組合物時，可采用能夠引導(dǎo)高水平表達(dá)易純化融和蛋白產(chǎn)物的載體。該類載體包括，但不限于，大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等人，五雄(9J.2:1791(1983》，其中該抗體克隆序列可在與lacZ編碼區(qū)同框的情況下單獨連接至該載體從而生產(chǎn)融和蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye,7Vwc/e/c^4c油ies1.73:3101-3109(1985);VanHeeke,口Schuster,/S/o/.C/2e附.24:5503-5509(1989));pGEX載體也可用于將外源多肽以谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融和蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。一般而言，該種融和蛋白具有可溶性，并能通過吸附，結(jié)合至基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖J朱，然后在自由谷胱甘肽存在下洗脫進(jìn)行簡單的純化。通過i殳計該pGEX載體包括了凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點，從而使該克隆的目標(biāo)基因產(chǎn)物可以乂人GST部分釋》文。在昆蟲系統(tǒng)中，通常4吏用苜蓿尺蠖核多角體病毒(AcNPV)作為表達(dá)外源基因的載體。該病毒生長于草地夜蛾細(xì)胞。該抗體編碼序列可單獨克隆進(jìn)入該病毒的非必須區(qū)(例如多角體蛋白基因)并位于AcNPV啟動子(例如該多角體蛋白啟動子)的控制下。在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可采用一系列基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)采用人腺病毒作為表達(dá)載體時，可將目標(biāo)抗體編碼序列連4妻至Ai病毒豸f錄/翻i奪4空制復(fù)合物如晚期啟動子和三耳關(guān)先導(dǎo)序列。然后可通過體外或體內(nèi)重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組。插入病毒基因組的非必須區(qū)(例如，El或E3區(qū))將形成有活力的并能在感染宿主中表達(dá)抗體分子的重組病毒。(例如，參見Logan&Shenk,7Va//.^cadtTX457:355-359(1984))。插入抗體編碼序列的有效翻i奪還將需要特定的啟動信號。這些信號包4舌ATG起動密碼子和鄰近序列。此外，該起動密碼子應(yīng)當(dāng)與目標(biāo)編碼序列的閱讀框架同期以確保整個插入物的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起動密碼子可來自于多種天然和合成來源。表達(dá)的效率可通過包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強(qiáng)原件，轉(zhuǎn)錄終止子等得到增強(qiáng)(參見Bittner等人.，M"/7ot^五"z少腳/.755:51-544(1987))。此外，還可選4奪以特定形式調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)，或修飾和處理基因產(chǎn)物的宿主細(xì)月包才朱。對該蛋白產(chǎn)物的該種f務(wù)飾(例如，糖基化)和處理(例如，裂解)可對該蛋白的功能非常重要。不同的宿主細(xì)胞可對蛋白和基因產(chǎn)物的翻i奪后處理和#~飾均有不同的特性和特殊的機(jī)制?？蛇x沖奪適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保表達(dá)的外源蛋白的正確^務(wù)飾和處理。為此，可4吏用具有正確處理基因產(chǎn)物的初級轉(zhuǎn)錄，一唐基^b和-粦S吏4b的細(xì)力包才幾制的真核宿主細(xì)"包。該種哺乳動物宿主細(xì)月包包括f旦不限于CHO，VERY,BHK，HeLa,COS,293,3T3,WI387,并4爭另'J包4舌侈寸3口BT483,Hs578T,HTB2,BT20以及T47D等乳&i癌細(xì)月包系以及例如CRL7030和Hs578Bst等正常乳&泉細(xì)月包系。優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)以進(jìn)4亍重組蛋白的長期高產(chǎn)量生產(chǎn)。例如，可通過工程改造得到穩(wěn)定表達(dá)該抗體分子的細(xì)胞系。宿主細(xì)胞可通過由適當(dāng)表達(dá)控制元件(例如，啟動子，增強(qiáng)子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，聚腺苷酸化位點等)和選4奪性標(biāo)記控制的進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而非使用包含病毒復(fù)制起始區(qū)的表達(dá)載體。在導(dǎo)入外源DNA后，將工程細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記可帶來對選擇因素的耐受并使細(xì)胞將該質(zhì)粒穩(wěn)定整合進(jìn)入其染色體，然后生長得到可進(jìn)行后續(xù)克隆并擴(kuò)展入細(xì)胞系的病灶。該方法可用于工程改造可穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。多種選4奪系統(tǒng)可供4吏用，包4舌^旦不限于可分別應(yīng)用于tk-，hgprt-或aprt-細(xì)月包的單純皰滲病毒胸苦激酶(Wigler等人，Ce〃11:223(1977)),次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski,7Va/7.爿cadUSA48:202(1992》，以及^^票p令石粦酸核壽唐轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人.，Ce〃22:8171980)基因。此夕卜，抗代i射物抗性可用作下列基因選擇的基礎(chǔ)具有對氨曱喋呤的抗性的dhfr(Wigler等人.，7Vw/.爿c^/.USA77:357(1980);O'Hare等人,Ato/.Sc/USA78:1527(1981));具有對麥考酚酸的抗性的gpt(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.SciUSA78:2072(1981));具有只于氛基斗唐苦G-418的4元寸生的neo(C7/m'ca/尸/^rmacy2:488-505;Wu和Wu,5/c^/zerap_y3:87-95(1991);Tolstoshev，爿肌P/2a削aco/.7bx/co/.32:573-596(1993);Mulligan,5W認(rèn)e260:926-932(1993);以及Morgan和Anderson,j朋.腸c/綴(62:191-211(1993);,r￡C/f11(5):155-215(1993年5月)；具有對潮霉素的抗性的hygro(Santerre等人.，Gem30:147(1984)。本領(lǐng)*或7>知的可供4吏用的重纟且DNA才支術(shù)可參見Ausubel等人.(eds.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY(1993);Kriegler，GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990);以及在Dracopoli等人.(eds)，CurrentProlocolsinHumanGenetics,第12和13章，JohnWiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapin等人，《/^Wo/"/o/.150:1(1981),其全文在此引用作為參考?？贵w分子的表達(dá)水平可通過載體擴(kuò)增得到提高(其綜述參見Bebbington和Hentschel,r/zeve"orsZos^owZWJc/謹(jǐn)Vg,AcademicPress,NewYork,Vol.3.(1987》。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記可進(jìn)行擴(kuò)增時，宿主細(xì)胞培養(yǎng)中抑制劑水平的提升可提高標(biāo)記基因拷貝數(shù)。由于擴(kuò)增區(qū)與抗體基因關(guān)聯(lián)，因而抗體的產(chǎn)量也會得到4是高(Grouse等人，Mo/.Ce〃.AW.3:257(1983))。該宿主細(xì)胞可被兩個本發(fā)明的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，該第一載體編碼一種重鏈衍生多肽，該第二載體編碼一種輕鏈衍生多肽。這兩種載體可包含相同的能4吏重和輕《連多肽同等表達(dá)的可選褲:標(biāo)記。替代性地，也可使用一種同時編碼重和輕《連多肽的單獨載體。在該種情況下，該輕4連^^尤先方文置在重鏈之前以防止過量的無毒重鏈(P匪dfoot,淑臟322:52(1986);Kohler，淑/.Jcrn/.Sc/.USA77:2197(1980))。該重和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。當(dāng)本發(fā)明的抗體分子被重組表達(dá)后，可通過本領(lǐng)域已知的任意免疫^求蛋白分子純化方法對其進(jìn)行純化，例如，層析(例如，離子交換層析，親和層析，特別是對蛋白A特異性抗原的親和層析，篩分柱層析)，離心，微分溶出，或通過任何其它蛋白純化標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)。替代性地，提高本發(fā)明抗體親和性的優(yōu)選方法參見US20020123057Al。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法中采用的結(jié)合分子或抗原結(jié)合分子包含了一種其中一個或多個區(qū)域被部分或全部刪除的合成恒定區(qū)("區(qū)域缺失抗體")。在特定實施例中的相容性修飾抗體包含了整個CH2區(qū)凈皮去除的區(qū)域缺失構(gòu)建體或變體(ACH2可變區(qū)的靈活性和自由移動性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將可以理解由于CH2區(qū)對抗體分解率的調(diào)節(jié)屬性，因而特別優(yōu)選該構(gòu)建體。在特定的實施方式中，本發(fā)明披露的方法中采用的修飾抗體為微抗體。微抗體可通過本領(lǐng)域已描述的方法進(jìn)行制備(例^口，參見，美國專矛J5,837,821或WO94/09817A1)。在另一實施方式中，本發(fā)明披露的方法中采用的修飾抗體為本領(lǐng)域已知的CH2區(qū)缺失抗體。區(qū)域缺失構(gòu)建體可通過編碼IgGl人源恒定區(qū)的載體(例如，來自BiogenIDEC^>司)獲得(例如，參見WO02/060955A2和WO02/096948A2)。這些示范性載體經(jīng)工程改造缺失了CH2區(qū)并提供了表達(dá)區(qū)域缺失IgGl恒定區(qū)的合成載體。在一個實施方式中，本發(fā)明所4皮露的治療方法中采用的NgRl拮抗劑抗體或其片段含了一種具有能支持單體亞基間結(jié)合的數(shù)個或者甚至單個氨基酸缺失或替換的免疫球蛋白重鏈。例如，在CH2區(qū)選定部位的單個氨基酸突變可足以降^氐Fc結(jié)合并/人而增強(qiáng)腫瘤定位。類似地，可能僅需要刪除控制帶調(diào)節(jié)效應(yīng)功能(例如，補體結(jié)合)的一個或多個恒定區(qū)。該恒定區(qū)的部分缺失可能^是高該抗體的選定特性(血漿半衰期)，同時保留其它與對象恒定區(qū)相關(guān)的所需功能的完整性。此外，如上文指出，所披露抗體的恒定區(qū)可通過對增強(qiáng)所得構(gòu)建體作用的一個或多個氨基酸的突變或替換進(jìn)4亍合成。就此而言，可以在石皮壞-床守結(jié)合位點(例如，F(xiàn)c結(jié)合)的活性的同時充分保留修飾抗體的構(gòu)型和免疫原性作用。另一實施例包含了向恒定區(qū)添加一個或多個氨基酸以增強(qiáng)所需的特性(例如效88應(yīng)功能)或者4是供更多細(xì)胞毒素或糖附著。在該類實施例中可能需要插入或復(fù)制來自選定恒定區(qū)的特定序列。本發(fā)明還才是供了包含此處所述的抗體分子(例如，VH區(qū)和或VL區(qū))的變體(包括彩f生物)，主要由其組成，或由其組成的抗體的用途，該抗體或其片段免疫特異性結(jié)合NgRl多肽。本列引入突變，包括但不限于，可導(dǎo)致氨基酸替換的定點突變和PCR介導(dǎo)的突變。優(yōu)選地，該變體(包括衍生物)相對參考Vn區(qū)，VHCDRl，VhCDR2，VhCDR3,Vl區(qū)，VLCDR1，VLCDR2或VLCDR3編碼少于50個氨基酸替換，少于40個氨基酸替換，少于30個氨基酸替換，少于25個氨基酸替換，少于20個氨基酸替換，少于15個氨基酸替換，少于10個氨基酸替換，少于5個氨基酸替換，少于4個氨基酸替換，少于3個氨基酸替換，或少于2個氨基酸替換。"保守氨基酸替換"是以具有類似電荷側(cè)鏈的氨基酸殘基替換其中一個氨基酸殘基。本領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)定義了有類似電荷側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)《連(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未帶電才及性側(cè)《連(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，無才及性側(cè)《連(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，P-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)的氨基酸。此夕卜，該突變可沿全部或部分編碼序列進(jìn)行(例如飽和突變)，對所得的突變進(jìn)行生物活性篩選以鑒定保留活性的突變體。例如，可以僅在抗體分子的才匡架區(qū)或CDR區(qū)引入突變。所引入的突變可以是同義或中性錯義突變，即對抗體結(jié)合抗原的能力沒有或具有4艮少的影響。這些類型的突變可能對優(yōu)化密碼子用途或4是高雜交瘤的抗體生產(chǎn)非常有用。然而非中性4晉義突變可改變一種抗體結(jié)合抗原的能力。多數(shù)同義或中性錯義突變的位點可能在框架區(qū)中，而多數(shù)非中性錯義突變的位點可能在CDR中，盡管這并非絕對。本領(lǐng)域的纟支術(shù)人員均能i殳計和測試具有所需屬性(例如未改變抗原結(jié)合活性或改變了結(jié)合活性(例如，纟是高了抗原結(jié)合活性或改變了抗體特異性))的突變分子。突變后可對編碼蛋白進(jìn)行常規(guī)表達(dá)，編碼蛋白的功能性和/或生物活性可通過此處所述的技術(shù)或本領(lǐng)域已知的常規(guī)J資飾」技術(shù)進(jìn)4亍測定。到多種可用于改變本發(fā)明抗體的生物屬性的方法，包4舌可以3是高或降低給定抗體穩(wěn)定性或半衰期，免疫原性，毒性，親和性或產(chǎn)率的方法，或通過4壬何其它方式改變它，以<吏它更適合特定應(yīng)用的方法。下文描述了包含本發(fā)明抗體的組合物及其用途可溶性Nogo受體-1多肽蛋白全長Nogo受體-l由4言號序列，N-末端區(qū)(NT),7\個亮氨酸富集重復(fù)序列(LRR),LRRCT區(qū)(/v個亮氨酸富集重復(fù)序列的亮氨酸富集重復(fù)區(qū)C-末端)，C-末端區(qū)(CT)和錨組成(參見圖1)?！坟疤帒艚镉玫腘gR區(qū)長口下定義表l.NgR區(qū)范例區(qū)域<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>本發(fā)明的部分實施方式提供了可溶性Nogo受體-1多肽。本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽包含了NT區(qū)；8LRRs和LRRCT區(qū)并缺失信號序列和功能性GPI錨(即，沒有GPI錨或該GP1錨失去了有效附著至細(xì)胞膜的能力)。在部分實施方式中，可溶性Nogo受體-1多肽包含了外源LRR。在部分實施方式中，可溶性Nogo受體-1多肽包含了2，3，4,5,6,7或8個外源LRRs。夕卜源LRR指乂人非Nogo受體-1蛋白中獲得的LRR?？色@得夕卜源LRR的示范性蛋白為toll樣受體(TLR1.2);T-細(xì)胞激活亮氨酸重復(fù)富蛋白；deceorin;OM-gp;類胰島素生長因子結(jié)合蛋白酸性不穩(wěn)定亞基slit和robo;以及toll-樣受體4。在部分實施方式中，本發(fā)明才是供了319氨基酸的可;容'hiNogo《#畫1鄉(xiāng)力t("5f;:，'hiNogo《#畫1344，sNogoRl—1344，ilsNogoR344)(SEQIDNOs:6的殘基26-344和SEQIDNO:8的殘基27-344)。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了285氨基酸的可溶性Nogo受體-1多肽(可〉容性Nogo受體-1,310，sNogoRl-l310,或sNogoR310)(SEQIDNOs:7的殘基26-310和SEQIDNO:9的殘基27-310)。見圖1。表1人和大鼠Nogo受體-1多肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>在本發(fā)明的部分實施方式中，本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽,皮用于抑制配體與Nogo受體-1的結(jié)合，并用作Nogo受體-1配體的拮抗劑。在本發(fā)明的部分實施方式中，本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽一皮用于減少一申經(jīng)元中的碎申經(jīng)突生長和4由芽(例^口軸突生長)抑制，并用于抑制神經(jīng)元中髓磷脂介導(dǎo)的生長錐萎縮。在部分實施方式中，該神經(jīng)元為CNS神經(jīng)元。令人驚奇的是，sNogoR310和sNogoR344阻斷NogoA,NogoB,NogoC,MAG禾口OM畫gp與Nogo受體-1的結(jié)合。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包含除了最多一個，兩個，三個，四個，十個或二十個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酉吏序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下《且合(a)SEQIDNO:49的氨基酸x-344,(b)SEQIDNO:49的氨基酸309-y，以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸x-y,其中x為由306至326的任意整凄史，而y是由328至350的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包含除了最多一個，兩個，三個，四個，十個或二十個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸x'-344，(b)SEQIDNO:49的氨基酸309-y',以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸x'-y',其中x'為由300至326的任意整數(shù)，而y'是由328至360的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。"NgRl參考氨基酸序列"或"參考氨基酸序列"指不進(jìn)行任4可氨基酸替換的特定序列。本領(lǐng)域普通才支術(shù)人員將能理解如果沒有替換，本發(fā)明的"分離多肽"包含了與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列。在部分實施方式中，本發(fā)明4是供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包含除了最多一個，兩個或三個單獨氨基酸*#換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合SEQIDNO:49的氨基酸309-335;SEQIDNO:49的氨基酸309-344;SEQIDNO:49的氨基酸310-335;SEQIDNO:49的氨基酸310-344;SEQIDNO:49的氨基酸309-350;SEQIDNO:49的氨基酸300-344;以及SEQIDNO:49的氨基酸315-344。在一種實施方式中，本發(fā)明才是供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包含除了最多三個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基酸309-344。在一種實施方式中，本發(fā)明4是供了具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包含除了最多三個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基S吏序列，其中所述的參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基f支309-335。在一種實施方式中，本發(fā)明分離多肽，其包含(a)除了參考氨基酸序列中至少一個半胱氨酸殘基,皮不同氨基酸替換外，與所述參考一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基S臾序列選自如下組合(i)SEQIDNO:49的氨基酸a畫445，(ii)SEQIDNO:49的氨基酸27-b,以及(iii)SEQIDNO:49的氨基酸a-b,其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。如本實施方式所述的對多肽片段的示范性氨基酸替換包括以不同的氨基酸替換本發(fā)明多肽中的單獨半胱氨酸殘基。任意不同的氨基酸均可替換本發(fā)明多肽的半胱氨酸。采用哪一種不同的氨基酸取決于一系列標(biāo)準(zhǔn)，令人，替換對多肽片段構(gòu)型的作用，多肽片段的電荷，或是多肽片段的親水性。用于本發(fā)明的多肽和參考氨基酸序列的氨基酸替換的氨基酸包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，無極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，P-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)的氨基酸。在參考氨基酸中替換半胱氨酸的典型氨基酸包括丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，特別是丙氨酸。通過工一呈改造編碼該多肽片,殳的多聚核苷酸來進(jìn)4亍該種^^換術(shù)語本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)的專業(yè)知識。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的分離多肽，其中至少至少一個半胱氨酸殘基被不同的氨基酸替換。在人NgRl中可-^^灸的半月光氨酉臾歹戈基包4舌C27,C31,C33,C43,C80，C140，C264,C266,C287,C309,C335，C336,C419,C429,C455和C473。在大鼠NgRl中可替換的半胱氨酸殘基包括C27,C31,C33,C80,C140,C264,C266,C287，C309,C335,C336,C419,C429,C455和C473。在小鼠NgRl中可替換的半胱氨酸殘基包括C27,C31,C33,C43,C80,C140,C264，C266，C287,C309,C335,C336,C419，C429,C455和C473。本發(fā)明進(jìn)一步才是供了具有40個殘基或少于40個殘基的分離多肽片段，其中該多肽片段除了C309被替換，C335被替換，C336被替換，C309和C335被替換，C309和C336被替換，C335和C336被替換，或C309,C335和C336被替換外，包含了與SEQIDNO:49的氨基酸309-344—致的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽中的半胱氨酸殘基可以任何外源氨基酸替換。在特定的實施方式中，該半胱氨酸被最不可能改變該多肽的三維構(gòu)型的小型不帶電氨基酸(例如，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，優(yōu)選丙氨酸)替換。在部分實施方式中，本發(fā)明的可溶性Nogo受體-l多肽是進(jìn)一步包含外源多肽的融合蛋白中的成分。在部分實施方式中，該外源多肽為免疫5求蛋白恒定區(qū)。在部分實施方式中，該免疫J求蛋白恒定區(qū)為重《連恒定區(qū)。在部分實施方式中，該外源多月太為Fc片,殳。在部分實施方式中，該Fc^皮連4妻至本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽的C-末端。在部分實施方式中該融合Nogo受體-l蛋白為二聚物。本發(fā)明進(jìn)一步包括了上述多肽片段的變體，類似物，或衍生物。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了分離多肽，其包含(a)除了最多二十個單獨氨基酸替換外與參考序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合(i)SEQIDNO:49的氨基酸a國445,(ii)SEQIDNO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQIDNO:49的氛基酉吏a-b,其中a為由1至35的4壬意整凄史，而b是由300至450的任意整數(shù)；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，該分離多肽SEQIDNO:49的氨基酸1-310，其中R269和A3l(H皮不同的氨基酸-齊才灸。用于該多肽中進(jìn)行替換的示范性氨基酸包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)4連(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，無才及性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，(3-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)的氨基酸。在一種實施方式中，該不同的氨基酸為色氨酉吏。示范性可溶NgR-Fc融合蛋白為人NgRl(319)-Fc，其包含與SEQIDNO:49的氨基酸1-319的C-末端結(jié)合的Fc。具有半月先氨酸^^換的示范性可::容性NgR-Fc融合蛋白為Ala-Ala-人(h)NgRl(310)-Fc(其包括了與具有SEQIDNO:58的氨基酸的可溶性多肽C-末端結(jié)合的Fc)，Ala-Ala-大鼠(r)NgR1(310)-Fc(其包括了與具有SEQIDNO:59的氨基酸的可溶性多肽C-末端結(jié)合的Fc)以及Ala-Ala-人(h)NgRl(344)-Fc(其包4舌了與具有SEQIDNO:64的氨基酸的可溶性多肽C-末端結(jié)合的Fc)。在本發(fā)明中，"多肽"可由通過肽4建或修飾肽鍵(即，肽等排物)結(jié)合的氨基酸組成，并可包含20個基因編碼氨基酸以外的氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸)。本發(fā)明的多肽可通過翻i奪后作用等自然作用，或通過本領(lǐng)域/>知的化學(xué)修飾4支術(shù)進(jìn)^刊奮飾。該-修飾在基本文本和更具體的專著，以及大量的研究文獻(xiàn)中得到了具體的描述。修飾可在多肽的任何部分發(fā)生，包括肽骨架，氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基末端。應(yīng)當(dāng)可以理解在給定多肽的多個位點可出現(xiàn)相同或不同程度的相同類型的修飾。此外，一種給定多肽可包含多種類型的修^飾。多肽可因為泛素化等原因而帶有分支，它們也可呈帶或不帶分支的環(huán)狀。環(huán)狀，分支和帶分支的環(huán)狀多肽可通過自然作用或合成方法形成。修飾包括，但不限于，乙?；?，?；珹DP-核糖基化，酰胺化，黃素的共價結(jié)合，亞鐵血紅素部分的共價結(jié)合，核苷酸或核香酸衍生物的共價結(jié)合，脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價結(jié)合，磷脂酰肌醇的共價結(jié)合，交聯(lián)，環(huán)化，形成二發(fā)u鍵，脫曱基，共價交聯(lián)的形成，半胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，曱酰化，Y-羧化，糖基化，GPI錨形成，羥基化，碘處理，甲基化，豆蔻?；趸?，聚乙二醇化，蛋白水解作用，石壽酸4b,異戊晞化，外消旋，硒化，辟^酸鹽化，如精胺?；冉?jīng)轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)向蛋白添加氛基酸，泛素化。(例如，參見Proteins-StructureAndMolecularProperties,T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork2ndEd.,(1993》PosttranslationalCovalentModificationOfProteins,B.C.Johnson,Ed.，AcademicPress,NewYork,pgs1-12(1983》Seifter等人.，五"^mo7182:626-646(1990);Rattan等人.，爿""A^TJcad663:48-62(1992》。此處所述的多月太可呈環(huán)狀。多月太的環(huán)j匕減少了線'I"生月太的構(gòu)型自由度并形成了更具結(jié)構(gòu)約束性的分子。本領(lǐng)域已知多種肽環(huán)化方法，例如，通過肽的N末端和C末端氨基酸殘基之間的氨4定的形成進(jìn)^"骨架至骨架摂環(huán)化。骨架至骨架摂環(huán)化法包4舌在兩個a-硫氨基酸殘基(例如，半胱氨酸，高半胱氨酸)之間二硫橋的形成。本發(fā)明的特定肽包括在肽的N和C末端進(jìn)行修飾以形成環(huán)狀多肽。該種^f奮飾包括，^f旦不限于，半胱氨酸殘基，乙酰化半胱氨酸殘基，具有NH2部分和生物素的半力光氨酸殘基。肽環(huán)化的其它方法可參見Li及Roller.Curr.Top.Med.Chem.3:325-341(2002)以及美國專利/>布U.S.2005-0260626Al，其全文在此引用作為參考。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片,殳可作為預(yù)制備多肽直接施用，或是通過核酸載體間接施用。在本發(fā)明的部分實施方式中，在治療方法中施用NgRl多狀或多月太片,殳的方法包括:(l)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染具有表達(dá)本發(fā)明NgRl多肽或多肽片段的核酸(例如，載體)的可移才直宿主細(xì)胞；以及(2)將轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在疾病，紊亂或損傷的位點移植進(jìn)入哺乳動物。例如，該轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可植入MS的慢性病灶位點。在本發(fā)明的部分實施方式中，該可移植宿主細(xì)月包一皮耳又出哺乳動物，臨時培養(yǎng)，以編碼本發(fā)明NgRl多肽或多肽片段的分離核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，并重新移植進(jìn)入其來自的同一哺乳動物。該細(xì)胞可以是(但不要求)從其移植的同一位點取出。該類實施方式(有時被稱為間接體內(nèi)基因治療)可于短時間內(nèi)在作用位點提供連續(xù)的本發(fā)明NgRl多肽或多肽片段。下文討論了本發(fā)明的NgR多肽的附加范例以及獲取這些分子以實施本發(fā)明的方法和材4+。融合蛋白和結(jié)合多肽本發(fā)明的部分實施方式包括了不是全長NgRl蛋白的NgRl多肽的使用，例如，融合至外源多肽部分以形成融合蛋白的NgRl多肽片段。該種融合蛋白可用于實現(xiàn)多種目的，例如，沖是高血清半衰期，改善生物相容性，體內(nèi)靶向特定器官或組織類型，4是高重組表達(dá)效率，提高宿主細(xì)胞分泌，簡化純化，以及獲得更高的親和性。4艮據(jù)待實現(xiàn)的目標(biāo)不同，該外源部分可呈惰性或具有生物活性。另夕卜，它可選4奪穩(wěn)定融合至本發(fā)明的NgRl多肽部分或者在體外或體內(nèi)裂解。實現(xiàn)這些目標(biāo)的外源性部分已為本領(lǐng)域所知。在本發(fā)明的部分實施方式中，NgRl多肽片,史可融合至另一NgRl多月太片,殳，例力。除Fc外的NgR2或NgR3多月太片,殳。人NgR2多肽顯示為下文的SEQIDNO:60。全長人NgR2(SEQIDNO:60):MLPGLRRLLQAPASACLLLMLLALPLAAPSCPMLCTCYSSPPTVSCQANNLDLGDNRHLRSLEPDTFQGLERLQSLHLYRCQLSSLPGNIFRGLVSLQYLYLQENSLLHLQDDLFADLANLSHLFLHGNRLRLLTEHVFRGLGSLDRLLLHGNRLQGVHRAAFRGLSRLTILYLFNNSLASLPGEALADLPSLEFLRLNANPWACDCRARPLWAWFQRARVSSSDVTCATPPERQGRDLRALREADFQACPPAAPTRPGSRARGNSSSNHLYGVAEAGAPPADPSTLYRDLPAEDSRGRCJGGDAPTEDDYWGGYGGEDQRGEQMCPGAACQAPPDSRGPALSAGLPSPIXCLLLLVPHHL小鼠NgR2多肽顯示為下文的SEQIDNO:61。全長小鼠NgR2(SEQIDNO:61):MLPGLRRLLQGPASACLLLTLLALPSVTPSCPMLCTCYSSPPTVSCQANNFSSVPLSLPPSTQRLFLQNNLIRSLRPGTFGPNLLTLWLFSNNLSTffiDPGTFRHLQALEELDLGDNRHLRSLEPDTFQGLERLQSLHLYRCQLSSLPGNIFRGLVSLQYLYLQENSLLHLQDDLFADLANLSHLFLHGNRLRLLTEHVFRGLGSLDRIXLHGNTRLQGVHRAAFHGLSRLTILYLFNNSLASLPGEALADLPALEFLRJLNANPWACDCRARPLWAWFQRARVSSSDVTCATPPERQGRDLRALRDSDFQACPPPTPTRPGSRARGNSSSNHLYGVAEAGAPPADPSTLYRDLPAEDSRGRQGGDAPTEDDYWGGYGGEDQRGEQTCPGAACQAPADSRGPALSAGLRTPIX(XLPLALHHL人NgR3多肽顯示為下文的SEQIDNO:62。全長人NgR3(SEQIDNO:62):mlrkgccvelllxlvaaelplgggcprdcvcypapmtvscqahnfaaipegipvdservflqnnrigllqpghfspamvtlwtysnnityihpstfegfvhleeldlgdnrqlrtlapetfqglvklhalylykcglsalpagvfgglhslqylylqdnh正ylqddifvdlvnlshlflhgnklwslgpgtfrglvnldrlllhenqlqwvhhkafhdlrrlttlflfnns^selqgeclaplgaleflrlngnpwdcgcrarslwewlqrfrgsssavpcvspglrhgqdlkllraedfrnctgpasphqdcshtltttdraarkehhsphgptrskghphgprpghrkpgknctnpr:nrnqiskagagkqapelpdyapdyqhkfsfdimptarpkrkgkcarrtpirapsgvqqassasslgasllawtlglavtlr小鼠NgR3多肽顯示為下文的SEQIDNO:63。全長小鼠NgR3(SEQIDNO:63):MLRKGCCVELLLLLLAGELPLGGGCPRDCVCYPAPMTVSCQAHNFAAIPEGIPEDSERIFLQNNRTTFLQQGHFSPAMVTLWIYSNNITFIAPNTFEGFVHLEELDLGDNRQLRTLAPETFQGLVKLHALYLYKCGLSALPAGIFGGLHSLQYLYLQDNHIEYLQDDIFVDLVNLSHLFLHGNKLWSLGQGIFRGLVNLDRLLLHENQLQWVHHKAFHDLHRLTTLFLFNNSUTELQGDCLAPJLVALEFLRLNGNAWDCGCRARSLWEWLRRFRGSSSAVPCATPELRQGQDLKIXRVEDFRNCTGPVSPHQIKSHTLTTSDRAARKE皿PSHGASRDKGHPHGHPPGSRSGYTCKAGKNCTSHRNRNQISKVSSGKELTELQDYAPDYQHKFSFDMPTARPKRKGKCARRTPIRAPSGVQQASSGTALGAPLLAWILGLAVTLR在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酉^^4灸外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸a-305，(b)SEQIDNO:49的氨基酸l-b，以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸a-b,其中a為由1至27的任意整數(shù)，而b是由264至309的任意整數(shù)；并且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列選自如下組合(a)SEQIDNO:60的氨基酸c-332，(b)SEQIDNO:60的氨基酸275-d,以及(c)SEQIDNO:60的氨基酸c-d,其中c為由265至306的任意整凄史，而d是由308至340的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽抑制nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基S吏^^換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基酸1-274，且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列為SEQIDNO:60的氨基酸275-311;并且其中所述的多肽抑制nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酸^,^:外與第一參考氨基g吏序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基酸1-274,且其中所述的第二多月太片4殳包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基S吏序列為SEQIDNO:60的氨基酸275-332;并且其中所述的多肽抑制nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酸4#-換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基酸1-305,且其中所述的第二多肽片4殳包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列為SEQIDNO:60的氨基酸306-311;并且其中所述的多肽抑制nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基l臾^^換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基酸1-305，且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列為SEQIDNO:60的氨基酸306-309;并且其中所述的多肽抑制nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在另一實施方式中，至少一個附加氨基酸^皮添加至該第二多肽片l殳的C-末端。可被添加至該多肽的示范性氨基酸包括具有石咸性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，無極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，P-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)的氨基酸。在一種實施方式中，該添加的氨基酸為色氨酸。在附加的實施方式中，在SEQIDNO:49的269位的4青氨酸一皮色氨酸替換。在一個實施方式中本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段除了不超過一個，兩個，三個，四個，十個，或二十個單獨氨基酸^#4灸外由SEQIDNO:49的氨基酸l-310組成；且其中所述的第二多肽片孚史除了不超過超過一個，兩個，三個，四個，或五個單獨氨基酸替換外由SEQIDNO:60的氨基酸311-318組成；并且；其中所述的多肽抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，本發(fā)明的多肽進(jìn)一步包含外源多肽。在部分實施方式中，該外源多肽為免疫J求蛋白恒定區(qū)。在部分實施方式中，該免疫球蛋白恒定區(qū)為重鏈恒定區(qū)。在部分實施方式中，該外源多肽為Fc片l殳。在部分實施方式中，該Fc蜂皮連4妻至本發(fā)明多肽的C-末端。在部分實施方式中，該融合物為二聚物。本發(fā)明進(jìn)一步包括了上述多肽片段的變體，類似物，或衍生物。作為融合蛋白的替代，選定的外源部分可預(yù)先制備并化學(xué)結(jié)合至本發(fā)明的NgR多肽部分。在多數(shù)情況下，選定的外源部分不管是否融合或結(jié)合至NgR多肽部分時均具有類似的功能。因此，在下列對外源氨基酸序列的討論中，除非另行指明，應(yīng)當(dāng)理解該外源序列可作為融合蛋白或化學(xué)結(jié)合物的形式與NgR多肽部分結(jié)合。此處纟皮露的治療方法采用的NgRl適體和抗體及其片段還可在N-或C-末端重組融合至外源多肽或化學(xué)結(jié)合(包括共價或非共1"介結(jié)合)至多月太或其它組合物。例30,NgRl4*#元劑適體和抗體及其片段可重組融合或結(jié)合至可用于4企測測定標(biāo)記的分子或外源多肽，藥物，放射性核素，或毒素等效應(yīng)分子。例如，參見PCT/>布WO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;美國專利5,314,995和EP396,387。此處4皮露的治療方法采用的NgRl拮抗劑多肽，適體和抗體及其片孚爻包括^務(wù)飾后的書亍生物，即，通過向該抗體共《介連4妻任何類型的分子，且該種共價連接不阻止該NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體抑制NgRl的生物功能。例如，但非限制，本發(fā)明的NgRl拮抗劑多肽，適體和抗體及其片革殳可通過糖基化，乙?；?，聚乙二醇化，磷?；?，磷酸化，酰胺化，通過已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)進(jìn)行衍生化，蛋白水解裂解，與細(xì)胞配體或其它蛋白連接等方法進(jìn)行^修飾。各種化學(xué)修飾中的任意一種均可通過已知技術(shù)實現(xiàn)，包括，但不限于特異性化學(xué)裂解，乙?；瑫貂；旅顾卮鷌射合成等。此外，該衍生物可能包含一個或多個非傳統(tǒng)氨基酸。此處才皮露的治療方法采用的NgRl拮抗劑多肽，適體和抗體及其片段可由通過肽一睫或修飾肽4建(即，肽等排物)彼此連接的氨基酸所組成，并可包含20個基因編碼氨基酸以外的氨基酸。NgRl拮抗劑多肽，適體和^t體及其片,殳可通過翻i奪后作用等自然作用，或通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾。該修飾在基本文本和更具體的專著，以及大量的研究文獻(xiàn)中得到了具體的描述。NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片段的任何部位均可進(jìn)行修飾，包括肽骨架，氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基終端，或在糖等部分上。應(yīng)當(dāng)可以理解在給定NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片段的多個位點可出現(xiàn)相同或不同程度的相同類型的修飾。此外，一種給定NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片,殳可包含多種類型的》務(wù)飾。NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片l爻可因為泛素化等原因而帶有分支，它們也可呈帶或不帶分支的環(huán)狀。環(huán)狀，分支和帶分支的環(huán)狀NgRl拮抗劑多肽，適體和抗體或其片段可通過翻i奪后自然作用或合成方法形成。修飾包括乙?；；?，ADP-核糖基化，酰胺化，黃素的共價結(jié)合，亞鐵血紅素部分的共價結(jié)合，核香酸或核香酸衍生物的共價結(jié)合，脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價結(jié)合，磷脂酰肌醇的共價結(jié)合，交聯(lián)，環(huán)化，形成二硫鍵，脫曱基，共價交聯(lián)的形成，半胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，曱?；?，羧化，糖基化，GPI錨形成，羥基化，碘處理，曱基化，豆蔻?；?，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解作用，磷酸化，異戊烯化，外消旋，硒化，碌u酸鹽化，如^青胺酰化等經(jīng)轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)向蛋白添加氨基酸，泛素化。(例如，參見尸ra/^/似-5VrM"wrej"6/Mo/ecw/ar尸ropeWes，T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork2ndEd.,(1993》/^"nms/aZ/owa/Covo/ew/A/o(ii/c加'o"7Voto'm1，B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,NewYork,pgs1-12(1983);Seifter等人.，Mef/z，o/182:626-646(1990);Rattan等人.，A^TJem/663:48-62(1992))。該NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片,殳融合的外源多肽為具有治療劑用途并可用于耙向該NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片段。NgRl拮抗劑融合蛋白，適體和抗體或其片段可用于實現(xiàn)多種目的，例如，提高血清半衰期，改善生物相容性，體內(nèi)草巴向特定器官或組織類型，提高重組表達(dá)效率，提高宿主細(xì)胞分泌，簡化純化，以及獲得更高的親和性。根據(jù)待實現(xiàn)的目標(biāo)不同，該外源部分可呈惰性或具有生物活性。另外，它可選擇穩(wěn)定融合至NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片段或者在體外或體內(nèi)裂解。實現(xiàn)這些目標(biāo)的外源性部分已為本領(lǐng)域所知。作為NgRl拮抗劑融合多肽，適體或抗體或其片段表達(dá)抗體。在多數(shù)情況下，選定的外源部分在融合或未結(jié)合NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片段時均具有類似的功能。因此，在下列對外源氨基酸序列的討論中，除非另行指明，應(yīng)當(dāng)理解該外源序列可作為融合蛋白或化學(xué)結(jié)合物的形式與NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片段結(jié)合。具有藥理活性的多肽如NgRl拮抗劑多肽，適體或抗體或其片段通常在體內(nèi)顯示出快速的清除，從而需要大劑量以在體內(nèi)實現(xiàn)治療有效濃度。此外，小于約60KDa的多肽有可能被腎小球濾過，這有時可導(dǎo)致腎毒性?？赏ㄟ^融合或結(jié)合相對小的多肽如NgR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的多肽片段以減少或避免該種腎毒性的風(fēng)險。已知有多種外源性氨基酸序列(即，多肽部分或載體摂)可提高治療性多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性(即，血清半衰期)。范例包括血清白蛋白，例如，牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)?；救L人血清白蛋白(HSA)或HSA片,殳由于其半衰期長，體內(nèi)分布廣，且不具有酶或免疫功能而常一皮用作外源部分。通過采用如Yeh等人，尸roc.7VW/.爿c^/.Sc/.C7&4，59:1904-08(1992)和Syed等人，59:3243-52(1997)所啟示的方法和材#+，HAS可用于形成通過NgR多肽部分而顯示藥理活性并能顯示明顯^是高的體內(nèi)穩(wěn)定性(例如，高10倍或100倍)的融合蛋白或多肽結(jié)合物。HSA的C-末端可一皮融合至NgR多肽部分的N-末端。由于HSA是一種天然分泌的蛋白，可開發(fā)HSA信號序列以當(dāng)融合蛋白在真核(例如，哺乳動物)表達(dá)系統(tǒng)生成時將融合蛋白分泌進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)基。在4爭定的實施方式中，本發(fā)明的方法中采用的NgRl拮抗劑多肽，適體，抗體及其抗體片段進(jìn)一步包含耙向部分。靶向部分包括引導(dǎo)定位至身體特定部位(如腦部或其分區(qū))的肽。在特定的實施方式中，本發(fā)明的方法中采用的NgRl拮抗劑多肽，適體，抗體及其抗體片段與腦靶向部分結(jié)合或融合。該腦部耙向部分被共價連接(例如，引導(dǎo)，翻譯融合，或者直接或通過可選4奪性裂解的間隔分子進(jìn)行化學(xué)連4妄)或非共^介連4妄(例如，通過抗生物素蛋白生物素:蛋白A:IgG等進(jìn)行可逆相互作用)。在特定的實施方式中，本發(fā)明的方法中采用的NgRl拮抗劑多肽，適體，抗體及其抗體片l殳與另一腦部輩巴向部分結(jié)合。在附加的實施方式中，該腦部輩巴向部分與多個本發(fā)明的方法中采用的NgRl拮抗劑多肽，適體，抗體及其抗體片段相結(jié)合。與NgRl拮抗劑多肽，適體，抗體或其抗體片段連接的腦部靶向部分增強(qiáng)了該NgRl拮抗劑多肽，適體，抗體或其抗體片段的腦部傳遞。據(jù)描述多種多肽在融合至蛋白或治療劑時可將該蛋白或治療劑傳遞通過血腦屏障(BBB)。非限制范例包括單域抗體FC5(Abulrob等人.(2005)J.A^wrac/zem.95，1201-1214);mAB83-14,—種4十對人月夷島素受體的單克隆抗體(Pardridge等人.(1995)P/2^7waco/.i仏12,807-816);結(jié)合至人4失傳遞蛋白受體(hTfR)的B2,B6和B8月太(Xia等人.(2000)J.Virol.74,11359-11366);結(jié)合至人4失傳遞蛋白受體的OX26單克隆抗體(Pardridge等人.(1991)/尸/z"r應(yīng)co/.￡平77zer.259，66-70);白喉毒素結(jié)合物(例如，參見Gaillard等人.，InternationalCongressSeries7277:185-198(2005);以及美國專利6,306,365的SEQIDNOs:1-18。上述參考文獻(xiàn)的全文在此引用作為參考。NgRl組合物增強(qiáng)的腦部傳遞可通過本領(lǐng)域所建立的多種方法進(jìn)4于測定。例如，向動物施用連4妻至腦部革巴向部分的一種》文射標(biāo)記的NgRl拮抗劑多肽，適體，抗體或其抗體片革殳；枱r測腦部定位；與未連接腦部靶向部分的同等力文射性標(biāo)記的NgRl拮抗劑多肽，適體，抗體或其抗體片段比較定位。其它檢測增強(qiáng)耙向的方法參見上述參考文獻(xiàn)。本發(fā)明的部分實施方式將NgR多肽部分融合至4交《連區(qū)和Fc區(qū)，即，Ig重《連恒定區(qū)的C末端部分。在部分實施方式中，鉸鏈區(qū)的氨基酸可以不同的氨基酸替換。參照這些方式進(jìn)行的鉸鏈區(qū)示范性氨基酸替換包括以不同的氨基酸替換4交鏈區(qū)中的單獨半胱氨酸殘基。任意不同的氨基酸均可替換鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸。用于本發(fā)明的多肽和參考氨基酸序列的氨基酸替換的氨基酸包括具有石威性側(cè)4連(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，無極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，P-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)的氨基酸。在參考氨基酸中替換半胱氨酸的典型氨基酸包括丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，特別是絲氨酸和丙氨酸。通過工程改造編碼該多肽片l殳的多聚核苷酸來進(jìn)^f亍該種^^換術(shù)語本領(lǐng)域普通寺支術(shù)人員常*見的專業(yè)知識。NgR-多肽-Fc融合的潛在優(yōu)點包括可溶性，體內(nèi)穩(wěn)定性，以及多《介性，例如，二聚化。所采用的Fc區(qū)可以是IgA,IgD或IgGFc區(qū)(4交鏈-CH2-CH3)。^齊^性地，它可以是IgE或IgMFc區(qū)(鉸鏈-CH2-CH3-CH4)。通?？刹捎肐gGFc區(qū)，例如，IgG!Fc區(qū)或IgG4Fc區(qū)。構(gòu)建和表達(dá)編碼Fc融合物的DNA的材并+和方法已為本領(lǐng)域所知，并可不經(jīng)其它試驗進(jìn)行采用以獲得融合物。本發(fā)明的一些實施方式采用如Capon等人的美國專利5,428,130和5,565,335所述的融合蛋白。該信號序列為編碼啟動蛋白跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的運輸?shù)陌被嵝蛄械亩嗑酆似账??？捎糜跇?gòu)建免疫融合素的信號序列包括抗體豐圣《連^f言號序歹ij,侈寸^口4元體14.18(Gillies等人"/m柳w"o/.125:191-202(1989))，抗體重鏈信號序列，例如MOPC141抗體重《連4言號序歹'J(Sakano等人.，7Va^"286:5774(1980))。4K&寸生的，也可采用其它4言號序列。例如，參見Watson,NuchAcidsRes.12:5145(1984)。該信號肽通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中被信號肽酶裂解。由此可獲得含F(xiàn)c區(qū)和NgR多肽部分的免疫融合素蛋白分泌物。在一些實施方式中，該DNA序列可在分泌表達(dá)單元和NgR多肽部分之間編碼蛋白水解裂解位點。該裂解位點可提供，例如編碼融合蛋白的蛋白水解裂解，從而將Fc區(qū)從目標(biāo)蛋白中分離。有用的蛋白水解裂解位點包括包括被胰蛋白酶，血漿酶，凝血酶，Xa因子或是腸激酶K等蛋白水解酶識別的氨基酸序列。該分泌表達(dá)單元可被整合進(jìn)入可復(fù)制表達(dá)載體。有用的載體包括線性核酸，質(zhì)粒，噬菌粒，粘粒等。示范性的表達(dá)載體為pdC,其中免疫融合素DNA的轉(zhuǎn)錄受人細(xì)胞巨化病毒增強(qiáng)子和啟動子的控制。例如，參見Lo等人.，5/op/2w.爿"a1088:112(1991);以及Lo等人，尸ra^/"五"g/"eeWrtg11:495-500(1998)。可通過編碼本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片,史的DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞并用于多肽的表達(dá)和分泌。通常采用的宿主細(xì)胞包括永生雜交瘤細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，293纟田月包，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，以及COS細(xì)胞。完整的野生型Fc區(qū)顯示了通常不必要且在本發(fā)明的方法釆用的Fc融合蛋白所不需要的效應(yīng)功能。因此，通常在該分泌表達(dá)單元構(gòu)建過程中從Fc區(qū)刪除特定的結(jié)合位點。例如，由于不需要與輕鏈共表達(dá)，可從IgE的Fc區(qū)的CH2區(qū)中刪除重鏈結(jié)合蛋白的纟吉合^f立點Bip(Hendershot等人，7w附mwo/.7bt/qy5:111-14(1987)),從而使該位點不干擾免疫融合素的有效分泌?？缒^(qū)序列(例如存在于IgM的該序列)也通常被刪除。IgGlFc區(qū)最為常用。^齊^C性i也，免疫J求蛋白gamma的其它小類(gamma-2,gamma-3以及gamma-4)的Fc區(qū)可用于分;必表達(dá)單元。免疫j求蛋白gamma國l的IgGlFc區(qū)通常用于分泌表達(dá)單元并包括至少部分4交《連區(qū)，CH2區(qū)以及Ch3區(qū)。在一些實施方式中，免疫5求蛋白gamma-l的IgGiFc區(qū)為Ch2-在臭失-Fc，其包4舌部分的4交鏈區(qū)和CH3區(qū)，但不包括Ch2區(qū)。對Ch2-缺失-Fc的描述可參見Gillies等人.Hum.Antibod.Hybridomas1:47(1990)。在一些實施方式中采用了IgA,IgD，IgE或IgM之一的Fc區(qū)。NgR-多肽-部分-Fc融合蛋白可構(gòu)建為多種不同的構(gòu)型。在一種構(gòu)型中NgR多肽部分的C末端一皮直接融合至Fc4交鏈部分的N末端。在一個略孩i不同的構(gòu)型中，在融合物中NgR多肽部分的N末端和Fc部分的C末端之間整合了短多肽如2-10個氨基酸。在一辜代性的構(gòu)型中，該短多肽整合在融合物中NgR多肽部分的C末端和Fc部分的N末端之間。該構(gòu)型的示范性實施例為NgR1(310)-2XG4S-Fc,其中SEQIDNO:49的氨基酸26-310一皮連接至與Fc連接的(Gly畫Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQIDNO:66)。該種4妻頭4是供了構(gòu)型靈活性，從而在某些情況下可提高生物活性。如果Fc部分保留了充分的鉸鏈區(qū)部分，NgR-多肽-部分-Fc融合物將二聚化，從而形成二價分子。單體Fc融合物的均一群將帶來單特異性，二價二聚體。兩種具有不同特異性的單體Fc融合物的混合物將帶來雙特異性，二價二聚體。多種包含相應(yīng)氨基反應(yīng)性基團(tuán)和硫醇反應(yīng)性基團(tuán)的交聯(lián)接頭中的任意一種均可用于連4妻本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段和血清白蛋白。適用接頭的范例包括插入石危醇反應(yīng)性馬來酰亞胺(例^口，SMCC,AMAS,BMPS,MBS,EMCS，SMPB,SMPH,KMUS以及GMBS)的胺反應(yīng)性交聯(lián)接頭其它使用的接頭插入碌u醇反應(yīng)性卣乙酸基團(tuán)，例如，SBAP,SIA，SIAB?？蓪εc巰基基團(tuán)的反應(yīng)提供保護(hù)或非保護(hù)硫醇的以生成可還原4建的接頭包括SPDP,SMPT,SATA以及SATP。該種試劑可/人市場上購得(例如PierceChemicalCompany,Rockford，IL)。結(jié)合物不一定需要包含本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段的N末端或血清白蛋白的石克醇部分。例如，NgR-多肽-白蛋白融合物可通過遺傳工程技術(shù)獲得，其中NgR多肽部分被融合至血清白蛋白的N末端，C末端，或同時融合至兩個末端。本發(fā)明的NgR多肽可一皮融合至多肽標(biāo)記。此處所用的術(shù)語"多肽標(biāo)記，，指任何能夠附著，結(jié)合或連接至NgR多肽并可用于鑒定，純化，濃縮或分離該NgR多肽的任意氨基酸序列。多肽標(biāo)記可通過，例如，構(gòu)建包含(a)編碼多肽標(biāo)記的核S吏序列，以及(b)編碼NgR多肽的核酸序列的核酸分子附著至NgR多肽。示范性多肽標(biāo)記包括，例如，能進(jìn)行翻譯后修飾的氨基酸序列，例如，生物素化的氨基酸序列。其它的示范性多肽標(biāo)記包括，例如，能夠一皮抗體(或其片段)或其它特異性結(jié)合試劑識別和/或結(jié)合的氨基酸序列。能夠被抗體(或其片段)或其它特異性結(jié)合試劑識別的多肽標(biāo)記包括，例如，本領(lǐng)域已知的"表位標(biāo)記"。表^f立標(biāo)記可以是天然的或是人工的表^f立才示i己。天然和人工的表4立才示i己已為本4貞i或所4口，包4舌，例^口，F(xiàn)LAG,Strep或聚組氨酸肽等人工表位。FLAG肽包括序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQIDNO:74)或Asp-Tyr—Lys—Asp畫Glu畫Asp-Asp-Lys(SEQIDNO:75)(Einhauor,A.禾口Jungbauer,A.,/^/op/y^s1,MeZ/2o<is49:1-3:455-465(2001))。Strep表^f立具有序列Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe國Gly畫Gly(SEQIDNO:76)。也可采用VSV-G表位，其具有序列Tyr-Thr-Asp-He畫Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys(SEQIDNO:77)。另一人工表位為聚-His序列，其具有六個組氨酸殘基(His-His-His-His-His-His(SEQIDNO:78)。天然存在的表位包凌舌^皮單克隆抗體12CA5識別的流感病毒血凝素(HA)序歹'JTyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-He-Glu陽Gly陽Arg(SEQIDNO:79)(Murmy等人，S/oc/z昆229:170-179(1995))以及被單克隆抗體9E10識別的來自人c-myc(Myc)的十一個氨基酸序列(Glu-Gin-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn(SEQIDNO:80)(Manstein等人，162:129-134(1995))。另一有用的表位為一皮單克隆抗體YL1/2識別的三肽Glu-Glu-Phe(Stammers等人.Z^".255:298-302(1991))。在特定的實施方式中，該NgR多肽和該多肽標(biāo)記可通過連接氨基酸序列相結(jié)合。此處所用的"連接氨基酸序列"可以是能夠凈皮一種或多種蛋白酶識別和/或裂解的氨基酸序列。能夠被一種或多種蛋白酶識別和/或裂解的氨基酸序列已為本領(lǐng)域所知。示范性的氨基酸序列為被以下蛋白酶識別的氨基酸序列VIIa因子，IXa因子，Xa因子，APC,t-PA,u-PA,月夷蛋白酶，糜蛋白酶，腸激酶，胃蛋白酶，組織蛋白酶B,H，L，S，D,組織蛋白酶G，高血壓蛋白原酶，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，基質(zhì)金屬蛋白酶(膠原酶，間質(zhì)溶解素，明膠酶)，巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶，Cir以及Cis?？杀磺笆龅鞍酌缸R別的氨基酸序列已為本領(lǐng)域所知?？杀惶囟缸R別的示范性序列可參見美國專利5,811,252。多肽標(biāo)記可促進(jìn)通過商用色譜介質(zhì)進(jìn)行的純化。在本發(fā)明的一些實施方式中，NgR多肽融合物構(gòu)建體可用于增強(qiáng)NgR多肽部分在細(xì)菌中的生成。在該構(gòu)建體中，在本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段的N末端融合伙伴上通常采用高水平表達(dá)和/或分泌的細(xì)菌蛋白。例如，參見Smith等人，67:31(1988);Hopp等人，所o&c/zwo/ogy6:1204(1988);LaVallie等人，飾&c/wo/，77:187(1993)。通過在適當(dāng)?shù)娜诤匣锇榈陌被汪然┒巳诤螻gR多肽部分可得到本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段的雙價或四價形式。例如，可將NgR多肽部分融合至Ig部分的氨基和羧基末端以生成含有兩個NgR多肽部分的二《介單體多肽。在這些單體的二聚化后，可通過Ig部分獲得NgR多肽蛋白的四《介形式。該種多^介形式可用于提高對目標(biāo)的結(jié)合親和性。本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段的多1介形式還可通過串耳關(guān)NgR多肽部分形成串耳關(guān)體(可單獨采用或融合至Ig或HAS等融合伙伴)獲得。結(jié)合的聚合體(多肽除外)本發(fā)明的部分實施方式涉及本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段，其中一種或多種聚合體被結(jié)合(共價連接)至NgR多肽。適用于該種結(jié)合物的聚合體的范例包括多肽(已在上文討-淪)，糖聚合體以及聚烷撐二醇鏈。通常，但不盡然，可通過將聚合物結(jié)合至本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段以改善下列一種或多種性質(zhì)可溶性，穩(wěn)定性，或生物相容性。聚烷撐二醇為常用于結(jié)合至本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段的聚合物類型。最為常用的是聚乙二醇(PEG)?？蓪EG部分(例如，1,2,3，4或5PEG聚合物)結(jié)合至各NgR多月太，乂人而相對單獨的NgR多肽才是高血清半衰期。PEG部分無抗原性，且;支。。"與NgR多肽結(jié)合的PEG部分的凄史量以及單獨PEG的分子量不盡相同?？傮w而言，聚合物的分子量越高，與多肽結(jié)合的聚合物鏈越少。與NgR多肽或多肽片段結(jié)合的總聚合體量通常介于20kDa至40kDa。因此，當(dāng)一個聚合體《連^皮結(jié)合時，該《連的分子量通常為20-40kDa。如果結(jié)合了兩條鏈時，各鏈的分子量通常為10-20kDa。如果結(jié)合了三條鏈，該分子量通常為7-14kDa。如PEG等聚合體可通過多肽上的任何適用的，暴露的反應(yīng)性基團(tuán)連接至NgR多肽。該種暴露的反應(yīng)性基團(tuán)可以是，例如，內(nèi)部賴氨酸殘基的N末端氨基基團(tuán)或epsilon氨基基團(tuán)中的一種或兩種?；罨木酆象w可與NgR多肽上任何自由氨基基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)和共價連接。NgR多肽(如有)的自由羧基基團(tuán)，適當(dāng)活化的羰基基團(tuán)，羥基，胍基，咪唑，氧化糖部分以及巰基基團(tuán)也可用作聚合體結(jié)合的反應(yīng)基團(tuán)。根據(jù)多肽濃度的不同，在結(jié)合反應(yīng)中每摩爾的多肽通?？刹捎眉s1.0至約IO摩爾活化聚合體。該比例的選擇通常代表了在最大化反應(yīng)的同時最小化能損害該NgR多肽部分目標(biāo)藥理活性的副反應(yīng)(通常為非特異性的)之間的平衡優(yōu)選地，至少保留NgR多肽50%的生物活性(例如，在本領(lǐng)域已知或本文所述的任意測定所證實)，最優(yōu)選保留4妻近100%的活性。該聚合體可通過常^M匕學(xué)方法結(jié)合至NgR多肽。例如，聚烷撐二醇部分可被偶合至NgR多肽的賴氨酸epsilon氨基基團(tuán)?？赏ㄟ^如PEG琥珀酰亞胺丁二酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA-PEG)等N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化酯與賴氨酸側(cè)鏈進(jìn)行連接。適用的聚烷撐二醇部分包括，例如，羧曱基-NHS和正亮氨酸-NHS,SC。這些試劑可/人市場上購得。其它的胺-反應(yīng)性PEG接頭可用于替代琥珀酰亞胺部分。其中包括，例如，異石克氰S吏，硝基苯基碳酸鹽(PNP),環(huán)氧化物，苯三哇碳酸鹽，SC-PEG，磺酸酯，醛，環(huán)氧化物，羰基咪唑以及碳酸PNP。通?？蓪l件進(jìn)行優(yōu)化以最大化反應(yīng)的選擇性和程度。該種反應(yīng)條件的優(yōu)化屬于本領(lǐng)域的普通技術(shù)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何聚乙二醇化反應(yīng)進(jìn)行聚乙二酉孚4匕。例^口，參見，F(xiàn)ocwsowGVowAFactor3:4-10(1992),以及S欠洲專利申i青EPO154316#口EP0401384?？赏ㄟ^與反應(yīng)'l"生聚乙二醇分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合體)的酰化反應(yīng)或烷化反應(yīng)進(jìn)-f亍聚乙二醇化。通過酰化進(jìn)行的聚乙二醇化通常包括與聚乙二醇的活性酯衍生物進(jìn)行反應(yīng)。任何反應(yīng)性PEG分子均可用于進(jìn)行聚乙二醇化。PEG酯化的N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)是一種常用的活化PEG酯。此處所用的"?；?包括但不限于下列治療性蛋白和水溶性聚合體(如PEG)之間的連接類型酰胺，氨基曱酸酯，聚氨酯等。例如，參見腸函乂，teC/2匿5:133-140，1994?？蓪Ψ磻?yīng)參數(shù)進(jìn)行一般選擇以避免損傷或滅活NgR多肽的溫度，溶劑以及pH條件。—4殳而言，該連接4建為酰胺，且通常至少95%的所得產(chǎn)物一皮單-,雙-或三-聚乙二醇化。然而還可形成具有更高聚乙二醇化程度的種類，其數(shù)量取決于所采用的特異性反應(yīng)條件。純化的聚乙二醇化種類可才采用常規(guī)的純化方法(例如，透析，鹽析，超濾，離子交換層析，凝膠過濾層析，疏水交換層析以及電泳)選擇性地從混合物(特別是未反應(yīng)的種類)中分離。通過酰化進(jìn)行的聚乙二醇化通常包括在還原劑存在下PEG的末端醛書f生物與本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片革殳的反應(yīng)。此外，人們可對反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)節(jié)使得實際上僅在NgR多肽的N末端氨基基團(tuán)進(jìn)行聚乙二醇化，即，得到單-聚乙二醇化蛋白。對于單-聚乙二醇化或多-聚乙二醇化，PEG組通常通過-CH2-NH-基團(tuán)與蛋白結(jié)合。特別對于-CH2-基團(tuán)，該種類型的鍵被稱為"烷"鍵。聚乙二醇化產(chǎn)物可利用可供衍生化的不同類型伯胺基基團(tuán)(N末端賴氨酸)的不同反應(yīng)性。該反應(yīng)可在特定pH下進(jìn)行，該pH可允許人們利用賴氨酸殘基的epsilon-氨基基團(tuán)和蛋白的N末端氨基基團(tuán)之間的pKa差異。通過該種選擇性衍生化可控制包含反應(yīng)性基團(tuán)(例如，醛)的水溶性聚合體與蛋白的結(jié)合與聚合體的結(jié)合主要發(fā)生在蛋白的N末端，且未發(fā)生對其它反應(yīng)性基團(tuán)(例如，賴氨酸側(cè)鏈氨基基團(tuán))的明顯修飾。該用于?；屯榛^程的聚合體分子可選自水溶性聚合體。所選的聚合體通?？山?jīng)過修飾以具有單獨的反應(yīng)性基團(tuán)(例如用于酰化的活性酯或用于烷化的醛)，從而可如同本方法一樣控制聚合程度。PEG醛的范例之一為水中穩(wěn)定的聚乙二醇丙醛，或單Cl-C10烷氧基或其烷氧基衍生物(例如，參見Harris等人.,美國專利5,252,714)。該聚合體可帶有或不帶有分支。對于酰化反應(yīng)，所選的聚合體通常具有單獨反應(yīng)性酯基團(tuán)。對于烷化反應(yīng)，所選的聚合體通常具有單獨反應(yīng)性醛基團(tuán)。一般而言，水溶性聚合體不會選自天然存在的糖基殘基，因為它們更方便由哺乳動物重組表達(dá)系統(tǒng)生成。制備聚乙二醇化本發(fā)明的NgR多肽的方法通常包括下列步驟:(a)將本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段與聚乙二醇(例如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物)反應(yīng),在該反應(yīng)條件下該分子可與一個或多個PEG基團(tuán)連接，以及(b)獲取反應(yīng)產(chǎn)物。一般而言，酰化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件將根據(jù)已知參數(shù)和目標(biāo)結(jié)果進(jìn)行個別確定。例如，PEG與蛋白的比例越大通?？缮筛蟊壤木?聚乙二醇化產(chǎn)物。通過還原性烷化生成充分均勻的單-聚合體/NgR多肽通常包括以下步驟(a)將本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片段與反應(yīng)性PEG分子在還原性烷化條件下反應(yīng)，反應(yīng)pH適于對NgR的N-末端氨基基團(tuán)進(jìn)行選擇性修飾；以及(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。對于充分均勻的單-聚合體/NgR多肽，還原性烷化反應(yīng)條件為允許水溶性聚合體部分與本發(fā)明的NgRl多肽或多肽片^殳的N末端選擇性結(jié)合的條件。該反應(yīng)條件通常提供了賴氨酸側(cè)鏈氨基基團(tuán)和N-末端氨基基團(tuán)之間的pKa差異。為達(dá)成本發(fā)明的目的，該pH通常在3-9的范圍內(nèi)，典型在3-6的范圍內(nèi)。本發(fā)明的NgRl多肽可包括標(biāo)簽，例如，可通過蛋白水解充分考奪;改的部分。因此，該賴氨酸部分可進(jìn)4亍如下選4奪性^修飾首先與以低分子量接頭(例如可同時與賴氨酸和N末端反應(yīng)的Trauti式劑(PierceChemicalCompany,Rockford，IL))j'l^牟的His-tag反應(yīng)，然后釋放該His-tag。然后該多肽將包含可用含硫醇-反應(yīng)性頭基(例如馬來酰亞胺基團(tuán)，乙》希石風(fēng)基團(tuán)，卣乙酉吏基團(tuán)，或者自由或^f呆護(hù)SH)的PEG選4奪性修飾的自由SH基團(tuán)。Traut試劑可通過能建立PEG連4妻特定位點的任何4妄頭進(jìn)^f亍^,4戈。例如，Traut試劑可用SPDP,SMPT,SATA或SATP(PierceChemicalCompany,Rockford,IL)進(jìn)4亍替i^。類4以；也，可^1奪蛋白與插入馬來酰亞胺(例如，SMCC,AMAS,BMPS,MBS,EMCS,SMPB，SMPH,KMUS或GMBS),卣乙酸(SBAP，SIA,SIAB),或乙烯砜基團(tuán)的胺-反應(yīng)性接頭反應(yīng)，并將所得的產(chǎn)物與包含自由SH的PEG反應(yīng)。在一些實施方式中，該聚烷撐二醇部分^皮偶合至NgR多肽的半胱氨酸基團(tuán)。可通過如馬來酰亞胺基團(tuán)，乙烯石風(fēng)基團(tuán)，卣乙酸基團(tuán)或硫醇基團(tuán)等基團(tuán)形成該偶合。該NgR多肽可選才奪性地通過易分解的鍵與聚烷撐二醇部分結(jié)合。該易分解的4建可在如生化水解，蛋白水解或是琉基裂解中斷裂。例如，該^建可在體內(nèi)(生理)條件下蜂皮斷裂。的方法中發(fā)生，通常pH約為5-8，例如，當(dāng)反應(yīng)性基團(tuán)在N末端的alpha氨基基團(tuán)上時pH為5,6,7或8。通常該過程包括制備活化的聚合體，然而使蛋白與該活化聚合體反應(yīng)以生成適用于制劑的可溶性蛋白。在4爭定的實施方式中，本發(fā)明的NgR多月太為可溶'性多肽。使多肽可溶或提高多肽可溶性的方法已為本領(lǐng)域公知。本發(fā)明的核酸分子本發(fā)明-提供了編碼本發(fā)明多肽(包括SEQIDNOs:1-9,26-27,29-37和41-45中任意一個的多肽)的核酸。在部分實施方式中，該核酸編碼選自如SEQIDNOs:6和8所示Nogo受體-1的氨基酸殘基26-344或是如SEQIDNOs:8所示Nogo受體-1的氨基酸殘基27-344的多肽。在部分實施方式中，該核酸編石馬選自如SEQIDNOs:7和9所示Nogo受體-1的氨基酸殘基26-310或是如SEQIDNOs:9所示Nogo受體-1的氨基酸殘基27-310的多肽。此處所用的"核酸"指基因組DNA,cDNA,mRNA和反義分子，以及基于替代中，該核酸進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄啟動子并選才奪性包含信號序列，其分別可才喿作地連沖妻至編碼本發(fā)明多肽的核苦酸序列。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明Nogo受體-1融合蛋白核酸，其包括包含了選自如SEQIDNOs:6和8所示Nogo受體—1的氛基酉臾歹戔基26—344或是^口SEQIDNOs:8戶斤示Nogo受體_1的氨基酸殘基27-344以及如SEQIDNOs:7和9所示Nogo受體-1的氨基酸殘基26-310或是如SEQIDNOs:9所示Nogo受體-1的氨基酸殘基27-310的多肽的融合蛋白。在部分實施方式中，該核酸編碼包含選自SEQIDNOs:26-27,29-37和41-45的多肽的Nogo受體-1融合蛋白。在部分實施方式中，該核酸編碼進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄啟動子并選擇性包含信號序列的Nogo受體-1融合蛋白。在部分實施方式中，該核苷酸序列進(jìn)一步編碼免疫球蛋白恒定區(qū)。在部分實施方式中，該免疫^求蛋白恒定區(qū)為重《連恒定區(qū)。在部分實施方式中，該核苷酸序列進(jìn)一步編碼與4交《連區(qū)連4妄的免疫J求蛋白重《連恒定區(qū)。在部分實施方式中，該核酸進(jìn)一步編石馬Fc。在部分實施方式中，該Nogo受體-1融合蛋白包含F(xiàn)c片革殳。本發(fā)明的編碼核酸可進(jìn)一步修飾以包含用于診斷和探測目的的可觀'J標(biāo)i己。各種該類標(biāo)記已為本領(lǐng)域所知并可簡單用于此處所述的編碼分子。適用的標(biāo)記包4舌，^旦不限于，生物素，》文射標(biāo)記的核苷酸等。技術(shù)人員可采用任4可本領(lǐng)域已知的標(biāo)記來獲4尋帶標(biāo)記的編碼核酸分子。本發(fā)明還包括了在中度嚴(yán)格或高度嚴(yán)格條件下與非編碼《連，或編碼本發(fā)明任意一個多肽的多聚核苦酸的補體雜交的多聚核香酸。嚴(yán)格條件已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并可參見CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。人Nogo受體-1多肽多聚核香酸顯示為下文的SEQIDNO:81。全長人Nogo受體-1由SEQIDNO:81的核苷酸166至核香酸1587進(jìn)行編碼cggggagacgcgcccsacccgtgcctgcgtcagggcctgccttcctgcsccctgccgcaaattgatgcggcagcgataattgggccgcctggcccggggcggacaacgcgcgcgccttccccgcgtggcctgacactctactggccccccggtgtgtgacgcggctcctccgtg3cctcacaccggccctcgctggggctgtactggagccgtgccgccctcaatgactcccctcgccgggccgtctgggggctcaggtgggcgctggtgcaagagcgtgcgccgccaagcctccctgstgagccgggcggccgggccgtggcgcccgccctacgatgaactgtggctgcaggctgtgccggcaaccgcacctcaccatcctgccttc3Cgcacagctccac3cacgctgtgttccgcggctgcaggcaccctcttcctggtgggctgcacatgtgcacctctgtttgcctgcgtgcccttgccgggcscctccgaggtgt5CC3tCCC3tcccaagtgcctggaagaccggtgacagccaccctttgggggcccgagggaggccaggctccctacccagctgtggacagctcagcagccggacgcctgccgaaacgacgagggcgtccaggcctggcagagcccaqggcgtgggcatctctcgcatgtctgtggctgcggtctgtggacacctgga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。RNAi4支術(shù)已在眾多出片反物中4皮露，例如美國專利5,919,619，6,506,559以及PCT7>開W099/14346，WO01A70949,WO01/36646,WO00/63364,WO00/44895,WOO1〃5164，WO01/92513,WO01/68836以及WO01/29058。該RNAi可特別通過siRNA(短干護(hù)乙RNA)與特定mRNA(例如，NgRl)相互作用沉默目標(biāo)基因。然后可輩巴向該dsRNA復(fù)合物以通過細(xì)胞降解。其它的RNAi分子包括短發(fā)夾RNA(shRNA);以及短干擾發(fā)夾。shRNA分子包含了來自目標(biāo)基因并由環(huán)連4妄的正義和反義序列。該shRNA由細(xì)月包沖亥^皮運llr至細(xì)月包質(zhì)，并隨mRNA,皮降解。PolIII或U6啟動子可用于為RNAi表達(dá)RNAs。能夠通過RNA干擾抑制基因表達(dá)的序列可具有任意長度。例如，該序列可具有至少10,15,20，25，30，35,40，45，50,100或更多個連續(xù)的核苷酸。-f叚設(shè)該序列可形成功能性沉默復(fù)合物以降解目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄物，該序列可以是dsRNA或4壬何其它類型的多聚核苦酸。RNAi可通過對其"目標(biāo)"mRNAs具有序列特異性同源性的又又《連RNA(dsRNA)分子進(jìn)4亍介導(dǎo)(Caplen等人，尸racA^7y4cadSc/USAP5:9742-9747，2001)。對果蠅無細(xì)力包、溶解物的生化研究顯示RNA依賴性基因沉默的介導(dǎo)物為18-25核苷酸"小干擾"RNA復(fù)制物(siRNAs)。相應(yīng)i也，siRNA分子可方使J也在本發(fā)明的方法中采用。siRNAs可通過以成為Dicer的RNaseIII-相關(guān)的核酸酶降解更長的dsRNA分子進(jìn)4亍夕卜部制備。(Bernstein等人.，A^/m"409:363-366,2001)。siRNAs還可外部導(dǎo)入細(xì)胞，或通過表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。siRNAs形成后可與蛋白元件組裝形成^皮稱為RNA-i秀導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISCs)的含核并唐核酸內(nèi)切酶的復(fù)合物。ATP生成的siRNA解《連激活RISCs，后者因而通過Watson-Crick石威基配對輩巴向互補mRNA轉(zhuǎn)錄物。不希望受限于特定的理論，據(jù)認(rèn)為RISC^皮導(dǎo)向目標(biāo)mRNA,其中的siRNA雙《連體進(jìn)4亍序列特異性相互反應(yīng)以通過催4匕方式介導(dǎo)裂解(Bernstein等人，7Va&"409:363-366,2001;Boutla等人，O^rS/o/1:1776-1780,2001)。mRNA的裂解發(fā)生于siRNA《連結(jié)合區(qū)的中部附近。該種序列凈爭異'1"生mRNA降解導(dǎo)至丈了基因沉默。RNAi已被用于通過非限制性樣本神經(jīng)元等途徑(Krichevsky等人，P騰胸/Sc/USA99:11926-11929,2002)分析基因功能以及鑒定哺乳動物細(xì)胞中的必要基因(Elbashir等人，tW^/zoA26:199-213,2002;Harborth等人，JCe〃USA114:4557--4565,2001)。人們評<介了RNAi的治療形態(tài)，例如對病毒(包括「4旦不限于脊fl灰質(zhì)炎病毒(GMin等人，ATa^re418:379-380,2002)和HIV(Capodici等人，J/mww"o/169:5196--5201，2002))的感染，復(fù)制和/或生長的抑制和阻斷，以及減少致癌基因的表達(dá)(例如，bcr-abl基因；Scherr等人，別ood9月26印刷前的電子^>開，2002)。RNAi已一皮用于調(diào)節(jié)哺乳動物(小鼠)和兩棲動物(爪蟾)胚胎(分別為Calegari等人，尸賜淑"cm/Sc/USA99:14236--14240,2002;以及Zhou,等人，A^c/e/cJc/A30:1664-1669,2002)以及出生后小鼠中的基因表達(dá)，并用于誘導(dǎo)成年轉(zhuǎn)基因小鼠中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(McCaffrey等人，Ato""418:38-39，2002)。在細(xì)月包培養(yǎng)和體內(nèi)才企測siRNAs效力和特異性的方法已有描述(例如，參見Bertrand等人，5/oc/zewS/op/z少51Co附ww"296:1000--1004，2002;Lassus等人,Sc/2002(147):PL13,2002;以及Leirdal等人，S/oc/zew歷—>^hC畫聽w295:744-74%,2002)。介導(dǎo)RNAi的分子(包括f旦不限于siRNA)可通過化學(xué)合成(Hohjoh,F五^S丄e"527:195-199,2002),dsRNA水解(Yang等人，procnatlacadsciUSA99:9942-9947，2002)，以T7RNA聚合酶體夕卜轉(zhuǎn)錄(Donzeet等人，M/c/e/cJc/A30:e46,2002;Yu等人,ProcNatlAcadSciUSA99:6047-6052,2002),以及采用^口大腸才干菌RNA酶III等核酸酶水解雙4連RNA(Yang等人，A^WJcadSc/USA99:9942-9947,2002)進(jìn)4亍體外制備。siRNA分子還可通過對兩個寡聚核苷酸相互退火形成，通常具有下列一般結(jié)構(gòu)，其中同時包括了雙鏈和單鏈部分(懸掛)1二-_J("核心，')5'-XXXXXXXXXX20CNNNNN-3,(SEQIDNO:88)3,-NNNNNYYYYYYYYYYYY-5,(SEQ工DNO:89)l一n—l(懸掛)其中N，X和Y為核苦酸，X與Y通過氫4建連接；""表示兩個石咸基之間的氫4建；x為介于1和約100之間的自然凄t;而m和n為介于0和約100之間的相互獨立的整H在部分實施方式中，N,X和Y各自為A，G，C和T或U。特別對于合成siRNA(即，兩個寡聚核苷酸的退火產(chǎn)物)，可能存在非天然存在的堿基和核苷酸。該雙《連中心區(qū)#皮稱為"核心"并以石咸基對(bp)作為測量單位；該雙鏈部分懸掛，并以核苦酸(nt)作為測量單位。所示的懸掛為3'懸端，但具有5'懸端的分子同樣在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。沒有懸掛的siRNA分子(即，m=0且n=0),以及^義在核心一側(cè)具有懸掛的分子(例如，m=0in>l,或與之相反)同樣在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。RNAi才支術(shù)最一刀并未顯示出可方侵j也應(yīng)用于哺乳動物系統(tǒng)。這是因為在哺乳動物中，dsRNA激活的dsRNA-活化蛋白激酶(PKR)可導(dǎo)至丈凋亡和細(xì)月包死亡(Der等人，7Va//.爿cadUSA94:3279-3283,1997)。此夕卜，人們4艮久以前^更知道ds脂A可在哺乳動物細(xì)胞中激活干擾素級聯(lián)，從而還可導(dǎo)致細(xì)胞生理學(xué)的改變(Colby等人,^w亂Af/crc6/o/.25:333,1971;Kleinschmidt等人.,Tev.jS/oc/zew.41:517,1972;Lampson等人.,iVoc.7Va/7.Jcac/.5W.USA58L782,1967;Lomniczi等人.，乂Gew.">o/.8:55，1970;以及Younger等人.，5a"en'o/.92:862,1966)。然而，dsRNA介導(dǎo)的PKR激活和干擾素級聯(lián)需要長度超過約30個石咸基對的dsRNA。相對地，據(jù)證明長度小于30個石咸基對的dsRNA可引起哺乳動物細(xì)月包中的認(rèn)Ai(Caplen等人.，尸rac.tV"z7.JcadSc/.USA98:9742--9747，2001)。因此，可期待通過制備基本沒有更長dsRNAs的短RNA來避免更長dsRNA分子帶來的有害的，非特異性的作用。有關(guān)siRNA的參考文獻(xiàn)Bernstein等人.，TV^we409:363-366,2001;Boutla等人，Cw/rAo/11:1776-1780,2001;Cullen,淑7m扁wo/.3:597-599，2002;Caplen等人，/Voc淑/USA98:9742-9747,2001;Hamilton等人，5We騰286:950-952,1999;Nagase等人，Z)A^6:63-70,1999;Napoli等人，尸WCe〃2:279-289,1990;Nicholson等人，Ma畫.G，膨13:67-73，2002;Parrish等人，她/Ce〃6:1077-1087,2000;Romano等人，MolMicrobiol6:3343-3353,1992;Tabara等人，Ce〃99:123-132,1999;以及Tuschl,C7^油》c/7皿2:239-245,2001。Paddison等人(Genes&Dev.16:948-958，2002)曾將小RNA分子4斤疊發(fā)夾以引起RNAi。相應(yīng)地，該4豆發(fā)夾RNA(shRNA)分子同樣可蜂皮本發(fā)明的方法方^f更采用。功能性shRNAs的主干和環(huán)的長度各不相同；在不影響沉默活性的前提下，主干長度可介于約25至約30nt,而環(huán)的大小可介于4至約25nt。不希望受特定理i侖之束縛，據(jù)i人為這些shRNAs類似于DICERRNA酶的dsRNA產(chǎn)物，且在任意情況下具有相同的抑制特定基因表達(dá)的能力。在部分實施方式中，本發(fā)明才是供了該siRNA或shRNA抑制NgRl表達(dá)。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步才是供了至少與包含CUACUUCUCCCGCAGGCG(SEQIDNO:52)或CCCGGACCGACGUCUUCAA(SEQIDNO:54)或CUGACCACUGAGUCUUCCG(SEQIDNO:56)的核苦酸序列具有80%,90%或95%—致性的siRNA或shRNA。在其它實施方式中，該siRNA或shRNA核苦酸序列為CUACUUCUCCCGCAGGCG(SEQIDNO:52)或CCCGGACCGACGUCUUCAA(SEQIDNO:54)或CUGACCACUGAGUCUUCCG(SEQIDNO:56)。在部分實施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該siRNA或shRNA核苷酸序列與多聚核苷酸序列GATGAAGAGGGCGTCCGCT(SEQIDNO:53)或GGGCCTGGCTGCAGAAGTT(SEQIDNO:55)或補。、'在本發(fā)明的一些實施方式中，該shRNA乂人實施例26所述的慢病毒載體中表達(dá)。經(jīng)過修飾(堿基，糖和/或磷酸鹽)的化學(xué)合成核酸分子可防止其被核糖核酸酶降級，這可以<提高它們的效力(例如，參見，Eckstein等人，國際/>布WO92/07065;Perrault等人，7V"/wre344:565(1990);Pieken等人，5Wewce253:314(1991);Usman和Cedergren,TVe"(is1S/oc/zew.Sc/.77:334(1992》Usman等人,國際7>布WO93/15187;以及Rossi等人，國際/〉布WO91/03162;Sproat，美國專利5,334,711;Gold等人，美國專利6,300,074;以及Burgin等人，同上文；全部文獻(xiàn)在此引用作為參考)。上述的各參考文獻(xiàn)描述了可對此處所述的核酸分子的堿基，磷酸鹽和/或糖部分進(jìn)行的各種化學(xué)^f'務(wù)飾。預(yù)期的修飾和增強(qiáng)其在細(xì)胞中的效力，,人核酸分子去除石成基以寡核苷酸合成時間并減少化學(xué)需求。本領(lǐng)域有眾多實施例描述了可對核酸分子進(jìn)行的并可明顯增強(qiáng)其核酸酶穩(wěn)定性和效力的糖，堿基和磷酸鹽修飾。例如，可奮飾寡核普酸以通過對核酸酶耐受基團(tuán)的^f奮飾(例如，2'-氨基，2'-C-蹄丙基，2'-氟，2'-0-曱基，2'-0-烯丙基，2'-H核普酸堿基修飾)來增強(qiáng)穩(wěn)、定性和/或增強(qiáng)生物活性(綜述可參見Usman和Cedergren,77:34(1992);Usman等人，7Vwc/e/c爿c油—p.37:163(1994);Burgin等人，S/oc/ze/mW^j35:14090(1996))。核酸分子的沖唐修飾已在本領(lǐng)域得到廣泛的描述(參見，Eckstein等人，國際申請PCTNo.WO92/07065;Perrault等人，7V^w"344:565-568(1990);Pieken等人，5We騰253:314-317(1991);Usman和Cedergren,r固A腸c/z，.Sc/.17:334-339(1992》Usman等人，國際申請PCTNo.WO93/15187;Sproat,美國專利5,334,711以及Beigelman等人，《/C/zew.270:25702(1995);Beigelman等人，國際PCT^>開號WO97/26270;Beigelman等人，美國專利5,716,824;Usman等人，美國專利5,627,053;Woolf等人，國際PCT^>開號WO98/13526;Karpeisky等人，1998,re/ra/2e^0w3.9:1131(1998);Earnshaw和Gait,S/opo/ymera(TVwc/e/cJc/d5We"ces」48:39-55(1998);Verma和Eckstein,^"亂Aev.腸c/7墜67:99-134(1998);以及Burlina等人，Sz'oorg.A/^/.C/zew.5:1999-2010(1997);所有文獻(xiàn)在此全文引用作為參考)。該類出版物描述了在不調(diào)節(jié)催化作用的情況下在核酸分子中進(jìn)行糖，石咸基和/或磷酸鹽等修飾的位置確定的一般方法和策略，且它們在此引用作為參考?？紤]到這些啟示，只要siRNA在細(xì)胞中促進(jìn)RNAi的能力未受抑制，如此處所述的類似的飾可用于{務(wù)飾本發(fā)明的siRNA4亥g吏分子。本發(fā)明的特4正在于具有包含一個或多個-粦石克酰，二石克代磷酸酯，曱基膦酸酯，磷酸三酯，嗎啉，酰胺化氨基曱酸酯，羧曱基，乙酰胺酸酯，聚酰胺，磺酸鹽，磺酰胺，氨基磺酸酯，曱縮醛，好u曱縮醛，和/或烷基矽取代的磷酸鹽骨架修飾的修飾siRNA分子。寡核苷酸骨架^f奮飾的綜述可參見Hunziker和Leumann，NucleicAcidAnalogues:SynthesisandProperties,inModernSyntheticMethods,VCH,331-417(1995)以及Mesmaeker等人，NovelBackboneReplacementsforOligonucleotides,inCarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,ACS,24-39(1994)。盡管通過與硫代磷酸酯，硫代磷酸酯，和/或5'-甲基磷酸連鎖的寡核苷酸核苷酸間連鎖的化學(xué)修飾可提高穩(wěn)定性，過度修飾可引起一些毒性或活性下降。因此，在i殳計核酸分子時，應(yīng)〗吏核香酸間連鎖的數(shù)量最小化。這些連鎖濃度的下降可降低毒性，從而使這些分子具有更高的效力和更高的特異性。此處提供了具有維持或增強(qiáng)活性的化學(xué)修飾的siRNA分子。該種核酸通常比未》務(wù)飾的核S臾對核酸酶更具耐受性。相應(yīng)地，體外和/或體內(nèi)活性不應(yīng)一皮顯著降低。在以調(diào)節(jié)為目標(biāo)的情況下，外部傳遞的治療性核酸分子最宜在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定至目標(biāo)RNA的反義得到足夠長的調(diào)節(jié)，以降低不良蛋白的水平的下降。根據(jù)疾病的狀態(tài)，該時間范圍可在凄t小時至凄t日內(nèi)變化。RNA和DNA化學(xué)合成的改善(Wincott等人，M/c/e"c油M.23:2677(1995);Caruthers等人，MeAoA/"五"2ymotogy211:2-19(1992)(在此引用作為參考))拓展了通過導(dǎo)入核苷酸^'f飾小務(wù)飾核酸分子來增強(qiáng)前述的核酸酶穩(wěn)、定性的能力。本發(fā)明的多聚核苦酸可包括一個或多個(例如，約1,2,3,4，5，6，7,8,9,10或更多)G-嵌核苷酸。G-嵌核苷酸為修飾的半胱氨酸類似物，其中該修飾可產(chǎn)生同時在雙鏈體中互補鳥噤，冷的Watson-Crick和Hoogsteen平面氫4建結(jié)合的能力，例4。，參見Lin和Matteucci，J.Am.Chem.Soc.120:8531-8532(1998)。在寡核苦酸內(nèi)的單個G-嵌類似物替換可導(dǎo)致與互補性寡核苷酸雜交時的螺S走熱穩(wěn)、定性和4晉配識別的增強(qiáng)。本發(fā)明的多聚核苷酸中對該種核苷酸的包含可同時導(dǎo)致對核酸輩巴標(biāo)，互補性序列或才莫4反《連的增強(qiáng)的親和力和特異性。本發(fā)明的多聚核苷酸還可包括一個或多個(例如，約1,2,3,4,5,6,7，8,9，10或更多個)LNA"鎖核酸"核苷酸，例如2'，4'-C亞甲基雙環(huán)核苷酸(例如，參見Wengel等人，國際PCT公開號WO00/66604和WO99/14226)。本發(fā)明的特征還在于本發(fā)明的siRNA分子的結(jié)合物和/或復(fù)合物。該種結(jié)合物和成復(fù)合物可用于促進(jìn)siRNA分子傳遞進(jìn)入生物系統(tǒng)，例如細(xì)胞。本發(fā)明提供的結(jié)合物和復(fù)合物可通過傳遞治療化合物通過細(xì)胞膜，改變藥代動力學(xué)，和/或調(diào)節(jié)本發(fā)明核酸分子的定位來產(chǎn)生治療活性。本發(fā)明包含了用于傳遞分子(包括，但不限于，小分子，脂質(zhì)，磷脂，核苷，核苷酸，核酸，抗體，毒素，帶負(fù)電荷的聚合物以及其它聚合物，例如蛋白，肽，激素，糖，聚乙二醇或聚胺)通過細(xì)胞膜的新型結(jié)合物和復(fù)合物的設(shè)計和合成。的情況下單獨或作為多成分系統(tǒng)的一部分進(jìn)fH吏用。這些4H合物預(yù)期可以在存在或不存在血清的情況下才是高本發(fā)明的分子向一系列來自不同組織的細(xì)胞類型中的傳遞和/或定位(參見Sullenger和Cech，美國專利號5,854,038)。此處所述分子的結(jié)合物可通過可生物降解的4妻頭(例如可生物降解的核酸4妄頭分子)連"f妄至生物活性分子。外部施用的治療性多聚核苷酸(例如，siRNA分子)優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定，直至所調(diào)節(jié)的RNA的逆轉(zhuǎn)錄足以降低RNA轉(zhuǎn)錄的水平。該核酸分子對核酸酶具有耐性，乂人而可以用作有效的月包內(nèi)治療劑。本領(lǐng)域和本發(fā)明所述的核酸分子的化學(xué)合成的改進(jìn)通過引入核苦酸修飾增強(qiáng)其如上所述的核酸酶穩(wěn)定性的拓展了》f飾核酸分子的能力。本發(fā)明還提供了經(jīng)過化學(xué)修飾的siRNA分子，其保持或增強(qiáng)了RNAi中i殳計的蛋白的酶活性。該種沖亥酉臾通常比未》務(wù)飾的核酸對核酸酶更具耐受性。因此，體外和/或體內(nèi)活性不應(yīng)#皮顯著降低。本發(fā)明的基于核苷酸的分子的使用將通過提供聯(lián)合療法(例如，靶向不同基因的多siRNA分子；與已知小分子調(diào)節(jié)劑偶合的核酸分子；或以包括不同基序和/或其它化學(xué)或生物分子等分子組合進(jìn)4于的間歇治療)的可能性對疾病進(jìn)展形成更好的治療。以siRNA分子治療對象還可包括不同類型的核酸分子的組合，例如酶核酸分子(核酶)，異型酶，反義，2,5-A寡腺苷酸，誘飾，適體等。在另一方面，本發(fā)明的siRNA分子可包含例如^f義在正義siRNA《連，反義siRNA鏈或兩種siRNA《連上的一個或多個5'和/或3'-帽子結(jié)構(gòu)。"帽子結(jié)構(gòu)"指被整合在寡核香酸任意末端的化學(xué)修飾(參見，例如，Adamic等人，美國專利號5，998，203,在此引用作為參考)。該末端<奮飾可<呆護(hù)核酸分子免受核酸外切酶降解，并可幫助在細(xì)胞內(nèi)傳遞和/或定位。該帽子可存在于5'-末端(5'-帽子)或在3'-末端(3'-帽子)或同時在兩個末端。在非限制性范例中，該5'-帽子選自如下組合反轉(zhuǎn)非堿性殘基(部分)；4',5'-亞曱基核苷酸；l-(P-D-赤式呋喃糖)核香酸；4'-辟u代核苦酸；》友環(huán)核苷酸；1,5-失水己糖醇核苦酸；L-核苷酸；a-核苦酸；^奮飾石成基核苷酸；二石克^/壽酸酯連鎖；蘇式-五呋喃4唐核苷酸；無環(huán)3'，4'-seco核芬酸；無環(huán)3，4-二羥丁基核苷酸；無環(huán)3,5-二羥戊基；3'-3'-反轉(zhuǎn)核苦酸部分；3'-2'-反轉(zhuǎn)非堿性部分；1,4-磷酸丁二醇；3'-磷酰胺；磷酸己酯；磷酸氨己基酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二石克代磷酸酯；或橋連或非橋連曱基磷酸酯部分。該3'帽子可選自如下組合4',5'-亞甲基核脊酸；1-((3-D-赤式呋喃纟唐)核苷酸；4'-碌"義核苷酸，-友環(huán)核苷酸；5'-氨基-烷基^壽酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸酯；1,2-氨基十二烷基磷酸酯；羥丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苦酸；a-核苷酸；^修飾的石成基核苦酸；二辟l/K/疇酸醋；蘇式-五呋喃糖核苦酸；無環(huán)3'，4'-seco核苦酸；3，4-二羥丁基核苦酸；3,5-二羥戊基核香酸；5'-5'-反轉(zhuǎn)核苦酸部分；5'-5'-反轉(zhuǎn)非堿性部分；5'-磷酰胺；5'-硫代磷酸酯；1,4丁二醇磷酸酯；5'-氨基；橋連或非橋連5'-磷酰胺，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，橋連或非橋連曱基石壽酸酯和5'-5化基部分(更多詳細(xì)4言息參見Beaucage和Iyer,7^ra/2e^ow49:1925(1993);在此引用作為參考)?？蓪iRNA結(jié)構(gòu)進(jìn)4于各種^f奮飾以增強(qiáng)這些分子的實用性。該種修飾將增強(qiáng)保存期限，體外半衰期，穩(wěn)定性，以及將該種寡核香酸導(dǎo)入目標(biāo)位點的容易度，例如，增強(qiáng)對細(xì)胞膜的穿透性，并賦予識別和結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞的能力。反義技術(shù)可通過反義DNA或RNA,或通過三螺旋構(gòu)型4空制基因表達(dá)。反義4支術(shù)的討i侖可參見，例如，Okano,j:A^wn9c/zew.56:560(1991);OligodeoxynucleotidesasAntisenseInhibitorsofGeneExpression,CRCPress,BocaRaton,FL(1988)。三螺旋構(gòu)型的討論可參見，例如，Lee等人.,A^c/e/c爿c油i，arc/z6:3073(1979);Cooney等人，5We"ce241:456(1988);以及Dervan等人，5Wewce257:1300(1991)。該方法基于多核香酸與互補DNA或脂A的結(jié)合。例如，編碼NgRl的多核苷酸的5'編碼部分可用于設(shè)計長度介于約10至40堿基對的反義RNA寡聚核苷酸。DNA寡聚核苷酸經(jīng)設(shè)計與涉及轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域互補，/人而可以阻止轉(zhuǎn)錄和目標(biāo)蛋白的生產(chǎn)。反義RNA寡聚核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交并阻斷mRNA分子翻i奪成為目標(biāo)多肽。在一個實施方式中，針對NgRl基因的反義核酸可通過由外源序列轉(zhuǎn)錄在胞內(nèi)生成。例如，通過轉(zhuǎn)錄載體或其部分生成反義核酸(RNA)。只要該載體可通過轉(zhuǎn)錄生成目標(biāo)反義RNA，它可呈游離態(tài)或與染色體整合。該載體可通過本領(lǐng)域重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)4亍構(gòu)建。載體可以是可用于在脊一偉動物細(xì)月包中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)4立，病毒或其它本4頁i或已知物質(zhì)。該反義分子可通過本4貞i或已知的任何作用于脊推動物，優(yōu)選人類細(xì)胞的啟動子(例如見本文其它部分的描述)進(jìn)行表達(dá)。盡管優(yōu)選反義分子的絕對互補，j旦對此不作要求。至少與編碼NgRl的RNA中的一部分互補的指其互補性足以與RNA進(jìn)^f亍雜交，形成穩(wěn)定雙4連體的序列；或可4企測到三股螺^走構(gòu)型。雜交的能力將取決于互補的程度以及反義核酸的長度。一般而言，雜交核酸越大，它可在包含更多堿基錯配的情況下依然形成穩(wěn)定的雙鏈體(或在某些情況下形成三鏈體)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過標(biāo)準(zhǔn)步驟確定錯配的容忍度以確定雜交復(fù)合物的熔點。與信4吏RNA的5'端(例如至AUG起動密碼子或包括AUG起動密碼子的5'未翻譯序列)互補的寡聚核苦酸在抑制翻譯方面具有最高的效率。然而，據(jù)顯示與mRNAs的3'未翻i奪序列互補的序列也能有效抑制mRNAs的翻i奪。一4殳可參見Wagner,R.,Nature372:333-335(1994)。因此，與5'-或3'-非翻i奪，非編石馬區(qū)互補的寡聚核苦酸可用于抑制NgRl翻i,的反義過程。與mRNA的5'非翻譯區(qū)互補的寡聚核苦酸應(yīng)當(dāng)包括AUG起始密碼子的補體。與mRNA編碼區(qū)互補的反義寡聚核苷酸在抑制翻譯方面的效率較低，但可參照本發(fā)明進(jìn)行使用。反義核酸的長度至少應(yīng)為六個核苦酸，優(yōu)選長度介于6至約50個核苷酸的寡聚核苷酸。在某些方面該寡聚核苦酸至少具有10個核苦酸，至少17個核苷酸，至少25個核苦酉臾或至少50個4亥苷酉吏。此處披露的治療性方法采用的多聚核苦酸(包括下文描述的適體)可以是單鏈或雙《連的DNA或RNA或其嵌合混合物或^f汙生物或^f奮飾形式。該多聚核苷酸可在堿基部分，糖部分，或磷酸鹽骨架進(jìn)行修飾，從而提高如分子，雜交物穩(wěn)定性等。該多聚核苷酸可包括其它附加基團(tuán)，例如肽(例如，為在體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體)，或是促進(jìn)3爭域細(xì)胞膜運輸?shù)脑噭?例如，參見Letsinger等人，iVoda"JcadU.S.A.86:6553-6556(1989);Lemaitre等人，TVa".<Sc/84:648-652(1987》;于1988年12月15日公布的PCT公布WO88/09810)或是血腦屏障(例如，參見于1988年4月25日公布的PCT公布WO89/10134)進(jìn)行運輸?shù)脑噭?，雜交觸發(fā)裂解試劑。(例30，參見Krol等人，S/orec/7m々ww6:958-976(1988))或是嵌入劑(仿J^口，參見Zon,P/2^附.W仏5:539-549(1988))。為實現(xiàn)該目標(biāo)，可將該寡聚核苷酸結(jié)合至另一分子，例如，肽，雜交觸發(fā)交耳關(guān)劑，運輸劑，雜交觸發(fā)裂解劑等。此處4皮露的治療性方法采用的反義寡聚核苷酸可包括至少一個選自以下組合的修飾石成基部分，該組合包括，但不限于，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-石典尿嘧啶，次黃嘌呤，黃。票呤，4-乙酰胞嘧咬，5-(羧基羥基曱基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基_2_硫尿核苦，5-羧基曱基氨基曱基尿嘧啶，二羥尿嘧啶，(3-D-半乳糖Q核苷，肌苷，N-6-異戊烯腺嘌呤，l-曱基鳥嘌呤，1-曱基肌苦，2,2-二曱基鳥噤呤，2-曱基腺噤呤，2-曱基鳥。票呤，3-甲基胞嘧啶，5-曱基胞嘧啶，N-6-腺噤呤，7-曱基鳥。票呤，5-曱基氨基曱基尿嘧啶，5-甲氧基氨基曱基-2-硫尿嘧啶，f3-D-甘露糖Q核苷，5'曱氧基羧基曱基尿嘧啶，5-曱氧基尿嘧啶，2-曱基硫-N-6-異戊烯腺嘌p令，尿口密口定畫5畫氧基乙商吏(v),wybutoxosine,々I尿口密口定，Q斗亥苦，2-石克月包嘧，定，5-甲基-2J克尿嘧口定，2-石克尿嘧。定，4-碌u尿嘧。定，5-曱基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v),5-曱基-2-石克尿嘧啶，3(3-氨基-3-N2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，以及2,6-二氨基嘌呤。此處4皮露的治療性方法采用的反義寡聚核苷酸還可包括至少一個選自包括，j旦不限于，阿^立伯糖，2-氟阿^立伯糖，木酮#唐以及己4唐的組合的〗務(wù)飾#唐部分。在另一實施方式中，此處4皮露的治療性方法采用的反義寡聚核香酸至少包含一個選自以下組合的^f奮飾^粦g臾鹽骨架，該纟且合包括，但不限于，硫代磷酸鹽，二硫代磷酸鹽，氨基硫代磷酸鹽，氨基磷酸鹽，二氨基磷酸鹽，曱基磷酸鹽，烷基磷酸三酯，以及縮醛4定或其類々乂物。在另一實施方式中，此處4皮露的治療性方法中采用的反義寡聚核苷酸為a-異頭寡聚核苷酸。a-異頭寡聚核苷酸可與互補RNA形成特定的雙鏈雜交體，并且與通常的情況相反，其中鏈相互平行(Gautier等人.，AWJc/AL75:6625-6641(1987))。該寡聚核普酸為2'-0-曱基核糖核苷酸(Inoue等人.，Wmc/.^c/A7仏15:6131-6148(1987)),或嵌合脂A-DNA類似物(Inoue等人.，275:327-330(1987))。本發(fā)明的多聚核苷酸(包括適體)可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如，可采用自動化DNA合成器(可乂人Biosearch,AppliedBiosystems等乂>司購得)。例如，碌u代磷酸寡聚核苦酸的合成方法可參見Stein等人.，tVwc/.^c/AW仏16:3209(1988),曱基石壽酸寡聚核苷酸可釆用可控孔度玻璃高分子載體進(jìn)行制備(Sarin等人:iVa//.爿cadU.S.A.55:7448-7451(1988))。此處纟皮露的治療性方法采用的多聚核苦酸組合物進(jìn)一步包括催化性RNA,或核酶(例如，參見PCT國際申i青WO90/11364,于1990年10月4日乂>布；Sarver等人，5Wewce247:1222-1225(1990))。優(yōu)選采用4垂頭狀核酶。《垂頭狀核酶可在與目標(biāo)mRNA形成互4卜石成基對的側(cè)翼區(qū)決定的^f立點裂解mRNAs。^舉一的要求是具有下列兩個石咸基(5'-UG-3')的序列的目標(biāo)mRNA。錘頭狀核酶的構(gòu)建體和產(chǎn)物已為本領(lǐng)域/>知并在Haseloff和Gerlach,A^ft/re3.34:585-591(1988)有更為完全的描述。優(yōu)選地，可對該核酶進(jìn)行改造從而使裂解識別位點接近目標(biāo)RNA的5'端；即，提高效率并最小化非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的胞內(nèi)積累。在反義過程中，本發(fā)明披露的診斷和治療性方法中釆用的核酶可由修飾后的寡聚核香酸(例如，為提高穩(wěn)定性，可進(jìn)行輩巴向等)組成并傳遞至體內(nèi)表達(dá)NgRl的纟田月包。編碼核酶的DNA構(gòu)建體可以與上述導(dǎo)入反義編碼DNA同樣的方式導(dǎo)入細(xì)胞。優(yōu)選的傳遞方法包4舌采用在編碼摂受強(qiáng)構(gòu)建型啟動子(例如，poiIII或polII啟動子)控制的核酶的DNA構(gòu)建體，從而使轉(zhuǎn)染細(xì)胞生成足夠數(shù)量的核酶以破壞內(nèi)源性NgRl信息并抑制翻譯。與反義分子不同，由于核酶具有催化性，其產(chǎn)生效果所需的胞內(nèi)濃度也更低。適體在另一實施方式中，本發(fā)明的方法采用的NgRl拮抗劑為適體。適體可以是具有獨特序列的，具有對所需靶標(biāo)(例如，多肽)具有結(jié)合特異性的并且是給定靶標(biāo)的特異性配體的核苷酸或多肽。本發(fā)明的核普酸適體包4舌結(jié)合NgRl的雙《連DNA和單《連RNA分子。核酸適體可通過本4頁域已知的方法進(jìn)4亍選自，例如，可通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)過程進(jìn)行選擇。SELEX是一種能高度特異性結(jié)合目標(biāo)分子的核酸分子的體外進(jìn)化方法，其描述可參見，例如U.S.Pat.Nos.5,475,096，5,580,737,5，567，588,5,707,796,5,763,177,6,011,577以及6,699,843,其全文在此引用作為參考。另一鑒定適體的篩選方法可參見美國專利5,270,163(同樣在此引用作為參考)。SELEX過程基于核酸形成一系列二和三維結(jié)構(gòu)的能力，以及核苷酸單體實際上能作為任何單體或聚合形式的化合物(包括其它核酸分子和多肽)的配體(形成特異性結(jié)合對)的多功能性。任何大小的分子或組合物可用作輩巴標(biāo)。SELEX法包括從候選寡聚核香酸混合物中進(jìn)行選4奪，并釆用相同的選擇方案逐步循環(huán)結(jié)合，分配和擴(kuò)增以獲得所需的結(jié)合親和性和選l奪性。該SELEX法以核酸混合物(優(yōu)選包含隨機(jī)序列的片段)起始，包括以下步驟將混合物和靶標(biāo)在利于結(jié)合的條件下相接觸；區(qū)分未結(jié)合核酸和與耙標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸；分離核酸-靶標(biāo)復(fù)合物；擴(kuò)增乂人核酸-輩巴標(biāo)復(fù)合物分離的核酸以獲得核酸的配體富集混合物。根據(jù)需要重復(fù)結(jié)合，區(qū)分，分離和擴(kuò)增步驟以獲得針對耙標(biāo)分子的高特異性高親和性核酸配體。核普酸適體可用作診斷工具或作為抑制劑來分析胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和運輸途徑(James(2001)C鮮.(9//".P/z"環(huán),/.1:540-546)。核苷酸適體的高親和性和特異性4吏它們成為藥物研發(fā)1的良好候選物。例如，毒素蓖麻毒素的適體拮抗劑已被分離并具有納摩爾級的IC50值(HesselberthJR等人.(2000)J5/o/C72ew275:4937-4942)。核苦酸適體還可針對傳染性疾病，惡性肺瘤以及病毒表面蛋白使用以降低細(xì)胞傳染性。本發(fā)明的方法采用的核苷酸適體可4姿此處所述的對其它多聚核苦酸的修飾方法進(jìn)行修飾(例如，^修飾骨架或石成基或與肽結(jié)合)。采用SELEX過程通過NgRl的蛋白結(jié)構(gòu)篩選作用于NgRl的適體可對抑制NgRl-介導(dǎo)的過程(例如，NgRl-介導(dǎo)的軸突再生抑制)的適體進(jìn)行鑒別。本發(fā)明的方法采用的多肽適體為才艮據(jù)其結(jié)合并因此阻斷NgRl作用的能力選4,的任意肽。多肽適體可包括在兩端與蛋白支架連接的短可變肽區(qū)。這種雙結(jié)構(gòu)限制大大提升了肽適體的結(jié)合親和性，達(dá)到了與抗體相當(dāng)?shù)乃?納摩爾級)。例如，參見Hoppe-SeylerF等人.(2000)Afo/78(8):426-430。4豆可變月太的長度通常約為10至20個氨基酸，該支架可以是任何具有良好溶解性和相容性的蛋白。支架蛋白的一個非限制性范例為細(xì)菌蛋白硫氧還蛋白畫A。例如，參見CohenBA等人.(1998)尸7VAS95(24):14272-14277。多肽適體為可作為蛋白功能顯性抑制劑的肽或小多肽。肽適體特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白，阻斷其功能(Kolonin等人.(1998)尸roc.A^f/.Sc/.95:14,266-14,271)。以高親和性和特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白的肽適體可通過本領(lǐng)域已知的多種4支術(shù)進(jìn)4亍分離。肽適體可通過酵母雙雜交篩選從隨機(jī)肽庫中分離得到(Xu，C.W.,等人.(1997)尸亂淑/.94:12,473-12，478)或通過核糖體展示(Hanes等人.(1997)尸亂淑/.」cadSc/.94:4937-4942)。它們還可從謹(jǐn)菌體庫(Hoogenboom,H.R.，等人.(1998)/mmi/wc^ec/mo/ogy4:l-20)或是化學(xué)生成肽庫中分離得到。此外，多肽適體還可通過選才奪配體調(diào)節(jié)肽適體(LiRPA)的進(jìn)4亍選沖奪。例如，參見BinkowskiBF等人.，(2005)C/zew12(7):847-855,在此引用作為參考。盡管由于肽適體合成較為困難，其使用比多聚核苦酸適體更為復(fù)雜，但它們具有無限的化學(xué)多樣性。多聚核普酸適體由于僅使用四種核苷酸堿基而受到限制，而肽適體則具有大得多的譜系(即，20個氨基酸)。本發(fā)明的方法采用的肽適體可參照本文別處描述的其它多肽的修飾方法進(jìn)行修飾(例如，與聚合體結(jié)合或與蛋白融合)。組合物在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含選自SEQIDNOs:1-5,26-27，29-37,口41—45的多月太的纟且合凈勿。在部分實施方式中，-Nogo受體-1或其抗原結(jié)合片段,合蛋白的組合物。在部分實施方式中，苷酸的組合物。在部分實施方式中，肽和抗炎劑的纟且合物。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗或可卩容性Nogo受體-1多肽或融本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多聚核本發(fā)明提供了包含了本發(fā)明的多在部分實施方式中，本發(fā)明可包含適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可4妻受的載體，包括可促進(jìn)活性化合物制備成為可傳遞至作用位點的制劑的賦形劑和輔劑。用于腸胃外施用的適用劑型包括水溶形式(例如，水溶性鹽)的活性化合物的水溶液。此外，可施用作為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺腋┑幕钚曰衔锏膽腋?。適用的親脂性溶劑或溶々某包括脂肪油，例如，芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如，乙基油酸酯或甘油三酸酯。水相注射懸浮劑可包含提高懸浮劑粘度的物質(zhì)，包括，例如，羧曱基纖維素鈉，山梨糖醇和右旋糖苦。該懸浮劑還可選褲:性地包含穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體也可用于包封本發(fā)明的分子以傳遞進(jìn)入細(xì)胞。示范性的"藥學(xué)可接受的載體"為任意的或全部的生理相容的溶劑，分散介質(zhì)，涂層，抗菌劑和抗真菌劑，等張劑和吸收延緩劑等，水，鹽水，磷酸鹽緩沖液，右旋糖，甘油，乙醇等，及其組合。在部分實施方式中，該組合物包含了等張劑，多元醇(例如甘露醇，山梨沖唐醇)，或氯4匕鈉。在部分實施方式中，該《且合物包含了藥學(xué)可才妻受的的物質(zhì)，例如，潤濕劑或纟效量的輔助物質(zhì)如潤濕或乳^^劑，防腐劑或緩沖液，其可提高本發(fā)明的抗體，抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體或融合蛋白的保存期限或效力。本發(fā)明的組合物可呈多種形式，包括，例如，液體，半固體和固體劑型，例如，液體溶液(例如，可注射和可豐lr注的〉容液)，分散劑或懸浮劑。優(yōu)選形式取決于目標(biāo)給藥模式和治療應(yīng)用。在一種實施方式中，組合物呈可注射或可輸注的溶液形式，例如用于通過其它抗體,皮動免疫人體的類似組合物。該纟且合物可制成)容液，孩i乳劑，分散劑，脂質(zhì)體或其它適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。無菌注射溶液可通過將含于適當(dāng)溶劑的所需量的抗-Nogo受體-1抗體根據(jù)需要與一種或多種上述列舉的成分結(jié)合，并通過無菌過濾進(jìn)行制備。一^:而言，分散劑可通過將活性化合物與包含了基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需其它上述成分的無菌載體結(jié)合得到。對于可用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末，其優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥，通過制備得到的粉末包含活性成分和乂人其無菌過濾溶液得到的任何附加所需成分。溶液的適當(dāng)流動性可通過多種方式維持，例如，通過適用卵磷脂等覆層，對于分散劑通過保持所需的顆粒尺寸以及通過表面活性劑的使用。可注射組合物的長期吸收可通過在組合物中包含一種延緩吸收的試劑(例如，單石更脂酸鹽和白明月交)來實現(xiàn)。在部分實施方式中，該活'性4匕合物可與<呆護(hù)該4匕合物免于迅速釋放的載體共同制備成如控釋制劑，包括移植物，透皮斑貼，乙基微膠嚢化傳遞系統(tǒng)?？刹捎每缮锝到?，生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯，聚酸酐，聚乙醇酸，膠原質(zhì)，聚原磷酯以及聚乳酸。制備該種劑型的多種方法已得到專利保護(hù)或為本領(lǐng)域技術(shù)人員戶斤公^口。侈J^口,參見5V^/a/"et/aw<iCow^x>〃e<i7e/eoseDri/gZ)e//ver_y5y欲附s，J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker，Inc.,NewYork(1978)。補充活性化合物也可包含在組合物中。在部分實施方式中，本發(fā)明的Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段，或可溶性Nogo受體-1多肽或融合蛋白可與一種或多種附加的治療劑(包括，例如，抗炎劑)共同制劑和/或共同施用。在一種實施方式中，該抗炎劑為非甾體抗炎劑。在另一實施方式中，該抗炎劑為甾體抗炎劑。在特定的實施方式中，該:阮炎劑為曱〉發(fā)尼龍。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及Nogo受體拮抗劑與非甾體抗炎劑(NSAID)，前藥酯或其藥學(xué)可接受的鹽的聯(lián)合使用。NSAIDs的范例已為本領(lǐng)域7>知，包4舌丙酸書f生物(例如，阿明洛芬，苯惡洛芬，布氯酸，卡布洛芬，芬布芬，非諾洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬，咪洛芬，萘普生，奧沙普秦，吡洛芬，普拉洛芬，舒洛芬，漆洛芬酸和-琉惡洛芬)，乙酸衍生物(例如，P引P朵美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，環(huán)氯茚酸，^又氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸，呋羅芬酸，異丁芬酸，4尹索克酸，oxpinac,舒才木酸，石克平酸，4乇美汀，齊多美辛和佐美酸)，滅酸4汙生物(例如，氟芬那酸，曱氯芬那酸酸，甲芬那酸和尼氟滅酸，托芬那酸)，苯基苯曱酸衍生物(二氟尼柳和氟苯沙酸)，氧昔康類(例如，伊索昔康，吡羅昔康，舒多昔康和替諾昔康)，水楊酸類(例如，乙酰水楊酸和柳氮石黃胺吡t定)以及吡唑酮類(例如，阿4L丙宗，bezpiperylon,非普4立宗，莫非布宗，羥基^呆泰+>和苯乙丁氮酮)；與NSAIDs具有類似的止痛和抗炎屬性的結(jié)構(gòu)相關(guān)的NSAIDs也包含在本組合中。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及Nogo受體拮抗劑與任意一種或多種甾體抗炎劑，例如皮質(zhì)類固醇，前藥酯或其藥學(xué)可4妄受的鹽中的聯(lián)合使用。該類甾體藥劑的非限制性范例包括氫化可的松和衍生自氳化可的松的化合物，21-醋酸基娠烯醇酮，阿氯米*>,阿爾孕酮，安西奈德，丙酸倍氯米松，倍他米水>,倍他米+>戊酸，布地奈德，氯潑尼+〉，丙酸氯倍他索，丙酸氯倍他索，氯倍他+>,氯倍他+〉丁酸鹽，氯可^6龍，氯潑尼醇，皮質(zhì)酮，可的*>,可的伐唑，deflazacon,;也奈德，去羥米+>，i也塞米^,二氟4立+>,二氟可龍，二氟潑尼酯，甘草次g交，氟4L可特，氟氯奈德、，氟美+>，新戊酸氟米松，氟尼縮松，氟輕松曲安縮松，醋酸氟輕松，氟氫松醋酸酯曲安縮7&,氟可丁丁酯，氟考龍，氟考龍己酸鹽，二氟可龍戊酸鹽，氟米龍，氟培龍醋酸鹽，醋酸氟潑尼定，氟潑尼龍，氟氫縮氟甲酰龍，p合西奈德，閨美他木>,卣潑尼+>醋酸鹽，氫可4也酯，氫化可的+〉，醋酸氫化可的*>,丁酸氫化可的+>,氫化可的+>磷酸鹽，氫化可的爭>,21-琥珀酸鈉，氫化可的松^又丁乙酸鹽，馬潑尼酮，曱羥松，曱基強(qiáng)的松，曱潑尼龍，糠酸莫米松，帕拉米松，》發(fā)尼卡酉旨，強(qiáng)的*>，強(qiáng)的木>龍21-diedryaminoacetate，》發(fā)尼+>龍石粦商吏鈉，醋酸;發(fā)尼+>龍琥珀酸鈉，強(qiáng)的4公龍鈉21-m-笨^黃g臾，強(qiáng)的木>龍鈉21-硬脂酸乙醇酸酯，叔丁乙酸鹽強(qiáng)的松，強(qiáng)的松龍21-三甲基乙酸鹽，潑尼+>,潑尼+>龍戊酸酯，潑尼立定，潑尼立定21-二乙氨基醋酸鹽，替可的松，曲安西龍，曲安西龍曲安縮+>，苯曲安奈德和己曲安奈德。具有類似的止痛和抗炎屬性的結(jié)構(gòu)相關(guān)的皮質(zhì)類固醇也包含在本組合中。在一個特定的實施方式中，該Nogo受體拮抗劑與甲潑尼龍聯(lián)合〗吏用。本發(fā)明的藥物組合物可包括"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的本發(fā)明的抗體，抗原結(jié)合片段，多肽，或融合蛋白。"治療有效量"指在必要的劑量和時間周期下其效果足以達(dá)到所需的治療結(jié)果的數(shù)量。Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體-1多肽或Nogo受體融合蛋白的治療有效量可根據(jù)個體的疾病狀態(tài)，年齡，性別以及體重等因素而改變。治療或預(yù)防有效量還可以是治療有益效果超越抗體，抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體-l多肽或Nogo受體融合蛋白的毒性或有害效果的量。"預(yù)防有效量"指在必要的劑量和時間周期下其歲文果足以達(dá)到所需的預(yù)防結(jié)果的凄t量。由于預(yù)防劑量通常在疾病發(fā)生前或疾病早期施用，子貞防有效量將小于治療有效量。可對給藥方案進(jìn)4亍調(diào)整以獲得最佳的目標(biāo)響應(yīng)(例如，治療或預(yù)防響應(yīng))。例如，可施用單獨丸劑，在一定時間內(nèi)多次施用分次劑量或根據(jù)治療狀況的迫切性的指示按比例減少或提高劑量。將腸胃外組合物制成單位劑型將特別有利于施用，此處所用的單位劑型的一致性指待治療哺乳動物對象的單位劑量的物理分散單位。每一個單位包含結(jié)合了所需藥物載體的預(yù)定凄t量的活性化合物化合物(通過計算可產(chǎn)生預(yù)期治療效果)。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)范可直接依據(jù)(a)抗體，抗原結(jié)合片段，以及可溶性受體-1多肽或Nogo受體融合蛋白的獨特性質(zhì)以及待達(dá)到的特定治療或預(yù)防效果，以及(b)復(fù)合該種用于治療個體靈敏性的抗體，抗原結(jié)合片段，以及可溶性受體-1多肽或Nogo受體融合蛋白的領(lǐng)域的固有限制所決定。在部分實施方式中Nogo受體-1或其抗原結(jié)合片段的治療有效計量范圍為每天0.1-4mg/Kg。在部分實施方式中Nogo受體-1或其抗原結(jié)合片段的治療有效計量范圍為每天0.2-4mg/Kg。在部分實施方式中Nogo受體-1或其抗原結(jié)合片l殳的治療有效計量范圍為每天0.2mg/Kg。在本發(fā)明的方法中該NgRl拮抗劑通常經(jīng)腦室或鞘內(nèi)直接施用于神經(jīng)系統(tǒng)，例如施用至MS的慢性病灶。根據(jù)本發(fā)明的方法施用的組合物可制成制劑，/人而可以0.001-1Omg/kg體重/天的劑量施用NgRl拮#元劑。在本發(fā)明的一些實施方式中，該劑量為0.01-1.0mg/kg體重/天。在一些實施方式中，該劑量為0.001-0.5mg/kg體重沃。在采用本發(fā)明NgRl拮抗劑進(jìn)行治療時，該劑量相對宿主體重可以為，例如，乂人約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg,0.5mg/kg,0.75mg/kg,lmg/kg，2mg/kg等)。例3口該劑量可以是1mg/kg體重或1Omg/kg體重或在l-10mg/kg范圍內(nèi)，優(yōu)選至少lmg/kg。上述范圍的中間劑量在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。對象給藥可采耳又每天《合藥，隔日給藥，每周《合藥或根據(jù)任何其它通過實證分析得到的進(jìn)度給藥。一種示范性的治療需要在較長的期限內(nèi)(例如，至少六個月)進(jìn)行多劑量給藥。一種示范性的治療需要在較長的期限內(nèi)(例如，至少六個月)進(jìn)行多劑量給藥。示范性的劑量給法包括連續(xù)每天l-10mg/kg或15mg/kg,隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中同時施用兩種或多種NgRl拮抗劑，其中各拮抗劑的施用劑量均在指示的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的方法采用的組合物還可結(jié)合輔助活性化合物。例如，NgRl拮抗劑可與一種或多種附加治療劑(例如抗炎劑，例如，曱潑尼龍)共同制劑或共同施用。本發(fā)明包含了向選定目標(biāo)組織傳遞本發(fā)明NgRl拮抗劑的任意適用傳遞方法，包括水溶液的彈丸注射或控壽奪系統(tǒng)的才直入?？刂浦踩霚p少了重復(fù)注射的需求。本發(fā)明的方法采用的NgRl拮抗劑可直4妻灌輸入腦部。已知有多種直^妄向腦部灌l(xiāng)命化合物的方法，且這些方法對于向患有神經(jīng)紊亂的人類患者傳遞治療化合物非常有效。這些方法包4舌適用泵向腦部慢性灌輸，立體定向灌輸，臨時間質(zhì)導(dǎo)管，永久顱內(nèi)導(dǎo)管灌輸，以及外科手術(shù)植入的可生物降解的灌輸。例如，參見Gill等人，同前文；Scharfen等人，"HighActivityIodine-125InterstitialImplantForGliomas,"/"A/Owco/ogyP/zjv^.24(4):583-91(1992);Gaspar等人，"Permanent1251ImplantsforRecurrentMalignantGliomas,"iaW"/7'cw0"co/ogy所o/.43(5):977--82(1999》chapter66,pages577-580,Bellezza等人,"StereotacticInterstitialBrachytherapy,"inGilderiberg等人,TextbookofStereotacticandFunctionalNeurosurgery,McGraw-Hill(1998》以及Brem等人,"TheSafetyofInterstitialChemotherapywithBCNU-LoadedPolymerFollowedbyRadiationTherapyintheTreatmentofNewlyDiagnosedMalignantGliomas:PhaseITrial,"乂臉腳-(9,/ogy26:111-23(1995)。該組合物還可包4舌一種分散于作為該化合物適當(dāng)傳遞或支持系統(tǒng)的生物相容載體材料的本發(fā)明的NgRl拮抗劑。緩釋載體的適當(dāng)范例包括成形(例如栓劑或膠嚢)的半透性聚合物基質(zhì)?？芍踩氲幕蚴俏⒛z嚢狀的緩釋基質(zhì)包括具乳酸(U.S.PatentNo.3,773,319;EP58,481)，L-谷氨酸和gamma-乙基-L-谷氨酸酯共聚物(Sidman等人，化opo/少wera22:547-56(1985));聚(2-羥乙基國異丁烯酉吏酉旨)，乙火希醋酉交乙烯(Langer等人，Afo/er.15:167-277(1981);Langer，C/zew.Tec/z.72:98-105(1982》或聚-D-(-)-3羥基丁酸(EP133,988)。在本發(fā)明的部分實施方式中，NgRl拮抗劑通過直接灌輸至腦部適當(dāng)區(qū)域的方式施用至患者。例如，參見Gi11等人.，"DirectbraininfusionofglialcelllinederivedneurotrophicfactorinParkinsondisease,"A^~M^/.9:589-95(2003)。此外還存在其它才支術(shù)并可用于施用本發(fā)明所述的NgR4吉3元劑。例如，可采用Riechert-Mundingeri殳備和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定^立i殳備實現(xiàn)立體定向安置導(dǎo)管或植入物。一種對比增強(qiáng)計算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)掃描(注射120ml歐乃派克，350mg》典酒/ml，層厚2mm)可支4爭三維多層治療計劃(STP,Fischer,Freiburg,Germany)。該4支術(shù)支4寺在》茲共4展影傳_研究的基礎(chǔ)上進(jìn)^亍計劃，融合CT和MRI目相W言息以進(jìn)ff明確的目標(biāo)確認(rèn)。經(jīng)改造后可配合4吏用GECT掃描4義(GeneralElectricCompany,Milwaukee,WI)的Leksell立體定向系纟克(DownsSurgical,Inc.,Decatur,GA)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)立體定向系纟克(Radionics,Burlington,MA)可用于該種用途。因此，在灌輸i刀期，可將BRW立體定向框架的環(huán)狀底座圏可附著在患者的頭骨上?？梢?mm的間隔對帶有夾在底盤上的石墨棒定位框的(目標(biāo)組織)區(qū)域獲取連續(xù)CT層。計算機(jī)治療計劃程序可以在采用石墨棒成像的CT坐標(biāo)在CT空間和BRW空間之間繪圖的VAX11/780計算才幾(DigitalEquipmentCorporation,Maynard，Mass.)上運行?？贵w,抗原結(jié)合片,殳，可溶性受體，融合蛋白，多聚核苷酸和組合物的4吏用在部分實施方式中，本發(fā)明提供了通過向有此需要的哺乳動物施用抗-Nogo受體-1抗體，該種抗體的抗原結(jié)合片,殳，可溶性Nogo受體-1多肽，或包含該種多肽的融合蛋白來抑制Nogo受體-1活性的方法。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了抑制Nogo受體-1與配體結(jié)合的方法，其包括將Nogo受體-l與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片萃史相4妄觸。在部分實施方式中該配體選自由NogoA,NogoB,NogoC,MAG和OM-gp構(gòu)成的組合。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了抑制神經(jīng)元中生長相接觸。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了減少神經(jīng)元中神經(jīng)突生長或抽芽抑制的方法，其包括將神經(jīng)元與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片l史相4妻觸。在部分實施方式中，該神經(jīng)元為CNS神經(jīng)元。在部分該方法中，該神經(jīng)突生長或抽芽為軸突生長。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中促進(jìn)具有死亡風(fēng)險的神經(jīng)元存活的方法，其包括(a)纟是供表達(dá)(i)抗-Nogo受體_1抗體或其抗原結(jié)合片段；或(ii)可溶性Nogo受體-1多肽的培養(yǎng)后的宿主細(xì)胞；以及(b)在該神經(jīng)元的位點或附近將該宿主細(xì)胞導(dǎo)入該噴乳動物。AlmudenaRamon-Cueto，MIsabelCordero,FernandoFSantos-Benito和JesusAvila(2000)Functionalrecoveryofparalegicratsandmotoraxonregenerationintheirspinalcordsbyolfactoryensheathingcells.jVewrow25,425-435。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了促進(jìn)哺乳動物中具有死亡風(fēng)險的神經(jīng)元存活的基因治療方法，其包括在該神經(jīng)元位點或附近施用包含了編碼(a)抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段；或(b)可溶性Nogo受體-1多肽的核苦酸序列的病毒載體，其中該抗-Nogo受體-1抗體，抗原結(jié)合片l史或可溶性Nogo受體-1多肽在p甫乳動物中由該核苷酸序列表達(dá)的量足以促進(jìn)該神經(jīng)元的存活?？捎糜谠摲N實施方式的病毒載體和方法描述于，例如Nogl等人，Z/i/wa"G匿r/z簡"，73:1483-93(2002)。在部分實施方式中，本發(fā)明才是供了抑制Nogo受體-1與配體結(jié)合的方法，其包括將配體與本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽或Nogo受體-1融合蛋白相4妻觸。在部分實施方式中，本發(fā)明4是供了調(diào)節(jié)Nogo受體-1配體活性的方法，其包括將Nogo受體-1配體與本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽或Nogo受體-l融合蛋白相接觸。在部分實施方式中，本發(fā)明-提供了抑制神經(jīng)元中生長錐萎縮的方法，其包括將Nogo受體-1配體與本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽或Nogo受體-1融合蛋白相4妻觸。在部分實施方式中，將Nogo受體-1配體與本發(fā)明的可〉容性Nogo受體-1多肽或Nogo受體-1融合蛋白相沖妻觸。在部分實施方式中，該神經(jīng)元為CNS一申經(jīng)元。在部分實施方式中該配體選自由NogoA,NogoB,NogoC，MAG和OM-gp構(gòu)成的組合。在部分實施方式中，該神經(jīng)突生長或抽芽為軸突生長。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了促進(jìn)神經(jīng)突生長的方法，其包括將神經(jīng)元與本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸或組合物相4妻觸。在部分實施方式中，該多肽，多聚核苦酸或組合物抑制神經(jīng)突生長抑制。在部分實施方式中，該神經(jīng)元在哺乳動物體內(nèi)。在部分實施方式中，該哺乳動物為人類。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了抑制NgRl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包括將神經(jīng)元與有效量的本發(fā)明多肽，多聚核苷酸或組合物相接觸。在部分實施方式中，該神經(jīng)元在哺乳動物體內(nèi)。在部分實施方式中，該哺乳動物為人類。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，紊亂或損傷的方法，其包4舌向需要該種治療的哺乳動物施用有效量的本發(fā)明多肽，多聚核苷酸或組合物。在部分實施方式中，該疾病，紊亂或損傷為多發(fā)性^使化癥，ALS,亨廷頓病，阿爾茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神經(jīng)病變，中風(fēng)，外傷性腦損傷，脊髓損傷，^L神經(jīng)炎，青光眼，聽力喪失以及腎上A良腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。此處所述的任意類型的抗體或受體可進(jìn)行治療性應(yīng)用。在部分實施方式中，該抗-Nogo受體-1抗體為人源抗體。在部分實施方式中，該哺乳動物為人類患者。在部分實施方式中，為進(jìn)行獸用或作為人類疾病的動物才莫型，該抗體或其抗原結(jié)合片賴j皮施用至表達(dá)Nogo受體-1的非人類哺乳動物(例如，靈長動物，食蟹猴或恒河猴)，其中該Nogo受體-1與該抗體交叉反應(yīng)。該種動物才莫型可用于評估本發(fā)明的抗體的治療效果。在部分實施方式中，抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段，或可溶性Nogo受體-1多肽或融合蛋白的施用被用于治療脊髓損傷以促進(jìn)損傷位點的軸突生長。本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片l殳，或可溶性Nogo受體-l多肽或融合蛋白可單獨提供，或與其它調(diào)節(jié)特定病理作用的其它藥劑聯(lián)合或順序聯(lián)合^是供。例如，可在中風(fēng)后聯(lián)合施用抗炎劑，以作為阻斷進(jìn)一步神經(jīng)元損傷并抑制軸突再生的手段如此處所用，當(dāng)Nogo受體-1抗體，抗原結(jié)合片,殳，可溶性Nogo受體-1多肽或Nogo受體融合蛋白與一種或多種附加治療劑同時，連續(xù)或獨立施用時，可i人為這兩者耳關(guān)合施用。本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體，抗原結(jié)合片,殳，可溶性Nogo受體-l多肽，Nogo受體-1融合蛋白可通過腸胃外，皮下，月永內(nèi)，月幾肉，透皮，吸入或口月空途徑進(jìn)4亍施用。例如，通過孩吏量注射向損傷^立點局部施用藥劑。典型的^立點包4舌，<旦不限于，由損傷引起的脊柱中受損區(qū)域。施用的劑量將取決于受體的年齡，健康和體重，同時存在的治療(如有)類型，治療頻率，以及預(yù)期作用的性質(zhì)。本發(fā)明的化合物通?？稍诓溉閯游?例如人，羊，馬，牛，豬，狗，貓，大鼠和小鼠)體內(nèi)，或在體外^f吏用。本發(fā)明的載體在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含編碼序列的重組DNA分子(rDNA)。此處所用的rDNA分子為經(jīng)過分子纟喿作的DNA分子。用于生成rDNA分子的方法以為本領(lǐng)域7>知，參見Sambrook等人.,MolecularCloning-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)。在部分rDNA分子中，編石馬DNA序列被可操作地連接至表達(dá)控制序列和載體序列。在部分實施方式中，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明多肽的核酸的載體。如本領(lǐng)域公知，與本發(fā)明的核酸可操作連4妻的載體和表達(dá)控制序列的選擇直接依賴于所需的功能(例如，蛋白表達(dá))以及待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體至少能夠引導(dǎo)包括該rDNA分子的結(jié)構(gòu)基因的復(fù)制或插入宿主染色體，并優(yōu)選還能表達(dá)該結(jié)構(gòu)基因。用于調(diào)節(jié)可操作連接的蛋白編碼序列表達(dá)的表達(dá)控制元件已為本領(lǐng)域所知并包括，j旦不限于，-漆導(dǎo)型啟動子，組成性啟動子，分泌信號以及其它調(diào)節(jié)元件。優(yōu)選地，該-漆導(dǎo)型啟動子易于控制，氯對宿主細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分產(chǎn)生響應(yīng)。在一種實施方式中，該包含編碼核酸分子的載體將包括原核復(fù)制子，即，能夠在原核宿主細(xì)月包(例如，細(xì)菌宿主細(xì)月包，其轉(zhuǎn)化細(xì)胞)中引導(dǎo)染色體外的重組DNA分子的自主復(fù)制和維持的DNA序列。該種復(fù)制子已為本領(lǐng)域公知。此外，包含原核復(fù)制的基因。典型的細(xì)菌耐藥性基因為可對氨比西林或四環(huán)素形成抗性的基因。包含原核復(fù)制子的載體還可包括原核或噬菌體啟動子，其能夠引導(dǎo)編碼基因序列在細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如五.co".)中的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)。啟動子是由能夠允許結(jié)合RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA序列形成的表達(dá)控制元件。與細(xì)菌宿主相容的啟動子通?？商峁楹锌刹迦氡景l(fā)明的DNA片段的常規(guī)限制性位點的質(zhì)斗立載體。該種載體質(zhì)并立的范例為pUC8，pUC9，pBR322以及pBR329(Bio-RadLaboratories),pPL和pKK223(Pharmacia)。任何適用的原核宿主均可用于表達(dá)編碼本發(fā)明的蛋白的重組DNA分子。與真核細(xì)力包相容(優(yōu)選與脊片,動物細(xì)力包相容)的表達(dá)載體，還可用于形成包含編碼序列的rDNA分子。真核細(xì)胞表達(dá)載體以為本領(lǐng)域/>知并可乂人多個/>司購^尋。該種載體通常包含可插入目標(biāo)DNA片^:的常MJ艮制性位點。該種載體的范例為pSVL和pKSV-10(Pharmacia),pBPV畫l,pML2d(InternationalBiotechnologies),pTDTl(ATCC31255)以及其它真核表達(dá)載體。用于構(gòu)建本發(fā)明的rDNA分子的原核細(xì)胞表達(dá)載體可進(jìn)一步包括在真核細(xì)胞中有效的選擇性標(biāo)記，優(yōu)選耐藥選4奪性標(biāo)記。優(yōu)選的耐藥標(biāo)記為其表達(dá)可導(dǎo)致新霉素耐藥性的基因，即，新霉素石粦酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因。(Southern等人.，《/7kfo/.爿wa/.7:327-341(1982))。替代性地，該選4奪性標(biāo)記可出現(xiàn)在單獨的質(zhì)粒上，該兩種載體可通過共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)^M并通過在以適當(dāng)?shù)乃幬镒鳛檫x"f奪性標(biāo)記的培養(yǎng)中選4奪轉(zhuǎn)染體。為表達(dá)本發(fā)明的抗體或抗體部分，編碼部分或全長輕和重《連的DNAs蜂皮插入表達(dá)載體以4吏基因被可才喿作地連4妄至轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。表達(dá)載體包括質(zhì)粒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，粘粒，YACs，EBV-衍生的游離基因等。該抗體基因被連接至載體，從而使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻i,控制序列可發(fā)4軍其預(yù)期的調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻i%的功能。選定的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可插入單獨的載體。在部分實施方式中，兩種基因^皮插入同一表達(dá)載體。該抗體基因可通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入表達(dá)載體(例如，抗體基因片段的互補限制性位點與載體連接，或當(dāng)沒有限制性位點時進(jìn)行平頭末端連接)。如上所述，實用的載體為編碼功能完整的人Ch或免疫球蛋白序列，具有適當(dāng)?shù)母脑煜拗菩晕稽c以使任意Vh或Vl序列可以簡單地插入和表達(dá)的載體。在該種載體中，通常可在插入的J區(qū)的剪接供體位點和人C區(qū)前的剪接受體位點之間，或者在人Ch外顯子內(nèi)的剪4妄區(qū)產(chǎn)生剪4妻。多聚&，苦酸化和轉(zhuǎn)錄終止出現(xiàn)在編碼區(qū)下游的天然染色體位點。該重組表達(dá)載體還可編碼促進(jìn)抗體鏈/人宿主細(xì)胞分泌的信號肽?？贵w鏈基因可被克隆進(jìn)入載體，/人而4吏信號肽被框內(nèi)連接至抗體鏈基因的氨基末端。該信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或外源信號肽(即，來自非免疫球蛋白的信號肽)。除了本發(fā)明的免疫原性多肽，Nogo受體-l抗體，抗原結(jié)合片l殳，可溶性Nogo受體-1多肽以及可溶性Nogo受體-1融合蛋白以外，本發(fā)明的重組表達(dá)甾體攜帶了控制其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能理解表達(dá)載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇將依賴于諸如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇，預(yù)期的蛋白表哺乳動物細(xì)胞中引導(dǎo)高水平蛋白表達(dá)的病毒元件，例如，例如來自于逆轉(zhuǎn)錄LRTs,細(xì)胞巨化病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強(qiáng)子)，猿病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強(qiáng)子)，腺病毒(例如，腺病毒主晚期啟動子(AdmlP))，多瘤的啟動子和/或增強(qiáng)子以及天然免疫J求蛋白和月幾動蛋白啟動子等強(qiáng)哺乳動物啟動子。有關(guān)病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進(jìn)一步描述參見，例如，Stinski的美國專利5,168,062,Bell等人的美國專利4,510,245以及Schaffher等人的美國專利4,968,615。在一個實施方式中可采用稱為NEOSPLA(美國專利6,159,730)的BiogenIDEC,Inc.的專有表達(dá)載體。該載體包含了細(xì)月包巨化病毒啟動子/增強(qiáng)子，小鼠beta球蛋白主啟動子，SV40復(fù)制起始區(qū)，牛生長激素多聚腺苷酸化序列，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1和外顯子2，二氫葉酸還原酶基因和前導(dǎo)序列。據(jù)發(fā)現(xiàn)該載體可在轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO細(xì)胞，并經(jīng)過含G418培養(yǎng)基中選4奪和曱氨蝶呤擴(kuò)增后可導(dǎo)致極高水平的表達(dá)。當(dāng)然，任何能在真核細(xì)胞引發(fā)表達(dá)的表達(dá)載體均可用于本發(fā)明。適用載體的范例包4舌，^旦不限于質(zhì)粒pcDNA3，pHCMV/Zeo,pCR3.1，pEFl/His,pIND/GS，pRc/HCMV2，pSV40/Zeo2,pTRACER-HCMV,pUB6/V5畫His,pVAXl和pZeoSV2(可乂人Invitrogen,SanDiego,CA購買)，以及質(zhì)沖立pCI(可/人Promega,Madison,WI購買)。其它的真核細(xì)力包表達(dá)載體已為本領(lǐng)i或所知并可在市場上購得。該種載體通常包含可插入目標(biāo)DNA片,炎的常^L限制性^立點。示范性載體包4舌pSVL和pKSV-10(Pharmacia),pBPV-1,pml2d(InternationalBiotechnologies),pTDTl(ATCC31255),逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pMIG和pLL3.7,A泉病毒穿4炎載體pDC315以及AAV載體。其它示范性載體系統(tǒng)可參見美國專利6,413,777。本發(fā)明的其它實施方式中采用慢病毒載體表達(dá)本發(fā)明的多聚核苷酸，例如，NgR拮抗劑多聚核苷酸，例如，siRNA分子。慢病毒可以感染非周期細(xì)胞和有絲分裂后細(xì)胞，并可纟是供在發(fā)育過程中不被沉默的優(yōu)勢，從而可通過感染胚胎干細(xì)胞來生成轉(zhuǎn)基因動物。Milhavet等人.，尸/za環(huán)腳/og/ca/iev.55:629-648(2003)。其它的多聚核苷酸表達(dá)病毒載體可基于，但不限于，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒或曱病毒進(jìn)行構(gòu)建。本發(fā)明的額多聚核苷酸(例如，siRNA分子序列)的轉(zhuǎn)錄可通過針對真核RNA聚合酶I(polI),RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polin)的啟動子進(jìn)4亍啟動。由polII或polIII啟動子進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄在所有的細(xì)月包中均有高水平表達(dá)；纟會定polII啟動子在給定細(xì)胞類型中的水平依賴于附近存在的基因調(diào)節(jié)序列的性質(zhì)(增強(qiáng)，沉默等)。只要原核RNA聚合酶在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)，同樣可以采用原核RNA聚合酶啟動子(Elroy-Stein和Moss,/Voc.淑/.Jcad5W.87:6743-7(1990);Gao和Huang,他c/e/c爿c油W仏21:2867-72(1993);Lieber等人，M^/^A五wzymo/.217:47-66(1993);Zhou等人，Mo/.Ce〃.肌o/.10:4529-37(1990))。許多研究者已經(jīng)i正實了由該種啟動子表達(dá)的多聚核苷酸可作用于哺乳動物細(xì)月包中(侈'B口，Kashani-Sabet等人，爿""^raei^.Dev.2:3-15(1992);Ojwang等人，7Va//.Jc^/.5W.6^489:10802-6(1992);Chen等人，M/c/e/cM.20:4581-9(1992);Yu等人，尸roc.淑/.^cadt/SJ90:6340-4(1993);L'Huillier等人，五Affi(9乂11:4411-8(1992);Lisziewicz等人，尸roc.A^"Sc/.t/SJ90:8000-4(1993);Thompson等人，M/c/e/d/AM.23:2259(1995);Sullenger&Cech,5We"ce262:1566(1993))。更具體而言，轉(zhuǎn)錄單位(例如來自于編石馬U6小核RNA(snRNA),壽爭移RNA(tRNA)和&，病毒VARNA的基因的轉(zhuǎn)錄單位)可用于在細(xì)胞中生成高濃度的目標(biāo)RNA分子，^口siRNA(Thompson等人,同上文；Couture禾口Stinchcomb,1996,同上文；Noonberg等人，A^/c/e/c爿c/d7仏22:2830(1994);Noonberg等人，美國專利5,624,803;Good等人，7Yzer.4:45(1997);Beigelman等人，國際PCT^>開WO96/18736。siRNA轉(zhuǎn)錄單位可一皮整合如多種載體以導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，該種載體包括j旦不限于，質(zhì)粒DNA載體，病毒DNA載體(例如&泉病毒或&i相關(guān)病毒載體)，或是病毒RNA載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或曱病毒載體)(其綜述參見Couture禾口Stinchcomb，1996,同上文)。除了外源基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可攜帶其它序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制(例如，復(fù)制起始區(qū))的序列以及選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記可幫助選擇未導(dǎo)入載體的宿主細(xì)月包(例3。，參見Axel等人的美國專利4,399,216;4,634,665以及5,179,017)。例如，該選4奪性標(biāo)i己基因通?？韶愇溆鑼?dǎo)入了該載體的宿主細(xì)胞對藥物(例如G418,潮霉素或氨曱喋呤)的耐受性。優(yōu)選的選4奪性標(biāo)記基因包括二氪葉酸還原酶(DHFR)基因(針對dhfr-宿主細(xì)胞在氨曱喋呤選擇/擴(kuò)增中的使用)和neo基因(針對G418選擇)。宿主細(xì)胞和重組生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白的方法編碼本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體，免疫原性肽，可溶性Nogo受體-1多肽，可溶性Nogo受體-1融合蛋白的核S吏分子和包含這些核酸分子的載體可用于適當(dāng)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化可以是用于向宿主細(xì)胞導(dǎo)入多聚核苷酸的任何已知方法。將外源性多聚核普酸導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法已為本領(lǐng)域公知并包括葡萄并唐介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，磷酸4丐沉淀，聚凝胺介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融合，電穿孔，通過在脂質(zhì)體中包封多聚核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以及直接將DNA顯微注射進(jìn)入細(xì)胞核。此外，還可通過病毒載體將核酸分子導(dǎo)入哺乳動4為纟田月包。本發(fā)明的rDNA分子可通過通常與所用載體和所用宿主系統(tǒng)類型有關(guān)的7>知方法轉(zhuǎn)化適當(dāng)細(xì)月包宿主。對于轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞，可采用電穿孔和鹽處理法(參見，例如，Sambrook等人.,Afo/ecw/arC7om'"g-爿丄a6ora^orjv"A/awi/a/,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);Cohen等人，/Voc.TV"http://.Jca<i.5"c/.tTS^69:2110-2114(1972))。對于用含rDNA載體轉(zhuǎn)化脊一,動物細(xì)月包，可采用陽離子脂質(zhì)體或鹽處理法(參見，例如，Graham等人.,Fz>o/ogy52:456-467(1973);Wigler等人，A^/.爿c^/."&47(5:1373-1376(1979))。成功壽爭4匕的細(xì)力包(即，包含本發(fā)明rDNA分子的細(xì)月包)可通過包括選才奪性標(biāo)記選擇在內(nèi)的公知技術(shù)進(jìn)行鑒定。例如，通過導(dǎo)入本發(fā)明rDNA所得的細(xì)胞可通過克隆生成單獨克隆。從該種克隆所得的細(xì)胞可進(jìn)行采集，溶解，并釆用如Southern,j:Mo/.所o/.98:503-517(1975)所述的方法一全測其DNA成分中rDNA的存在或通過免疫學(xué)方法測定細(xì)月包生成的蛋白。用于表達(dá)本發(fā)明的方法中釆用的本發(fā)明的多肽或抗體的宿主細(xì)力包可以是原核或真4亥細(xì)"包。可作為表達(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系已為本領(lǐng)域公知并包括許多可從美國菌種保藏中心(ATCC⑧)獲得的永生化細(xì)胞系。其中包括，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，NSO，SP2細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞，猴腎細(xì)胞(COS)，人G2)，A549細(xì)月包，以及多種其它細(xì)月包系。特別優(yōu)選的細(xì)胞系為通過測定那種細(xì)胞系具有最高表達(dá)水平所選4奪的細(xì)胞系。其它有用的真核宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞。其它可供使用的細(xì)胞系為昆蟲細(xì)胞系，例如Sf9細(xì)胞。示范性的原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌和鏈霉菌。當(dāng)編碼本發(fā)明的免疫原性多肽，Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體-1多肽和可溶性Nogo受體-1融合蛋白的重組表達(dá)載體被導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞，它們可通過將宿主細(xì)月包培養(yǎng)一定時間進(jìn)4亍生產(chǎn)，其中該;備養(yǎng)時間足以允許宿主細(xì)月包中抗體，多肽和融合多肽的表達(dá)，或者更優(yōu)選允許向宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中分泌本發(fā)明的免疫原性多肽，Nogo受體-1抗體或抗體結(jié)合片段，可溶性Nogo受體-1多肽和可溶性Nogo受體-1融合蛋白。本發(fā)明的免疫原性多肽，Nogo受體-1抗體或抗體結(jié)合片段，可溶性Nogo受體-1多肽和可溶性Nogo受體-1融合蛋白可通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)從培養(yǎng)基中回收。此夕卜，本發(fā)明的免疫原性多肽，Nogo受體-l抗體或抗體結(jié)合片辜殳，可-容性Nogo受體-1多肽和可i容性Nogo受體-1融合蛋白在生產(chǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)可通過一系列已知技術(shù)得到增強(qiáng)。例如，谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)系統(tǒng)(GS系統(tǒng))為增強(qiáng)特性條件下的表達(dá)的常用方法。有關(guān)GS系統(tǒng)的完全或部分的討論可參見歐洲專利0216846,0256055和0323997以及歐洲專利申i青89303964.4。宿主細(xì)"包本發(fā)明進(jìn)一步才是供了以編碼本發(fā)明Nogo受體-1抗體，抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體-1多肽和/或可溶性Nogo受體-1融合蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。只要細(xì)胞系能夠與細(xì)胞培養(yǎng)方法相容，與表達(dá)載體的增殖以及與基因產(chǎn)物的表達(dá)相容，用于表達(dá)本發(fā)明的蛋白的真核細(xì)胞不受限制。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括，但不限于，酵母，昆蟲和哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選來自于如小鼠，大鼠，猴或人細(xì)胞系的脊推動物細(xì)胞。有用的真核細(xì)胞的范例包括可作為CCL61從ATCC⑧獲得的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，可作為CRLl658/人ATCC獲得的NIH瑞士小鼠胚胎細(xì)胞NIH-3T3，幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)，以及類似的真核組織i咅養(yǎng)細(xì)月包系。其它有用的真核宿主細(xì)胞包括4直物細(xì)胞。其它可供4吏用的細(xì)胞系為昆蟲細(xì)胞系，例如Sf9細(xì)胞。示范性的原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌和4連霉菌。-使用rDNA分子生產(chǎn)重la蛋白本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用此處所述的核酸分子生產(chǎn)本發(fā)明Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片革殳，可溶性Nogo受體-1多肽和/或可溶性Nogo受體-1融合蛋白的方法。一般而言，蛋白的重組形式的生產(chǎn)通常包含以下步冬聚首先，獲得編碼本發(fā)明蛋白的核酸分子。如果該編碼序列沒有被內(nèi)含子中斷，它直接適用于在任何宿主中表達(dá)。然后該核酸分子被選4奪性地與適當(dāng)?shù)目刂菩蛄?如上所述)進(jìn)行可操作的鍵合，以形成包含該蛋白開放閱讀框架的表達(dá)單元。該表達(dá)單元可用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，而該轉(zhuǎn)化的宿主在允許該重組蛋白生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)。該重組蛋白可選才奪性地乂人該培養(yǎng)基或細(xì)胞分離；在某些可以容忍雜質(zhì)的情況下不需要對該蛋白進(jìn)行回|欠和純^匕。前述每一個步驟均可通過多種途徑實現(xiàn)。例如，該目標(biāo)編碼序列可從基因組片段獲得并可直接用于適當(dāng)?shù)乃拗?。在多種宿主中可操作的表達(dá)載體可采用如上列舉的適當(dāng)?shù)膹?fù)制和控制序列實現(xiàn)構(gòu)建?？刂菩蛄校磉_(dá)載體和轉(zhuǎn)化方法依賴于用于表達(dá)該基因的宿主細(xì)胞的類型并在之前進(jìn)行了詳細(xì)的討論。如正常情況下不存在，適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c可被添加至編碼序列的末端從而提供可插入這些載體的可刪除基因。技術(shù)人員可簡單地采用本領(lǐng)域已知的任何宿主/表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合本發(fā)明的核酸分子生成重組蛋白。對相關(guān)領(lǐng)域的普通纟支術(shù)人員而言，對此處所述的方法和應(yīng)用進(jìn)4亍的其它適當(dāng)?shù)摹穭?wù)飾和更改可以顯而易見的，且該種和更改可不脫離本發(fā)明或其任意實施方式的范圍。為更好理解本發(fā)明，陳述了以下的實施例。這些實施例僅供闡述目的，不可解釋為以任〃f可方式對本發(fā)明的范圍進(jìn)4亍限制。具體實施例方式實施例1V、虞卓乂謦戎-7WX(9^€#-7特異性結(jié)合本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽的抗Nogo受體-1抗體可通過以下方法和步艱《進(jìn)4亍制備。免疫采用了兩種免疫步艱纟1.以COS-7細(xì)胞或含Nogo受體-l(NogoR-l)的細(xì)胞膜作為免疫原將大鼠Nogo受體-1基因(GenBankTMNo.AF462390)亞克隆進(jìn)入含有CMV啟動子和用于藥物選4奪的遺傳霉素(geneticin)抗性基因的哺乳動物表達(dá)載體pEAG1256(Biogen⑧)。通過S叩erfect(Qiager^)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入COS-7細(xì)胞。使用遺傳霉素(GibcoTM,2mg/ml)選^奪轉(zhuǎn)染體，克隆并通過FACS馬會i正Nogo受體-1蛋白的表面表達(dá)。COS-7月莫可參照[Wang等人.，J.Neurochem.75:1155-1161(2000)]所述的方法通過兩次洗滌由這些細(xì)胞制備得到，并以lmg/ml[蛋白濃度]于-70V貯存在10%甘油中。使用含有50昭大鼠Nogo受體-l-COS-7膜或者含有在表面上表達(dá)Nogo受體-1的全COS-7細(xì)月包和50piRJBIMPL+TDM+CWS佐劑的乳劑每兩周一次腹腔免疫八周大的雌性RBF小鼠(JacksonLabs,BarHarbor,ME)。在首次免疫前，第二和第三次免疫7天后，以及第三次免疫38天后采集免疫小鼠的血清，并參照下文描述使用ELISA沖企測抗-Nogo受體-1抗體效價。2.以特異性Nogo受體-1肽作為免疫原4吏用載體NTiTM軟件對大鼠Nogo受體-1基因序列進(jìn)行抗原性分析(圖2)。通過標(biāo)準(zhǔn)的戊二醛法將分析中鑒定得到的抗原性肽結(jié)合至匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。使用含有50嗎KLH-結(jié)合肽和50|al完全Freund佐劑(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO)的乳劑每兩周一次腹腔免疫八周大的站偉性RBF小鼠(JacksonLabs,BarHarbor,ME)。在首次免疫前，第二和第三次免疫1周后收集免疫小鼠的血清，并一企測抗-Nogo受體_1抗體效〗介。第三次免疫后給用加強(qiáng)劑量。該加強(qiáng)劑量免疫三天后，啟動融合實馬全。雜交瘤生產(chǎn)和篩選通過ELISA篩選以抗原性Nogo受體-1肽免疫的小鼠的血清，并通過流式細(xì)月包4義篩選以表達(dá)Nogo受體-1的COS-7細(xì)月包免疫的小鼠的血清。通過流式細(xì)胞儀鑒定對特異性結(jié)合Nogo受體-1-COS-7細(xì)胞的抗體呈陽性的小鼠并將其處死。才艮據(jù)描述(Kennett等人，Mo"oc/owa/v4"/7'6oWwj7VewZ)/wem7'ow^S/o/og/ca/Jwa/j^s7、PlenumPress,NewYork(1993))/人該小鼠分離脾細(xì)月包并融合至FL653骨髓瘤(一種Ig-/HGPRT國Balb/c小鼠脾細(xì)月包APRT-4汙生物，寸呆存在含10%FBS,4500mg/L葡萄#唐，4mML-谷胺酰胺，和20mg/ml8-氮鳥噤p令的DMEM中)。將融和細(xì)月包涂布于24-或48-孔一反(CorningGlassWorks,Corning,NY),并以含有^^票p令，氨p萊口令和胸苦的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。按照下述方法以ELISA或流式細(xì)胞4義通過對Nogo受體-l-COS-7細(xì)月包或Nogo受體-1抗原性肽的結(jié)合篩選抗AAT培養(yǎng)。通過有限稀釋法進(jìn)一步亞克隆陽性纟鼓孔中的細(xì)胞。為了篩選與Nogo受體-1抗原性肽結(jié)合的抗體，該種用作免疫原的肽,皮結(jié)合至BSA。向96孑LMaxiSorpTM平才反(NuncTM)的每一個孩吏孔添加0.5pg〉容于50(alpH9.0的0.1M重碳酸鈉l^沖液中的結(jié)合肽。將該平才反在37。C下孵育1小時或在4。C下孵育16小時，并采用25mMHEPES(pH7.4,含有0.1°/。BSA,0.1%卯白蛋白，0.1%blotto和0.001%疊氮化物)阻斷非特異性結(jié)合位點。添加雜交瘤上清液并在25。C下孵育1小時。以PBS洗滌三次后，向每個孩吏孔添加50(^1的一種夢束才艮過氧〗匕酶結(jié)合的山羊抗小鼠二級抗體(JacksonImmunoResearchlnc.)的1:10,000,希禾奪液并繼續(xù);t咅養(yǎng)1小時。三次洗滌后，以TMB(Pierce)顯色并以2M碌u酸終止。以分光光度計在450nm下監(jiān)測色彩強(qiáng)度。通過如下所述篩選結(jié)合全長Nogo受體-1的抗體。參照銷售商描述以0.1(iMCellTrackerTM綠色CMFDA(分子^冢4十，Eugene,OR)標(biāo)記COS-7細(xì)月包。在以抗-Nogo受體-1測試血清孵育前將等量的CellTrackerTM標(biāo)記的對照細(xì)胞與洗滌后的Nogo受體-l-COS-7細(xì)胞相混合。將50微升的細(xì)胞混合物分布到96孔V形底聚苯乙烯板(Costar3877,Corning,NY)上，并添力口100|al的雜交瘤上清液或3于照抗-Nogo受體-1抗體。在4。C下:^養(yǎng)30分鐘后，洗滌細(xì)月包并與50jal含于PBS中的R-藻紅蛋白結(jié)合親和性純F(ab')2片段山羊抗小鼠IgGFcgamma特異性二級抗體(1:200,JacksonImmunoResearchLaboratory,WestGrove,PA)進(jìn)4亍孵育。在孵育末期，以PBS洗滌細(xì)胞兩次并懸浮于含1%FBS的200nlPBS中，然后進(jìn)行FACS分坤斤?；蛘邔ogo受體-1-COS-7細(xì)胞與雜交瘤上清液混合并以R-藻紅蛋白-結(jié)合山羊抗-小鼠二級抗體處理，然后直4妻進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)FACS分析。我們通過多種免疫原生成了25種抗-Nogo受體-1抗體。我們以對應(yīng)大鼠Nogo受體-1殘基110-125的肽序列作為免疫原生成了兩種抗體，7E11和5B10。我們通過乂人全長大鼠Nogo受體-1轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞制備的膜作為免疫原生成了三種抗體，1H2,3G5和2F7。我們以sNogoR310-Fc作為免疫原生成了13種抗體(1D9.3,1E4.7,1B4.3,2C4.3,1F10.3,2H1.4,1H3.3,1G4.1.1E4.1,2G7.1,2C4.1,2F11.1和1H4.1)并以對應(yīng)大鼠Nogo受體-1殘基423-434的肽序列作為免疫原生成了7種抗體(2E8.1，2G11.2和1B5.1)。單克隆抗體7E11和5B10的序列分析我們釆用QiagenRNeasy⑧孩i型試劑盒萃取總RNA，并乂人分離的RNA生成cDNA。我們通過PCR以引物5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3'(SEQIDNO:12)和5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'(SEQIDNO:25)擴(kuò)增輕《連序列。我們通過PCR以引物(SEQIDNO:13)和-3'(SEQIDNO:14)擴(kuò)增重鏈序列。這些引物包含如下簡并核苦酸S4戈表G或C;M^f戈表A或C,R4戈表G或A;W代表A或T;K代表G或T;且Y代表T或C。我們將PCR片段克隆進(jìn)入測序載CDRs的DNA序列。我們概念性翻譯了DNA序列，表2顯示了單克隆抗體7E11和5B10的重和輕鏈的CDR區(qū)的部分氨基S交序列。單抗的重和輕《連的3個CDRs在表2中下劃線表示。7E11和5B10的輕鏈具有94%的氨基酉吏序列一致性而重鏈具有91%的氨基酸序列一致性。單抗7E11,5B10和1H2屬于IgGl同型，單抗3G5和2F7屬于IgG2a同型。該五個單^t每一個老卩帶有kappa同型的輕《連。我們通過該方法分析了其它單克隆抗體的序列。表2.單抗7E11和5B10的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table>單克隆抗體7E11的表位定位單抗7E11可以結(jié)合大鼠和人NgRl。為確定負(fù)責(zé)7E11結(jié)合的表位，我們生成了大鼠NgRl的片段和合成肽并測試其與7E11的結(jié)合。以酸或溴化氰(CNBr)處理包含所有8個LRR區(qū)和N-和C-末端帽子(sNgR310)的大鼠NgRl的重組片革殳并通過凝月交電泳分離該片4殳。未處理sNgR310遷移的表^見分子量為42kDa。sNgR310的酸處理生成15kDa(aa27-aa122)和30kDa(aa123-aa310)兩個主要的裂解產(chǎn)物。CNBr處理生成三個片段，33/35kDa雙重線(aa27-aa229)(可能代表了具有外源糖基化的片段)，10kDa產(chǎn)物(aa241-aa310)，以及l(fā)l-氨基酸片段(aa"0-aa240)(未保留在凝膠上)。以7E114冢測凝月交的western印跡i正實它與完整大鼠NgRl(aa27-aa310),15kDa酸片4殳(aa27-aa122)以及35kDaCNBr片孚殳(aa27-aa229)結(jié)合。7E11不結(jié)合30kDa酸片段(aa123-aa310)或10kDaCNBr片段(aa241-aa310)。15kDa酸片段和35kDaCNBr片段均包含序列LDLSDNAQLRWDPTT(SEQIDNO:1)，這與7E11結(jié)合NgRl上的單個表位相一致。7E11結(jié)合^f立點可通過測試sNgR310的月爽蛋白酶月太消4b進(jìn)一步分析。HPLC分析顯示了多個片段，提示NgRl序列中具有多個胰蛋白酶敏感型賴氨酸和精氨酸殘基。7E11僅結(jié)合單個胰蛋白酶消化肽，這為7E11結(jié)合NgRl上的單個表位提供了其它證據(jù)。后續(xù)的質(zhì)i普(MS)和序列分一斤鑒定該結(jié)合3太為AAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQIDNO:26)。對LDLSDNAQLRWDPTT肽(SEQIDNO:l)進(jìn)行進(jìn)一步的定位分析。以胰蛋白酶消化該肽得到兩個主要的片段LDLSDNAQLR(SEQIDNO:27)和WDPTT(SEQIDNO:28),并測試7E11與它們的結(jié)合能力。MS分一斤揭示該抗體結(jié)合肽LDLSDNAQLR(SEQIDNO:27)，因此該肽包含針對7E11的結(jié)合表位。在該肽片段中，具體的MS分析鑒定了多個同樣結(jié)合7E11的亂序的(scrambled)肽，包括在Asnl15和Glnl17處脫氨基，在112或113位添加丙氨酸，或者在114位添加絲氨酸的肽(表3)。這些數(shù)據(jù)顯示該肽片段中的一些氨基酸殘基對于7E11結(jié)合可能并不重要。^3.7￡〃/#合好克賞農(nóng)肽結(jié)合氨基蔣列脫氨基的野生型片段LDLSDNAQLR(SEQEDNO:27)ldlsddaelr(seqidno:29)脫氨基的亂序片段弁1LDLASDNAQLR(SEQEDNO:30)LDLASDDAELR(SEQIDNO:31)脫氨基的亂序片段#2LDALSDNAQLR(SEQIDNO:32)LDALSDDAELR(SEQIDNO:33)脫氨基的亂序片段#3LDLSSDNAQLR(Se6IDNO:34)LDLSSDEAELR(SEQIDNO:35)對來自不同物種的氨基酸序列NgRl，NgR2和NgR3進(jìn)4亍分沖斤，以才艮據(jù)7E11結(jié)合大鼠和人NgRl^f旦不結(jié)合小鼠NgRl，人NgR2或小鼠NgR3這一觀察預(yù)測7E11結(jié)合表位中的關(guān)4建殘基。序列比對顯示大鼠NgRl的氨基酸110-125與人NgRl的相應(yīng)序列一致且小鼠NgRl序列僅在位置119上有一個氨基酸的區(qū)別(在大鼠和人NgRl中為Argl19，而在小鼠NgRl中為Hisll9;表4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>NgRl上的Argll9可促成7E11結(jié)合，因為它與大鼠和人NgRl能很好地結(jié)合，但與小鼠NgRl結(jié)合很差。類似地，由于7E11與NgR3未能4艮好結(jié)合，且由于DNAQLR序列(SEQIDNO:37)中NgR3與NgRl的相應(yīng)序列僅有一個精氨酸的區(qū)別，因此Alal16包含在該表位中。在DNAQLR(SEQIDNO:37)序列中，NgR2的六個殘基中有4個與大鼠NgRl—致。Alal16和Glnl17分別一皮精氨酸和組氨S史替換。這確認(rèn)了Alall6是促成7E11結(jié)合的重要氨基酸殘基，但不一定排除Gln117的參與。為了馬企i正這些4妻觸點，生成了多個在LDLSDNAQLR序列(SEQIDNO:27)中具有點突變的肽并進(jìn)行了7E11結(jié)合測試。該肽一皮固定化至MaxiSorpTM平寺反(NuncTM)，并添加系列碎希釋的7E11。表5顯示了所得的ECs。值。7E11以和原始肽類似的ECso值與Leul10Ala和Aspl11Ala結(jié)合。在測試Glnl17Ala時，EC5o上升了304咅，在測試Argll9His時，EQo上升了25倍。當(dāng)Argl19突變?yōu)楸彼釙r可觀察到EC5G最明顯的變化。<table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table>7E11結(jié)合表位的〗立置還可在sNgR310的新溶解的晶體結(jié)構(gòu)中測定。如同預(yù)期，該結(jié)構(gòu)顯示7E11表位暴露在分子的表面。歹戈基Argll9,Gln117,Alal16禾口Aspl14乂人結(jié)構(gòu)中向外突出，而Leul18和Asnl15位于內(nèi)部。該表位^f立于該結(jié)構(gòu)凹陷表面中的酸性斑塊以及面對其中一側(cè)的石成性表面的頂部。單克隆抗-Nogo受體-1抗體對配體與可溶性Nogo受體-1結(jié)合的抑制測定了上述生成的抗-Nogo受體-1單克隆抗體是否抑制配體與Nogo受體-1的結(jié)合。將0.5(ag如下述生成的包含大鼠Nogo受體-l的氨基酸殘基26-334以及大鼠IgGl分子(sNogoR344-Fc)的4交《連和Fc區(qū)的可溶性Nogo受體-l融合蛋白在250嗎結(jié)合了蛋白-A-或麥胚凝集素的SPA珠上在25。C下固定2小時。向每個樣本微孔添加含于50pl的HEPES-纟爰沖脬育i咅養(yǎng)基(lOmMHEPES，pH7.4,0.1%牛血清白蛋白，0.1%卯白蛋白，2mMMgCl2,2mMCaClz和蛋白酶抑制劑)的偶合了Fc-sNogoR-l,抗-Nogo受體-1單抗和1^11251-Nogo66(Amersham，2000Ci/mmo1,lnM)的SPA王朱。16小日于后，通過TopCount(Packard)在一式四^f分的才羊本中才全測;改射活性。/人曲線擬合分析計算得到ICso值(PRISM,GraphPad軟件，NJ)(圖3)。在部分實-驗中，我們還采用了AP-配體結(jié)合物(例如，AP-Nogo66)并通過監(jiān)測堿性磷酸酶活性來4企測結(jié)合。我們還測定了該單抗阻斷配體MAG-Fc和AP-OM-gp結(jié)合Nogo受體-1的能力。單克隆抗體7E11,5B10,1H2,3G5和2F7均抑制Nogo66，MAG和OM-gp與sNogoR344-Fc的結(jié)合。經(jīng)計算Nogo66對7E11和1H2的ICso分別為400nM和60nM。表6總結(jié)了通過ELISAs監(jiān)測的單抗介導(dǎo)的對三種配體與Nogo受體-1結(jié)合的抑制。表6.單4元抑制NOG066,MAG和OM-GP與NOGO受體畫l的結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>替換百分比在30nM抗體和才艮據(jù)描述從曲線擬合分析測得的特定單抗的EC5。下顯示，"一，，表示沒有可測的活性，"ND"表示未測定。實施例2特異性結(jié)合本發(fā)明免疫原性Nogo受體-1多肽的抗-Nogo受體-lFab-噬菌體抗體還可通過以如下方式在Fab-p藍(lán)菌體庫中篩選進(jìn)行制備。通過大鼠可;容性sNogoR310-Fc蛋白和表達(dá)大鼠Nogo受體-1的COS7細(xì)月包篩選MorphoSysFab卩藍(lán)菌體庫HuCALGOLD。純化并鑒定特異性結(jié)合Nogo受體-1的Fab-噬菌體。14D5的重《連來自于VH2基因而輕鏈來自于VK1基因。表7顯示了這些Fab-噬菌體之一，14D5的重鏈和輕《連的CDRs的氨基酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table>14D5可結(jié)合單〗介和雙i"介形式的大鼠Nogo受體-1。此外，14D5可結(jié)合小鼠和人Nogo受體-1和人Nogo受體-2，^旦不結(jié)合小鼠Nogo受體-3。實施例3為進(jìn)行免疫沉淀，分別在30[il蛋白A或G和1-2昭抗體的存在下將100(il溶解細(xì)胞或50(ilPiPLC處理的細(xì)胞與400或450(il萃取緩沖液[IOmMTris-HCl,pH7.2,0.5%Tween-20TM,0.2mMPMSF]或RIPA緩沖液混合。將混合物在振蕩器上于4。C下孵育16小時。輕柔轉(zhuǎn)動樣本，使蛋白A或G偶合珠聚集成球。以lml洗滌緩沖液(IOmMTris-HCl,pH7.2，0,1%Tween-2(T)洗滌i朱子三次。使用10%原始洗滌緩沖液進(jìn)行最終的洗滌。pl含有10%卩-巰基乙醇的2XSDS中。在4-20%Tris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE前在室溫下孵育樣本。通過SDS-PAGE凝"交分析測定單克隆抗體3G5和2F7可免疫沉淀Nogo受體-1。實施例4為測定實施例1和2中生產(chǎn)的單克隆和Fab-嗟菌體抗體的特異性，我們采用一組Nogo受體-1多肽進(jìn)行了ELISA。該多肽組由sNogoR310陽Fc(包含大鼠Nogo受體-1的氨基酸26-310以及大鼠Fc片4殳的融合蛋白)，sNogoR344-Fc(見上文)，多月太p-617(SEQIDNO:1),多肽p-618(來自于大鼠Nogo受體-lLRR7區(qū)的19-氨基酸多肽；圖2;SEQIDNO:1l)以及多肽p-4和p-5(分別來自于Nogo受體-1的LRR5和LRRCT區(qū)的多肽)組成。卵白蛋白和BSA一皮用作對照。如圖4所示，單抗1H2,3G5和2F7均特異性結(jié)合sNogoR344-Fc。在類似的實-驗中，這些抗體同才羊特異性結(jié)合由大鼠Nogo受體-1的氨基酸310-344組成的多肽(SEQIDNO:3)，而單抗7E11和5B10結(jié)合多肽p-617(SEQIDNO:1)。來自sNogoR310-Fc免疫的10個抗體(1D9.3，1E4.7,1B4.3,2C4.3,1F10.3,2H1.4,1H3.3,1G4.1,1E4.1和2G71l)可在結(jié)合中4皮此^^換，表明它們識別sNogoR310-Fc上類似或重疊的表^f立。來自sNogoR310-Fc免疫的其它三個抗體(2C4.1,2F11.1,和1H4.1)識別氨基酸殘基26-310中的不同表4立。我們還4吏用Fab-噬菌體14D5進(jìn)4亍了ELISA結(jié)合測定。AP-Nogo66,AP-OM-gp和MAG-Fc配體能夠結(jié)合固定化sNogoR344-Fc,而1pM14D5完全抑制了Nogo和MAG結(jié)合。完全承卩制OM-gp與sNogoR344-Fc的結(jié)合需要10jaM的14D5。實施例5為4企測上述制備的單克隆和Fab-嗟菌體減少CNS髓磷脂對神經(jīng)元的抑制的能力，使用0.1mg/ml聚-0-賴氨酸(81§11^@)涂布Lab-Tel^培養(yǎng)玻片(4孑U。CNS髓磷脂或PBS作為3(aU鼓滴點上玻片。向髓磷脂/PBS添加熒光微球(Polysciences)以便隨后鑒別該孩i滴(Grandpre等人，Nature403:439-444(2000))。然后以10pg/ml層粘蛋白(GibcoTM)洗滌和涂布Lab-Tek⑧玻片。以1mg/ml1型月交原酶(Worthington)解離P3-4SpragueDawley大鼠幼鼠的背4艮神經(jīng)節(jié)(DRG's)，用預(yù)涂布的火拋光巴斯德移液管進(jìn)行粉碎以富集神經(jīng)元細(xì)胞并最終以23,000細(xì)胞/孔在預(yù)涂層Lab-Tek⑧培養(yǎng)玻片上進(jìn)ft涂布。采用含有5%熱滅活供體馬血清，5%熱滅活胎牛血清以及50ng/mlmNGF的F12i咅養(yǎng)基，在37°C5%002存在下;咅養(yǎng)6小時。:余布后立即加入15|ag/ml的單抗7E11。以含20%蔗糖的4%多聚曱醛固定玻片，并在20分鐘后以1:500,希釋的神經(jīng)元標(biāo)記抗-piII-孩i管蛋白(CovanceTUJ1)進(jìn)4亍染色。以1:300稀釋二級抗體抗-小鼠AlexaFluor594(MolecularProbes)并以Gel/Mount(Bi0medaTM)覆蓋玻片。使用OpenLabT、W+獲取5x數(shù)字圖象，并使用MetaMorph軟件分析對圖象進(jìn)行神經(jīng)突生長定量分析。單抗7E11保護(hù)DRG神經(jīng)元不受髓磷脂介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。(圖5)。在單抗1H2和3G5中可觀察到類似的結(jié)果。在CNS髓磷脂基質(zhì)上培養(yǎng)大鼠P7DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突生長保護(hù)測定中，雙1介14D5同樣能有效促進(jìn)神經(jīng)突生長。實施例6為了進(jìn)一步表4i如實施例1制備的抗-Nogo受體-1單抗的結(jié)合屬性，我們比較了與表達(dá)大鼠或人Nogo受體-1的固定和游離COS-7或293細(xì)胞的結(jié)合。固定細(xì)月包將Nogo受體-1轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)月包涂布于8-孔Lab-Tek⑧培養(yǎng)玻片，以4%多聚曱醛固定15分鐘，以含于PBS的10%普通山羊血清，0.1%TritonX-100封閉1小時。向去于閉溶液添加15pg/ml和1.5(ig/ml的單抗7E11并在室溫下孵育2小時；以1:300的比例將Alexa⑧-結(jié)合的二級抗體抗小鼠(MolecularProbes)-希并奪于封閉溶液并孵育l小時；向二《及抗體添加5jig/ml的DAPI以標(biāo)^己所有的細(xì)月包沖亥。;摔離細(xì)月包將轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞涂布于8孔Lab-Tek培養(yǎng)玻片，在4°C下以FACS1￡沖液(含4%供體馬血清)封閉30分鐘，與含于FACS《爰沖液的15ng/ml和1.5jig/ml的7E11在4。C下孵育1小時，洗滌并與二級抗體抗-小鼠-Alexa(1:300含于FACS緩沖液)在4。C下孵育30分4中。免疫iEH匕染色實-瞼i正明了所有的單4元結(jié)合表達(dá)大鼠Nogo受體畫l的纟田月包。單抗7E11，2G7.1和2C4.1同時結(jié)合表達(dá)人Nogo受體-1的固定禾口:摔離細(xì)月包。實施例7#體挫務(wù)*^WV、虞^T^為了測試實施例1中所制備的抗-Nogo受體-1單抗在體內(nèi)對神經(jīng)元的作用，我們采用了小鼠脊髓挫傷損傷模型。以止痛和抗菌劑預(yù)防處理雌性小鼠(18-22g)。麻醉小鼠并置于立體定向裝置并將脊柱固定于立體顯微鏡下。釆用改良的重量打擊法(M.Li等人，A^wrosc^"cePP:333-342(2000)引發(fā)脊髓的外傷。簡單而言，進(jìn)行T9和T10推才反切除術(shù)并采用一對支持,人T9-T10兩側(cè)4黃向處理的小鼠沖黃向4f固定脊柱。將直徑1.4mm且重量為2g的不4秀鋼沖擊一奉升至^更腦力莫上2.5cm并墜落至T10水平的脊髓。在手術(shù)過程中，將小鼠置于37。C溫暖的逸子中并在術(shù)后向各只小鼠皮下施用lml的無菌溫鹽水以避免脫水。每天人工纟齊壓膀胱一次，直至恢復(fù)反射性膀胱控制。所有的動物在術(shù)后8-12小時4妻受術(shù)后止痛，并在此后7天每天兩次4妻受抗生素處理。在研究期間動物自由獲耳又食物和水?？?Nogo受體-1抗體參照下文大鼠脊髓4黃切才莫型的描述在28天中通過鞘內(nèi)注射傳遞至損傷位點。實施例8T溶嫂7VOG(9融合蛋^W《在為了表^正可;容性Nogo受體-1多肽(sNogoR-l)和融合蛋白(Fc-sNogoR-1),我們進(jìn)行了以下實-瞼。將3(ag可溶性Nogo受體(sNogoR310-Fc和sNogoR344-Fc)固定至250pgWGA-SPAJ朱并4妄受含于終體積為100pL的結(jié)合緩沖液(20mMHEPES,pH7.4,2mMCa,2mMMg，0.1%BSA,0.1%卵白蛋白和蛋白酶抑制劑)的力文射活性配體(終濃度0.5nM)。酉己體包4舌10jiMNogo66,10125I-Nogo40(NogoA的氛基酸i_40)以及4十對每個配體組的10抗-Nogo受體-1抗體上清液。在Nogo40上的三個酪氨酸一皮單獨石典化并分別命名為Nogo40-A,-B和-C。三次重復(fù)的平均值^皮表示為歸一化的％結(jié)合放射活性(圖6,7和8)。誤差棒表示SEM。抑制劑缺失時的結(jié)合放射活性定為100%,并將10Nogo40存在下的最低結(jié)合力文射活性定為0%，以進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化。實施例9鴕謬與^T漆^AT(9G(9/1^合f^潛合^^伊賴可采用與實施例8的結(jié)合測定類似的結(jié)合測定來測試實施例1中制備的兩種單抗抑制"5;[-Nogo66與sNogoR344-Fc結(jié)合的能力。單抗2F7和3G5抑制125I-Nogo66結(jié)合sNogoR344-Fc。實施例10長兩定以0.1mg/ml聚-D-賴氨酸(Sigma⑧)涂覆培養(yǎng)玻片(4孑L)。將單獨的CNSfl石粦脂或與sNogoR310,sNogoR310-Fc融合蛋白，單抗5B10或?qū)φ誔BS的混合物分別作為3jal《鼓滴點上玻片。向髓磷脂/PBS添加熒光孩b求(Polysciences)以便隨后鑒別該樣吏滴(Grandpre等人，Nature403:439-444(2000))。然后以10ng/ml層粘蛋白(GibcoTM)洗滌和涂布Lab-Tek⑧J皮片。以1mg/ml1型膠原酶(Worthington)解離P3-4SpmgueDawley大鼠幼鼠的背才艮神經(jīng)節(jié)(DRG's)，用預(yù)涂布的火拋光巴斯德移液管進(jìn)行粉碎以富集神經(jīng)元細(xì)胞并最終以23,000細(xì)胞/孔在預(yù)涂層LabTek培養(yǎng)玻片上進(jìn)行涂布。釆用含有5%熱滅活供體馬血清，5%熱滅活胎牛血清以及50ng/mlmNGF的F12培養(yǎng)基，在37°C5%C02存在下培養(yǎng)6小時。以含20%蔗糖的4%多聚曱醛固定玻片，并在20分鐘后以1:500稀釋的神經(jīng)元標(biāo)記抗-piII-農(nóng)吏管蛋白(CovanceTUJ1)進(jìn)4亍染色。以1:300#希#奪二纟及抗體抗-小鼠AlexaFluor594(MolecularProbes)并以Gel/Mount(Bi0medaTM^l蓋3皮片。4吏用OpenLab^d+獲取5x數(shù)字圖象，并使用MetaMorph⑧軟件分析對圖象進(jìn)行神經(jīng)突生長定量分析。sNogoR310,sNogoR310-Fc和單抗5B10均{呆護(hù)DRG神經(jīng)元不受髓磷脂-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制(圖9-11)。在采用雞神經(jīng)元的類似測定使用sNogoR310并發(fā)現(xiàn)其具有^f呆護(hù)性。我們還通過層粘蛋白存在或缺失時的細(xì)胞生長實驗測定了可溶性Nogo受體的神經(jīng)元保護(hù)作用。在層粘蛋白缺失的培養(yǎng)基中的神經(jīng)元細(xì)胞生長較差且模擬了神經(jīng)元應(yīng)力條件。從新生6-7日大鼠幼鼠(P6-7)切開得到DRG,分解為單細(xì)胞并涂布如上所述以聚-D-賴氨酸預(yù)涂的96-孔板。在部分孩支孔中添加2pg/ml層粘蛋白2-3小時，并在涂布細(xì)月包前清洗。孵育18-20小時后，以4%多聚曱醛固定該平4反，以1:500稀釋的兔抗-(3-III-微管蛋白抗體(Covance⑧)和1:100稀津奪的抗-HuC/D(MolecularProbes)染色，并添力口1:200牙希釋的熒光二級3元體(MolecularProbes)。ArrayScanII(Cellomics;^于通過采用神經(jīng)突生長應(yīng)用捕獲5x數(shù)來自3^f啟孔/條件的9個5x圖象。在部分實馬全中采用了PC12細(xì)月包(NeuroscreenTM)的亞克隆(Cellomics②)。以200ng/mlNGF將NeuroscreenTM細(xì)月包預(yù)分化7曰，脫附并重新涂布于以聚-D-賴氨酸預(yù)涂的96-孔板。在部分微孔中在5-3小時內(nèi)添加2[ig/ml層粘蛋白并在涂布細(xì)月包前清洗。孵育2日后，以4%多聚曱醛固定該平板，以1:500稀釋的兔抗-(3-IIl4鼓管蛋白抗體(Covance⑧)和Hoechst染色(核染色)。如同在DRG細(xì)月包中一才羊采用ArrayScanII對神經(jīng)突生長定量。在涂布時將含于〉容液的sNogoR344-Fc或大鼠IgG添加至P6-7DRG碎申經(jīng)元,口分4匕的NeuroscreenTM細(xì)月包。當(dāng)P6DRG神經(jīng)元在層粘蛋白缺失下生長時可觀察到l[iM和IOjiM的sNogoR344-Fc具有神經(jīng)元4呆護(hù)作用。神經(jīng)突生長的定量顯示其隨sNogoR344-Fc的添加呈劑量依賴性上升。向生長于層粘蛋白底物的DRG神經(jīng)元添加相同濃度的sNogoR344-Fc未產(chǎn)生任-f可異常作用，表明sNogoR344-Fc^義對應(yīng)i敫細(xì)月包具有活性。還可在Neuroscreen細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)層粘蛋白缺失時相同濃度的sNogoR344-Fc的神經(jīng)元寸呆護(hù)作用。實施例11將編碼大鼠Nogo受體-1的氨基酸1-310的cDNA構(gòu)建體融合至包含在哺乳動物表達(dá)載體的大鼠IgGlFc，并將該載體電穿孔進(jìn)入中國倉鼠卵巢(CHO)(DG44)細(xì)胞。將細(xì)胞維持在添加了10%透4斤胎牛血清，2mM谷氨酰胺和抗生素-抗真菌藥劑的a-MEM。轉(zhuǎn)染后兩天，采集該條件培養(yǎng)基并在還原條件下用Western印跡分析。通過多克隆兔抗-Nogo受體-1抗體片企測到一條約60kDa的蛋白條帶。擴(kuò)增細(xì)胞并采用R-PE結(jié)合的山羊抗-大鼠IgG抗體分選。第二次分選后，以1細(xì)力包/孩支孔的密度將細(xì)力包涂布在96-孔斧反上。4企測由單個孩i孔分泌的可溶性Nogo受體-1蛋白水平并與夾心ELISA法進(jìn)4亍比砵交。ELISA平4反以山羊抗-大鼠IgGFck特異性抗體;余布。應(yīng)用條件培養(yǎng)基。通過HRP結(jié)合的驢抗-大鼠IgGFab,Fc特異性抗體檢測結(jié)合可溶性Nogo受體-1蛋白。克隆4C12具有最高的分泌水平。擴(kuò)增4C12并在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)生長于CHO-M7培養(yǎng)基中。在37卩下的分;必7jc平約為10mg/L。大規(guī)j才莫培養(yǎng)表達(dá)sNogoR310-Fc融合蛋白的CHO細(xì)月包。從10L的生物反應(yīng)器中獲取1.7L的濃縮條件培養(yǎng)基。通過添加十分之一體積的i.oMTris-HCl，pH8.94是高pH。分別添加固體氯化鈉和甘氨酸至3.0M和1.5M。用3M氯化鈉，1.5M甘氨酸的10mMTris-Hcl，pH8.9,平4軒60mL蛋白A-SepharoseTM制備柱。<吏用蠕動泵將濃縮的條件培養(yǎng)基以1.5mL/min的速度上柱。先后以300mL含3M氯化鈉，1.5M甘氨酸的10mMTris-Hcl，pH8.9和120mL含3M氯4匕鈉的5mMTris-Hcl，pH8.9洗柱。以25mM石粦酸鈉，100mM氯化鈉，pH2.8洗脫蛋白。將10mL的組分收集于含1.0mL的1.0MHEPES,pH8.5的管中。匯集蛋白組分并對3X2L的5mM石壽酸鈉，300mMNaCl，pH7.4透析。實施例12脊體橫勿^t為了測試sNogoR-l融合蛋白促進(jìn)功能性恢復(fù)的能力，在脊髓4黃切測定中對其進(jìn)4亍測定。將當(dāng)日新鮮配制的測試；容液(含于PBS的sNogoR310-Fc)加載至Alzet⑧滲透泵。經(jīng)計算加載濃度為5和50mM。在移4直進(jìn)入動物之前在37。C下將泵準(zhǔn)備〉40小時。對J難性LongEvans大鼠給用術(shù)前止痛和鎮(zhèn)靜劑并^f吏用異氟醚(3%含于02)麻醉。將大鼠置于立體定向〗義并將運動皮層雙面暴露于通^各(tract)示蹤劑BDA(10,000MW)的灌注中。然后在脊髓的T5-T6處對大鼠進(jìn)行脊髓半切，然后才直入鞘內(nèi)導(dǎo)管和泵系統(tǒng)以傳遞測試化合物(n=l1每組)。使大鼠恢復(fù)并存活至術(shù)后28天。記錄BBB系統(tǒng)的行為評分至導(dǎo)入損傷后28天，研究的存活期終止之前。灌注和固定之后，去除脊髓，冷凍保存，切片，染色并進(jìn)行軸突計數(shù)。監(jiān)測損傷后的大鼠和小鼠的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動評分(Basso等人.，Neurotrauma13:343-359(1996》，斜板i式馬全禾"頃殺牛網(wǎng)才各爬升i式馬全(LiandStrittmatter,J7Vewro^/.23:4219-27(2003))。對于斜板試驗，我們4全測了小鼠在5秒鐘內(nèi)不滑落的50cmx60cm板最大傾斜角度。對于傾斜網(wǎng)格爬升，我們訓(xùn)練小鼠爬上斜度為45度的網(wǎng)才各(35cm長x2.54cm寬)。記錄在每次/人底部到頂部的爬升中后足跌落網(wǎng)格板的案例數(shù)。對于大鼠行為，采用BBB運動評分，網(wǎng)才各爬4亍和足跡分一斤。對于網(wǎng)才各爬4t，.我們訓(xùn)練大鼠在網(wǎng)才各上爬行(70cm長x2.54cm寬)，并記錄后足i失落網(wǎng)才各下的案例數(shù)。對于足跡分析，以墨水記錄在90cm的跑道上連續(xù)運動中大鼠后足的行走模式，并計算每一側(cè)的步長和步寬(Metz等人，Sra/"W仏883:165-177(2000))。所有這些4亍為測試均至少對兩個個體進(jìn)行。在整個手術(shù)，行為測試和組織學(xué)分析過程中，研究者均不了解微型泵中的化合物的信息。sNogoR310-Fc促進(jìn)功能恢復(fù)(圖12)。實施例13在大鼠脊髓挫傷測定中4全測了可溶性Nogo受體-1多肽和融合蛋白在體內(nèi)對神經(jīng)元的作用。以止痛和抗菌劑預(yù)防處理帶頭罩的雌性LongEvans大鼠(170-190g)。手術(shù)前10分鐘，通過2.5mg/kg咪達(dá)唑侖腹腔止痛并以含于02的2-3%異氟醚麻醉。然后將大鼠剃毛，以酒精和優(yōu)石典處理，并只于其眼部采用潤眼劑。然后在中線和T7至T124侏骨切開。在T91/2和T10進(jìn)行背側(cè)推板切除術(shù)以暴露脊髓。將大鼠固定至沖擊器。首先夾鉗T7和T8體節(jié)，然后將T11和T12體節(jié)連接至尾鉗。在大鼠的胸腔下置入軟材料。將沖擊棒設(shè)置為零位置，并將電接地線夾連接至傷口邊緣。然后將沖擊棒提升至25.0mm并適當(dāng)調(diào)節(jié)至暴露脊髓的直4妄上方的位置。4妻著釋》文沖擊棒以擊中暴露的脊髓，并將沖擊棒立即提升。解除大鼠的固定，并將Gelfoam⑧置于傷口。將傷口的月幾肉縫合，并通過手術(shù)4丁住切口。將動物置于培養(yǎng)器直至它們/人麻醉中蘇醒。根據(jù)需要向大鼠給用抗生素，止痛劑和鹽水。此后每天早晚擠壓膀胱直至功能恢復(fù)。如上文的大鼠脊髓碎黃切才莫型所述，鞘內(nèi)施用可::容性Nogo受體-1融合蛋白(例3口，sNogoR310-Fc)。在手術(shù)后一天，以及在4至6周內(nèi)每周進(jìn)4亍BBB評分。實施例14我們構(gòu)建了表達(dá)可溶性Nogo受體-1蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠以測試其在體內(nèi)表達(dá)時的作用。我們將小鼠sNogoR310cDNA(對應(yīng)Nogo受體-1的氨基酸1-310)克隆進(jìn)入C-3123載體的位點。在該載體中，sNogoR310表達(dá)受膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gfap)基因調(diào)節(jié)元件的控制，這使得損傷位點的反應(yīng)活性星形細(xì)胞可以進(jìn)行分泌提高的高水平表達(dá)。我們依次以AatII和Sfil消化了所得的載體并在3.4kb片段分離了g/^:^7VogoW370構(gòu)建體。我們將該片段顯孩t注射進(jìn)入胚胎以生成轉(zhuǎn)基因小鼠。我們通過PCR驗證了該轉(zhuǎn)基因已經(jīng)整合，并鑒定了五個建立者系。我們將具有最高表達(dá)水平的兩個建立者系的雄性雜合子與站,寸生C57BL/6J小鼠雜交。我們通過Western印跡分才斤采用針對Nogo受體-1的抗體確認(rèn)了雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠中GFAR-陽性細(xì)月包表達(dá)和分泌sNogoR310。[O509]我們在添力口了蛋白酶抑制劑(Roche)的Tris-纟爰沖鹽溶液中將皮層和脊髓勻漿化并將勻漿物在4'C下40,000rpm離心20分鐘。我們以4%的多聚曱醛處理上清液20分鐘以4是高抗體特異性并在免疫印跡之間進(jìn)4亍透才斤。我們在RIPA纟爰沖液(1%TritonX-100,0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS含于PBS)中超聲勻漿化孩史粒組分，將所得勻漿物離心并按如上所述處理該上清液(清洗液-可溶性孩i粒組分)。我們通過免疫印跡采用1:2000稀釋的針對Nogo受體-1的兔抗血清分析了20嗎腦或脊髓蛋白。我們通過與AP-結(jié)合的抗-兔IgG和NBT/BCIPAP底物孵育顯示免疫反應(yīng)性。我們沖全測了來自兩個轉(zhuǎn)基因系Tg08和Tg01的皮層和脊骨泉的無清洗液可-容萃耳又物中分泌的37kDasNogoR310，？f旦在同胎l子畜野生型(WT)小鼠中j又存在(如有)才及少的37或81kDa的可〉容性Nogo受體-1蛋白。對微粒組分的檢測證明了在WT和轉(zhuǎn)基因小鼠中有類似水平的內(nèi)源性Nogo受體-1。實施例15凝仿^/一差^V、薦尹57V(9GC^376/W4這我們通過進(jìn)行脊髓半切測試了CNS損傷對轉(zhuǎn)基因小鼠中sNogoR310表達(dá)的作用。我們參照實施例14的描述通過雜合子雄性與C57/BL6雌性的交配獲得了sNogoR310轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談游铩Ｎ覀兩疃嚷樽砹顺墒齑菩噪s合子轉(zhuǎn)基因或同胎仔畜WT小鼠(10-16周大)并進(jìn)行了完全推板切除術(shù)，完全暴露T6和T7水平的脊髓的背側(cè)部分。我們以30號針在T6進(jìn)行了背側(cè)半切并以微型剪刀完全斷絕背側(cè)和背外側(cè)皮質(zhì)脊髓束(CSTs)。我們用帶標(biāo)記的針多次穿過脊髓的背側(cè)以確認(rèn)損傷的深度為l.Omm。我們在牙,才反切除處縫合月幾肉層并用手術(shù)纟逢4丁閉合背側(cè)皮月夫。為了追蹤皮質(zhì)脊髓束，我們在脊髓損傷后14日在顱骨上右側(cè)的大腦皮質(zhì)上方制作了一個鉆孔。我們在3巨離皮質(zhì)表面0.7mm深的4個注射位點應(yīng)用了示3宗劑BDA(MWIO，OOO,10%含于PBS)(MolecularProbes,Eugene,OR)。損傷后四周，對小鼠灌流PBS,然后為4%多聚曱醛。用于sNogoR310表達(dá)試-驗的小鼠不^妻受〗壬〗可示蹤劑注射。對于用于western印跡分析的小鼠，收集未在損傷后14日進(jìn)4亍灌流的T3和L3水平之間的脊髓。用于Nogo受體-1免疫組化染色的小鼠在半切后10天以4%多聚曱醛灌流，去除損傷脊髓進(jìn)行切片。為了4企測轉(zhuǎn)基因和WT小鼠受損腦部的sNogoR310表達(dá)，以立體定向裝置(DavidKopf,Tujunga，CA)中的11號手術(shù)刀片進(jìn)4亍皮質(zhì)刺傷。得到4mm矢狀竇旁切口，距前自背面0.5mm,中線側(cè)面1.5mm，3.5mm深。我們檢測了轉(zhuǎn)基因小鼠(未檢測WT小鼠)中損傷后10天可溶性脊髓萃^f又物中上升的sNogoR310水平，該水平與損傷周圍的GFAR上調(diào)相一致。為了確認(rèn)這不是由于Nogo-A的補償性上調(diào)引起的，我們測試了它的表達(dá)并發(fā)現(xiàn)它在WT和轉(zhuǎn)基因小鼠的完好或損傷皮層和脊髓中都比4交類似。我們以4十對Nogo受體-1和GFAP抗體對含有損傷區(qū)域*的受損腦部和脊髓進(jìn)行免疫染色，；險測了損傷CNS中sNogoR310的細(xì)胞表達(dá)。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的一般形態(tài)在WT和轉(zhuǎn)基因小鼠之間并無區(qū)別，{旦gfap::sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠中的月包內(nèi)和月包外空間的Nogo受體-l染色密度明顯高于WT小鼠，說明在轉(zhuǎn)基因小鼠的損傷周圍的sNogoR310表達(dá)上升。Nogo受體-1蛋白僅在轉(zhuǎn)基因小鼠中與星形細(xì)胞標(biāo)記GFAP共定位。在轉(zhuǎn)基因樣本中還存在非細(xì)月包染色的大幅才廣散，這與月包夕卜空間中的sNogoR310片目——至丈。在WT和轉(zhuǎn)基因小鼠中均;險測到神經(jīng)元細(xì)胞體Nogo受體-1染色。實施例16我們測試7凝務(wù)y^庫sA^goi3M嫂我這_±^>￡矛會,放凝斜嫂^存^。我々〕通過3口Li禾口Strittmatter,乂A^wroyc/.23:4219-27(2003)所述在右運動皮層注射順行示蹤劑生物素葡萄糖胺(BDA)考察了下行皮質(zhì)脊髓束(CST)的完整性。在同胎仔畜WT小鼠中，突出背部CST(dCST)緊密結(jié)合至損傷吻側(cè)，且少部分背側(cè)CST纖維在同側(cè)可見。少量的BDA-標(biāo)記的短側(cè)芽伸入灰色物質(zhì)，特別是在腹線處，但抽芽大部分限制在示蹤劑注射的相對側(cè)。然而，從損傷sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠吻側(cè)至背側(cè)半切的切片顯示了非常不同的BDA標(biāo)記模式。在所有來自Tg08系或Tg01系的轉(zhuǎn)基因小鼠中突出dCST外側(cè)均觀察到了高密度的BDA-標(biāo)記的CST纖維。異位纖維在整個灰質(zhì)區(qū)域延伸，部分纖維達(dá)到了側(cè)面和背側(cè)白質(zhì)。在脊髓的相對側(cè)(示蹤劑注射位點的同側(cè))觀察到較多纖維(每個橫向切片4-12萌芽)。對側(cè)芽的微密度測量顯示在sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)芽密度大約提高了10倍。與同胎仔畜WT動物不同，對從吻側(cè)至損傷處1至4mm矢一犬竇旁全從側(cè)切片的片企測顯示dCST纖維向sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的腹側(cè)灰質(zhì)延伸了大量的側(cè)芽。一般而言，轉(zhuǎn)基因小鼠中從吻側(cè)到損傷處抽芽的模式和程度與使用Nogo受體-1拮抗劑肽NEP1-40全身處理的小鼠中觀察到的結(jié)果類似(Li和Strittmatter，乂臉wr騰/,23:4219-27(2003》。這些結(jié)果i正明了分泌的sNogoR310在轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)了CST抽芽。實施例17再生CST軸突繞過損傷位點進(jìn)入SNOGOR310轉(zhuǎn)基因小鼠的末梢脊髓我們分離了轉(zhuǎn)基因小鼠至損傷位點吻側(cè)4mm和尾側(cè)4mm(總長8mm)的脊髓并將其埋在戊二醛-聚合白蛋白基質(zhì)中，并在4展動切片才幾上縱切(厚30pm)。我們采集了損傷位點吻側(cè)5-7mm和尾側(cè)5-7mm的脊髓的一黃向切片(50jim)。對于大鼠sNogoR310-Fc注射實-驗，在4展動切片才幾上》從切(50(am)損傷^f立點吻側(cè)10mm和尾側(cè)10mm的脊髓。采集損傷^立點吻側(cè)11-16mm和尾側(cè)11-16mm的脊髓的橫向切片。我們將切片與抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶復(fù)合物孵育并通過鎳增強(qiáng)的二氨基聯(lián)苯HPR反應(yīng)顯示示蹤劑(Grandpre,A^w"417:547-551(2002))。我們通過間接免疫熒光對部分切片進(jìn)行了血清素免疫組化(抗-5-HT抗體)。為了顯示損傷區(qū)域，我們用針對GFAP(Sigma，St.Louis，MO)的抗體對部分切片進(jìn)行了雙重染色。我們將切片封固，脫水并用封固劑^隻蓋。我們測試了由損傷后的轉(zhuǎn)基因小鼠(參見實施例16)中表達(dá)的sNogoR310"i秀導(dǎo)的纖維是否通過損傷區(qū)域進(jìn)入尾側(cè)脊髓以提供功能性恢復(fù)。在顯^f象器中顯示的^爭過損傷位點的連續(xù)縱向切片展示了距損傷數(shù)毫米處的再生CST纖維的分布才莫式。從WT小鼠獲得的切片顯示沒有^爭過損傷位點的CST纖維。來自sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的類似切片顯示了以高度分支模式穿過橫切區(qū)域并進(jìn)入末梢灰和白質(zhì)區(qū)域的大量CST纖維。在半切的近吻側(cè)，來自突出dCST的高密度的BDA-標(biāo)記的CST抽芽深入損傷區(qū)域，^f旦大部分CST抽芽未能穿越形成傷疤且組織空化突出的碎黃切區(qū)域。再生軸突中一個孩i小<旦非常明顯的部分繞過損傷位點進(jìn)入剩余的腹側(cè)組織橋和腹外側(cè)灰和白質(zhì)。此外，少量CST纖維經(jīng)損傷的腹側(cè)和腹外側(cè)脊髓穿過沖黃切區(qū)域本身進(jìn)入末梢區(qū)域。在損傷的附近，再生纖維的^各線通常呈彎曲狀，與吻側(cè)CST常見的直纖維截然不同。側(cè)面和分支纖維在末梢脊髓的灰質(zhì)中才及為常見。該改造^正明了5-15BDA-標(biāo)記的再生纖維經(jīng)過各轉(zhuǎn)基因小鼠的損傷尾側(cè)l-4mm的吻側(cè)-尾側(cè)軸上的任意水平。對于5-7mm尾側(cè)至背側(cè)半切的橫向切片，在各轉(zhuǎn)基因小鼠的灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域均可見到BDA-標(biāo)記的CST軸突。轉(zhuǎn)基因小鼠的纖維數(shù)顯示在矢狀切片中的近側(cè)水平具有類似凄史量的BDA-標(biāo)i己的CST纖維。除了CST纖維，其它下行束(例如，中縫纖維)同樣有助于小鼠的運動功能。在小鼠背側(cè)夕卜半切模型中，橫切損傷了大部分血清素激性纖維，在前角中減少了大約80%的該種纖維。在尾側(cè)脊髓的前角中的血清素纖維的總長分析顯示轉(zhuǎn)基因組小鼠中該種纖維的凄t量遠(yuǎn)大于WTia，揭示sNogoR310在4爭基因小鼠中的生長促進(jìn)作用不限于一種軸突下4亍途徑。實施例185TV(9G(97370^/-差^4:^傻遽適動鍵復(fù)CST軸突^艮蹤和血清素激性纖維分析顯示乂人轉(zhuǎn)基因小鼠的星形細(xì)胞釋》文的sNogoR310刺激脊髓中損傷的下行軸突的伸展結(jié)構(gòu)再生。我們進(jìn)4于了多個如實施例12所示的4于為測i式以測定這些再生纖維是否有益于功能恢復(fù)。由BBB測試的評估可見，WT小鼠在4周的存活中部分恢復(fù)了運動功能。損傷后4周，大部分WT小鼠恢復(fù)至以具有一致性減重的一致性腳掌行走為特征的水平，但它們僅顯示了偶然的前肢-后肢協(xié)調(diào)性，且在首次與表面接觸時會有主導(dǎo)爪輪換。與之相反，Tg08和TglO系sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的BBB評分在整個7-28天的7見察期中明顯高于對照組(圖13A和13B)。損傷后28天，大部分轉(zhuǎn)基因小鼠顯示了一致性前足-后足協(xié)調(diào)性，且主導(dǎo)爪位置與身體平行。我們另外釆用了兩個行為測試以進(jìn)一步表征sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)。首先，我們才企測了小鼠不會在5秒鐘內(nèi)脫手的最大平4反傾角。在背側(cè)半切損傷前，轉(zhuǎn)基因和WT小鼠均能在角度為55度的板上保持姿勢。損傷后27日，所有小鼠可維持的角度均有所下降，但轉(zhuǎn)基因小鼠可維持的角度明顯大于對照組(圖13C)。在另一4亍為測試中，小鼠爬升與垂直方向呈45度角的網(wǎng)格，并對爬升中后足跌落網(wǎng)格平面以下的次數(shù)進(jìn)行計數(shù)(Metz等人.，Sra/wM.883:165-177(2000))。在損傷前訓(xùn)練中未有小鼠在該測試中出4晉。在損傷后2-6周內(nèi)WT小鼠出現(xiàn)了多次腳步4晉i吳且僅有極小的改善。與此相反，sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠在該階,殳的網(wǎng)才各爬4亍中顯示了漸進(jìn)的改善，大部分改善出現(xiàn)在損傷后1-3周(圖13D)。因此，/人星形細(xì)月包分泌SnogoR310的轉(zhuǎn)基因小鼠在胸一侏半切后顯示了CST再生，中縫抽芽和運動功能改善。實施例19萄一力滋^SV(9GC^370-Fcf^謬爭CST^AJ^作為對可溶性Nogo受體-1在脊推外傷后的生長促進(jìn)作用的另一種4企測，我們鞘內(nèi)施用了純化的蛋白。我們將大鼠Nogo受體-1的配體結(jié)合區(qū)(27-310)融合至大鼠IgGlFc區(qū)以促進(jìn)穩(wěn)定性和純化。我們從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞純化蛋白。與小鼠sNogoR310-MycHis相同，該蛋白在體外阻斷Nogo-66,MAG和髓石壽月旨作用(Fournier等人.，《/7Vew^wc/.22:8876-8883(2002);Liu等人，Sc/e"ce297:1190-1193(2002))。我們通過樣l型蠕動泵將sNogoR310-Fc蛋白鞘內(nèi)傳遞至具有中胸背側(cè)半切損傷的大鼠。在損傷后的四周存活期中，向每只大鼠局部施用1.2mgsNogoR310-Fc蛋白。在4妄受載體治療的大鼠中(1.2mg大鼠IgG),半切吻側(cè)的切片在損傷位點上顯示了緊密結(jié)合的突出背側(cè)CST和極少的異位BDA-標(biāo)記的CST纖維。來自接受了sNogoR310-Fc蛋白的損傷大鼠的損傷吻側(cè)切片顯示了專交為不同的標(biāo)記才莫式。從橫切和矢狀竇旁切片觀察到眾多由BDA-標(biāo)記的CST產(chǎn)生的異位纖維抽芽。在部分案例中，突出穿越接近脊索圓周的中線的dCST區(qū)域，與背外側(cè)CST混合。抽芽軸突延伸通過灰質(zhì)的程度遠(yuǎn)大于白質(zhì)。對臨近dCST的異位抽芽纖維(在沖黃向切片中^100nm，在矢狀切片中^200(am)的沖企測顯示在sNogoR310-Fc-處理的大鼠中有更大的提高。實施例20^5TWX(9i370-FC義理W義^哞CST>^《岸^迷入^#,#鑀我們深度麻醉了雌性Sprague-Dawley大鼠(190-250g)并在T6-7推板水平進(jìn)行推板切除術(shù)，暴露脊髓。我們以30號針在脊髓背半部切口，用一對孩吏型剪刀斷絕CSGT束的背側(cè)部分，并通過ll號刀片橫切脊髓背半部以確保損傷的深度(l.8mm)(Grandpre等人，7V(3/w"417:547-551(2002))。將填充了含于PBS的1.2mg大鼠IgG或含于PBS的1.2mgsNogoR310-Fc融合蛋白的孩i型蟲需動泵(Alzet2ML4,2ml體積，2.5pl/h，28天傳遞)》逢合于動物背部皮月夫下的肌肉中。將連接微型泵出口的導(dǎo)管從硬腦膜上的小孔在T7-8水平插入脊髓的鞘內(nèi)空間。Nogo受體-1拮抗劑蛋白輸注資導(dǎo)大鼠半切吻側(cè)的延伸抽芽，^f旦更關(guān)4建的問題是該抽芽CST纖維是否插入末梢脊髓并促成運動恢復(fù)?？缭饺苊教幚泶笫蟮膿p傷位點的縱向切片在損傷水平下未顯示出可測的或是僅顯示極少量的BDA-標(biāo)記的腹側(cè)CST纖維(G腦dpre等人，淑匿417:547-551(2002);Weidner等人，Proc.淑/.^cad5W.98:3513-3518(2001》。來自sNogoR310-Fc處理的大鼠的類似切片證明了許多BDA-標(biāo)記的纖維繞過碎黃切位點并主要通過腹側(cè)橋4妄組織進(jìn)入尾側(cè)脊髓和腹外側(cè)脊髓。星形細(xì)月包標(biāo)記GFAP的免疫染色顯示橫切所達(dá)的程度深于中心管區(qū)域。與突出背側(cè)CST中吻側(cè)纖維的線性剖面不同，再生CST纖維在末梢脊髓中通常具有高度分支的軌跡，特別是在灰質(zhì)區(qū)域。這些纖維可在脊髓的許多區(qū)域檢測到，但它們更容易在整個脊髓的中央部分和脊髓背半部看見。矢狀切片的CST纖維計凄t顯示每只sNogoR310-Fc-處理大鼠在損傷尾側(cè)l-2mm約有20個BDA-標(biāo)記的軸突，且在損傷末梢7-8mm處有15個^艮蹤軸突?！?殳而言，這些纖維的分支才莫式與在局部NEP1-40肽處理的動物中所7見察到的類似，<旦在以sNogoR310-Fc蛋白處理的切片的每個抽芽中可見到更多的側(cè)枝。對末梢脊髓抽芽的檢測證明了在sNogoR310-Fc-處理的大鼠中各個抽芽的總側(cè)枝長度是NEPl-40-處理的動物的兩4咅。在Nogo受體-1拮抗劑-處理組的脊髓尾側(cè)1-10mm的抽芽(長度^200(am)凄t均為對照組的約20-404咅。sNogoR310-Fc處理大鼠中可見到比局部NEP1-40處理更多的4由芽(50對25抽芽/大鼠)，但該差異不具有統(tǒng)計顯著性^=0.1713,1-檢驗)。在4妄受sNogoR310-Fc處理的大鼠脊髓的半切尾側(cè)11-15mm處的碎黃向切片中可7見察到再生CST軸突。在脊ft的灰質(zhì)和白質(zhì)中均可檢測到該種纖維。在灰質(zhì)中檢測到的纖維通常比白質(zhì)區(qū)域顯示出更多的側(cè)枝。與之相反，在溶媒-處理組的橫向切片中，在腹側(cè)白質(zhì)區(qū)域僅偶爾發(fā)現(xiàn)BDA-標(biāo)記，這與未損傷腹側(cè)CST軸突一致。在該末梢脊髓水平，Nogo受體-1拮抗劑-處理組[sNogoR310-Fc和NEP1-40]中BDA-標(biāo)記的CST纖維的平均H是溶々某-處理大鼠的約2(H咅。綜上，Nogo受體4吉4元劑，sNogoR310-Fc蛋白和NEPl-40肽均導(dǎo)致末梢脊髓中顯著的CST軸突再生，^旦前者誘導(dǎo)的抽芽顯示了更高的分支模式。實施例21乃舉5TWXC^3M-FC謬尋凝^^義it脊^尹ir裙脊體;^j^，半切后十四日，在下力支的感覺運動皮層上的顱骨上制作小鉆孔以追蹤C(jī)ST纖維。在各側(cè)距硬腦膜深度為1.5mm的七個注射位點采用順行神經(jīng)元示蹤劑BDA(10%含于PBS,每個皮層3.5|il)。為了在大鼠中追蹤紅核脊髓束，將示蹤劑BDA(lpi;MW10,000;10%含于PBS)注射進(jìn)入左側(cè)的紅核(前囪背面5.8mm，顱骨表面的側(cè)面0.7mm,腹側(cè)7.0mm)。BDA注射后兩周，以PBS灌注這些動物，然后灌注4%多聚曱醛，并采集用于ia織學(xué)的la織。對損傷的紅核脊髓束(RST)纖維的^f奮復(fù)可促進(jìn)脊髓損傷后的功能才是升(Liu等人.，JA^/ra^/.,19:4370-4387(1999))。Nogo受體-1在CNS神經(jīng)元中的廣泛分布(Wang等人.，/A^wrosd22:5505-5515(2002))使得通過拮抗劑抑制Nogo受體-1并導(dǎo)致RST軸突在損傷后再生成為可能。為了測試sNogoR310-Fc對損傷RST的作用，向左側(cè)紅核注射BDA以對該途徑的完整性進(jìn)4亍追蹤。在脊髓水平，RST纖維通常位于脊髓的背外側(cè)白質(zhì)區(qū)域，并4皮本研究的背側(cè)半切所才黃切。在對照大鼠損傷的吻側(cè)ll-15mm的沖黃向切片中，在突出RST和背側(cè)角灰質(zhì)之間發(fā)現(xiàn)了少量的短BDA-標(biāo)記的纖維。與sNogoR310-Fc處理在相同水平的切片在主RST和背側(cè)角灰質(zhì)之間顯示了多個連^妄纖維。對于SCI末梢11-15mm的沖黃向切片，在溶々某-處理的大鼠中未見BDA-標(biāo)記的RST纖維。與之相反，在接受sNogoR310-Fc處理的相同水平的切片在示蹤劑注射的相對側(cè)的灰和白質(zhì)中均顯示了大量BDA-標(biāo)記的RST纖維。BDA注射同側(cè)灰質(zhì)中可看到部分抽芽具有分支模式。還4企查了sNogoR310-Fc處理的脊髓損傷大鼠中的中縫(ruphespinal)脊骨逸纖維。免疫染色i正明纟容:!某和sNogoR310-Fc處理組之間的損傷吻側(cè)11-15mm處的血清素激性纖維密度相類似。在損傷下11-15mm的切片中，在sNogoR310-Fc處理的大鼠中的血清素(seroton)纖維是對照組的兩倍。這些結(jié)果i正明對由sNogoR310-Fc蛋白引起的Nogo受體-1抑制的響應(yīng)不限于CST纖維，其它的下行束(例如紅核脊髓和血清素激性軸突)同才羊?qū)ogo受體-1拮抗作用進(jìn)4亍響應(yīng)。實施例22"5TV(9GOR370-FC乃4^^^^炎葛義篇的《錄^鍵復(fù)鞘內(nèi)施用sNogoR310-Fc蛋白可刺激外傷性脊髓損傷后的多個下4亍途徑中的軸突再生。我們測試了該蛋白是否還改善損傷脊髓的功能恢復(fù)。在半切2周后，；容+某處理大鼠的運動BBB"i平分達(dá)到12的穩(wěn)定水平(圖14A)。損傷后4周，大部分對照(7只中的6只)具有頻繁的一致性減重足底行走和頻繁一致性前足-后足協(xié)調(diào)性，但它們首次與表面接觸時會有主導(dǎo)爪輪換。相反地，在接受sNogoR310-Fc蛋白處玉里的大鼠中，運動i平分在外傷后2-4周繼續(xù)4是升。損傷后4周，所有9只sNogoR310-Fc處理動物具有一致的前足-后足協(xié)調(diào)性并在首次接觸測試平面時具有平行的爪位置。網(wǎng)才各爬4亍:帔用于評估在脊髓損傷后的下朽4青細(xì)運動控制缺陷(Metz等人，Sra/"i^.883:165-177(2000))。該性能要求由腹外側(cè)，皮質(zhì)脊髓和紅核脊髓纖維介導(dǎo)的前足-后足協(xié)調(diào)性和自發(fā)運動控制。在損傷前訓(xùn)練中，所有的大鼠將其后足精確地放在網(wǎng)才各條上。損傷后2-4周，對照大鼠每次過程中可產(chǎn)生8-9次^"誤，且隨時間進(jìn)展中^又有才及小的改善。相反;也，以sNogoR310-Fc處5里的大鼠在網(wǎng)格爬行中顯示出漸進(jìn)的改善并具有明顯更少的錯誤(4-7次/評價每個過程)。主要的改善出現(xiàn)在損傷后2-3周。與未損傷大鼠或接受sNogoR310-Fc處理的損傷動物相比，在半切后4周的對照組后足足跡分析顯示步長明顯下降而步寬有所上升。因此，該多重行為測試證明通過局部注射拮抗劑蛋白對Nogo受體-1功能的阻斷改善了損傷后的運動恢復(fù)。實施例23卓^發(fā)拔-7VGi7戎#與^r溶'/i義itM9G(9菱謬，(S7VG鹿W-錯合對1D9Fab和大鼠NgRl的可溶性片段(srNgR310)的共結(jié)晶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析顯示該抗體的結(jié)合位置靠近大鼠NgRl的N-末端帽和富亮氨酸重復(fù)區(qū)域的結(jié)合部。圖15。1D9僅結(jié)合至大鼠NgRl且不識別人或小鼠NgRl,NgR2和NgR3。對于大鼠srNgR310-Fc與1D9Fab的結(jié)晶化，每個大分子都由木瓜蛋白酶裂解，/人Fc部分純4匕，并貝±存于10mMHepespH7，50mMNaCl。該復(fù)合物均制備為80并以2:1的體積比與14%Peg3350,0.4M醋酸鋅，0.1M氯化鎂組成的匯集溶液相混合。在20。C下將該溶液孵育1小時，并12,000xg離心3分鐘以去除沉淀。在20。C下向含有50%至100%匯集溶液的液體中添加3-5pL的上清液以生成結(jié)晶。在2(TC下1周內(nèi)可生成薄板狀的晶體。將該晶體迅速轉(zhuǎn)移至0.2M醋酸《辛，8%Peg3350,25%乙烯乙二醇進(jìn)4亍冷凍-床護(hù)，并迅速轉(zhuǎn)移至液氮進(jìn)行冷凍。約10(im厚的晶體在國家同步光源(Upton,NY)的光束線X25下4汙射至3.2A。以HKL禾呈序包v.l.97(Otwinowski,Z.，和Minor,W"￡"z，o/276:307-326(1997))處理數(shù)據(jù)揭示該晶體屬于P21212空間群，大概的晶胞尺寸為a=90.6A,b=188.6A，c=125.5A,ia=p=y=90，這與每個不對稱單元的2Fab-NgRI復(fù)合物一致。該晶體結(jié)構(gòu)可采用對潤濕晶體的多重同晶型置才灸實-瞼的信息進(jìn)行揭示，以此可以鑒定分子置換時結(jié)合至NgR的普通水4艮位點?？臻g群可通過檢查水銀和金同晶型差異帕特森圖(在W=0p合克截面鑒定到一致性5sigma峰)得到鑒定。與MOLREP的分子置換(Vagin,A.，和Teplyakov,A.,/jp//.O^W.30:1022-1025(1997))采用基于人NgRl結(jié)構(gòu)(pdb代/馬10ZN)的大鼠NgR同源性才莫型(He,X丄.等人，TVewra"38:111(2003))而4十對1D9Fab的同源性才莫型可促成NgRl,—個Fab和另一個NgRl分子的置換，并得到48%的R-因子和Fab的CDR區(qū)的確定密度。才莫型的安置可通過在4妻近Aspl38和Hisl82的NgRl分子的同等位置上的差異帕特森圖鑒定的水銀位點得到確認(rèn)。該密度下未明確鑒定到其它的Fab片段。采42%的R-因子和46%的自由剩余^f直4青制(Brunger,A.T.等人.，Oj^tofogr"5/o/Oj^to〃ogr54:905-921(1998))至3.2A。表8顯示了lD9Fab和大鼠NgRl之間的4妄觸。表中列舉了Fab的原子距離大鼠NgRl的原子3.9A之內(nèi)的4妄觸，且能與主鏈或側(cè)鏈形成氫鍵的接觸帶有星號(*)。<table>tableseeoriginaldocumentpage198</column></row><table>*顯示H-4建相互作用實施例24遞《摔#脊染謬遞7VG7i7VJ/4十對人NogoRl(圖16A)轉(zhuǎn)錄物-沒計三個RNAi構(gòu)建體。RNAi-l和RNAi-3分別針對人NgR基因。RNAi-2i殳計4十對人，小鼠和大鼠NgR基因。合成DNA寡聚核苷酸對并構(gòu)建進(jìn)入基于Polin啟動子的RNAi表達(dá)載體pU6(含人U6啟動子，kar耐受基因和Pacl克隆4立點)。Nogor2mi殳計攜帶兩個4十對目標(biāo)序列的錯-配并用作陰性對照。圖16B顯示了這些寡聚核苷酸的核苷酸序列。RNAi構(gòu)建體首先通過在小鼠L細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染人NgR表達(dá)載體和RNAi表達(dá)質(zhì)4立(phU6NgR-RNAi-l，2和3)進(jìn)4亍篩選。^1尋小鼠L細(xì)胞涂布于6孔培養(yǎng)板，然后單獨以GFP才艮告質(zhì)?；蚪Y(jié)合4十對GFP的RNAi載體pU6GFPRNAi(泳道2和3)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。監(jiān)測GFP表達(dá)作為GFP基因沉"默的只于照。以0.5，1或2pg的hNgR表達(dá)載體(泳道4-6)轉(zhuǎn)染小鼠L細(xì)胞。通過加入pUC19質(zhì)粒將每個孩i孑L中的DNA凄t量調(diào)整為總計4figDNA。RNAi:目標(biāo)比例為4:1。5fig的hNgR載體與2ngNgRRNAi-l,2,3或2m質(zhì)并立共壽爭染(泳道7-10)。轉(zhuǎn)染后四十/\小時，在SDS上才羊纟爰沖液釆集細(xì)月包并進(jìn)行SDS-PAGE。采用針對多克隆hNgR抗體R150的兔血清(圖A)或單克隆抗體7E11(圖B)通過western印跡分牙斤hNgR表達(dá)。在采用NgR抗體7E11(單克隆)和R150(兔多克隆)的Western印跡上可7見察到phU6NgR-RNAi-l和-2轉(zhuǎn)染細(xì)月包中的有效NgR表達(dá)沉默。結(jié)果顯示于圖17。在NgRRNAi-l和-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NgR的表達(dá)^皮降低至基準(zhǔn)水平。相反地，NgRRNAi-3未顯示4壬4可明顯的NgR下降，這與對照突變體NgRRNAi-2m類似。因此，NgRRNAi-l和-2對hNgR基因沉默有歲丈。瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果i正實NgR表達(dá)抑制>90%。實施例25盡管以兩種抗體類型測得的信號對hNgR具有特異性(僅存在于hNgRcDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞)(圖17),測得條帶的表觀MW(50kD)低于預(yù)期。不希望受限于理-淪，這可能是由于小鼠L細(xì)胞中人NgR的糖基化的改變所引起。為了對NgRMW差異的現(xiàn)象進(jìn)4亍確iL,通過Lipofectin再次在人SKN細(xì)月包和293細(xì)月包中進(jìn)4亍hNgRcDNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后四十/乂小時，在SDS上樣纟爰沖液采集細(xì)月包并進(jìn)4亍SDS-PAGE。通過如上所述采用7E11和R150的Western印跡4全測NgR的表達(dá)。在親本SKN或293細(xì)月包中未斗企測到hNgR特異性信號，且以R150才企測到的hNgR的表觀MW(>65kD)在SKN和293細(xì)月包中均在預(yù)期之內(nèi)(圖18)。RNAi介導(dǎo)的hNgR沉默在SKN細(xì)J包中得到了確i人。將SKN細(xì)胞涂布于6孔培養(yǎng)板，然后單獨以GFP報告質(zhì)粒或結(jié)合4十對GFP的RNAi載體pU6GFPRNAi(泳道2和3)進(jìn)4亍壽爭染。監(jiān)測GFP表達(dá)作為GFP基因沉默的對照。以2jag的hNgR表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SKN細(xì)胞(泳道4)。通過加入pUC19質(zhì)粒DNA將每個纟鼓孔中的DNA數(shù)量調(diào)整為總計4昭DNA。0.5嗎hNgR載體與2嗎NgRRNAi-1,2,3或2m質(zhì)壽立共轉(zhuǎn)染(泳道5-8)。轉(zhuǎn)染后四十/v小時，在SDS上樣緩沖液采集細(xì)胞并進(jìn)行SDS-PAGE。通過采用針對hNgRR150的兔血清的western印跡分才斤hNgR的表達(dá)。在所有NgRRNAi-1和-2中再次i正實了大于90%的NgR阻承卩，^f旦在NgRRNAi-3和-2m中凌丈率有所下降(圖19)。實施例26由CellomicsInc.獲耳又表達(dá)NgR的NeuroScreen細(xì)月包以進(jìn)行NgR功能分析。為了在NeuroScreen細(xì)胞中實現(xiàn)穩(wěn)定的NgR阻抑，所有的RNAi構(gòu)建體均被轉(zhuǎn)化成為(3-gal或GFP骨架的慢病毒載體。圖20顯示了慢病毒載體的示意圖。慢病毒載體可通過用包裝質(zhì)粒(Invitrogen)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞生成。為了構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NgRlRNAi的十曼病毒載體，i亥(即，Nogo-l，Nogo-2m,,口Nogo-3)啟動發(fā)夾表達(dá)的hU6啟動子RNAi盒通過PacI消化乂人phU6載體分離(如實施例24所述)并克隆進(jìn)入SSM007質(zhì)粒獨特的Pacl^f立點。參見，例如，Robinson等人，淑匿3.3:401-406(2003)中所述的方法。為了追蹤'隄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，CBA-GFP表達(dá)盒或CMV-LacZ表達(dá)盒^皮插入SSM007質(zhì)粒的Xbal位點，所得的構(gòu)建體分別^皮命名為SSM007-BFGW和SSM007-BFZW。將所有的NgRlRNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入SSM007-BFGW和SSM007-BFZW骨架之后，一夸該載體與包裝質(zhì)4立，pLPl,pLP2和pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染進(jìn)入FT293細(xì)月包以進(jìn)ff十曼病毒生產(chǎn)(Viropoweri式劑盒，Invitrogen)。pLPl是包含了HIV-1gag/pol序列禾口由CMV啟動子表達(dá)得到的rev應(yīng)答元件(RRE)并具有bJ求蛋白polyA的8889bp構(gòu)建體；pLP2是表達(dá)來自RSV啟動子的Rev并具有HIV-1polyA以終止轉(zhuǎn)錄的4180bp構(gòu)建體；pLP/VSVG是5821bp的質(zhì)粒，并表達(dá)來自CMV啟動子的水皰性口炎病毒糖蛋白G以及p王求蛋白polyA。由于RNAi干擾對慢病毒效價的自我限制作用，所有的病毒懸液效價均表現(xiàn)為低于普通慢病毒載體，在培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)導(dǎo)單^f立介于4-5x105的范圍內(nèi)。NgRRNAi十曼病毒(LV-NgRRNAi),皮用于以moi(感染復(fù)凄t)1壽爭導(dǎo)NeuroScreen細(xì)月包。通過GFP表達(dá)或卩-半乳糖苷酶染色顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)效率約為1%。由于NgRRNAi-2一皮證明在NgR沉,默中有凌文，且它輩巴向所有的人，小鼠和大鼠NgR，因而選4奪LV-NgRRNAi-2轉(zhuǎn)導(dǎo)NeuroScreen細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞通過有限稀釋在96-孔板上被克隆。鑒定p-半乳糖芬酶陽性或GFP陽性克隆并進(jìn)行擴(kuò)增以進(jìn)行進(jìn)一步的NgR表達(dá)分析。通過釆用7E11單克隆抗體進(jìn)4亍Western印跡分4斤了約20個用于NgR表達(dá)的克隆細(xì)月包系。圖21顯示了典型的western印跡結(jié)果。GAPDH被用作加載歸一化的對照。所有克隆中的NgR表達(dá)通過只十western印跡上的NgR條帶光密度掃4苗并歸一4匕至GAPDH水平得到定量。NgR與GAPDH的比例;故用于測量NgR表達(dá)水平。在篩選的12個克隆中，其中11個具有下降的NgR表達(dá)(采用LV-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的最低NgR表達(dá)克隆1E9作為參考)。相反地，所有4個LV-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)克隆具有與原態(tài)NeuroScreen細(xì)月包相當(dāng)?shù)腘gR水平。圖22。這些結(jié)果i正實通過減少NgR表達(dá)建立了穩(wěn)定細(xì)l包系。實施例27i福/封^《遂'勤、浙我們選4奪了來自LV-NgRRNAi轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的四個克隆進(jìn)4亍功能性分坤斤。以原態(tài)NeuroScreen細(xì)J包的NgR7jc平作為參考，這四個克隆的NgR水平與原態(tài)細(xì)胞相比分別為3cl2b約10%，3c4b約20%，5dl2約30%,4al2約為60%(圖23)。實施例28卓義謦恭7VG^7在#7，^^賞乂掙識身乂M^7通過計算積^莫擬顯示在1D9抗體中的突變支才寺識別人NgRl。通過計算枳4莫擬，1D9重鏈的N56可,皮突變?yōu)榻z氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或谷氨酰胺以與人NgRl的R78相互作用。此夕卜，輕鏈的R33可通過計算機(jī)模擬突變?yōu)楸彼峄蚪z氨酸以避免與人NgRl的R95的,爭電和空間沖突。實施例29《yg^逆脊7尹鏺4秉凝^神遂《^:在曱潑尼龍(MP)和NgR(310)ecto-Fc耳關(guān)合治療脊ft損傷(SCI)的考察中，力圖驗證這些試劑具有獨立的作用機(jī)制。簡單而言，將髓磷脂在預(yù)涂布了80或400ng/微孑L(分另'J為2.5和12.7ng/mm2)的聚-L-賴氨酸的平^反(BectonDickinson,Bedford,MA,USA)上干燥過4復(fù)。然后以10jig/ml層粘蛋白(Calbiochem,LaJolla，CA，USA)在室溫下(22-24°C)覆蓋1小時。分離胚芽期13日雞背才艮神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元并4安前述涂布6-8小時(GrandPre等人.，2000;Fo畫&r等人.，2001)。以8jiMNgR(310)ecto-Fc在10昭/nlMP(Pharmacia,Kalamazoo,MI，USA)存在或擊夾失的情況下在整個生長期處理神經(jīng)元。然后固定神經(jīng)元并以(31in啟管蛋白抗體(Covance,Princeton,NJ，USA)染色，采用自動化細(xì)月包成^f象和分才斤系統(tǒng)(AxonInstrument,UnionCity,CA,USA)對一中經(jīng)突生長進(jìn)^f亍定量。每個孩吏孑L的神經(jīng)生長歸一化至每個試-^(n=3)中兩個對照孩i孔的平均值。NgR(310)ecto-Fc的活性基于其逆轉(zhuǎn)髓磷脂的軸突生長抑制的能力。圖24A-B。相反地，單用MP對髓磷脂底物上背才艮神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突生長沒有作用，且MP的存在不改變NgR(310)ecto-Fc的軸突生長刺激。這些lt據(jù)顯示MP不直纟妄影響髓-粦脂-誘導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制，且MP和NgR(310)ecto-Fc具有獨立的作用。這些體外數(shù)據(jù)支持了MP和NgR(310)ecto-Fc可以順序有效方式增強(qiáng)SCI恢復(fù)的假設(shè)。實施例30義、體《孝仿#的《錄#鍵復(fù)^K河i著/，^MP和NgR(310)ecto-Fc治療對脊fi一黃切后的功能性恢復(fù)均具有時間顯著作用。簡單而言，將站何生LongEvans大鼠(7周大；CharlesRiver,Wilmington,MA,USA)用25mg/kg咪達(dá)哇侖i.p.(AbortLaboratories,Chicago,IL,USA)和含于02的2-3%氟力克(Baxter,Deerfield,IL，USA)進(jìn)4亍麻醉，并在T6和T7脊才,水平進(jìn)4亍背側(cè)推板切除術(shù)。通過含于02的1.5-2%氟烷維持全身麻醉。進(jìn)行背側(cè)半切以完全阻斷主背內(nèi)側(cè)和次背外側(cè)皮質(zhì)脊骨逸束(CST)成分。釆用樣i波刀(microscapel)在3巨離脊fl表面1.8mm的深度立體定向橫切脊髓。在CST橫切后立即向蟲朱網(wǎng)膜下空間的T7插入一個鞘內(nèi)導(dǎo)管，并連接至插入皮下空間的預(yù)充微型滲透泵。該微型滲透泵以0.25^L/h的速率傳遞大鼠IgG同型對照蛋白或磷酸鹽緩沖液(PBS)(5mg/ml，11=8)或NgR(310)ecto-Fc(50|iM,"=19)。在損傷后當(dāng)時以及4和8小時，NgR(310)ecto-Fc處理大鼠群組還以MP(Pharmacia;30mg/kgiv)處理，而獨立群組以單獨的MP處理(30mg/kgiv)。在其后幾天和凄t周中采用BBB曠場(openfield)評分法(Basso等人，乂A^wro&m/wa12:1-21(1995))評估功能性恢復(fù)。只于照動物在研究過程中恢復(fù)了后月支功能，在4周后平均BBB評分達(dá)到12±0.87。在同一時間點的治療組的平均BBB評分為MP,14.9±0.23;NgR(310)ecto-Fc,14.8±0.24以及NgR(310)ecto-Fc力口MP,15.63±0.18。AH處理組在研究過程中顯示出比對照組更佳的BBB評分。相對對照P0.05，Tukey事后#:-驗的雙因素重復(fù)才全測方差分析。(圖25A)。與乂十照動物或單用NgR(310)ecto-Fc處5里的動物相比，以MP-和MP力。NgR(310)ecto-Fc-處理的大鼠中7見察到了統(tǒng)計學(xué)顯著提高的BBB評分。SCI后2天MP-處理大鼠中的BBB評分明顯才是高。相對對照P<0.05，Tukey事后才企—瞼的雙因素重復(fù)才企測方差分析。(圖25B)。這一^L察揭示了MP處理對恢復(fù)的早期作用?？紤]到這一非常早期的MP作用，BBB評分^t歸一化至第2曰以減去MP早期作用(圖25C)乂人而顯示作用在4交為后期產(chǎn)生的NgR(310)ecto-Fc的作用。對單獨動物歸一化至第2天的BBB"i平分顯示了在SCI后2,3和4周±MP的NgR(310)ecto-Fc-處理大鼠中功能性恢復(fù)的顯著提高。相對對照P0.05,Tukey事后才僉驗的雙因素重復(fù)才企測方差分析。(圖25C)。在耳關(guān)合處理組減去了MP對NgR(310)(ecto)-Fc處理的增強(qiáng)作用的歸一化BBB評分顯示(i)在聯(lián):合處理組中MP的作用在SCI后早期出現(xiàn)，且(ii)通過減去該作用，耳關(guān)合處理組和NgR(3lO)ecto-Fc組的功能性恢復(fù)的速率和畔呈度一致，且比單用MP更為明顯。在BBB評分上的判別點為14分，對應(yīng)于一致性減重足底行走和一致性前足-后足協(xié)調(diào)性。一致性腳掌行走頻率和后肢陽前肢協(xié)調(diào)性，顯示了SCI后3和4周獲得14或更高評分的各組中的大鼠比例。相應(yīng)地，結(jié)果一皮表示為大鼠獲4尋14分或更高分的頻率；50%的對照大鼠在損傷后4周達(dá)到14或更高的分凄t(圖25D)。以NgR(310)ecto-Fc和MP耳關(guān)合處理顯著才是高了功能性恢復(fù)的速率。相對對照P<0.05,Fischer確切才企-驗。所有(100%)以NgR(310)ecto-Fc或MP或聯(lián)合治療的大鼠在4周中表現(xiàn)出一致性足底行走和一致性運動。聯(lián)合治療提高了協(xié)調(diào)功能恢復(fù)的速率，與對照或單用NgR(310)ecto-Fc或單用MP相比，該處理組中顯著更高比例的動物在3周內(nèi)達(dá)到了14分或更高評分(圖25D)。改善的功能性恢復(fù)還可通過NgR(3lO)ecto國Fc和NgR(3lO)ecto-Fc力口MP-處J里纟且與只寸照組相比顯著提高的平均步長得到證實(圖25E)。單用MP并未顯著^是升SCI后4周測得的步長。PO.05，單因素方差分析和Dunnett事后纟全測。實施例31/^^^i義l/GG^義篇7VG^/五CrO-潛Y夕嫂r27-37W力^遂'yg^^理f資,體《,仿^^祐焚^r塗'M/存i以NgR(310)ecto-Fc處理或以MP和NgR(310)ecto國Fc聯(lián)合處理增強(qiáng)脊髓4黃切后的軸突可塑性/再生。簡單而言，為了對CSTs進(jìn)4亍組織學(xué)追蹤，在CST橫切后2周爿尋動物再次麻醉并在頭皮切口。對皮膚切口周圍區(qū)域進(jìn)行局部麻醉注射，通過石皮顱術(shù)暴露左側(cè)感覺運動皮層，并使用納升注射器和micro4控制器在前囪背面0-3.5mm和中線側(cè)面0-2.5mm以皮層表面lmm以下的深度在12個點上注射含于PBS的7nL10。/。生物素葡萄并唐胺(BDA;10,000MW;MolcularProbes,Eugene,OR,USA)。在部分范例中，該CST通過相同的步艱《7又面才示i己。在CST橫切后28日以仲丁石克巴比妥(100-110mg/kgi.p.)麻醉大鼠并依次以肝素化鹽水(100ml,10iu肝素)和4%多聚曱醛(150ml)灌流。耳又出脊骨逸，在4%多聚曱醛中固定，然后以30%的蔗糖浸漬48小時，將3巨對黃切位點吻側(cè)10mm和尾側(cè)15mm的25mm長的脊髓與距離損傷吻側(cè)10-15mm和尾側(cè)15-20mm的脊髓包埋于最佳切削溫度化合物(OCT)中。對冷凍切片(50fmi)進(jìn)^f亍連續(xù)切割并以《連霉親和素結(jié)合的AlexaFluor-594(1:200;MolecularProbes)染色以顯示標(biāo)記的CST軸突。在沖黃切位點尾側(cè)10和15mm處所耳又的沖黃切切片上進(jìn)行軸突計數(shù)。所有的纟企測均為盲測。對每只動物在每個脊推水平上每八個切片(即，相距400iam的切片)進(jìn)行計數(shù)并將值表示為每個切片上的平均軸突數(shù)量。以NgR(310)ecto-Fc處理或以MP和NgR(310)ecto-Fc聯(lián)合處理可促使損傷位點尾側(cè)15mm的生物素葡聚糖胺(BDA)-標(biāo)記的軸突計數(shù)明顯上升(圖26A)?？煽吹紹DA-標(biāo)記的軸突由背側(cè)柱抽芽進(jìn)入背側(cè)角灰質(zhì)，而剩余的腹側(cè)CST進(jìn)入腹側(cè)灰質(zhì)。在脊髓離散區(qū)域的軸突計數(shù)揭示在灰質(zhì)中的軸突數(shù)量上升最大。與腹側(cè)白質(zhì)(vWM)和背側(cè)白質(zhì)(dWM)比較在灰質(zhì)中觀察到最大的軸突數(shù)量上升(圖26B)。PO.05,單因素方差分4斤和Dunnett事后沖企測。這些^^居4是示結(jié)合或不結(jié)合MP進(jìn)4亍的NgR(310)ecto-Fc處理促進(jìn)損傷后脊髓中的可塑性。實施例32^!^^^至義it/GGW義it7VGW五Cr(9-潛y夕鍵f27-"與f遂Vg^農(nóng)合々理增強(qiáng)^:參#標(biāo)記^舉和應(yīng),運動7^經(jīng)兄之辨W^焚遂凝炎抗-嚢泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體l(vGLUTl)抗體(1:2500稀釋)一皮用于對一中經(jīng)元細(xì)月包體進(jìn)4亍染色，在薄片9中的a-和y-運動碎中經(jīng)元可通過其大小和形態(tài)進(jìn)行鑒定。與對照動物相比MP+NgR(310)ecto-Fc-處理組中與a-和y-運動^中經(jīng)元4妻觸的軸突凄t量顯著上升，且在4妄受NgR(310)ecto-Fc和MP聯(lián)合處理的動物中觀察到最顯著的作用(圖27)。PO.05,單因素方差分析和Dunnett事后檢測。生物保藏雜交瘤HB7E11(ATCC編號PTA-4587),HB1H2(ATCC編號PTA-4584),HB3G5(ATCC編號PTA畫4586)，HB5B10(ATCC編號PTA-4588)以及HB2F7(ATCC編號PTA-4585)已于2002年8月9日保藏于美國菌種保藏中心("ATCC⑧")(10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209，USA)。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員所能理解，本發(fā)明的優(yōu)選實施方式可在不脫離本發(fā)明精神的前提下進(jìn)行多種修改和修飾。所有這些變化均意在落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包括除了不超過三個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自以下組合(a)SEQIDNO49的氨基酸x至344；以及(b)SEQIDNO49的氨基酸309至y；其中x為由305至326的任意整數(shù)，而y是由328至350的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽片段抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。2.如權(quán)利要求1所述的多肽片段，其中x為由300至326的任意整數(shù)，而y是由328至360的任意整數(shù)。3.如權(quán)利要求2所述的多肽片段，其中所述的參考氨基酸序列選自以下組合(i)SEQIDNO:49的氨基酸309至335;(ii)SEQIDNO:49的氨基酸309至344;(iii)SEQIDNO:49的氨基酸310至335;(iv)SEQIDNO:49的氨基酉吏310至344;(v)SEQIDNO:49的氨基酸309至350;(vi)SEQIDNO:49的氨基酸300至344;以及(vii)SEQIDNO:49的氨基酉臾315至344。4.如權(quán)利要求3所述的多肽片段，其中所述的參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基酸309至335。5.如權(quán)利要求3所述的多肽片段，其中所述的參考氨基酸序列為SEQIDNO:49的氨基酸309至344。6.具有60個殘基或少于60個殘基的分離多肽片段，其包括SEQIDNO:49的氨基酸x至y,其中x為由300至310的任意整凄史，而y是由340至360的4壬意整數(shù)；并且其中所述的多肽片段抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。7.如權(quán)利要求1-6任意一項所述的多肽，其中所述的多肽為環(huán)狀。8.如權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述的環(huán)狀多肽進(jìn)一步包含連才妻在N-末端的第一分子和連4妄在C-末端的第二分子；其中所述的第一分子和所述的第二分子;f皮此連"t妄形成所述的環(huán)狀分子。9.如權(quán)利要求8所述的多肽，其中所述的第一和第二分子選自如下組合生物素分子，半胱氨酸殘基，以及乙?；腚装彼釟埢?。10.如權(quán)利要求9所述的多肽，其中所述的第一分子為連接至所述多肽N-末端的生物素分子而所述的第二分子為連4妻至所述多肽C-末端的半胱氨酸殘基。11.如^又利要求9所述的多肽，其中所述的第一分子為連4妻至所述多肽N-末端的乙酰化半胱氨酸殘基而所述的第二分子為連才妻至所述多肽c-末端的半胱氨酸殘基。12.如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的多肽，其中所述的C-末端半胱氨酸連接有NH2部分。13.包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含除了不超過二十個單獨氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基S臾序列，其中所述的第一參考氨基酸序列選自以下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸a至445，(b)SEQIDNO:49的氨基酸27至b,以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸a至b，其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；并且其中所述的第二多肽片段包含除了不超過二十個單獨氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列選自以下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸c至445,(b)SEQIDNO:49的氨基酸27至d,以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸c至d，其中c為由25至35的任意整數(shù)，而d是由300至450的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。14.如權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述的第一參考氨基S臾序列選自以下纟且合(a)SEQIDNO:49的氨基酸27至310，以及(b)SEQIDNO:49的氨基酸27至344。15.如權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述的第二參考氨基酸序列選自以下纟且合(a)SEQIDNO:49的氨基酸27至310，以及(b)SEQIDNO:49的氨基酸27至344。16.如權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述的第一多肽片段包含SEQIDNO:49的氨基酸27至310,并且其中所述的第二多肽片,殳包含SEQIDNO:49的氨基酉復(fù)27至310。17.如權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述的第一多肽片,炎包含SEQIDNO:49的氨基酉吏27至344,而其中所述的第二多月太片革殳包含SEQIDNO:49的氨基酉臾27至310。18.如權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述的第一多肽片段包含SEQIDNO:49的氨基酸27至344,并且其中所述的第二多肽片革殳包含SEQIDNO:49的氨基酸27至344。19.如權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述的第一多肽片段位于所述第二多肽片段的上游。20.如權(quán)利要求13所述的多肽，進(jìn)一步包括介于所述第一多肽片段和所述第二多肽片,史之間的肽4妻頭。21.如權(quán)利要求20所述的多肽，其中所述的肽4妄頭包含SEQIDNO:65(G4S)3。22.如權(quán)利要求1-21任意一項所述的多肽，其中所述參考氨基酸序列，所述第一參考氨基酸序列或所述第二參考氨基酸序列中至少一個半胱氨酸殘基被不同的氨基酸替換。23.如權(quán)利要求22所述的多肽，其中所述的至少一個半胱氨S臾殘基位于C266。24.如權(quán)利要求22所述的多肽，其中所述的至少一個半胱氨酸殘基位于C309。25.如權(quán)利要求22所述的多肽，其中所述的至少一個半胱氨S臾殘基位于C335。26.如權(quán)利要求22所述的多肽，其中所述的至少一個半胱氨酸殘基位于C336。27.如^L利要求22所述的多肽，其中所述的不同氨基酸選自如下組合丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸。28.如權(quán)利要求27所述的多肽，其中所述的不同氨基酸為丙氨酸。29.如權(quán)利要求l-28任意一項所述的多肽，其與外源多肽相融合。30.如權(quán)利要求29所述的多肽，其中所述的外源多肽為血清白蛋白。31.如權(quán)利要求29所述的多肽，其中所述的外源多肽為Fc區(qū)。32.如權(quán)利要求29所述的多肽，其中所述的外源多肽為信號肽。33.如權(quán)利要求29所述的多肽，其中所述的外源多肽為多肽標(biāo)記。34.如權(quán)利要求31所述的多肽，其中所述的Fc區(qū)選自如下組合IgAFc區(qū)；IgDFc區(qū)；IgGFc區(qū)；IgEFc區(qū)以及IgMFc區(qū)。35.如權(quán)利要求33所述的多肽，其中所述的多肽標(biāo)記選自如下組合Flag標(biāo)記；Strep標(biāo)記；聚組氨酸標(biāo)i己；VSV-G標(biāo)i己；淨(jìng)u感病毒血凌是素(HA)才示i己；以及c-Myc才示i己。36.如權(quán)利要求1-35任意一項所述的多肽，其中所述的多肽與一種或多種聚烷撐二醇部分相連接。37.如權(quán)利要求36所述的多肽，其中所述的一種或多種聚烷撐二醇部分為聚乙二醇(PEG)部分。38.如權(quán)利要求37所述的多肽，其中所述的多肽與1-5PEG部分相連接。39.分離多肽，其包含(a)除了所述參考氨基酸序列中至少一個半月光氨ir復(fù)殘基一皮不同的氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸選自以下組合(i)SEQIDNO:49的氨基酸a至445，(ii)SEQIDNO:49的氨基酸27至b，以及(iii)SEQIDNO:49的氨基酸a至b，其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。40.如權(quán)利要求38所述的多肽，其中所述參考氨基酸序列的C266被不同的氨基酸替換。41.如權(quán)利要求39所述的多肽，其中所述參考氨基酸序列的C309被不同的氨基酸替換。42.如權(quán)利要求39所述的多肽，其中所述參考氨基酸序列的C335被不同的氨基酸替換。43.如4又利要求39所述的多肽，其中所述參考氨基酸序列的C266和C309被不同的氨基酸替換。44.如權(quán)利要求39所述的多肽，其中所述參考氨基酸序列的C309和C335被不同的氨基酸替換。45.如權(quán)利要求39-44任意一項所述的多肽，其中所述的不同氨基酉吏為丙氛酉臾。46.如權(quán)利要求39所述的多肽，其中所述的外源多肽選自以下組合(a)血5青白蛋白，(b)Fc區(qū)，(c)信號肽，(d)多肽才示i己，以及(e)兩種或多種所述外源多肽的組合。47.^口才又^寸|>泉46,斤述的多月太，其中戶斤述的Fc區(qū)選自^口下纟且^:IgAFc區(qū)；IgDFc區(qū)；IgGFc區(qū)；IgEFc區(qū)以及IgMFc區(qū)。48.3口4又利要求47所述的多月太，其中所述的Fc區(qū)為IgGFc區(qū)。49.如^L利要求46所述的多肽，其中所述的多肽標(biāo)記選自如下組合Flag標(biāo)i己；Strep標(biāo)記；聚組氨酸標(biāo)i己；VSV-G標(biāo)i己；流感病毒血埃是素(HA)才示i己；以及c-Myc才示i己。50.如權(quán)利要求39-49任意一項所述的多肽，其中所述的多肽與一種或多種聚烷撐二醇部分相連接。51.如權(quán)利要求50所述的多肽，其中所述的一種或多種聚烷撐二醇部分為聚乙二醇(PEG)部分。52.如權(quán)利要求51所述的多肽，其中所述的多肽與1-5PEG部分相連接。53.分離多肽，其包含(a)除了不超過二十個單獨氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自以下組合(i)SEQIDNO:49的氨基酸a至445，(ii)SEQIDNO:49的氨基酸27至b,以及(iii)SEQIDNO:49的氨基酸a至b,其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。54.如權(quán)利要求53所述的多肽，其中所述的外源多肽選自以下組合(a)血;青白蛋白，(b)Fc區(qū)，(c)信號肽，(d)多狀才示i己，以及(e)兩種或多種所述外源多肽的組合。55.如權(quán)利要求54所述的多肽，其中所述的Fc區(qū)選自如下組合IgAFc區(qū)；IgDFc區(qū)；IgGFc區(qū)；IgEFc區(qū)以及IgMFc區(qū)。56.如一又利要求55所述的多肽，其中所述的Fc區(qū)為IgGFc區(qū)。57.如權(quán)利要求56所述的多肽，進(jìn)一步包括介于所述氨基酸序列和所述IgGFc區(qū)之間的肽4妄頭。58.如權(quán)利要求57所述的多肽，其中所述的肽接頭包含SEQIDNO:66(G4S)2。59.如;K利要求54所述的多肽，其中所述的多肽標(biāo)記選自如下組合Flag才示i己；Strep標(biāo)i己；聚纟且氛酸才示i己；VSV-G木亍i己；力充感病毒血;疑素(HA)才示i己；以及c-Myc才示i己。60.如權(quán)利要求53-59任意一項所述的多肽，其中所述的多肽與一種或多種聚烷撐二醇部分相連接。61.如4又利要求60所述的多肽，其中所述的一種或多種聚;^克撐二醇部分為聚乙二醇(PEG)部分。62.如權(quán)利要求61所述的多肽，其中所述的多肽與1-5PEG部分相連接。63.包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含除了不超過二十個單獨氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列選自以下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸a至305,(b)SEQIDNO:49的氨基酸1至b，以及(c)SEQIDNO:49的氨基酸a至b,其中a為由1至27的任意整數(shù)，而b是由264至309的任意整數(shù)；并且其中所述的第二多肽片段包含除了不超過二十個單獨氨基酸^齊換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列選自以下組合(a)SEQIDNO:60的氨基酸c至332;(b)SEQIDNO:60的氨基酸275至d,以及(c)SEQIDNO:60的氨基酸c至d，其中c為由265至306的4壬意整H,而d是由308至340的4壬意整數(shù)；并且其中所述的多肽抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。64.如權(quán)利要求63所述的多肽，其中所述的第一參考氨基酸序列選自以下組合(a)SEQIDNO:49的氨基酸1至274;以及(b)SEQIDNO:49的氨基酸1至305。65.如4又利要求63所述的多肽，其中所述的第二參考氨基酸序列選自以下纟且合(a)SEQIDNO:60的氨基酸275-311;(b)SEQIDNO:60的氨基酸275-332;(c)SEQIDNO:60的氨基酸306-311;(d)SEQIDNO:60的氨基酸306至308;以及(e)SEQIDNO:60的氨基酸306-309。66.如一又利要求63所述的多肽，其中所述的第一多肽片,殳包含SEQIDNO:49的氨基酸1-274而其中所述的第二多肽片段包含SEQIDNO:60的氨基酸275-311。67.如權(quán)利要求63所述的多肽，其中所述的第一多肽片段包含SEQIDNO:49的氨基酸1-274而其中所述的第二多肽片段包含SEQIDNO:60的氨基酸275-332。68.如權(quán)利要求63所述的多肽，其中所述的第一多肽片段包含SEQIDNO:49的氨基酸1-305而其中所述的第二多肽片段包含SEQIDNO:60的氨基酸306-311。69.如權(quán)利要求63所述的多肽，其中所述的第一多肽片段包含SEQIDNO:49的氨基酸1-305而其中所述的第二多肽片,殳包含SEQIDNO:60的氨基酸306-309。70.如權(quán)利要求69所述的多肽，其中至少一個附加氨基酸被連接至所述第二多肽片^:的C-末端。71.如—又利要求70所述的多肽，其中所述的至少一個附加氨基酸為色氨酸。72.如權(quán)利要求71多肽，其中所述第一多肽片段的A269被不同的氨基酸替換。73.如權(quán)利要求72所述的多肽，其中所述的不同氨基酸為色氨酸。74.包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片l殳除了不超過二十個單獨氨基酸^齊換外由SEQIDNO:49的氨基酸1-310組成；且其中所述的第二多肽片段除了不超過五個單獨氨基酸替換外由SEQIDNO:60的氨基酸311-318組成；并且；其中所述的多肽抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長抑制。75.如權(quán)利要求63-744壬意一項所述的多肽，其與外源多月太相融合。76.如權(quán)利要求75所述的多肽，其中所述的外源多肽為血清白蛋白。77.如權(quán)利要求75所述的多肽，其中所述的外源多肽為Fc區(qū)。78.如4又利要求75所述的多肽，其中所述的外源多肽為信號肽。79.如權(quán)利要求75所述的多肽，其中所述的外源多肽為多肽標(biāo)記。80.如沖又利要求77所述的多肽，其中所述的Fc區(qū)選自如下組合IgAFc區(qū)；IgDFc區(qū)；IgGFc區(qū)；IgEFc區(qū)以及IgMFc區(qū)。81.如4又利要求79所述的多肽，其中所述的多肽標(biāo)記選自如下組合Flag標(biāo)i己；Strep才示i己；聚纟且氨酉吏才示i己；VSV-G才示"i己；i乾感病毒血〕疑素(HA)才示i己；以及c-Myc才示i己。82.^口斗又利要求63-814壬意一項所述的多月太，其中所述的多月太與一種或多種聚烷撐二醇部分相連接。83.如權(quán)利要求82所述的多肽，其中所述的一種或多種聚烷撐二醇部分為聚乙二醇(PEG)部分。84.如沖又利要求83所迷的多月太，其中所述的多月太與1-5PEG部分相連接。85.分離多聚核苷酸，其包含了編碼如權(quán)利要求1-84任意一項所述的多肽的核苷酸序列。86.如一又利要求85所述的多聚核普酸，其中所述的核苷酸序列可操作地連接至表達(dá)控制元件。87.如權(quán)利要求86所述的多聚核苦酸，其中所述的表達(dá)控制元件選自如下組合可請導(dǎo)啟動子；組成型啟動子；以及分泌信號。88.選自如下組合的分離多聚核苦酸(i)反義多聚核苷酸；(ii)核酶；(iii)小干4尤RNA(siRNA);以及(iv)小發(fā)夾RNA(shRNA)。89.如權(quán)利要求88所述的多聚核苷酸，其中所述的多聚核苷酸為包含了與NgRlmRNA編碼部分互補的至少10個石咸基的反義多聚核脊酸。90.如片又利要求88所述的多聚核香酸，其中所述的多聚核苷酸為核酶。91.如一又利要求88所述的多聚核苦酸，其中所述的多聚核苦酸為si脂A。92.如4又利要求88所述的多聚核苦酸，其中所述的多聚核苷酸為shRNA。93.如權(quán)利要求91或92所述的多聚核苷酸，其中所述的siRNA或shRNA抑制NgRl表達(dá)。94.如斥又利要求93所述的多聚核苦酸，其中所述的siRNA或shRNA與包含CUACUUCUCCCGCAGGCG(SEQIDNO:52)的核苷酸序列至少具有90%的一f丈性。95.如一又利要求93所述的多聚核苷酸，其中所述的siRNA或shRNA包含4t香酉吏序列CUACUUCUCCCGCAGGCG(SEQIDNO:52)。96.如—又利要求93所述的多聚核苦酸，其中所述的siRNA或shRNA包含了與包含序列GATGAAGAGGGCGTCCGCT(SEQIDNO:53)的多聚核苦酸生成的mRNA互補的核苷酸序列。97.如權(quán)利要求93所述的多聚核苦酸，其中所述的siRNA或shRNA與包含CCCGGACCGACGUCUUCAA(SEQIDNO:54)的核苷酸序列至少具有90%的一致性。98.如權(quán)利要求93所述的多聚核苷酸，其中所述的siRNA或shRNA包含核普酸序列CCCGGACCGACGUCUUCAA(SEQIDNO:54)。99.如權(quán)利要求93所述的多聚核苷酸，其中所述的siRNA或shRNA包含了與包含序列GGGCCTGGCTGCAGAAGTT(SEQIDNO:55)的多聚核香酸生成的mRNA互補的核苦酸序列。100.如權(quán)利要求93所述的多聚核苦S臾，其中所述的siRNA或的核苷酸序列至少具有90%的一致性。101.如權(quán)利要求93所述的多聚核苦酸，其中所述的siRNA或shRNA包含核香酸序列CUGACCACUGAGUCUUCCG(SEQIDNO:56)。102.如權(quán)利要求93所述的多聚核苷酸，其中所述的siRNA或shRNA包含了與包含序列GACTGGTGACTCAGAGAAGGC(SEQIDNO:57)的多聚核苷酸生成的mRNA互補的核普酸序列。103.包含如權(quán)利要求85-102任意一項所述多聚核苦酸的載體。104.如包含—又利要求103所述載體的宿主細(xì)月包。105.包含如權(quán)利要求1-84任意一項所述多肽以及藥學(xué)可接受載體的纟且t4勿。106.包含如權(quán)利要求85-102任意一項所述多聚核苷酸以及藥學(xué)可接受載體的組合物。107.包含如權(quán)利要求103所述的載體或如一又利要求104所述的宿主細(xì)胞以及藥學(xué)可接受載體的組合物。108.包含SEQIDNO:7的氨基酸27-310以及抗炎劑的組合物。109.如權(quán)利要求108所述的組合物，其中所述的抗炎劑選自由甾體抗炎劑和非甾體抗炎劑構(gòu)成的組合。110.如—又利要求109所述的組合物，其中所述的甾體抗炎劑選自如下組合氫化可的松，21-醋酸基娠烯醇酮，阿氯米松，阿爾孕酮，安西奈德，丙酸倍氯米+>,倍他米松，倍他米松戊酸，布地奈德，氯潑尼+>，丙酸氯倍他索，丙酸氯倍他索，氯倍他氯4^f也+^丁酸鹽，氯可4毛龍，氯潑尼醇，皮質(zhì)酮，可的+>，可的伐哇，deflazacon，地奈德，去羥米+〉，地塞米+>,二氟拉松，二氟可龍，二氟潑尼酯，甘草次g吏，氟扎可特，氟氯奈德，氟美爭〉，新戊酸氟米爭>,氟尼縮+>,氟輕+>曲安縮+>,醋酸氟輕+>,氟氫+>醋酸酯曲安縮+>，氟可丁丁酯，氟考龍，氟考龍己酸鹽，二氟可龍戊酸鹽，氟米龍，氟培龍醋酸鹽，醋酸氟潑尼定，氟潑尼龍，氟氫縮+>，氟甲酰龍，。合西奈德，卣美他+>，卣潑尼+>醋酸鹽，氫可他酯，氫化可的木>,醋酸氫化可的松，丁酸氫化可的松，氬化可的松磷酸鹽，氫化可的松，21-琥珀酸鈉，氫化可的松叔丁乙酸鹽，馬潑尼酮，曱羥松，曱基強(qiáng)的木〉，曱潑尼龍，糠酸莫米+〉，帕^立米+>,潑尼卡酯，強(qiáng)的,強(qiáng)的+>龍21-diedryaminoacetate,〉發(fā)尼水>龍石岸酉臾4內(nèi)，醋酸潑尼松龍琥珀酸鈉，強(qiáng)的松龍鈉21-m-苯磺酸，強(qiáng)的松龍鈉21-硬脂酸乙醇酸酯，4又丁乙酸鹽強(qiáng)的+>,強(qiáng)的+>龍21-三甲基乙酸鹽，潑尼松，潑尼松龍戊酸酯，潑尼立定，潑尼立定21-二乙氨基醋酸鹽，替可的+>,曲安西龍，曲安西龍曲安縮苯曲安奈德和己曲安奈德。111.如權(quán)利要求IIO所述的組合物，其中所述的甾體抗炎劑為曱潑尼龍。112.如權(quán)利要求109所述的組合物，其中所述的非甾體抗炎劑選自如下組合阿明洛芬，苯惡洛芬，布氯酸，卡布洛芬，芬布芬，非諾洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬，咪洛芬，萘普生，奧沙普秦，吡洛芬，普拉洛芬，舒洛芬，噻洛芬酸，硫惡洛芬，吲哚美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，環(huán)氯茚酸，雙氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸，呋羅芬酸，異丁芬酸，-f尹索克酸，oxpinac,舒林酸，石克平酸，4乇美汀，齊多美辛，佐美酸，氟芬那酸，曱氯芬那酸酸，曱芬那酸，尼氟滅酸，4乇芬那酸，二氟尼柳，氟笨沙酸，〗尹索昔康，吡羅昔康，舒多昔康，替諾昔康，乙酰水楊S臾，柳氮石黃胺吡啶，阿扎丙宗，bezpiperylon，非普4立宗，莫非布宗，羥基4呆泰+〉和苯乙丁氮酉同。113.包含SEQIDNO:9的氨基酸27-310以及抗炎劑的組合物。114.如權(quán)利要求113所述的組合物，其中所述的抗炎劑選自由甾體抗炎劑和非甾體抗炎劑構(gòu)成的組合。115.如權(quán)利要求114所述的組合物，其中所述的甾體抗炎劑選自如下組合氫化可的松，21-醋酸基娠歸醇酮，阿氯米松，阿爾孕酮，安西奈德，丙酸倍氯米松，倍他米松，倍他米松戊酸，布地奈德，氯潑尼松，丙酸氯倍他索，丙酸氯倍他索，氯倍他松，氯倍他松丁Si鹽，氯可托龍，氯潑尼醇，皮質(zhì)酮，可的松，可的伐哇，deflazacon,地奈德，去羥米+>,地塞米+>,二氟拉松，二氟可龍，二氟潑尼酯，甘草次酸，氟扎可特，氟氯奈德，氟美+>，新戊@臾氟米+>，氟尼縮+>,氟輕爭>曲安縮木>,醋酸氟輕+>,氟氫+〉醋酸酯曲安縮+^，氟可丁丁酯，氟考龍，氟考龍己酸鹽，二氟可龍戊酸鹽，氟米龍，氟培龍醋酸鹽，醋酸氟潑尼定，氟潑尼龍，氟氬縮+>,氟曱酰龍，p合西奈德，卣美他松，囟潑尼松醋酸鹽，氬可他酯，氫化可的松，醋酸氪化可的+>,丁酸氬化可的+>,氫化可的松磷酸鹽，氫化可的*>,21J虎珀酸鈉，氫〗匕可的+>井又丁乙酸鹽，馬潑尼酮，曱羥木〉，甲基強(qiáng)的+>，曱潑尼龍，糠酸莫米+>,帕拉米+>，潑尼卡酯，強(qiáng)的+>，強(qiáng)的+>龍21-diedryaminoacetate,〉發(fā)尼+>龍石粦酉臾4內(nèi)，醋酸潑尼松龍琥珀酸鈉，強(qiáng)的*>龍鈉21-m-苯磺酸，強(qiáng)的+>龍鈉21-硬脂酸乙醇酸酯，詐又丁乙酸鹽強(qiáng)的爭>,強(qiáng)的松龍21-三曱基乙酸鹽，潑尼松，潑尼木〉龍戊酸酯，潑尼立定，潑尼立定21-二乙氨基醋酸鹽，替可的+〉，曲安西龍，曲安西龍曲安縮+>，苯曲安奈德和己曲安奈德。116.如權(quán)利要求115所述的組合物，其中所述的甾體抗炎劑為曱潑尼龍。117.如權(quán)利要求114所述的組合物，其中所述的非甾體抗炎劑選自如下組合阿明洛芬，苯惡洛芬，布氯酸，卡布洛芬，芬布芬，非諾洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬，咪洛芬，萘普生，奧沙普秦，吡洛芬，普拉洛芬，舒洛芬，噻洛芬酸，碌u惡洛芬，吲、，呆美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，環(huán)氯茚酸，雙氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸，呋羅芬酸，異丁芬酸，4尹索克酸，oxpinac，舒4木酸，石克平酸，托美汀，齊多美辛，佐美酸，氟芬那酸，甲氯芬那酸酸，曱芬那酸，尼氟滅酸，托芬那酸，二氟尼柳，氟苯沙酸，^尹索昔康，吡羅昔康，舒多昔康，替諾昔康，乙酰水楊g吏，柳氮磺胺吡啶，阿扎丙宗，bezpiperylon，非普^立宗，莫非布宗，羥基^呆泰+>和苯乙丁氮酮。118.如權(quán)利要求108-117任意一項所述的組合物，其中所述的SEQIDNO:7或9的氨基酸27-310一皮融合至外源多月太。119.如權(quán)利要求118所述的組合物，其中所述的外源多肽為Fc。120.促進(jìn)神經(jīng)突生長的方法，其包括將神經(jīng)元與選自如下組合的藥劑相4妾觸(a)如權(quán)利要求1-84任意一項所述的多肽；(b)如—又利要求85_1024壬意一項所述的多聚核苦酸；以及(c)如^又利要求108-119任意一項所述的組合物，其中所述的藥劑抑制神經(jīng)突生長抑制。121.如—又利要求120所述的方法，其中所述的神經(jīng)元在哺乳動物中。122.如4又利要求121所述的方法，其中所述的哺乳動物為人。123.抑制NgRl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包括將神經(jīng)元與有效量的選自如下組合的藥劑相4姿觸(a)如權(quán)利要求1-84任意一項所述的多肽；(b)如權(quán)利要求85-102任意一項所述的多聚核苷酸；以及(c)如一又利要求108-119任意一項所述的組合物。124.如^L利要求123所述的方法，其中所述的神經(jīng)元在哺乳動物中。125.如才又利要求124所述的方法，其中所述的哺乳動物為人。126.在哺乳動物中治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，紊亂或損傷的方法，其包括向需要該種治療的哺乳動物施用有效量的選自如下組合的藥劑(a)如權(quán)利要求1-84任意一項所述的多肽；(b)如權(quán)利要求85-102任意一項所述的多聚核苷酸；以及(c)如權(quán)利要求108-119任意一項所述的組合物。127.如權(quán)利要求126所述的方法，其中所述的疾病，紊亂或損傷選自如下組合多發(fā)性石更4匕癥，ALS，亨廷頓病，阿爾茨海,默病，帕金森氏病，糖尿病神經(jīng)病變，中風(fēng)，外傷性腦損傷，脊髓損傷，視神經(jīng)炎，青光眼，聽力喪失以及腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。全文摘要本發(fā)明披露了免疫原性Nogo受體-1多肽，Nogo受體-1抗體，其抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體及其融合蛋白以及編碼它們的核酸。本發(fā)明還披露了Nogo受體拮抗劑多聚核苷酸。本發(fā)明還披露了包含該種Nogo受體抗體，其抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體及其融合蛋白，編碼它們的核酸以及拮抗劑多聚核苷酸的組合物，以及這些成分的制備和使用方法。文檔編號A61K39/395GK101420977SQ200780010338公開日2009年4月29日申請日期2007年1月26日優(yōu)先權(quán)日2006年1月27日發(fā)明者K·簡·雷爾頓,R·布萊克·佩平斯凱,丹尼爾·H·S·李,保羅·H·魏因雷布,勞拉·西爾維安,埃倫·A·加伯,文丁一,沃納·邁爾,王辛中,阿列克謝·盧戈夫斯科伊申請人:比奧根艾迪克Ma公司